Формирование электровозбудимости у развивающихся в культуре эмбриональных скелетных миоцитов лягушки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Терентьев, Дмитрий Александрович

• Терентьев, Дмитрий Александрович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Терентьев, Дмитрий Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. 1. Потенциалозависимые ионные каналы мембраны скелетной мышцы

I. 2. Натриевые каналы

I. 3. Кальциевые каналы

I. 4. Потенциалозависимые калиевые каналы

I. 5. Калиевые каналы входящего выпрямления ■...■

II МЕТОДИКА И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

II. 1. Культивирование клеток

II. 2. Регистрация потенциалозависимых ионных токов и изменений мембранного потенциала

III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

III. 1. ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИИ ПЛОЩАДИ ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ И МЕМБРАНЫ Т-СИСТЕМЫ МИОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ

III. 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСНОВНЫХ СВОЙСТВ ТРАНСМЕМБРАННЫХ ИОННЫХ ТОКОВ МИОЦИТОВ

III. 2. 1. Натриевый ток

III. 2.2. Кальциевые токи

III. 2. 3. Потенциалозависимые калиевые токи

III. 2. 3.1. Изменения кинетических характеристик 1к в процессе развития

III. 2. 3.2. Фармакологический анализ потенциалозависимых 1к

III. 2. 4. Калиевый ток входящего выпрямления

III, 2, 4,1, Модулирующее влияние 4-АП на lir

III. 3. ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ИОННЫХ ТОКОВ МИОЦИТОВ И ФОРМИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРОВОЗБУДИМОСТИ

III. 3.1. Количественные изменения К+ тока входящего выпрямления миоцитов в процессе развития; потенциал покоя

III. 3.2. Количественные изменения Na+ и потенциалозависимых К+ ионных токов миоцитов в процессе развития; потенциал действия

III. 3.3. Количественные изменения Са2+ ионных токов миоцитов в процессе развития

IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

IV. 1. Потенциал покоя и калиевые каналы входящего выпрямления

IV. 2. Натриевые и потенциалозависимые калиевые каналы; потенциал действия

IV. 3. Кальциевые каналы

IV. 4. Качественные изменения потенциалозависимого 1к

IV. 5. Модулирующее влияние 4-аминопиридина на калиевые каналы входящего выпрямления

IV. 6. Заключение

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АТФ - аденозинтрифосфат

4-АП - 4-аминопиридин

ВАХ - вольт-амперная характеристика

ДТП - дигидропиридин

ГТФ - гуанозинтрифосфат

Ел - постоянный поддерживаемый потенциал

Еконд - кондиционирующий потенциал

Етест - тестирующий потенциал

Ег - потенциал реверсии

Ек - равновесный потенциал д ля ионов К+

ПД - потенциал действия

1111 - потенциал покоя

СМВ - скелетно-мышечное волокно

ТТХ - тетродотоксин

ТЭА - тетраэтиламмоний

ЭМС - электромеханическое сопряжение

1ка - натриевый ток

т V» о

1к - потенциалозависимыи калиевыи ток

X О

lea - кальциевым ток

Iir - калиевый ток входящего выпрямления Iatp - АТФ-зависимый калиевый ток

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование электровозбудимости у развивающихся в культуре эмбриональных скелетных миоцитов лягушки»

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Становление механизмов электровозбудимости в ходе онтогенетического развития организма - одна из важных проблем физиологии возбудимых мембран. Изучение развития электровозбудимости мембраны скелетно-мышечного волокна (СМВ) с помощью эмбриофизиологического приема исследования (Гинецинский, 1961) не только улучшает понимание физиологии проводящей функции мышечной мембраны, но и позволяет определить некоторые особенности становления этой функции в миогенезе и эволюции.

Для всех мышц позвоночных мышечная дифференциация сопровождается арестом клеточного цикла, транскрипционной активацией мышечно-специфичных генов, слиянием одиночных миоцитов в мультинуклеарные миотубы и, наконец, установлением контактов с нейронами. До самого последнего времени работ, посвященных развитию возбудимости сарколеммы и механизмов ее регуляции в онтогенезе, было не так много. Но в последние 5 лет интерес к этой проблеме значительно возрос и появился целый ряд статей, где дискутируются вопросы о роли процесса слияния (Constantin et al., 1995), иннервации (Altiok et al., 1995, Pasino et al., 1996), взаимозависимости экспрессии ионных токов (De Luca et al., 1994; Greaves et al., 1996; Linsdell, Moody, 1994, 1995; Villaroel, Sakmann, 1996) и последовательности событий в развитии возбудимости скелетно-мышечных клеток. При этом остается большое количество неразрешенных вопросов.

Для развивающихся мышечных клеток характерными являются присутствие динамично сменяющегося "набора" и/или изменения уровня экспрессии практически для каждого описанного класса каналов и

рецепторов как то: потенциалозависимые натриевые каналы (Frelin et al., 1981; Kubo, 199la,б), калиевые каналы задержанного выпрямления (Ernsberger, Spitzer, 1995; Ribera Spitzer, 1991; Zemkova et al, 1989) калиевые каналы входящего выпрямления (Chautah-Patel, Spruce, 1997; Hancock et al., 1996), АТФ-зависимые калиевые каналы (Honore, Lazdunski, 1995; Tricarico et al., 1997), кальциевые дигидропиридин-чувствительные каналы (Bulteau et al., 1996), хлорные каналы (De Luka et al., 1990), никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Missias et al.,1996, Romano et al.,1997).

До сих пор данные, полученные разными авторами, носят разрозненный характер; в исследованиях использовались различные объекты и методические подходы, в основном исследователи сосредотачивались на изучении одного конкретного типа каналов на определенных стадиях развития. Интерпретация результатов часто усложнялась, так как не были запрещены слияние миоцитов в миотубы и установление контактов с нейронами.

Как объект исследования электровозбудимости, зрелое СМВ лягушки изучено наиболее полно (Adrian et al., 1970а,b; Adrian, Peachey, 1973; Almers, Pallade, 1981; Lynch, 1985, Hencek et al., 1988). Поэтому удобной для сравнения и подходящей для комплексного изучения качественных и количественных изменений в процессе формирования электровозбудимости представляется культура эмбриональной мышечной ткани лягушки.

Учитывая все вышесказанное, мы поставили ЦЕЛЬЮ НАСТОЯТЦЕЙ РАБОТЫ исследование становления электровозбудимости мембраны скелетно-мышечной клетки лягушки на ранних этапах его онтогенетического развития.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Выяснить, до какой степени система электрогенеза может развиться на одиночной клетке, то есть насколько экспрессия ионных каналов, обеспечивающих электровозбудимость, определяется миогенными факторами, не связанными с нервной или эндокринной регуляцией.

2) Проследить последовательность событий в процессе формирования электровозбудимости, качественные и количественные изменения потенциалозависимых интегральных ионных токов, потенциала покоя и потенциалов действия у развивающихся в культуре скелетных миоцитов лягушки.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1) В процессе развития миоцитов в условиях, запрещающих как деление, так и слияние клеток, при отсутствии нейрональной и эндокринной регуляции, экспрессируются все основные типы потенциалозависимых ионных токов: тетродотоксин-чувствительный натриевый ток, быстрый и медленный кальциевые токи, а также токи через калиевые каналы входящего и задержанного выпрямления.

2) С различной динамикой все эти токи претерпевают количественные изменения.

3) Потенциалозависимый калиевый ток в процессе развития претерпевает не только количественные, но и качественные изменения, касающиеся в основном кинетики инактивации быстрой фазы.

4) Экспрессия медленного

Са тока происходит параллельно увеличению площади Т-системы. Медленные Са -каналы/ДГП-рецепторы, играющие важную роль в процессе электромеханического сопряжения, с самого начала мышечной дифференцировки встраиваются непосредственно в мембраны Т-системы.

5) В процессе развития одиночных миоцитов лягушки на ранних стадиях дифференцировки происходит формирование механизма генерации натриевого потенциала действия.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. Был проведен детальный кинетический и фармакологический анализ интегральных потенциалозависимых ионных токов скелетной мышечной клетки лягушки Rana temporaria на ранних стадиях миогенеза. Показано, что миоциты обладают количественно и качественно изменяющимся в ходе миогенеза набором трансмембранных потенциалозависимых ионных токов через натриевые, кальциевые ДТП-чувствительные и низкопороговые ДТП-нечувствительные, калиевые задержанного и входящего выпрямления каналы. Впервые на эмбриональных скелетных миоцитах лягушки была исследована динамика изменений потенциала покоя и потенциалов действия. Также впервые было показано активирующее влияние 4-аминопиридина, "классического" блокатора потенциалозависимых калиевых каналов, на К+-ток входящего выпрямления.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные данные дают существенный материал для понимания эволюции проводящей функции мышечной мембраны и развития процессов возбуждения и сокращения на ранних этапах миогенеза. Результаты исследования подтверждают, что культивирование одиночных миобластов лягушки дает уникальную возможность широкого изучения онтогенетических аспектов процессов возбуждения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: на 1(Х1) Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996 г.); на 25 Европейской мышечной конференции (Монтпелъе, 1996 г.); на XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.); на 42 ежегодной конференции Биофизического общества (Канзас Сити, Миссури, 1998 г); на 27 Европейской мышечной конференции (Лунд, 1998 г.); на XVII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998

г.)

ПУБЛИКАЦИИ: Основные результаты диссертации отражены в тринадцати публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики, изложения результатов, дискуссии, выводов и списка литературы. Она изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 3 таблицами. Библиография включает 173 наименования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В процессе эмбрионального развития скелетных мышц in vivo недифференцированные клетки должны пройти несколько важнейших этапов. Сначала клетки активно делятся, затем происходит слияние миоцитов в миотрубки, которые образуют контакты с нейронами. Развитие клеток in vitro в значительной степени зависит от условий их культивирования. В нашей лаборатории была разработана оригинальная методика культивирования первичных эмбриональных скелетных миоцитов лягушки (Lukyanenko et al., 1993). В течение 10 дней клетки развиваются в условиях, запрещающих как деление, так и слияние миоцитов в миотрубки. Однако несмотря на такие условия, клетки не только остаются жизнеспособными, но у нас есть основания полагать, что программа миогенеза запущена и до некоторой степени реализуется. Подтверждением этому служат результаты исследования структурной дифференцировки миоцитов (Наследов и др., 1998). Было выявлено, что слияние миоцитов в миотрубки не является необходимым условием образования в мышечных клетках сократительного аппарата с развитыми саркомерами, а также специализированных мембранных структур (Т-системы и триад), обеспечивающих электромеханическое сопряжение. Параллельно со структурно-морфологической специализацией происходят другие важные процессы: активно синтезируются мышечно-специфичные белки, обеспечивающие возбудимость мышечных клеток, экспрессируются мембранные каналы, ответственные за активный и пассивный мембранный транспорт. К 5-6-му дню развития в культуре миоциты приобретают способность сокращаться в ответ на деполяризацию, вызывающую вход кальция через потенциалозависимые Са2+-каналы (Nasledov et al., 1992). Морфологические исследования выявили, что в этот период клетки имеют сформированный

сократительный аппарат и триадные структуры. У культивируемых одиночных миоцитов крысы, не сливающихся в миотрубки, было показано сопряжение процессов возбуждения и сокращения (Constantin et al., 1995), а на эмбриональных миоцитах лягушки Xenopus выявлено, что отсутствие нейронального влияния не препятствует экспрессии Са2+-каналов (Moody-Corbett, Virgo, 1991).

Таким образом, не имеющие контактов с нейронами и не сливающиеся культивируемые миоциты способны достигать довольно продвинутых стадий мышечной дифференцировки, причем последовательность событий in vitro во многом повторяет последовательность in vivo.

Возбуждение в нервных и мышечных клетках обеспечивается движением ионов через ионные каналы клеточных мембран. Ионный канал - это гомо- или гетеромультимерная макромолекулярная трансмембранная пора, обладающая свойством избирательно пропускать тот или иной ион. По принципу избирательности каналы делятся на Na , К , Ca и Cl". По механизму, определяющему открытое и закрытое состояние канала, выделяют потенциалозависимые, лигандуправляемые, механочувствительные и др. каналы (Hille, 1992).

Впервые формальное описание изменений проницаемости возбудимой мембраны было предложено Ходжкиным и Хаксли в работе на гиганском аксоне кальмара (Hodgkin, Huxley, 1952).

Потенциалозависимые ионные каналы мембраны скелетной мышцы.

Прямые измерения трансмембранных ионных токов на мышечных волокнах стали производиться приблизительно с 20-летней задержкой по

сравнению с началом таких исследований нервных волокон. Это было связано с трудностью разработки адекватного метода фиксации потенциала на мышечной мембране. Деполяризация мышечного волокна выше -55мВ вызывает его сокращение. Кроме того, наличие у мышечных волокон Т-системы существенно затрудняет возможность создания удовлетворительных условий пространственной фиксации потенциала. В настоящее время вся полученная информация об ионных токах у скелетных мышц получена с использованием нескольких разновидностей метода фиксации потенциала: методы с применением внутриклеточных микроэлектродов (Adrian et al., 1970а; Adrian, Marshall, 1977); методы с использованием внеклеточных электродов при изоляции малых участков мышечной мембраны с помощью сахарозных (Ildefonse, Rougier, 1972) и вазелиновых мостиков (Hille, Campbell, 1976). В последнее время наиболее популярным и информативным методом исследования ионных токов является метод отведения от участков мембраны при помощи специального стеклянного электрода в условиях высокоомного контакта -пэтч-кламп (Hamill et al., 1981).

Электрическое раздражение мышечного волокна приводит к изменению ионной проводимости мембраны, обусловленному прохождением через натриевые, кальциевые и калиевые каналы токов соответствующих ионов. (Adrian et al., 1970а; Beaty, Stefani, 1976; Sanchez, Stefani, 1978; Stanfield, 1977). Ионная проводимость мышечной мембраны в покое обеспечивается функционированием хлорных каналов и калиевых каналов входящего выпрямления (Hodgkin, Horovicz, 1959; Adrian, Frey gang, 1962). Далее дается более подробное описание каждого из этих типов каналов.

Натриевые каналы

Потенциалозависимые натриевые ионные каналы ответственны за увеличение натриевой проницаемости во время начальной быстрой фазы деполяризации потенциала действия у большинства электровозбудимых клеток. Потенциалозависимый натриевый ток СМВ лягушки - быстрый входящий ток, чувствительный к тетродотоксину (ТТХ - 0.5 мкМ) (Adrian et al., 1970а; Hille, Campbell, 1976). Для описания кинетики INa были использованы формальные выражения модели Ходжкина-Хаксли (Adrian et al., 1970а). Кинетическая модель натриевого канала приведена в работе Хилле и Кэмпбелла (Hille, Campbell, 1976). Согласно модели, натриевый канал - это протеиновый комплекс, состоящий из селективного фильтра, воротного механизма и сенсора напряжения. Натриевый ток достигает пиковых значений обычно в течение 0.5-3.0 мс при Максимальные значения амплитуды 1ка отмечаются при тестирующем потенциале -20 - -30 мВ. После достижения пикового значения In3 быстро инактивируется. Скорость и стационарный уровень инактивации зависят от потенциала. Постоянная времени инактивации (т) при тестирующем потенциале (ЕтеСт), соответствующем максимальному значению амплитуды тока, равна примерно 1.5 мс при

1-5 °С (Mandrino, 1977; Stefani, Chirandini, 1982). Стационарный уровень инактивации (hoo)

изменяется от 1 до 0 в диапазоне потенциалов -100---40 мВ (Adrian et al.,

1970а).

Относительная проницаемость натриевых каналов представлена последовательностью: Na>Li>NH4>K (1: 0.96: 0.11: 0. 048) (Cambpell, 1976). Воротные характеристики и селективность натриевых каналов СМВ у лягушки и у млекопитающих близки (Adrian, Marshall, 1977; Duval, Leoty, 1980; Pappone, 1980).

Показано, что натриевый канал скелетной мышцы млекопитающих состоит из двух белковых субъединиц: а и Рь Следует отметить высокую гомологию белков Na+ - каналов не только разных позвоночных животных, но даже беспозвоночных (дрозофила) и позвоночных, установленную методами молекулярного клонирования (Noda et al., 1984; Trimmer et al., 1989; Salkoff et al., 1987).

К настоящему времени на мышечных волокнах млекопитающих описано 2 типа потенциалозависимых Na+ - каналов, различающихся по чувствительности к тетродотоксину. ТТХ-устойчивые каналы кодируются геном hi и экпрессируются в денервированных волокнах (Trimmer et al., 1989) и в миогенезе. Их плотность достигает максимальных значений вскоре после рождения, после чего очень быстро снижается (Gonoi et al., 1989; Rubo, 1991a,b). ТТХ-чувствительные каналы кодируются fil-геном. Сразу после рождения резко повышается уровень их экспрессии, и их плотность со временем увеличивается в 8-10 раз, достигая величин, характерных для взрослого СМВ (Sherman, Catterall, 1982). У зрелых СМВ лягушки нечувствительных к ТТХ натриевых каналов не обнаружено (Adrian, Marshall, 1977). INa СМВ лягушки не изменяет своих характеристик после денервации (Hencek et al., 1985). На развивающихся культивируемых миоцитах лягушки Xenopus было выявлено, что в процессе миогенеза проводимость (24-28 пС) и время открытого состояния (0.5-0.6 мс при Етест -40мВ) одиночного канала не меняются, параметры активации и инактивации интегрального тока не отличаются от значений аналогичных параметров зрелого СМВ, и также не изменяются со временем культивирования (DeCino, Kidokoro, 1985). В процессе развития СМВ увеличивается амплитуда суммарного тока и частота контактов пипетки с участками мембраны, содержащими Na -канал. Авторы делают вывод, что увеличение амплитуды как 1ма, так и

потенциала действия (ПД) связано с увеличением количества Na+-каналов.

Опыты с детубуляцией СМВ лягушек показали, что натриевые каналы расположены как в поверхностной мембране, так и в мембране Т-системы. По данным разных авторов, плотность их в Т-системе в 2-10 раз меньше, чем в поверхностной мембране (Hille, Campbell, 1976; Jaimovich et al., 1976; Mandrino, 1977).

Большинство данных обо всех ионных токах скелетных мышц было получено на фазных волокнах лягушки и млекопитающих. Величина натриевой хордовой проводимости у тонических мышечных волокнон

о

лягушки (менее 0.02 мС/см ) очень мала по сравнению с фазными волокнами (Gilly, Hui, 1980).

Кальциевые каналы.

Вход ионов Са2+ в клетки считается одним из определяющих факторов в процессе дифференцировки и развития электровозбудимости скелетных мышц (Shainberg et al., 1971; David et al., 1981; Linsell, Moody, 1995). В электровозбудимых клетках вход кальция обеспечивается активацией потенциалозависимых кальциевых каналов (Hille, 1992). К настоящему времени на разных объектах описано большое количество

94-

типов потенциалозависимых Ca -каналов (Tsien et al., 1987; McDonald et al., 1994). На зрелых СМВ лягушки показано наличие двух типов 1Са: ДТП-чувствительный lea L-типа и нечувствительных к дигидропиридинам быстрого lea Т-типа (Hencek et al., 1988) или быстро активирующегося и неинактивирующегося при длительной деполяризации Ica (Cota, Stefani., 1986, Garcia, Stefani, 1987).

Медленный Ica L-типа лягушки имеет порог активации -40 —30 мВ, достигает пиковых значений амплитуды в течение 100-700 мс и затем

медленно инактивируется с постоянной времени 1-20 сек при температуре 15-20° С (Stanfield et al., 1977; Sanchez, Stefani, 1983; Cota, Stefani, 1989; Aimers et al., 1981; Avila-Sakar et al., 1986; Hencek et al, 1988; Gyorke, Nasledov, 1987). По данным разных авторов, постоянная времени инактивации варьирует от 1 до 20 сек при температуре 15-20° С, а середина кривой стационарной инактивации - в пределах -50 -35 мВ (Stanfield et al., 1977; Sanchez, Stefani, 1983; Gyorke, Nasledov, 1987; Cota et al., 1984).

Медленный ICa обладает особой чувствительностью к дигидропири динам. В концентрациях 50-300 мкМ внеклеточное приложение нифедипина полностью устраняет, а применение ВауК 8644 или CGP увеличивает L- Са ток на 40-200% (Aimers, Palade, 1981; Fosset et al., 1983, Shvinka et al., 1990). Селективность Са -каналов L-типа характеризуется последовательностью относительной проницаемости для

| fy | /у r\ I

двухвалентных катионов: Ва > Sr > Са > Mg (Aimers, Palade, 1981; Hess et al., 1986). Отмечено, что при эквимолярной замене ионов

Са

на

Ва амплитуда тока через L-каналы увеличивается в 1.5 - 5 раз (Aimers, McCleskey, 1984; Cota, Stefani, 1989). Эксперименты на детубулированных при помощи глицерина СМВ позволили выявить, что в зрелых скелетно-мышечных волокнах медленные ДТП-чувствительные Са2+ каналы преимущественно локализованы в мембранах Т-системы (Aimers et al., 1981; Fosset et al., 1983; Nicola-Siri et al., 1980).

Рядом авторов подчеркивается сходство характеристик L- тока лягушки и млекопитающих (Donaldson, Beam, 1983; Gonoi, Hashegava 1988; и др.). Молекулярный анализ L-кальциевого канала скелетной мышцы кролика показал, что канал является комплексом из 5 субъединиц (Catterall et al., 1988). Молекулярная структура и биохимические характеристики ai-субъединицы Са2+-канала L-типа во многом сходны с

таковыми потенциалозависимого Na-канала (Tanabe et al., 1987; Hosey, Lazdunski, 1988).

На эмбриональных и неонатальных клетках и волокнах скелетно-мышечной ткани животных различных видов было показано присутствие 2-х типов кальциевых токов - быстрого и медленного (Beam et al., 1986; Cognard et al, 1986; Beam, Knudson, 1988; Gonoi, Hasegava, 1988; Kano et al, 1989; Moody-Corbett et al., 1989). У зрелых мышц мыши (Gonoi, Hashegava, 1988) и птиц (Капо et al, 1989) остается только ДТП-чувствительный L- 1са. В зрелых мышцах человека экспрессируется быстрый Т- и медленный L- Ica (Rivet et al., 1992). На культивируемых миоцитах человека также показано наличие третьего типа 1са, по кинетическим характеристикам близкого к нейрональному току N-типа, но нечувствительного к специфическому блокатору каналов N-типа -омега-конотоксину (Rivet et al, 1992). На взрослых волокнах лягушки помимо lea L-типа присутствуют нечувствительные к дигидропиридинам быстрый lea Т-типа (Hencek et al., 1988) или быстро активирующийся и неинактивирующийся при длительной деполяризации Ica (Cota, Stefani, 1986, Garcia, Stefani, 1987). У эмбриональных скелетных миоцитов Xenopus, кроме L-тока, был выявлен 1Са - Т-типа (Moody-Corbett et al., 1989). Этот ток встречался относительно редко только в присутствии во внутриклеточном растворе АТФ.

На зрелых волокнах лягушки и крысы наличие быстрого 1са связывают с возможностью генерации кальциевых ПД (Beaty, Stefani, 1976; Chiarandini, Stefani., 1983). Однако на эмбриональных миоцитах Xenopus кальциевых ПД зарегистрировано не было (DeCino, Kidokoro, 1985), что объясняют низкой частотой встречаемости клеток с быстрым lea (Moody-Corbett et al., 1989). Ряд авторов считает, что на ранних стадиях мышечной дифференцировки вход кальция через потенциалозависимые каналы является решающим фактором в развитии электровозбудимости и

экспрессии других типов потенциалозависимых каналов (David et al., 1981; Moody-Corbett et al., 1989; Linsell, Moody, 1995). Высказывается и другая точка зрения - вход кальция через потенциалозависимые каналы участвует в регуляции процессов дифференцировки не напрямую, а опосредованно, активируя Са2+-зависимые К+-каналы, что приводит к

о«

гиперполяризации мембраны и усилению движущей силы .для ионов Ca (Shin et al., 1996, 1998). У культивируемых одиночных миоцитов крысы, не сливающихся в миотрубки, было показано сопряжение процессов возбуждения и сокращения (Constantin et al., 1995); авторы делают вывод, что процесс слияния не определяет экспрессию ДТП-чувствительных Ca

-каналов. На эмбриональных миоцитах лягушки Xenopus было выявлено, что отсутствие нейронального влияния не препятствует экспрессии

Ca

-каналов (Moody-Corbett, Virgo, 1991). Потенциалозависимые калиевые каналы.

Суперсемейство потенциалозависимых К+-каналов включает в себя большое число типов с широким спектром кинетических и фармакологических характеристик. Молекулярно-генетической основой этого многообразия является существование нескольких локусов, контролирующих синтез а-субъединиц К+-каналов (Pongs, 1992, Pongs, 1993, Ribera, 1990, Takumi, 1993, Warmke et. al., 1991). Разнообразие в пределах семейства определяется большим числом вариантов альтернативного сплайсинга для каждого из локусов, формирование канала как гомо- или гетеротетрамера (McCormac et al., 1990) и модификацией канала в результате интеграции с инактивационной ß-субъединицей (Murell-Landago, Aldrich, 1993, Wittka et al., 1991), а также модулирующими влияниями различного происхождения (Bretweiser, 1996; Ernsberger, Spitzer, 1995).

В соответствии с основными кинетическими и фармакологическими различиями на феноменологическом уровне выделяют два основных типа потенциалозависимых каналов (Rudy, 1988):

1) каналы А-типа, быстро активирующиеся и быстро инактивирующиеся, как правило, характеризующиеся высокой чувствительностью к ингибирующему действию 4-аминопиридина (4-АП) (Camacho et al., 1996);

2) каналы задержанного выпрямления, с широким спектром кинетических характеристик, чувствительные к ингибирующему действию тетраэтиламмония (ТЭА) (Stanfield, 1970), ионов Ва (Armstrong, Taylor, 1980, Eaton, Brodwick, 1980; Armstrong et al, 1982) и 4-АП (Pichon et al., 1981; Choguet, Korn, 1992). Условно этот тип можно разделить на две группы: а) инактивирующиеся каналы и б) каналы с чрезвычайно медленной инактивацией или полным ее отсутствием. В пределах этого типа фармакологические свойства могут существенно варьировать.

В отдельный класс выделяют каналы, активность которых зависит как от потенциала, так и от внутриклеточной концентрации свободного Са2+.

Все указанные типы каналов характеризуются высокой селективностью по отношению к ионам К+, типичным для них является следующий ряд относительных проницаемостей: Tl+>K+>Rb+>NH4+»Na+.

В зрелой скелетной мышце лягушки интегральная калиевая проводимость определяется функционированием по крайней мере двух типов потенциалозависимых ионных каналов со свойствами задержанного выпрямления: один из них по активационным характеристикам близок к каналам в гигантском аксоне кальмара, но инактивируется с постоянной времени 500-1000 мс, второй тип канала характеризуется медленной активацией (2-3 сек) и за время 7-10 сек инактивируется только частично

(Adrián et al, 1970a; Adrián et al., 1973; Stanfield, 1970; Lynch, 1985). Кроме того, в мембране Т-системы доказано присутствие К-каналов А-типа (Camacho et al., 1996).

Характеристики (и/или набор) К+-каналов зрелых СМВ различаются не только в зависимости от вида животного, но и конкретного типа мышцы (Adrían et al., 1970a,b; Gilly, Huí, 1980; Lynch, 1985).

В эмбриональных клетках различного происхождения и клетках тканей в процессе постнатального развития разными авторами отмечается присутствие калиевых каналов, по числу типов или характеристикам отличных от К+-каналов в зрелых тканях (Davies et al., 1996; Lukyanenko et al., 1993; Xu et al.,1996;). При этом изменение "набора" и/или смена доминирующего типа коррелирует с критическими стадиями эмбрио- или морфогенеза (Davies et al., 1996; Kilborn and Felida., 1990; Winckenden et al., 1997; Zemkova et al., 1989).

На эмбриональных миоцитах Xenopus были выявлены 4 типа потенциалозависимых К+-каналов (Moody-Corbett, Gilbert, 1989). По кинетическим характеристикам быстро инактивирующийся ток, появляющийся на поздних сроках культивирования (Ribera, Spitzer, 1991), отличается от зарегистрированных в зрелом СМВ (Ernsberger, Spitzer, 1995).

Ранее на миоцитах Rana temporaria были описаны 9 компонентов потенциалозависимого 1к, различающихся по времени достижения пика: быстрая группа с временем достижения пика менее 70 мс и выраженной инактивацией (5 компонентов), а также медленная группа с медленной инактивацией (или полным ее отсутствием) и временем достижения пика 1-7 секунд (Lukyanenko et al., 1993). Компоненты быстрой группы характеризуются более высокой чувствительностью к блокирующему действию ТЭА, а медленная группа токов более чувствительна к 4-АП. Частота встречаемости отдельных компонентов зависела от стадии

развития клетки. Ни один из выявленных компонентов по совокупности характеристик не может быть отождествлен с быстрым или медленным 1к зрелого СМВ.

Калиевые каналы входящего выпрямления.

К+-каналы входящего выпрямления (ERK), АТФ-чувствительные (Кдтр) и G-белок активируемые (GIRK) калиевые каналы относятся к одному семейству Kir. Если G-белок активируемые каналы найдены только в клетках мозга, сердца и гладкомышечных клетках (Quayle, 1997), то в отношении Кдтр и собственно каналов входящего выпрямления есть сведения об их экспрессии в скелетных мышцах (Inagaki et al., 1995, Kubo et al., 1993). Ион-проводящие участки этих типов каналов обладают сходной молекулярной структурой (Quayle, 1997). Каналы этого семейства характеризуются высокой калиевои избирательностью, особой чувствительностью к блокирующему действию ионов бария и слабой чувствительностью к блокаторам потенциалозависимых К+-каналов (Quayle, 1997, Standen, Stanfield, 1978; Shien et al., 1998). Эта каналы также потенциалозависимым образом блокируются цезием (Gay, Stanfield, 1977; Senyk, 1986).

Калиевые каналы входящего выпрямления проводят входящие токи при потенциалах отрицательнее чем К+ потенциал реверсии (Ек). Выходящие токи при потенциалах положительнее Ек характеризуются значительно меньшей амплитудой (Hille, 1992). Это свойство К+-каналов входящего выпрямления определяет их участие в формировании потенциала покоя и контроле возбудимости клеток многих тканей. К настоящему времени было описано два механизма, которые определяют выпрямляющие свойства каналов данного типа. Первый механизм -потенциалозависимое блокирование внутриклеточными Mg (Matsuda et

al., 1987; Vandenberg, 1987) и полиаминами (Fickler et al, 1994; Lopatin et al, 1994; Aleksandrov, 1996). Эти наблюдения находятся в соответствии с гипотезой, что входящее выпрямления вызывается блокирующей пору внутриклеточной частицей (Hille, Schwarz, 1978). Второй, только недавно

TT СС о

предложенный механизм - это рН-зависимыи внутренний воротный механизм, определяющий инактивацию токов выходящего направления, независимый от внутриклеточных Mg и полиаминов (Shien et al., 1996;).

Принципиальное различие в пределах семейста Kir касается механизмов, определяющих вероятность открытого состояния канала. Для АТФ-зависимых каналов основным управляющим фактором, снижающим вероятность открытого состояния, является увеличение внутриклеточной концентрации АТФ. Обычно они обладают слабо выраженным выпрямлением. Кдп^канал формируется как гетеромультимер из порообразующей субъединицы подсемейства Kir 6.0 и субъединицы SUR, самой по себе не обладающей канальной активностью и являющейся одновременно рецептором к производным сульфонил мочевины и АТФ-связывающим белком, принадлежащим к суперсемейству АТФаз (Aguilar-Bryan et al., 1995; Inagaki et al., 1996). Наличие рецептора к производным сульфонил мочевины у АТФ-зависимых каналов позволяет произвести фармакологическое разделение в пределах семейства Kir (Ashcroft, Ashcroft, 1992).

Повышение уровня потенциала покоя в процессе миогенеза показано для многих видов животных (Brodie et al.,1985; Fischbach et al., 1971; Ritchie, Fambrough, 1975; Spector, Prives, 1977; Shin et al., 1997; Liu et al., 1998). Было выявлено, что электрогенная Na+/K+ - АТФаза вносит вклад в мембранный потенциал покоя культивируемых миотуб и увеличение ПП сопровождается увеличением электрогенного компонента (Brodie et al., 1985). Ричи и Фэмбруг (Ritchie, Fambrough, 1975) впервые

показали, что в процессе ранней мышечной дифференцировки увеличение ПП происходит благодаря увеличению пассивной проницаемости мембраны для ионов К+ по отношению к ионам Na+. Для культивируемых миоцитов цыпленка было показано, что величина проницаемости в покое Рка/Рк , рассчитываемая по уравнению Гольдмана-Ходжкина-Катца, снижалась примерно в 4 раза от стадии миобласта до стадии слияния в м йоту бы, при весьма несущественном значении Pq/Pk <0.001 на всех исследованных стадиях (Shin et 1., 1997). Авторы делают вывод, что основной вклад в увеличение потенциала покоя вносит ток через каналы входящего выпрямления. Блокирование lir существенно снижало ПП, в результате чего клетки становились неспособны к слиянию. Сходные результаты были получены на миоцитах человека (Liu, 1998).

К настоящему времени накоплен обширный фактический материал, всесторонне охватывающий проблему электровозбудимости скелетномышечной ткани. Механизмы, обеспечивающие электрогенез у зрелых клеток, развиваются постепенно в ходе онтогенеза соответствущих клеток. При этом изучение мышечных клеток особенно интересно, поскольку электрогененез здесь связан с инициацией процесса сокращения, и имеет более сложную, чем, например, в нервных клетках, пространственную организацию, благодаря развитию системы поперечных трубочек. Большой прогресс достигнут в изучении становления электровозбудимости в миогенезе. Однако сведения носят разрозненный характер; в исследованиях использовались различные объекты и методические подходы, в основном исследователи

сосредотачивались на изучении одного конкретного типа каналов на определенных стадиях развития. Интерпретация результатов часто усложнялась, так как не были запрещены слияние миоцитов в миотубы и установление контактов с нейронами. Первой нашей задачей было выяснить, до какой степени система электрогенеза может развиться на одиночной клетке без слияния в миотубы и насколько экспрессия ионных каналов, обеспечивающих электровозбудимость, определяется миогенными факторами, не связанными с нервной или эндокринной регуляцией.

По набору и уровню экспрессии потенциалозависимых ионных каналов, определяющих электровозбудимость клетки, миоциты лягушки могут отличаться от зрелых скелетно-мышечных волокон. Кроме того, в процессе раннего развития и набор, и уровень экспрессии каналов может существенно изменяться. Следующей нашей задачей явилось проследить последовательность событий в процессе формирования электровозбудимости у миоцитов, качественные и количественные изменения потенциалозависимых интегральных ионных токов, потенциала покоя и потенциалов действия.

МЕТОДИКА И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование клеток. Для получения первичной моноелойной культуры скелетно-мышечной ткани лягушки производилось искусственное осеменение икры лягушек Rana temporaria. Эмбрионы отбирались на стадии ранней нейрулы. После стерилизационной обработки производили хирургическое выделение дорсального участка эмбриона, включающего в себя мезодерму. Выделенные участки эмбрионов переносили в диссоциирующий раствор следующего состава (в мМ): NaCl 50; КС1 0.7; КН2Р04 0.9; NaHP04 16; NaHC03 2.4; EDTA 1.9 (Freed, Mezger-Freed, 1970). Через 10 мин инкубации, предварительно отделив эктодерму, диссоциированные клетки мезодермы переносили в чашки Петри диаметром 40 мм, заполненные 4 мл культуральной питательной среды следующего состава: 55% среды 199М (Инст. Полимиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва), 10% бычьей эмбриональной сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Раствор приготавливали на деионизированной дистиллированной воде. Операционный раствор отличался от культурального пониженным (до 2%) содержанием сыворотки. Использование среды 199М предотвращало деление (Teylor-Papadimitrou, Rozengurt, 1979), а повышенное содержание сыворотки -слияние клеток при редком посеве (DeCino, Kidokoro, 1985). Работы по приготовлению культуры производились в камере с ламинарным потоком стерильного воздуха КОН-Г.

Первичная культура выращивалась на покровных стеклах, обработанных следующим образом: алмазным карандашом стекла нарезались на квадраты (сторона квадрата - 4 мм), затем стекла выдерживались 1 час в бихромате калия, тщательно промывались в

проточной и дистиллированной воде, после чего выдерживались 30 минут в одномолярном растворе ЫаОН и снова тщательно промывались. До использования стекла хранились в этиловом спирте (ректификат).

После посева чашки Петри содержались в термостате при температуре 20" С. Прикрепление клеток к поверхности стекла происходило примерно через сутки. С этого момента отсчитывалось время культивирования. В экспериментах использовали одиночные миоциты 1-10 дня культивирования, не имевшие контактов с другими клетками (Рис. 1). Для измерения длины и ширины клеток "использовали инвертированный световой микроскоп Биолам П-1. Увеличение светового микроскопа определяли при помощи стандартной измерительной линейки (1 деление = 0.1 мм).

? »

№

в

«

Р • с

35»к м

Рис. 1. Типичный миоцит 4-го дня культивирования.

Регистрация потенциалозависимых ионных токов и изменений мембранного потенциала. Интегральные токи в ответ на одиночные прямоугольные стимулы и линейно изменяющееся напряжение (0.005-0.5 мВ/мс, пилообразный стимул) регистрировали с помощью метода фиксации напряжения на целой клетке при плотном контакте (whole cell, Hamill et al., 1981). Постоянный поддерживаемый потенциал варьировали от -60 до -80 мВ. Величину потенциала покоя и изменения мембранного потенциала в ответ на стимуляцию постоянным током регистрировали в режиме фиксации тока. Использовали усилители Рок ЗМ (Россия) и List-7 (Medical Systems, Германия), сопротивление обратной связи 0.5-10 ГОм. Высокочастотные шумы до ввода в компьютер удалялись фильтром Бесселя второго порядка с полосой пропускания 3 кГц. Считывание данных производили при помощи АЦП с частотой 0.01-10 кГц (т.е. квант считывания от 100 мкс до 100 мс). 12-ти разрядные цифро-аналоговый и аналого-цифровой преобразователи собраны на кафедре биофизики биолого-почвенного факультета СПбГУ из деталей отечественного производства. Схема системы регистрации приведена на Рис. 2.

Микропипетки изготавливались из мягкого стекла С52 в три приема на установке для вытягивания микроэлектродов МЭ-4. Затем кончик пипетки оплавлялся так, чтобы его внутренний диаметр был равен примерно 1,5 - 2 микрометра. Сопротивление кончика пипетки составляло 3-5 МОм. Для регистрации трансмембранных ионных токов стекло с миоцитами помещали в экспериментальную камеру объемом 0.1 мл, заполненную наружным раствором. Под визуальным контролем с использованием инвертированного микроскопа с помощью микроманипулятора пипетка подводилась к наиболее широкой центральной части миоцита. При создании в микропипетке отрицательного давления между ее кончиком и мембраной клетки образовывался высокоомный контакт (более 5 ГОм). Запись данных в

компьютер IBM 486 и хранение производились при помощи программного пакета Clamp 5, разработанного на кафедре биофизики биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Для обработки данных использовали пакет MicroCal Origin 4.0.

Рис. 2. Схема установки для регистрации интегральных ионных токов миоцигов. 1) инвертированный микроскоп, 2) предметный столик-позиционер, 3) экспериментальная камера, 4) микропипетка, 5) держатель микропипетки, к которому подсоединяется система контроля давления, 6) выносная головка усилителя с сопротивлением обратной связи, 7) микроманипулятор, 8) источник света, 9) усилитель, 10) электростимулятор, 11) АЦП, 12) осциллограф С1-83, 13) компьютер IBM 486, 14) экранирующая камера.

В качестве стандартного внутрипипеточного использовали раствор (в мМ): KCl 110, СаС12 1, MgCl2 1, K2EGTA 10, HEPES-KOH 8, pH 7.2. Для регистрации входящих натриевых и кальциевых токов применяли раствор, в котором 110 мМ KCl были эквимолярно замещены на 60 мМ CsCl и 50 мМ ТЕАС1. В качестве основного наружного использовали раствор (в мМ): NaCl 120; KCl 1.5; СаС12 2; HEPES-NaOH 8; pH 7.4. Растворы с повышенной концентрацией К+ (5 - 110 мМ) приготовляли путем эквимолярного замещения NaCl на KCl. Исследуемые агенты: 4-аминопиридин ("Fluka"), верапамил ("Sigma"), хинидин ("Sigma"), глибенкламид ("Sigma"), тетродотоксин ("Sankyo"), нифедипин ("Sigma"), ВауК 8644 ("Merk"), амилорид ("Sigma"), омега-конотоксин ("Sigma") и ВаС12 растворяли в соответствующем наружном растворе. При необходимости применяли внутриклеточные растворы, содержащие 5-10 мМ MgATO ("Sigma") и 50-300 мкМ TTOyS ("Sigma").

Средние величины параметров, представленных в разделе "Результаты и их обсуждение", приведены с ошибкой среднего и рассчитывались по методике, описанной в литературе (Лакин, 1980). Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Динамика изменений площади поверхностной мембраны и мембраны Т-системы миоцитов в процессе развития.

TV w

В результате исследовании с использованием световой микроскопии было установлено, что после прикрепления к стеклу миоциты приобретают характерную вытянутую симметричную веретенообразную форму (Рис. 1). В условиях разреженной культуры они не имеют контактов друг с другом. С увеличением срока культивирования ширина клеток в центральной части меняется незначительно (12-14 мкм), в то время как длина увеличивается от 80 мкм на 1 сутки до 250 к 10-м (Рис. 1). Полученные данные позволяют для оценки площади поверхности миоцитов (SM) использовать формулу для геометрического тела, ограниченного двумя конусами. Принимая во внимание эллиптическую форму поперечного сечения и тот факт, что длина клетки много больше ширины, оценка SM может быть получена из формулы: SM = 7il(R + 3/4R)/2 [1]

где R - радиус поперечного сечения центральной части клетки, 1 - длина

-6 6 2

клетки. Средние значения SM возрастают от 13,6*10 до 47*10" см от 1-го к 10-му дню (Табл. 1).

Площадь мембраны также может быть вычислена из значений клеточной емкости (Скл), принимая величину удельной емкости за 1 мкФ/см , характерную для биологических мембран (Marty, Neher, 1983). Известно, что Скл, вычисляемая методом интегрирования тока переходного процесса, представляет собой сумму емкостей поверхностной мембраны и мембран системы поперечных трубок (Ribera, Spitzer, 1991).

Разница между морфометрической оценкой Бм, и Б, вычисленной из Скл, есть не что иное, как площадь мембраны Т-системы (8Т). Значения Бм и 8Т по дням культивирования, представленные в Табл.1, использовались нами для оценки удельных ионных проводимостей и плотностей токов. В нашей лаборатории на одиночных культивируемых миоцитах параллельно были проведены электронно-микроскопические исследования развития сократительного аппарата и внутриклеточных мембранных структур, обеспечивающих электромеханическое сопряжение (Наследов и др., 1998). Результаты электрофизиологической оценки относительной площади Т-системы (8Т/8М), и данные морфологических исследований, приведенные для сравнения в Таблице 1, для миоцитов начиная с 6-го дня находятся в хорошем соответствии. Однако, в отличие от морфологического, электрофизиологический метод позволяет выявить наличие Т-системы лишь начиная с 4-го дня.

Таблица 1. Изменения размеров, клеточной емкости, и площади Т-системы миоцитов в процессе дифференцировки.

Возраст, дни

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Я, мкм (п>40) 6.23Ю.08 6.15±0.09 5.71+0.08 6.42±0.07 6.50±0.07 6.78+0.07 6.80±0.07 6.80+0.08 7.05+0.09 7.00+0.09

1, мкм (п>40) 79±5 124+5 148+5 170+7 185±7 202+8 215+7 224+6 231±6 235±8

Бм 10"6 см2 13.6+1.1 21.4+0.7 24.5Ю.6 29.5+1.3 32.1+1.6 34.7±0.9 37.3±1.5 39.03+2.1 39.9±2.7 40.8+3.2

Скя пФ 13.8+1.6 п=6 21.611.5 п=8 26.2+1.6 п=8 34.5±0.9 п=7 37.9+0.8 п=5 43.4+2.6 п=6 50.1+3.9 п=8 52.8+3.6 п=12 53.7±5.5 п=5 56.0+4.9 п=6

8т 10"6 см2 0.15+0.24 0.2Ю.18 2.5±1.2 5.7+0.4 6.5+0.8 9.4±1.3 14.6±1.1 14.9+1.7 14.2±2.4 15.6±0.7

йт/йм 0.01+0.02 0.02±0.02 0.10+0.05 0.19±0.09 0.19+0.03 0.27±0.10 0.37±0.07 0.38+0.11 0.36+0.12 0.39+0.09

^внут^^нар 0.07±.0.06 0.13+0.08 0.25+0.02 0.28+0.06 0.28+0.11 0.41+0.13 0.45±0.16

Радиус (Д), длина (1) клеток и отношение площади внутриклеточных

с» ч> ч>

мембран, имеющих контакт с наружной средой, к площади наружной мембраны (8внут/8нар) - данные морфологических исследований; Бм -площадь поверхностной мембраны, вычисленная при помощи уравнения [1], Скл - клеточная емкость; Бт - площадь Т-системы, полученная как разность между Бм и площадью клеточных мембран, вычисленной из Сш, принимая величину удельной емкости 1 мкФ/см ; 8т/8м - предполагаемая относительная площадь Т-системы. (* - цит. по Наследов и др., 1998)

Исследование основных свойств трансмембранных ионных токов миоцитов.

В течение первых 5-6 суток культивирования у миоцитов

наблюдается экспрессия всех основных типов потенциалозависимых

ионных токов. На Рис. ЗА представлены типичные записи интегрального

ионного тока миоцита 7-го дня. Быстрый входящий компонент является

натриевым током и может быть ингибирован при аппликации 1 мкМ ТТХ

(Рис. ЗБ). Выходящий компонент является суммарным током через

калиевые каналы и полностью устраняется последующим приложением

10 мМ 4-аминопиридина (Рис. ЗВ). Остаточный медленный входящий

компонент является током через кальциевые каналы. Динамика

экспрессии этих токов в процессе развития различна.

Рис. 3. Типичные записи интегрального ионного тока у миоцита 7-го дня

(A) - интегральные ионные токи в стандартном внеклеточном растворе, зарегистрированные в ответ на деполяризующие стимулы (Етест) ДО -20, -10, и 0 мВ от поддерживаемого потенциала (Еп) -80 мВ. Прослеживаются быстрый входящий INa, выходящий 1к, и медленный входящий 1Са. (Б) - интегральные ионные токи после аппликации 1 мкМ ТТХ. Быстрый входящий компонент блокирован. Временная шкала для (А) и (Б) нелинейна, длительность тестирующих стимулов 2 сек.

(B) - интегральные токи в присутствии ТТХ и 10 мМ 4-АП. Присутствует лишь медленный входящий компонент, являющийся суммарным током через медленные и быстрые Са2+-каналы.

Натриевый ток.

Быстрый входящий ток наблюдался только в присутствии ионов Na+ в наружной среде. Поскольку этот компонент полностью блокировался ТТХ в концентрациях до 1 мкМ (Рис. ЗБ), он был квалифицирован как натриевый теродотоксин-чувствительный ток. В течение всего наблюдаемого периода в культуре ТТХ-нечувствительного 1на у миоцитов зарегистрировано не было. Основные кинетические характеристики INa миоцитов остаются неизменными в процессе культивирования. На Рис 4А представлена усредненная пиковая вольт-амперная характеристика, нормированная к максимальному значению амплитуды тока. Исходя из наклона правой ветви ВАХ, потенциал реверсии 1ма в нормальных ионных условиях составляет в среднем 50 мВ. Хордовая проводимость вычислялась по формуле: GNa= 1ыа/(Е-Ег^а). Усредненные значения нормированной хордовой проводимости, представленные на Рис. 4Б, были аппроксимированы в соответствии с уравнением Больцмана:

G(E)/GMaKC-l/{l+exp[(E-Eo.5)/h]} [2]

где Ео.5 - потенциал соответствующий значению функции 0.5, h -фактор крутизны наклона (в мВ). Значения параметров, обеспечивающих наилучшее соответствие: Е0.5= -18.22 мВ, h=10.14 мВ. Диапазон времени достижения пиковых значений амплитуды от момента подачи стимула варьировал от 0.5 до 10 мс в зависимости от величины тестирующего потенциала (Рис. 4Б). Значения стационарной инактивации были получены при использовании кондиционирующих потенциалов (Ек0Нд) длительностью не менее 1 секунды (Рис. 4В). Усредненные данные были аппроксимированы в соответствии с уравнением Больцмана (Уравнение 2): Е0.5— -61.6 мВ, h= 7.65 мВ (Рис. 2В). На Рис. 4В также приведены значения постоянной времени инактивации (тин) в зависимости от потенциала.

Рис. 4. Кинетические характеристики тока миоцитов.

Е, мВ

-80 -40 0 40

(А) - усредненная пиковая ВАХ, нормированная к максимальному значению амплитуды; (Б) - время достижения пика (1, белые треугольники) и нормированная к максимальному значению хордовая проводимость (0/0маКс, черные кружки); (В) - стационарная инактивация (Ъоо, белые кружки) и постоянная времени инактивации 1Ка (хин, черные треугольники). п>20.

По своим кинетическим и фармакологическим характеристикам, 1ма эмбриональных миоцитов Rana temporaria идентичен ТТХ-чувствительному INa, описанному у зрелого СМВ лягушки (Adrian et al., 1970а; Campbell, Hille, 1976) и у эмбриональных миоцитов шпорцевой лягушки (DeCino, Kidokoro, 1985).

Кальциевые токи.

Входящие кальциевые токи могут быть зарегистрированы практически во всех клетках, начиная с 4-го дня при использовании для подавления 1к внутриклеточных растворов, где К+ замещен на ионы Cs+ и/или ТЭА+, или внеклеточного приложения калиевых блокаторов (Рис. 3). Как правило, в клетке одновременно присутствуют два типа 1са, различающиеся по кинетическим и фармакологическим свойствам. На Рис. 5А представлено фармакологическое разделение компонентов 1Са при помощи нифедипина. Нифедипин-нечувствительный компонент отличается более низким порогом активации (Рис. 5Б). На Рис. 5В приведены кривые стационарной инактивации быстрого (Е0.5= -49.7 мВ, h= 8.9 мВ) и медленного (Е0.5=-43.9 мВ, h=8.7 мВ) токов. Постоянные времени инактивации в зависимости от потенциала быстрого Ica (Icaf) варьируют в диапазоне 70 - 450 мс, тогда как медленного Ica (leas) - от 1 до 5 сек. Дигидропиридин-чувствительные Ca -каналы характеризуются

2~ь 2+

высокой проницаемостью для ионов Ва . Проницаемость для ионов Ва и Са2+ ДГП-нечувствительных каналов примерно одинакова.

Рис. 5. Два типа Са2+ - токов миоцитов.

Е, мВ

-80 -60 -40 -20 0 20

Е, мВ

(А) - интегральные ионные токи миоцита 9-го дня, зарегистрированные при использовании внутрипипеточного раствора, содержащего 60 мМ Cs+ и 50 мМ TEA для устранения выходящих калиевых токов, и наружного раствора с 1 мкМ ТТХ для устранения 1ка, до (кривая 1) и после (кривая 2) приложения 300 мкМ нифедипина. Етест -20 мВ, Еп -80 мВ. Кривая (3) -разность кривых (1) и (2), представляющая ДТП-чувствительный Са -ток. (Б) - ВАХ зарегистрированные до (треугольники) и после приложения нифедипина (белые кружки), а так же разница между ними (черные кружки). (В) - Стационарная инактивация (Ь* , кружки) и постоянная времени инактивации (тин, треугольники) медленного 1са (черные символы) и быстрого 1са (белые символы), п для каждой точки >10. Стационарную инактивацию исследовали, используя Ек0Нд длительностью 30 сек., Еп -80 мВ. Усредненные данные были аппроксимированы в соответствии с уравнением Больцмана (Уравн. 2). Для ICaf Ео.5= -49.7 мВ, h= 8.9 мВ; для Icas Ео.5=-43.9 мВ и h=8.7 мВ.

По своим кинетическим и фармакологическим свойствам ICas соответствует току через дигидропиридин-чувствительные каналы L-типа и идентичен описанному у взрослого СМВ лягушки (Stefani, Chirandini, 1982; Sanchez, Stefani, 1983) и у эмбриональных миоцитов Xenopus (Moody-Corbett et al., 1989) L-току.

leaf нечувствителен к блокатору каналов Т-типа - амилориду (1 мМ, n=7; Tang et al., 1988) и N-типа - омега-конотоксину GVIA (100 мкМ, п=4; Keith et al., 1989). По кинетическим и фармакологическим характеристикам ICaf не соответствует ни одному из описанных в литературе типов Са2+-токов.

Потенциалозависимые калиевые токи.

Изменения кинетических характеристик 1к в процессе развития.

Ранее у эмбриональных миоцитов лягушки были описаны 9 компонентов потенциалозависимого 1к, различающихся по времени достижения пика: быстрая группа с временем достижения пика менее 70 мс и выраженной инактивацией (5 компонентов), а также медленная группа с медленной инактивацией (или полным ее отсутствием) и временем достижения пика 1-7 секунд (Lukyanenko et al., 1993). В отличие от натриевого и кальциевых токов, 1к в процессе культивирования претерпевает качественные изменения. На уровне анализа суммарного калиевого тока эти изменения относятся в основном к скорости инактивации в составе быстрой фазы: у миоцитов более поздних сроков наблюдается значительно более быстрая инактивация, в то время как по скорости активации различий практически не наблюдается (Рис. 6А,Б). Кроме того, доля неинактивирующегося или инактивирующегося

чрезвычайно медленно 1к (Ik®) падает от 35-50% на 2-е сутки до 10-15 к 67-м суткам. На Рис. 6В. представлены кривые ЫХНк» в полулогарифмическом масштабе, нормированные к максимальному значению, соответствующие записям токов на Рис.бА у миоцитов 4-го (1) и 8-го (2) дня культивирования при Етест 0 мВ. Сплошные линии соответствуют аппроксимации кривых экспоненциальной функцией [A'exp(-t/Tiffl)]. Экспериментальные данные для миоцита 8-го дня достаточно хорошо описываются экспоненциальной функцией при значении постоянной времени инактивации т^ = 88 мс. Инактивация миоцита 4-го дня более медленная (тин = 234 мс). Очевидно, что кинетика инактивации не является моноэкспоненциальной, но может быть удовлетворительно аппроксимирована суммой двух экспонент (Ai=0.64, тин1=89 мс; А2=0.36, тш2=492 мс). В большинстве экспериментов кинетика инактивации не являлась моноэкспоненциальной. В связи с этим в качестве характеристики скорости инактивации в целом было выбрано время спада до половинного уровня от максимального значения 1к (to s)-Средние значения этого параметра уменьшаются более чем в 25 раз от 2-го до 5-го дня культивирования и остаются практически неизменными вплоть до 8-го дня (Рис. 6Г).

Рис. 6. Типичные записи интегрального калиевого тока миоцитов на различных стадиях культивирования.

(A) - Типичные записи 1к миоцитов 2-го, 4-го и 8-го дня культивирования. (Б) -те же записи 1к, что и на (А) для миоцитов 2-го и 4-го дня в другой временной шкале. Еп -80 мВ. Етест от -30 до 0 мВ, шаг 10 мВ. Наружный раствор содержал 3 мкМ ТТХ и 300 мкМ нифедипина.

(b) - кривые IK(t) - к» в полулогарифмическом масштабе, нормированные к максимальному значению, соответствующие записям токов на (А) у миоцитов 4-го (1) и 8-го (2) дня культивирования при ЕТеСт 0 мВ. Сплошные линии соответствуют экспоненциальным функциям с постоянными времени 234 мс (1) и 88 мс (2).

(Г) - Изменения времени спада до половинного уровня от пикового значения тока при ЕТеСт вблизи 0 мВ (to s) по дням. п>12

ГОС 4

Фармакологический анализ потенциалозависимых 1к

С целью разделения компонентов 1к был проведен фармакологический анализ. Влияние нифедипина в концентрациях 30-100 мкМ на калиевые токи исследовалось с целью выявления кальций-чувствительных (ЪаШгге е1 а1., 1989) и дигидропиридин-чувствительных калиевых каналов (Уа1гшег й а1., 1991). Нифедипин в заказанных концентрациях не оказывает ингибирующего влияния на амплитуду суммарного выходящего калиевого тока, так же, как и ДТП агонист Са2+-каналов ВауК 8644 в том же диапазоне концентраций. Полученные данные свидетельствуют о том, что К+-каналы скелетных миоцитов лягушки не относятся к известным из литературы ДТП-чувствительным, а также о том, что описанные ниже эффекты хинидина и верапамила, часто использующиеся в качестве блокаторов Са2+-каналов, не опосредованы изменениями внутриклеточной концентрации свободного Са2+ как результата активации кальциевых каналов Ь-типа.

Хинидин в концентрациях 30-200 мкМ оказывает обратимое ингибирующее действие на все компоненты 1к (Рис. 7А). При приложении серии коротких стимулов наблюдается существенное усиление блокирующего эффекта. Можно предположить, что связывание хинидина с К+-каналами происходит преимущественно, если не исключительно, при открытом состоянии канала. Аналогичные предположения были сделаны в работах (Оуата е1 а1., 1992; Воку& е1 а1., 1990) по результатам исследования влияния хинидина и хинина на калиевые токи пирамидальных нейронов гиппокампа крысы и бета-клеток поджелудочной железы мыши.

Верапамил в концентрациях 50-700 мкМ дозозависимо ингибирует суммарный калиевый ток и существенно изменяет его кинетику (Рис. 7Б). Медленные калиевые токи необратимо устраняются верапамилом в

концентрации 100 мкМ. Что касается быстрой фазы, то под воздействием верапамила происходит частично обратимое увеличение скорости инактивации (в 8-10 раз при концентрации 300 мкМ). Деполяризующая стимуляция ускоряла развитие этого эффекта, что, вероятно, указывает на преимущественное взаимодействие с быстрыми К+-каналами в открытом состоянии.

Рис. 7. Ингибирующее действие кальциевых блокаторов на 1к-

(А) - Блокирующее действие верапамила на интегральный калиевый ток миоцитов. Ехест 0 мВ. Еп -80 мВ. 1) Контроль, 2) после приложения 50 мкМ верапамила, 3) отмыв. (Б) - Блокирующее действие хинидина на интегральный калиевый ток миоцитов. Етест 20 мВ. Еп -80 мВ. 1) Контроль, 2) после приложения 50 мкМ хинидина, 3) отмыв.

Ранее было показано, что, так же как верапамил, 4-аминопиридин в концентрациях 100-500 мкМ необратимо устраняет медленный 1к миоцитов (Ьикуапепко е! а1., 1993). Предпринятый нами более детальный анализ действия 4-АП позволил нам произвести разделение в пределах быстрой группы 1К. Для всей быстрой группы характерно, что 4-АП

взаимодействует с каналами в открытом состоянии, причем максимальный эффект наблюдается при деполяризации мембраны до -40 --60 мВ. При более положительных потенциалах наблюдается частичное освобождение от блока 4-АП. Зависимость развития блока от времени в условиях повторяющейся стимуляции и дозозависимость коррелировали со скоростью инактивации компонентов 1к (Рис. 8). Для компонентов с постоянной времени инактивации около 1 секунды эффективные концентрации были ниже (полное устранение при приложении 500 мкМ) и скорость развития ингибирующего эффекта выше, чем у компонентов с более быстрой инактивацией. Компоненты с очень быстрой инактивацией (тин около 50 мс) были менее чувствительны и не подавлялись полностью в присутствии 2.5-5 мМ 4-АП.

Приведенные данные фармакологического анализа позволяют сделать несколько выводов: потенциалозависимые К-каналы миоцитов лягушки: 1) нечувствительны к дигидропиридинам; 2) эффективно ингибируются недигидропиридиновыми кальциевыми блокаторами; 3) по фармакологическим характеристикам делятся на две основные группы: первая - каналы, необратимо блокирующиеся верапамилом и 4-АП (ток имеет медленную кинетику); вторая - каналы, ингибируемые верапамилом и 4-АП обратимо (быстрая фаза 1к); 4) в свою очередь в составе быстрой фазы 1к, при более детальном анализе влияния 4-АП, следует выделить 2 группы: быстро инактивирующаяся низкочувствительная (Кд =215 мкМ) и медленно инактивирующаяся высокочувствительная (Кд=45 мкМ) к 4-АП.

Следует также отметить, что по данным, полученным ранее (Ьикуапепко е! а1., 1993), внеклеточное приложение другого "классического" блокатора 1к -ТЭА становится эффективным только при концентрациях, близких к полной замене ионов (110 мМ).

Рис. 8. Ингибирующее действие 4-аминопиридина на 1к.

контроль

1-я запись в 250 мкМ 4-АР

2-я запись

3-я запись стационарный блок

500

< В

600

400

200

t, мс

600-

400-

200

контроль 250 мкМ 4-АР 1-я запись после отмыва стационарный уровень после отмыва

1000

2000

3000

!

t, мс

в

4-Дп/^>ПИК

Кд=215 мкМ, М-1

/ , 1 сек. после достижения пика Кд=45 мкМ, Н=1

100 1000 [4-АР], мкМ

о

(А) - Развитие блокирующего эффекта 250 мкМ 4-АП во времени; миоцит 5-го дня, Етест 0 мВ, Еп -80 мВ. (Б) - Дозозависимость стационарного блока; миоцит 2-го дня, Етест 0 мВ, Еп -80 мВ. (В) - Зависимость от времени восстановления от блока после отмыва 250 мкМ 4-АП; миоцит 2-го дня, ЕтеСт 10 мВ, Еп -80 мВ. Компонент с быстрой инактивацией восстановился полностью, тогда как медленно инактивирующийся компонент 1к блокирован необратимо. (Г) - Кривые доза-эффект ингибирования 4-АП пика амплитуды и задержанного 1к- Етест вблизи 0 мВ, Еп -80 мВ. п для каждой точки >10. Данные аппроксимированы в соответствии с уравнением Хилла: 1к, 4-апЯк ^ 1/(1+([4-АП]/Кд)н; для пиковых значений тока Кд=215 мкМ и Н=1, для задержанного тока (1 сек. после достижения пика) Кд=45 мкМ и Н=1.

Калиевый ток входящего выпрямления.

С использованием пилообразного стимула было исследовано влияние повышения наружной концентрации калия на интегральную ионную проводимость миоцитов на фоне блокирующего действия тетродотоксина и нифедипина. Па Рис. 9А представлены вольт-амперные характеристики суммарного ионного тока в ответ на пилообразный стимул (0.2 мВ/мс) в стандартных ионных условиях и в растворах, с повышенной концентрацией ионов К+ ([К+]0). В стандартном растворе ([К+]о =1.5 мМ) проводимость вне области активации потенциалозависимых К+-токов мала (<50 пС/пФ). Повышение [К+]о, кроме характерного изменения вида ВАХ 1к, вызывает увеличение проводимости в отрицательной области потенциалов (-140 - -50 мВ). Эффект усиливается в течение 3-6 минут после замены раствора (Рис. 9Б), стационарный уровень зависит от величины [К+]о-

Значения потенциала реверсии (Ег) интегрального ионного тока в зависимости от [К+]0 представлены на Рис. 10. В контрольном растворе величина Ег варьировала от -20 до -60 мВ, то есть отличалась от теоретического значения равновесного потенциала для ионов калия (Ек) на 50 - 90 мВ. Ек, рассчитанный по уравнению Нернста:

Ек=(КТ/Р)*1п {[К+]о/[К+]т} (Уравнение 4)

в стандартных инных условиях составлял -111 мВ. Увеличение [К+]о до 510 мМ вызывает сдвиг потенциала реверсии интегрального тока в область отрицательных потенциалов. Различия между Ег и Ек уменьшаются, а начиная с 11,5 мМ, Ег практически совпадает с Ек- Это указывает на высокую избирательность выявленного компонента к ионам К+.

Рис. 9. Зависимость вольт-амперных характеристик интегральной калиевой проводимости от концентрации К+в наружном растворе.

-80 -40 Б, мВ

Е, мВ

Регистрация ответов на пилообразные стимулы (0.2 мВ/мс), подаваемые в де- и гиперполяризующем направлении от поддерживаемого потенциала. Наружный раствор содержал тетродотоксин (1 мкМ) и нифедипин (100 мкМ). (А) - ВАХ в контрольном растворе, при 11.5, 60и110 мМ К+; (Б) - ВАХ в контрольном растворе и при 110 мМ К+ через 1 и 5 минут после полной замены раствора.

-О— эксперимент -теоретический

Рис. 10. Зависимость потенциала реверсии интегрального ионного тока от внеклеточной концентрации ионов К+.

Сплошная линия проведена в соответствии с уравнением Нернста для равновесного потенциала для ионов К+. п>10.

[К+]0, мМ

При внеклеточном приложении ионов Сэ+ в концентрациях 10-60 мМ на фоне повышенной [К+]о наблюдается потенциалозависимое блокирование анализируемого компонента тока (11Г) (Рис. 11). Рисунок 12 иллюстрирует основные различия фармакологических свойств 1к и 1ц-. Внеклеточное приложение 10 мМ 4-аминопиридина устраняет № образную область ВАХ, связанную с активацией потенциалозависимых К+-токов и не влияет на линейную составляющую ВАХ (Рис. 12А), в то время как ионы Ва в низких концентрациях (0.1-0.5 мМ) полностью блокируют ток в области отрицательных потенциалов, но практически не

Л 1

влияют на 1к (Рис. 12Б). Известно, что ионы Ва блокируют не только 11Г, но и другие типы К -каналов. Ингибирующее влияние ионов Ва на потенциалозависимый 1к для сравнения представлено на Рис. 13. Очевидно, что эффективные концентрации Ва для 1к гораздо выше, чем для1^.

Рис. 11. Блокирующее действие ионов Сб+ при внеклеточном приложении на интегральные калиевые токи.

—•— 60 мМ К++60 мМ N3+ —О— 60 мМ К++60 мМ Са+

с

.......X /

/

V

>ск >о-< УО-О-ОГ'

р

<

/

и г*

ВАХ зарегистрированы в ответ на пилообразный стимул со скоростью развертки 0.5мВ/мс. Темные кружки - ВАХ в растворе с 60 мМ К+ и 60 мМ Ыа+; светлые кружки - ВАХ после эквимолярной замены Ыа+ на Сб+.

-120 -80 -40 0

Е, мВ

Рис. 12. Различие фармакологических свойств потенциалозависимых К+-токов и тока входящего выпрямления.

Е> мВ Е, мВ

(А) - В АХ, зарегистрированные до (черные кружки) и после (белые кружки) внеклеточного приложения 10 мМ 4-аминопиридина; (Б)- В АХ, зарегистрированные до (черные кружки) и после (белые кружки) внеклеточного приложения 0.1 мМ Ва2+. Скорость развертки пилообразного стимула - 0.5 мВ/мс.

I

Рис. 13. Ингибирующее действие ионов Ва на 1к

1200

< в

800

400

1050 2050 3050 мс ^

-60 -40

Е, мВ

(А) - Типичные записи 1к в контрольном растворе и при приложении различных концентраций Ва2+, Етест -20 мВ, Ед -80 мВ. (Б) -пиковая ВАХ 1к при различных концентрациях Ва2+. На вставке - кривая доза-эффект. ЕТеСт - вблизи 0 мВ. Данные (п>6) аппроксимированы в соответствии с уравнением Хилла, Кд=250 мкМ, Н=2.

По основным характеристикам, анализируемый компонент сходен с токами через калиевые каналы, относящиеся к семейству Kir. Для решения вопроса о возможной принадлежности анализируемого тока к АТФ-чувствительным была проведена серия экспериментов с использованием селективного блокатора - глибенкламида (гр42) и внутриклеточного приложения магниевой соли АТФ (п=7). Глибенкламид (1-100 мкМ) не оказывал ингибирующего действия, внутриклеточное приложение АТФ (5-10 мМ) не оказывает влияния на частоту и степень выраженности эффекта повышения [К+]0.

Потенциалозависимые К+-токи миоцитов поздних стадий развития (более 7 суток) характеризуются быстрой кинетикой инактивации (Рис. 4, 14А). Это позволяет, за счет подбора скорости развертки пилообразного стимула, выделить компонент lir без использования фармакологических блокаторов 1к. На Рис. 14Б представлены ВАХ интегрального тока 8-го дня культивирования при скорости развертки пилообразного стимула 0.1 мВ/мс в контрольном растворе и в растворе 60 мМ К+. В контрольном растворе ВАХ близка к линейной, что указывает на минимальный вклад 1к. В растворе 60 мМ К+ проводимость при потенциалах выше и ниже потенциала реверсии различается в 10 раз.

На более ранних стадиях развития 1к характеризуется относительно медленной и неполной инактивацией. В связи с этим большинство экспериментов в период от 2-го до 5-го дня культивирования было проведено с использованием 4-АП, как наиболее эффективного из специфических блокаторов потенциалозависимых К+-токов миоцитов (Рис. 8). В этих экспериментах проводимость при переходе через потенциал реверсии изменялась не более чем в 3 раза.

0,5 0,0 -0,5 -UH

-1,5

Рис. 14. Типичные записи К -токов миоцита 8-го дня культивирования. 0,5

Еп=-80 мВ,

ETect=-100,-40, -20,0 мВ

А

100 200 300 400 t, мс

-80 -40 Е, мВ

(А) - Записи токов в ответ на прямоугольные стимулы от поддерживаемого потенциала -80 мВ в стандартном наружном растворе; (Б) - ВАХ, зарегистрированные в ответ на пилообразный стимул со скоростью развертки 0.1 мВ/мс в стандартном растворе и при 60 мМ К+.

Однако нами было показано, что длительное воздействие 4-АП оказывает модулирующее воздействие на lir. Влияние 4-АП на Iir рассмотрено отдельно ниже.

В отличие от 1Атф, помимо зависимости величины проводимости от потенциала (Е-Ек), ток через каналы входящего выпрямления обнаруживает свойство инактивации. ВАХ, построенная по стационарным значениям тока, имеет участок с отрицательным наклоном при больших гиперполяризующих смещениях потенциала (Aimers, 1972).

Наши эксперименты показали, что форма ВАХ 11Г у миоцитов также зависит от скорости развертки пилообразного стимула (Рис. 15А). При максимальной скорости развертки (0.5 мВ/мс) ВАХ близка к линейной, по мере уменьшения скорости наблюдается загиб в области отрицательных потенциалов. Токи в ответ на одиночные прямоугольные стимулы от

исходного потенциала характеризуются относительно быстрой инактивацией (Рис. 15Б). Разность между мгновенным и стационарным значением тока возрастает по мере увеличения гиперполяризации. Величина постоянной времени инактивации в зависимости от потенциала варьирует незначительно, но зависит от величины [К+]о. В растворе, содержащем 110 мМ К+, эти значения составляют 250-300 мс, но могут возрастать до 600-1000 мс при длительной экспозиции в растворах с высокой [К+]о и/или под воздействием 4-аминопиридина.

Рис. 15. Кинетические характеристики инактивации Наружный раствор содержал 110 мМ К+ и 10 мМ 4-АП.

Е, мВ г, МС

(А) - Влияние скорости развертки пилообразного стимула на характер вольт-амперной характеристики 11Г; (Б) - Записи токов в ответ на прямоугольные стимулы от Еп-60 мВ.

Модулирующее влияние 4-АП на 1ж.

Внеклеточное приложение 4-АП индуцировало появление

дополнительного компонента интегрального тока. В стандартных ионных

условиях ([К+]о =1.5 мМ) этот компонент имел вид выходящего тока с

медленной кинетикой активации (Рис. 16А, кривая 3). Эффект усиливался

в течение последующих 10-20 минут, был необратим при отмывании 4Г) •

АП и полностью блокировался внеклеточным приложением Ва в концентрации 25-200 мкМ. Параллельно с увеличением амплитуды 4-АП-индуцированного тока наблюдалось смещение Ег интегрального тока в сторону отрицательных значений. На Рис. 16Б представлены ВАХ суммарного ионного тока, зарегистрированные в ответ на пилообразные стимулы де- и гипер- поляризующих направлений. Значение Ег до начала воздействия 4-АП составляет -50 мВ (ВАХ-1), после развития активирующего эффекта Ег= -102.1 мВ (ВАХ-2,3). Величина интегральной хордовой проводимости вблизи потенциала реверсии возрастала в 10-50 раз по сравнению с контролем (ВАХ 1-3).

Значения коэффициентов относительной проницаемости (Рк/ Рш), рассчитанные с использованием уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца, свидетельствуют о том, что 4-АП-индуцируемый компонент значительно превосходит по избирательности к ионам К+ (Рк/ Рш =333±72, п=16) потенциалозависимый 1к (Рк/ Рш = 47.6±4.1, п=55).

При использовании наружных растворов с повышенной концентрацией К+ было установлено, что 4-АП в концентрациях вплоть до 10 мМ не оказывал блокирующего действия на 11Г. Однако, при длительной (3-10 минут) экспозиции в 4-АП (>50 мкМ) наблюдалось увеличение амплитуды тока входящего направления и изменение вида вольт-амперной характеристики: устранение отрицательного наклона при больших гиперполяризующих потенциалах (Рис. 17, ВАХ 1,2).

Рис. 16. Последовательное развитие блокирующего и активирующего действия 4-АП на ионные токи миоцита.

I, пА

500 -

0

I, пА

1000

500

0

О 50 мс 1с 2с Зс

Б

Заключение диссертации по теме «Физиология», Терентьев, Дмитрий Александрович

ВЫВОДЫ:

На развивающихся в течение 10 дней в культуре одиночных эмбриональных скелетных миоцитах лягушки Rana temporaria был изучен процесс формирования электровозбудимости в раннем миогенезе. Полученные результаты исследования позволяют сделать следующие выводы:

1. В процессе развития в условиях, запрещающих как деление, так и слияние клеток, экспрессируются с различной динамикой все основные типы потенциалозависимых ионных токов: тетродотоксин-чувствительный натриевый ток, быстрый и медленный кальциевые токи, а также токи через калиевые каналы входящего и задержанного выпрямления. Следовательно, процесс слияния миоцитов в миотубы, а также нейрональная или эндокринная регуляция не являются определяющими факторами для экспрессии всех основных типов ионных каналов.

2. Натриевый ток у эмбриональных миоцитов обеспечивается функционированием однородной популяции каналов, по совокупности свойств идентичных натриевым каналам зрелой мышцы. Наиболее выраженный рост плотности 1ма (в 16 раз) миоцитов приходится на период со 2-го по 7-й день в культуре и максимальное значение этого параметра в 40-300 раз ниже, чем в зрелых мышечных волокнах.

3. Количественные изменения 1к, происходят в основном за счет компонентов быстрой группы. Плотность 1к миоцитов возрастает со 2-го к 4-му дню менее чем в 2 раза и далее к 10-му дню снижается на 20%. Максимальное значение Ík в 40-300 раз меньше, чем в зрелых СМВ лягушки.

4. 1к в процессе развития претерпевает качественные изменения, касающиеся в основном кинетики инактивации быстрой фазы. Происходящее со 2-го по 5-й день уменьшение времени спада 1к до половинного уровня от максимального значения в 25 раз на фоне относительно стабильной величины плотности тока, является результатом посттрансляционной модификации каналов одного семейства.

5. Динамика экспрессии медленного ДТП-чувствительного Ica L-типа и особого, не описанного на зрелых СМВ, низкопорогового быстрого Са2+ тока, различна. Плотность Icaf возрастает в период с 1-го по 6-й день в 4 раза и далее практически не изменяется. Экспрессия Icas происходит с некоторой задержкой и после 3-го дня наблюдается монотонный рост, параллельный увеличению площади Т-системы. Медленные Са -каналы/ДГП-рецепторы, играющие важную роль в процессе электромеханического сопряжения, с самого начала мышечной дифференцировки встраиваются непосредственно в мембраны Т-системы. Величина плотности Icas в пересчете на единицу площади поверхности миоцитов на поздних сроках приближается к таковой в зрелом скелетно-мышечном волокне

6. У развивающихся миоцитов наблюдается экспрессия К+-каналов входящего выпрямления по фармакологическим свойствам и характеру зависимости проводимости от [К+]о аналогичных каналам зрелых скелетно-мышечных волокон. Увеличение интегральной проводимости Ijr указывает на увеличение общего числа каналов (не менее чем в 3 раза) данного типа и их плотности (в 1.5 -2 раза) в процессе дифференцировки.

7. Классический блокатор потенциалозависимых калиевых каналов 4-аминопиридин обладает модулирующим эффектом на калиевый ток входящего выпрямления, изменяя воротные характеристики К1Г - каналов.

8. Потенциал покоя у миоцитов возрастает от -21.2 мВ до -59,2 мВ с 1-го по 10-й день развития в культуре. Значения ПП на поздних сроках приближаются к таковым у зрелых тонических и существенно меньше значений 1111 у фазных СМВ лягушки.

9. В процессе развития одиночных миоцитов лягушки на ранних стадиях дифференцировки происходит формирование механизма генерации натриевого потенциала действия. Вклад медленного и быстрого lea в натриевый ПД не был выявлен.

Заключение

Рассмотренные выше результаты собственных исследований и данные литературы позволяют сделать некоторые общие заключения о развитии электровозбудимости мышечных мембран лягушки в процессе раннего развития.

Очевидно, что процесс слияния миоцитов в миотубы, а также нейрональная или эндокринная регуляция не являются определяющими факторами для экспрессии всех основных типов потенциалозависимых ионных каналов: а именно - ТТХ-чувствительных натриевых каналов, быстрого и медленного кальциевых каналов, а также калиевых каналов входящего и задержанного выпрямления.

Натриевый ток у эмбриональных миоцитов обеспечивается функционированием однородной популяции каналов, по совокупности свойств идентичным натриевым каналам зрелой мышцы. Плотность Na+-каналов в эмбриональных миоцитах значительно ниже, чем в зрелых мышечных волокнах. Видимо уровень экспрессии Ма+-каналов, сопоставимый с наблюдаемым у зрелых СМВ, может быть достигнут только после слияния клеток, также как у птиц (Frelin et al., 1981), причем факторы нейрональной природы на этот уровень могут оказывать существенное влияние. В работе ДеЧино и Кидокоро на культуре клеток лягушки Xenopus было показано, что только присутствие нервной ткани без непосредственного контакта с миоцитами вызывало удвоение плотности Ыа+-каналов (DeCino, Kidokoro, 1985). На ранних стадиях дифференцировки миоцитов происходит формирование механизма генерации натриевого потенциала действия, наличие которого зависит от величины gNa а основные его параметры, кроме того, от соотношения gNa/gK- На зрелых волокнах лягушки и крысы наличие быстрого 1са связывают с возможностью генерации кальциевых ПД (Beaty, Stefani, 1976; Chiarandini, Stefani., 1983). Однако на эмбриональных миоцитах

Xenopus кальциевых ПД зарегистрировано не было (DeCmo, Kidokoro, 1985), что объясняют низкой частотой встречаемости клеток с быстрым lea (Moody-Corbett et al., 1989). Несмотря на высокую частоту встречаемости Icaf на поздних стадиях (до 75% клеток) и высокие значения плотности Са2+-токов у миоцитов Rana temporaria, нам не удалось зарегистрировать кальциевых ПД и выявить вклад обоих 1Са в натриевый потенциал действия. Возможно, что в этом нам могли помешать некоторые методические ограничения: недостаточная для больших клеток со сложной пространственной организацией максимально возможная амплитуда стимулирующего тока (200 пА), а также известный эффект снижения амплитуды кальциевого тока во времени условиях регистрации от целой клетки (randown, Hille, 1992). Вполне вероятно, что у интактных миоцитов поздних сроков (после 6-го дня) процесс возбуждения приводит к входу кальция через потенциалозависимые каналы и что 1са может вносить некоторый вклад в натриевый ПД, причем определяющими факторами является низкий порог активации, кинетика (быстрая активация и относительно медленная инактивация) и плотность быстрого кальциевого тока. Одной из наших задач на будущее является создание математической модели электровозбудимости миоцитов, которая позволит реконструировать электрические ответы интактных клеток и с достаточной степенью достоверности делать предположения о роли конкретных типов ионных токов, в частности быстрого и медленного кальциевых токов. Количественные изменения leas происходят параллельно росту площади Т-системы. Этот факт позволяет нам предположить, что медленные Са -каналы/ДГП-рецепторы в раннем миогенезе встраиваются непосредственно в мембраны Т-системы. Значения плотности Icas У миоцитов поздних сроков приближаются к таковым у зрелых СМВ. Столь высокая плотность Са -каналов характерна не только для развивающихся клеток лягушки, но также и для клеток млекопитающих (Constantin et al., 1995).

Потенциалозависимые Ik в процессе культивирования претерпевают как количественные, так и качественные изменения. Кинетика инактивации в составе быстрой фазы 1к по ходу развития существенно ускоряется. Компоненты, входящие в состав быстрой фазы 1К, в миоцитах имеют идентичные фармакологические свойства и качественно сходные характеристики активации, поэтому, скорее всего, являются подтипами одного семейства. Ускорение инактивации на фоне относительно стабильных величин iK наиболее вероятно является результатом посттрансляционной модификации каналов одного семейства. К сходному заключению пришли Рибера и Спитцер, исследовавшие качественные изменения 1к у культивируемых миоцитов Xenopus. В их экспериментах ингибирование только синтеза новых каналов при возможности посттрансляционного процессии га не препятствовало ускорению инактивации в процессе дифференцировки (Ribera, Spitzer, 1991).

В работе Гилберта и Муди-Корбетта (Gilbert, Moody-Corbett, 1989) на эмбриональных миоцитах Xenopus было показано, что 2 компонента 1к эффективно блокируются антагонистами 1са - Со и дигидропиридинами. Эти два компонента были отнесены авторами к Са2+-зависимым 1к-Экспериментов с изменением внутри- и внеклеточной концентрации Са2+ , как это принято при работе с кальций-зависимыми калиевыми каналами, авторы не проводили. В наших экспериментах ДТП-чувствительных 1к выявлено не было, а ингибирующее влияние хинидина и верапамила на 1к не являлось результатом изменения внутриклеточной [Са2+]. В выбранных нами экспериментальных условиях выявить Са2+-зависимых калиевых токов было нельзя. Для этого следует существенно снижать внутриклеточную концентрацию Ca -хелатора - ЭГТА, что приводит к сокращению миоцитов при входе Са2+ через потенциалозависимые Са2+-каналы в ответ на деполяризацию и, как следствие, к нарушению контакта с пэтч-пипеткой (Nasledov et al., 1992). Нам не удалось найти в литературе сведений о Са -зависимых К -каналах СМВ лягушки, полученных при использовании адекватных методик. Для определенного ответа на вопрос экспрессируются ли

Са

-зависимые К -каналы (также как и КЛтр-каналы) в миоцитах Rana temporaria требуется дополнительный анализ на уровне одиночных каналов, регистрируемых в конфигурации inside-out, когда

2+ примем бранную концентрацию Са (или АТФ) можно контролировать с достаточной степенью точности. Делать выводы на основании ингибирующего влияния блокаторов кальциевых каналов на 1к нам представляется некорректным.

У миоцитов экспрессируется однородная популяция К+-каналов входящего выпрямления с характеристиками, аналогичными каналам зрелых скелетно-мышечных волокон. Потенциал покоя миоцитов возрастает от -21.2 мВ до -59,2 мВ от 1-го к 10-му дню развития в культуре. Рост ПП наблюдается в том же временном диапазоне, что и происходящая экспрессия каналов входящего выпрямления, плотность которых на единицу площади поверхности возрастает не менее чем в 1.5 раза. Поскольку хлорная проводимость на всех исследованных стадиях была незначительной, а потенциалозавиеимый 1к миоцитов Rana temporaria (также как и миоцитов Xenopus (Gilbert, Moody-Corbett, 1989)) представлен только компонентами с высоким порогом активации (-40 мВ), мы полагаем, что существенный вклад в формирование потенциала покоя миоцитов лягушки вносят К+-каналы входящего выпрямления. Аналогичные выводы были сделаны в работах на развивающихся клетках птиц (Shin et al., 1997) и человека (Liu et al., 1998). Вероятно увеличение 1111 за счет экспрессии К+-каналов входящего выпрямления в раннем миогенезе является характерным для большинства (если не всех) представителей позвоночных.

Таким образом, у развивающихся в культуре одиночных скелетных миоцитов лягушки нами были прослежены качественные и количественные изменения потенциалозависимых интегральных ионных токов, потенциала покоя и потенциалов действия, а также намечен ряд направлений дальнейших исследований формирования электровозбудимости в миогенезе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Терентьев, Дмитрий Александрович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Гинецинский А.Г. Об эволюции функций и функциональной эволюции. -М. - Л., АН СССР, 1961. - 21 с.

2. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.

3. Наследов Г.А., Томилин Н.В., Лукьяненко В.И., Терентьев Д.А. Структурная дифференцировка диссоциированных скелетных эмбриональных миоцитов лягушки в условиях клеточной культуры, Цитология, 1998, Т.40, №1, С.69-75.

4. Adrian R.H., Chandler W.K. Hodgkin A.L. Voltage clamp experiments in striated muscle fibres. J. Physiol. 1970a, v 208, N 3, p 607-645.

5. Adrian R.H., Chandler W.K. Hodgkin A.L. Slow changes in potassium permeability in skeletal muscle. J. Physiol. 1970b, v 208, N 3, p 645-669.

6. Adrian R.H, Freygang W.H. The potassium and chloride conductance of frog muscle membrane. J. Physiol. 1962, v 163, p 61-103.

7. Adrian R.H., Marshall M.W. Sodium currents in mammalian muscle. J. Physiol. 1977, y 268, p 223-250.

8. Adrian R.H., Peachey L.D. Reconstruction of action potential of frog sartorius muscle. J. Physiol. 1973, v 235, p 103-131.

9. Aguilar-Byan L., Nichols C.G., Wechsler S.W., Clement J.P., Boyd A.E., Gonzalez G., Herrera -Sosa H., Nguy K., Bryan J., Nelson D.A. Cloning of the P cell high affinity sulphonylurea receptor: a regulator of insulin secretion. Science. 1995, v 268, p 423-426.

10. Aleksandrov A., Velimirovic B., Clapham D.E. Inward rectification of the Irkl K+ channel reconstituted in lipid bilayers. Biophys. J. 1996, v 70, p 2680-2687.

11. Aimers W. Potassium conductance changes in skeletal muscle and the potassium concentration in the transverse tubules. J. Physiol. 1972, v 225, p 33-56.

12. Aimers W., McCleskey E.W. Non-selective conductance in calcium channels of frog muscle: calcium selectivity in a single-file pore. J. Physiol. 1984, v 353, p 585-608.

13. Aimers W., Fink R., Palade P.T. Calcium depletion in frog muscle tubules: the decline of calcium current under maintained depolarization. J. Physiol. 1981, v 312, p 177-207.

14. Aimers W., Palade P.T. Slow calcium and potassium currents across frog muscle membrane: measurements with a vaseline-gap technique. J. Physiol. 1981, v 312, p 159-176.

15. Altiok N., Bessereau J.L., Changeux J.P. ErbB3 and ErbB2/neu mediate the effect of heregulin on acetylcholine receptor gene expression in muscle: differential expression at the endplate. EMBO J. 1995, v 14, N 17, p 42584266

16. Armstrong C.M., Swenson R.P., Taylor S. R. Block of squid axon K channels by intracellularly and extracellularly applied barium ions. J. Gen. Physiol. 1982, v 80, p 663-682.

17. Armstrong C.M., Taylor S.R. Interaction of barium ions with potassium channels in squid giant axons. Biophys. J., 1980, v 30, N 3, p 473-488.

18. Ashcroft F.M., Heiny J.A., Vergara J. Inward rectification in the transverse tubule system of frog skeletal muscle studied with Potentiometrie dyes. J. Physiol. 1985, v 359, p 269-291.

19. Ashcroft S.J.H., Aschroft F.M.A. Properties and functions of ATP-sensitive K-channels. Cell. Signal. 1990, v 2, p 197-214.

20. Ashcroft S.J.H., Ashcroft F.M.A. The sulfonylurea receptor. Biochim. Biophys. Acta. 1992, v 1175, p 45-59.

21. Avila-Sacar A.J., Cota G., Gamboa-Aldeco R., Garcia J., Huerta M., Munis J., Stefani E. Skeletal muscle C2+ channels. J. Muscle Res. Cell Motil. 1986, v 7, p 291-298.

22. Beam K.G., Adams B.A., Niidome T., Numa S., Tanabe T. Function of a truncated dihydropyridine receptor both voltage sensor and calcium channel. Nature. 1992, v 360, p 169-171.

23. Beam K.G., Knudson C.M. Calcium currents in embryonic and neonatal mammalian skeletal muscle. J. Gen. Physiol. 1988, v 91, N 6, p 781-798.

24. Beam K.G., Knudson C.M., Powell J.A. A lethal mutation in mice eliminates the slow calcium current in skeletal muscle cells. Nature. 1986, v 320, p 168-170.

25. Beaty G.N., Cota G„ Siri L.N., Sanchez J.A., Stefani E. Skeletal muscle Ca2+ channels. In Structure and Physiol of the slow inward calcium channel. Allan R. Liss, 1987, p 123-140.

26. Beaty G.N., Stefani E. Inward calcium current in twitch muscle fibres of the frog. J. Physiol. 1976, v 260, p 27P.

27. Bokvist K., Rorsman P., Smith P. Effects of external tetraethylammonium ions and quinine on delayed rectifying K channels in mouse pancreatic b-cells. J. Physiol. 1990, v 423, p 311-325.

28. Breitwieser, G. E. Mechanisms of K+ channel regulation. J. Memb. Biol. 1996, v 152, p 1-11.

29. Bretag A.H. Muscle chloride channels. Physiol. Rev. 1987, v 67, p 618724.

30. Brodie C., Bak A., Sampson S. R. Dependence of Na+,K+-ATPase and electrogenic component of Em in cultured myotubes on cell fusion. Brain Res. 1985, v 336, p 384-386.

31. Bulteau L., Cogné M., Cognard C., Raymond G. Reversal of the relative expression of cardiac and skeletal alphal subunit isoforms of L-type calcium channel during in vitro myogenesis. Pflugers Arch. 1996, v 433, p 376-378.

32. Camacho J., Delay M.J., Vazques M., Arguello C., Sanchez J.A. Transient outward K+ channels in vesicles derived from frog skeletal muscle plasma membranes. Biophys. J. 1996, v71,p 171-181.

33. Campbell D.T. Ionic selectivity of the sodium channel of frog skeletal muscle. J. Gen. Physiol. 1976, v 67, N 3, p 295-307.

34. Campbell D.T., Hille B. Kinetic and pharmacological properties of the sodium channel of frog skeletal muscle. J. Gen. Physiol. 1976, v 67, N 3, p 309-323.

35. Catterall W.A. Cellular and molecular biology of voltage-gated sodium channels. Physiol. Rev. 1992, v 72, p sl5-s48.

36. Catterall W.A., Seagar, M.G., Takahashi M. Molecular properties of dihydropyridine-sensitive calcium channels in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 1988, v 263, p 3535-3538.

37. Chiarandini D.J., Stefani E. Calcium action potentials in rat fast-twitch and slow-twitch muscle fibres. J. Physiol. 1983, v 335, p 29-40.

38. Choquet D., Korn H. Mechanism of 4-aminopyridine action on voltage-gated potassium channels in lymphocytes. J. Gen. Physiol. 1992, v 99, 217240.

39. Chauhan-Patel R., Spruce A. E. Characterization of single inward rectifier potassium channels from embryonic Xenopus laevis myocytes. J. Membr. Biol. 1997, v 158, p 265-274

r\ I

40. Cognard C, Lazdunski M., Romey G. Different types of Ca channels in mammalian skeletal muscle cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, v 83, p 517-521.

41. Constantin B., Cognard C, Raymond G. Myoblast fusion is not a prerequisite for the appearance of calcium current, calcium release, and contraction in rat skeletal muscle cells developing in culture. Exp. Cell Res. 1995,v 217, p 497-505.

42. Cota G., Siri N.L., Stefani E. Calcium channel inactivation in frog (Rana pipiens and Rana montezuma) skeletal muscle fibres. J. Physiol. 1984, v 354, p 99-108.

43. Cota G., Stefani E. A fast-activated inward calcium current in twitch muscle fibres of the frog (Rana montezuma). J. Physiol. 1986, v 370, p 151163.

44. Cota G., Stefani E. Fast and slow Ca channels in twitch muscle fibres of the frog. Biophys. J. 1985, v 47, p 65-75.

45. Cota G., Stefani E. Voltage-dependent inactivation of slow calcium channels in intact twitch muscle fibres of the frog. J. Gen. Physiol. 1989, v 94, p 937-951.

46. Davies M.P., An R.U., Doevendas P., Kubabak S., Chien K.R., Kass R.S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circulation Res. 1996, v 78, N 1, p 15-25.

47. David J.D., See W.M., Higginbotham C.-A. Fusion of chick embryo skeletal myoblasts: role of calcium influx preceding membrane union. Dev. Biol. 1981, v 82, p 308-316.

48. DeCino P., Kidokoro Y. Development and subsequent neural tube effects on the excitability of cultured Xenopus myocytes. J. Neurosci. 1985, v 5, p 1471-1482.

49. De Luca A., Conte Camerino D., Connold A., Vrbova G. Pharmacological block of chloride channels of developing rat skeletal muscle affects the differentiation of specific contractile properties. Pflugers. Arch. 1990, v 416, p 17-21.

50. De Luca A., Tricarico D., Pierno S., Conte Camerino D. Aging and chloride channel regulation in rat fast-twitch muscle fibres. Pflugers Arch. 1994, v 427, p 80-85.

51. Donaldson P.L., Beam K.G. Calcium currents in a fast-twitch skeletal muscle of the rat. J. Gen Physiol. 1983, v 82, p 449- 468.

52. Duval A., Leoty C. Ionic currents in slow and twitch skeletal muscle in the rat. J. Physiol. 1980, v 307, p 23-41.

53. Eaton D. C., Brodwick M. S. Effects of barium on the potassium conductance of squid axon. J. Gen. Physiol. 1980, v 75, p 727-750.

54. Ernsberger U., Spitzer N. C. Convertible modes of inactivation of potassium channels in Xenopus myocytes differentiating in vitro. J. Physiol. 1995, v 484, p 313-329.

55. Ficker E., Taglialatela M., Wible B., C. Henley, Brown. A. Spermine and spermidine as gating molecules for inward rectifier K+ channels. Science. 1994, v 266, p 1068-1071.

56. Fischbach G.D., Nameroff M., Nelson P.G. Electrical properties of chick skeletal muscle fibers developing in cell culture. J. Cell. Biol. 1971, v 78, p 289-300.

57. Fosset M., Allard B., Lazdunski M. Coexistence of two classes of glibenclamide-inhibitable ATP-regulated K+ channels in avian skeletal muscle. Pflugers Arch. 1995, v 431, p 117-124.

58. Fosset M., Jaimovich E., Delpont E., Lazdunski M. Nitrendipine receptors in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 1983, v 258, p 6086-6092.

59.Freed J.J., Mezger-Freed L. Culture methods for anuran cells. Methods in cell physiol., N.Y.: Acad. Press. 1970, p 19-48.

60. Frelin C., Lombet A., Vigne P., Romey G., Lazdunski M. The appearance of voltage-sensitive Na+ channels during in vitro differentiation of embryonic chick skeletal muscle cells. J. Biol. Chem. 1981, v 256, p 1235512361.

61. Garcia J., Stefani E. Appropriate conditions to record activation of fast Ca channels in frog skeletal muscle (Rana pipiens). Pflug. Arch. 1987, v 408, p 646-648.

62. Gay L.A., Stanfield P.S. Cs+ causes a voltage-dependent block of inward K currents in resting skeletal muscle fibres. Nature. 1977, v 267, p 167-185.

63. Gilbert R., Moody-Corbett F. Four outward potassium currents in Xenopus skeletal muscle cells in culture. Canad. J. Physiol. Pharmacol. 1989, v 67, p Axiii-Axiv.

64. Gilly W. F., Hui C.S. Electrical properties of frog slow fibers. J. Physiol. 1980, v 301, p 157-173.

65. Gonoi T., Hagihara Y., Kobayashi J., Nakamura H., Ohisumi Y. Geographutoxin-sensitive and insensitive sodium currents in mouse skeletal muscle developing in situ. J. Physiol. 1989, v 414, p 159-177.

66. Gonoi T., Hasegawa S. Post-natal disappearance of transient calcium channels in mouse skeletal muscle. J. Physiol. 1988, v 401, p 617-637.

67. Gonoi T., Hasegawa S. Postnatal induction and neural regulation of inward rectifiers in mouse skeletal muscle. Pflugers Arch. 1991, v 418, p 601-607.

68. Gonoi T., Hasegawa S. Induction of inward rectifiers in mouse skeletal muscle fibres in culture. Pflugers Arch. 1991, v 419, 657-661.

69. Gonoi T., Sherman S.G., Caterall W.A. Voltage clamp analysis of tetrodotoxin-sensitive and insensitive sodium channels in rat muscle cells developing in vitro. J. Neurosci. 1985, v 5, p 2559-2564.

70. Gyorke S., Nasledov G.A. Evidence for voltage-dependent inactivation of slow current through calcium channels in frog muscle membrane. Gen. Physiol. Biophys. 1987, v 6, p 185-188.

71. Hamill O.P., Marty A., Neher E. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfliigers Arch. 1981, v 391, p 85-100.

72. Hancock S., Moody-Corbett F.L., Virgo N.S. Potassium inward rectifier and acetylcholine receptor channels in embryonic Xenopus muscle cells in culture. J. Neurobiol. 1996, v 29, p 354-366.

73. Hencek M., Zacharova D., Zachar J. Fast calcium currents in cut skeletal muscle fibres of the frogs Rana temporaria and Xenopus laevus. Gen. Physiol. Biophys. 1988, v 7, p 651-656.

74. Hencek M., Zacharova D., Zachar J., Karhanec M. Sodium and calcium currents in denervated phasic muscle fibres of the frog. Physiol. Bohemoslov. 1985, v 34, p 424.

75. Henning R.H., Duin M., van Popta J.P., Nelemans A., den Hertog A. Different mechanisms of Ca2+-handling following nicotinic acetylcholine receptor stimulation, P2U-purinoceptor stimulation and K+-induced depolarization in C2C12 myotubes. Br. J. Pharmacol. 1996, v 117, p 17851791.

76. Hess P., Lansman J.B., Tsien R.W. Calcium channel selectivity for divalent and monovalent cations. Voltage and concentration dependence of single channel current in ventricular heart cells. J. Gen. Physiol. 1986, v 88, p 293319.

77.Hille B. Ionic Channels of Excitable Membranes (2nd ed..) Sunderland, MA: Sinauer, 1992.

78. Hille B., Campbell D.T. An improved vaseline gap voltage clamp for skeletal muscle fibers. J. Gen. Physiol. 1976, v 67, p 265-293.

79. Hille B., Schwarz W. Potassium channels as multi-ion single-file pores. J. Gen. Physiol. 1978, v 72, p 409-442.

80. Hodgkin A. L., Horovicz P. The influence of potassium and chloride ions on the membrane potential of single muscle fibres. J. Physiol. 1959, v 148, p 127-160.

81. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. 1952, vl 17, p 500-544.

82. Honore E., Lazdunski M. Biophysical, pharmacological and developmental properties of Pflugers ATP-sensitive K+ channels in cultured myotomal muscle cells from Xenopus embryos. Pflugers Arch. 1995, v 429, p 607-616.

83. Hosey M.M., Lazdunski M. Calcium channels: molecular pharmacology, structure, and regulation. J. Membr. Biol. 1988, v 104, p 81-107.

84. Huerta M., Stefani E. Calcium action potentials and calcium currents in tonic muscle fibres of the frog (Rana pipiens). J. Physiol. 1986, v 372, p 293-301.

85. Iganaki N., Tsuura, Y., Namba N., Masuda K., Gonoi T., Horie M., Seino Y., Mizuta M., Seino S. Cloning and functional characterization of a novel ATP-sensitive potassium channel ubiquitously expressed in rat tissues, including pancreatic islets, pituitary, skeletal muscle, and heart. J.Biol.Chem. 1995, v 270, p 5691-5694.

86. Iganaki N., Gonoi T., Clement J.P., Aguilar-Byan L., Wang C.S., Bryan J., Seino S. A family of sulphonylurea receptors determines the pharmacological properties of ATP-sensitive K+ channels. Neuron. 1996, v 16, p 1011-1017.

87. Ildefonse M., Rougier C. Voltage-clamp analysis of the early current in frog skeletal muscle fibre using the double sucrose-gap method. J. Physiol. 1972, v 222, p 373-395.

88. Jaimovich E., Venosa R.A., Shrager P., Horowicz P. Density and distribution of tetrodotoxin in receptors in normal and detubulated frog sartorius muscle. J. Gen. Physiol. 1976, v 67, p 399-416.

89. Kano M. Development of excitability in embryonic chick skeletal muscle cells. J. Cell Physiol. 1975, v 86, p 503-510.

90. Keith, R.A., Mangano, T.J., Pacheco, M.A., Salama A.I. Characterization of the effects of -conotoxin GVIA on the responses of voltage-sensitive calcium channels. J. of Auton. Pharmacol. 1989, v 9, p 243-252.

91. Kilborn M. J., Felida D. A study of the developmental changes in outward currents of rat ventricular myocytes. J. Physiol. 1990, v 430, p 37-60.

92. Kubo Y. Electrophysiological and imunnochemical analysis of muscle differentiation in a mouse mesodermal stem cell line. J. Physiol. 1991, v 442, p 711-741.

93. Kubo Y. Comparison of initial stages of muscle differentiation in rat and mouse myoblastic and mouse mesodermal stem cell line. J. Physiol. 1991, v 442, p 743-759.

94. Kubo Y., Baldwin T.J., Jan Y.N., Jan L.Y. Primary structure and functional expression of a mouse potassium channel. Nature. 1993, v 362, p 127-133.

95. Latorre A.O., Labarca P., Alvares O. Varieties of calcium-activated potassium channels. Ann. Rev. Physiol. 1989, v 51, p 385-401.

96. Linsdell P., Moody W.J. Na+ channel misexpression accelerates K+ channel development in embryonic Xenopus laevis skeletal muscle. J. Physiol. 1994, v 480, p 405-410.

97. Linsdell P., Moody W.J. Electrical activity and calcium influx regulate ion channel development in embryonic Xenopus skeletal muscle. J. Neurosci.

1995, v 15, p 4507-4514.

98. Liu J.H., Bijlenda P., Fischer-Lougheed J., Ochiodoro T., Kaelin A., Bader C.R., Bernheim L. Role of an inward rectifier K+ current and of hyperpolarization in human myoblast fusion. J. Physiol. 1998, v 510, p 467476.

99. Lopatin A. N., Makhina E. N., Nichols. C. G. Potassium channel block by cytoplasmic polyamines as the mechanism of intrinsic rectification. Nature. 1994, v 372, p 366 -369.

100. Lopatin A.N., Nicols C.G. [K+] dependence of open-channel conductance in cloned inward rectifier potassium channels (Irkl, Kir2.1). Biophys. J.

1996, v 71, p 682-694.

101. Lukyanenko V., Katina I.E., Nasledov G.A. Voltage dependent fast calcium current in cultured skeletal myocytes of the frog Rana temporaria. Gen. Physiol. Biophys. 1994, v 13, p 237-246.

102. Lukyanenko V., Katina I.E., Nasledov G.A., Lonsky A.V. Voltage dependent ionic currents in frog cultured myocytes. Gen. Physiol. Biophys. 1993, v 12, p 231-247.

103. Lynch C. Ionic conductances of frog short skeletal muscle fibres with slow delayed rectifier currents. J. Physiol. 1985, v 386, p 359-378.

104.. Mandrino M. Voltage-clamp experiments on frog single skeletal muscle fibres: evidence for a tubular sodium current. J. Physiol. 1977, v 269, p 605626.

105. Marty A., Neher E. Tight-seal whole-cell recording. In Single Channel Recording. New York: Plenum Pres. (edited by SAKMANN, B. & NEHER, E.), 1983, p 107-122.

106. Matsuda H., Saigusa A., Irisawa. H. Ohmic conductance through the

rj I

inwardly rectifying channel and blocking by internal Mg . Nature. 1987, v 325, p 156-159.

107. McCormack K., Lin J.W., Iverson L.E., Rudy B. Shaker K+ channel subunits form heteromultimeric channel with novel functional properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990,v 171, p 1361-1371.

108. McDonald T.F., Pelzer S., Trautwein W., Pelzer D.J. Regulation and modulation of calcium channels in cardiac, skeletal, and smooth muscle cells. Physiol. Rev. 1994, v 74, 365-507.

109. Missias A.C., Chu G.C., Klocke B.J., Sanes J.R., Merhe J.P. Maturation of the acetylcholine receptor in skeletal muscle: regulation of the ACHR gamma-to-epsilon switch. Dev. Biol. 1996, v 179, p 223-238.

110. Moody-Corbett F., Gilbert R. Inward rectifier potassium current in embryonic Xenopus muscle cells at different times in culture. Devel. Brain Res. 1990, v 55, p 139-142.

111. Moody-Corbett F., Gilbert R. A K+ current in Xenopus muscle cells which shows inactivation. NeuroReport. 1992, v 3, p 153-156.

112. Moody-Corbett F., Gilbert R., Acbarali H., Hall J. Calcium current in embryonic Xenopus muscle cells in culture. Cañad. J. Physiol. Pharmacol. 1989, v 67, p 1259-1264.

113. Moody-Corbett F., Virgo N.S. Exposure to nerve does not affect the appearance of calcium currents in embryonic muscle. NeuroReport. 1991, v 2, p 437-440.

114. Murell-Landago R.D., Aldrich R.W. Interaction of amino terminal domains of shaker K channels with a pore blocking site studied with synthetic peptides. J. Gen. Physiol. 1993, v 102, p 947-975.

115. Nasledov G.A., Lukyanenko V., Katina I.E., Lonsky A.V. Ionic requirements for the activation of contraction in embryonic frog myoblasts in culture. Gen. Physiol. Biophys. 1992, v 11, p 153-159.

116. Navarro-Polanco R.A., Sanchez-Chapula J.A. 4-aminopyridine activates potassium currents by activation of muscarinic receptor in feline atrial myocytes. J. Physiol. 1997, v 498, p 663-678.

117. Nicola Siri L., Sanchez J.A., Stefani E. Effect of glycerol treatment on calcium current of frog skeletal muscle. J. Physiol. 1980, v 305, p 87-96.

118. Nasri-Sebdani M., Cragoe E.J., Cognard C., Potreau D., Raymond G. The depressant effects of some amiloride analogues on the slow outward K+ current and contraction of voltage-clamped frog muscle fibres. Eur. J. Pharmacol. 1989, v 171, p 97-107.

119. Noda M., Shimizu S., Tanabe T., Takai T., Kayano T., Ikeda T., Takahashi H., Nakayama H, Kanaoka Y., Minamino N., Kangawa K., Matsuo H., Raftery M., Hirose T., Inayama S., Hayashida H., Miyata T., Numa S.

Primary structure of Elecrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence. Nature. 1984, v 312, p 121-127.

120. Oyama Y., Harata N., Akaike N. Accelerating action of quinidine on the decay phase of transient outward current in hippocanipal pyramidal neurons. Jpn. J. Pharmacol. 1992, v 58, p 185 189.

121. Pappone P.A., Voltage-clamp experiments in normal and denervated mammalian skeletal muscle fibres. J. Physiol. 1980, v 306, p 377-410.

122. Pasino E., Buffelli M., Arancio O., Busetto G., Salviati A., Cangiano A. Effects of long-term conduction block on membrane properties of reinnervated and nonnally innervated rat skeletal muscle. J. Physiol. 1996, v 497, p 457-472.

123. Peachey L.D. The sarcoplasmic reticulum and transverse tubules of the frog's sartorius. J. Cell. Biol. 1965, v 25, p 209-231.

124. Pichon Y., Meves H., Pelhate M. Effects of Aminopyridines on ionic currents and ionic channel noise in unmyelinated axons. J. Physiol. 1981, v 295, p 53-68.

125. Pongs 0. Molecular biology of voltage-dependent potassium channels. PhysioLRev. 1992, v 72, p S69-S88.

126. Pongs 0. Structure-function studies on the pore of potassium channels. J. Membrane Biol. 1993, v 136, p 1-8.

127. Potier B., Rascol O., Lamour Y., Dutar P. Verapamil has an effect independent of its calcium channel antagonist action in rat hippocompal neurons. C. R. Acad. Sci. Paris, 1990, v 311, p 89-94.

128. Quayle J.M., Nelson M.T., Standen N.B. ATP-sensitive and inwardly rectifying potassium channels in smooth muscle. Physiol. Rev. 1997, v 77, p 1165-1232.

129. Ribera A. B. A potassium channel gene is expressed at neural induction. Neuron. 1990, v 5, p 691-700.

130. Ribera A. B., Spitzer N. C. Differentiation of delayed rectifier potassium current in embryonic amphibian myocytes. Dev. Biol. 1991, v 144, p 119128.

131. Ritchie A., Fambrough D.M. Electrophysiological properties of the membrane and acetylcholine receptor in developing rat and chick myotubes. J. Gen. Physiol. 1975, v 66, p 327-355.

132. Rivet M., Cognard C., Imbert N., Rideau Y., Duport G., Raymond G. A third type of calcium current in cultured human skeletal muscle cells. Neurosci. Lett. 1992, v 138, p 97-102.

133. Romano S.J., Pugh P.C., Mcintosh J.M., Berg D.K. Neuronal-type acetylcholine receptors and regulation of alpha 7 gene expression in vertebrate skeletal muscle. J. Neurobiol. 1997, v 32, p 69-80

134. Rudy B. Diversity and ubiquity of K channels. Neurosci. 1988, v 25, p 729-749.

135. Salkoff L., Butler A, Wei A., Scavarda N„ Giffen K., Ifune C„ Goodman R., Mandel G. Genomic organization and deduced amino acid sequence of a putative sodium channel gene in Drosophila. Science. 1987, v 237, p 744749.

136. Sanchez J.A., Stefani E. Inward calcium current in twitch muscle fibres of the frog. J. Physiol. 1978, v 283, p 197-209.

137. Sanchez J.A., Stefani E. Kinetic properties of calcium channels of twitch muscle fibres of the frog. J. Physiol. 1983, v 337, p 1-17.

138. Schneider M.F., Chandler W.K. Effects of membrane potential on the capacitance of skeletal muscle fibers. J. Gen. Physiol. 1976, v 67, p 125163.

139. Schmid A., Renaud J.-F., Fosset M., Meaux J.-P., Lazdunski M. The nitrendipine-sensitive Ca channel in chick muscle cells and its appearance during myogenesis in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 1984, v 259, p 1136611372.

140. Sherman S.J., Catterall W.A. Biphasic regulation of development of the high-affinity saxitoxin receptor by innervation in rat skeletal muscle. J. Gen. Physiol. 1982, v 80, p 753-768.

141. Sherman S.J., Catterall W.A. Electrical activity and cytosolic calcium regulate levels of tetrodotoxin-sensitive sodium channels in cultured rat muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984, v 81, p 262-266.

142. Senyk O. External [K+] and the block of the K+ inward rectifier by external Cs+ in frog skeletal muscle. Biophys. J. 1986, v 50, p 677-683.

143. Shainberg A., Yagil G., Yaffe D. Control of myogenesis in vitro by Ca2+ concentrations in nutritional medium. Exp. Res. 1971, v 58, p 163-167.

144. Shien R.-C., Chang J.-C,, Arreola J. Interaction of Ba2+ with the pores of the cloned inward rectifier K+ channels Kir2.1 expressed in Xenopus oocytes. Biophys J. 1998, v 75, p 2313-2322.

145. Shieh R.-C., John S. A., Lee J.-K., Weiss J.N. Inward rectification of the IRK1 channel expressed in Xenopus oocytes: effects of intracellular pH reveal an intrinsic gating mechanism. J. Physiol. 1996, v 494, p 363-376.

146. Shin K.S., Park J.Y., Ha D.B., Chung C.H., Kang M.S. Involvement of KCa channels and stretch-activated channels in calcium influx triggering membrane fusion of embryonic myoblasts. Dev. Biol. 1996, v 174, p 14-23.

147. Shin K.S., Park J.Y., Kwon H., Chung C.H., Kang M.S. Opposite effect of intracellular Ca and protein kinase C on the expression of inwardly rectifying K+ channel I in mouse skeletal muscle. J. Biol. Chem. 1997, v 272 N 34, p 21227-21232.

148. Shin K.S., Park J.-Y., Kwon H„ Chung C.H., Kang M.S. A possible role of inwardly rectifying K+ channels in chick myoblast differentiation. Am. J. Physiol. 1997, v 272, p C894-C900.

149. ShvinkaN.E., Gyorke S., Nasledov G.A. Effects of diltydropyridine CGP through the calcium channels in frog skeletal muscle. Gen. Physiol. Biophys. 1990, v 9, p 83- 86.

150. Spector I., Prives J.M. Development of electrophysiological and biochemical membrane properties during differentiation of embryonic skeletal muscle in culture. Proc. Natl. Acad. USA. 1977, v 74, p 5166-5170.

151. Spruce A.E., Standen N.B., Stanfield P.R. Studies of the unitary properties of adenosine-5'-triphosphate-regulated potassium channels of frog skeletal muscle. J. Physiol. 1987, v 382, 213-236.

152. Standen, N.B., Stanfield P.R. A potential- and time-dependent blockade of inward rectification in frog skeletal muscle fibres by barium and strontium ions. J. Physiol. 1978, v 280, p 169-191.

153. Standen N.B., Stanfield P.R. Potassium depletion and sodium block of potassium currents under hyperpolarization in frog sartorius muscle. J. Physiol. 1979, v 294, p 497-520.

154. Stanfield P.R. The effect of the tetraethylammonium ion on the delayed currents of frog skeletal muscle. J. Physiol. 1970, v 209, p 209-229.

155. Stanfield P.R. A calcium dependent inward current in frog skeletal muscle fibres. Pflugers Arch. 1977, v 368, p 267-270.

156. Stefani E., Chiarandini D. Ionic channels in skeletal muscle. Annu. Rev. Physiol. 1982, v 44, p 357-372.

157. Steinmeyer K., Ortland C., Jentsch T.J. Primary structure and functional expression of a developmentally regulated skeletal muscle chloride channel. Nature. 1991, v 354, p 301-304.

158. Stephens G.J., Garratt J.C., Robertson B., Owen D.G. On the mechanism of 4-aminopyridine action on the cloned mouse brain potassium channel mKvl.l. J. Physiol. 1994, v 477, p 187-196.

159. Takumi T. A protein with a single transmembrane domain forms an ion channel. NIPS. 1993, v 8, p 175-178.

160. Tanabe T., Takeshima H., Mikami A., Flockerzi V., Takahashi H., Kangawa K., Kojima M., Matsuo H., Hirose T., Numa S. Primary structure of the receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle. Nature. 1987, v 328, p 313-318.

161. Tang C.-M., Presser F., Morad M. Amiloride selectively blocks the low threshold (T) calcium channel. Science. 1988, v 240, p 213-215.

162. Teylor-Papadimitrou J., Rozengurt E. The role of thymidine uptake in the control of cell proliferation. Exp. Cell Res. 1979, v 119, 393-396.

163. Tricarico D., Petruzzi R., Conte Cametino D.C. Different sulfonylurea and ATP sensitivity characterizes the juvenile and the adult form of KATP

channel complex of rat skeletal muscle. Eur. J. Pharmacol. 1997, v 321, p 369-378.

i

164. Trimmer J.S., Cooperman S.S., Tomiko S.A., Zhou J.Y, Crean S.M.,. Boyle M.B, Kallen R.G., Sheng Z.H., Barchi R.L., Sigworth F.J., Goodman R.H., Agnew W.S., Mandel G. Primary structure and functional expression of a mammalian skeletal muscle sodium channel. Neuron, 1989, v 3, p 3349.

165. Tsien R. W„ Hess P., McCleskey E. W., Rosenberg R. L. Calcium channels: mechanisms of selectivity, permeation, and block. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1987, v 16, p 265-290.

166. Valmier J., Richard S., Devic E., Nargeot J., Simonneau M., Baldy-Moulinier M. Dihydropyridines interact with calcium-independent potassium currents in embryonic mammalian sensory neurons. Pflugers Arch. 1991, v 419, p 281-287.

167. Vandenberg C. Inward rectification of a potassium channel in cardiac ventricular cells depends on internal magnesium ions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987, v 84, p 2560-2564.

168. Van Heukelom J.S. Role of anomalous rectifier in determining membrane potential of mouse muscle fibres at low extracellular K+. J. Physiol. 1991, v 434, p 549-560.

169. Xu H, Dixon J.E., Barry D.M., Timmer J.S., Merlie J.P., McKinnon D„ Nerbonne J.M. Developmental analysis reveals mismatches in the expression of K+ channel currents in rat ventricular myocytes. J. Gen. Physiol. 1996, v 108, p 405-419.

170. Warmke J.R., Drysdale R., Ganetzky B.A distinct potassium channel polypeptide encoded by the Drosophila ead locus. Science. 1991, v 252, p 1560-1562.

171. Winckenden A.D., Kaprielian R., Parker T.G., Jones, O.T., Backx, P.H. Effects of development and thyroid hormone on K+ currents and K+ channel gene expression in rat ventricle. J. Physiol. 1997, v 504, p 217-286.

172. Wittka R., Stocker M., Boheim G., Pongs 0. Molecular basis for different rates of recovery from inactivation in the shaker potassium channel family. FEBS Let. 1991, v 286, p 193-200.

173. Zemkova H., Vyskocil F., Tolar M., Vlachova V., Ujek, E. Single K+ currents during differentiation of embryonic muscle cells in vitro. Biochem. Biophys. Acta. 1989, v 986, p 146-150.

Выражаю глубокую признательность всем, кто способствовал выполнению данной диссертационной работы. Прежде всего, я глубоко благодарен своему научном руководителю - д.б.н., профессору Григорию Александровичу Наследову, который предложил мне взяться за такую непростую, но интересную тему и оказывал мне постоянную научную и практическую поддержку. Огромную помощь в выполнении экспериментальной части исследований и биофизическом осмыслении полученных данных оказала Ирина Евгеньевна Катина. Выполнение диссертационной работы за время моего обучения было бы невозможно и без содействия Валерия Ивановича Лукьяненко. Кроме того, я приношу глубокую благодарность всем сотрудникам лаборатории нейрорегуляции мышечной функции ИЭФиБ им. И.М. Сеченова за ту поддержку, которую они оказывали мне за время моего обучения.