ДНК-диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и связь статуса коров по ВЛКРС с генеалогической принадлежностью и уровнем молочной продуктивности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Виноградова, Ирина Валерьевна

• Виноградова, Ирина Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Виноградова, Ирина Валерьевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Геном вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.2. Лейкоз крупного рогатого скота.

2.3. Распространение вируса лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации и за рубежом.

2.4. Методы диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.5. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Объекты и материалы исследований.

3.2. Материально-техническое обеспечение исследований.

3.3. Методы исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Разработка тест-системы диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота методом «гнездовой» ПЦР.

4.1.1. Выбор и обоснование метода, лежащего в основе тест-системы.

4.1.2. Состав тест-системы для диагностики ВЛКРС.

4.1.3. Разработка программы и методики исследовательских испытаний.

4.1.4. Проведение исследовательских испытаний тест-системы.

4.1.5. Создание экспериментальных образцов тест-системы.

4.1.6. Разработка проекта инструкции по применению тест-системы.

4.2. Изучение ВЛКРС-статуса коров в аспекте генеалогической структуры стада и уровня молочной продуктивности.

4.2.1. Влияние принадлежности коров к генеалогической линии на инфицированность вирусом лейкоза.

4.2.2. Изучение связи статуса по ВЛКРС на уровень молочной продуктивности коров.

4.3. Усовершенствование приемов диагностики ВЛКРС.

4.3.1. Оценка результативности тест-системы для ранней диагностики ВЛКРС в крови телят.

4.3.2. Оценка результативности тест-системы при использовании проб кожи в качестве исходного материала

4.4. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ДНК-диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и связь статуса коров по ВЛКРС с генеалогической принадлежностью и уровнем молочной продуктивности»

Лейкозы животных одни из наиболее распространенных заболеваний, которые встречаются во всех странах мира (Гулюкин М.И., 2004 г.). Массовое распространение вируса лейкоза (BJIKPC) в молочных стадах крупного рогатого скота представляет сегодня огромную проблему в молочном скотоводстве (Кузнецов А.П., Никитин И.Н., 1993, Кузин А.И., Закрепина E.H., 1997, Shanks R.D. et al., 1993, Yang D., 1993). Экономический ущерб, причиняемый лейкозом хозяйству, является следствием снижения количества и качества продукции, преждевременного падежа или вынужденной выбраковки и убоя больных животных, затрат на обеззараживание молока (пастеризацию, так как сырое молоко от зараженных животных запрещено использовать для питания людей), недополучения молодняка, потери его племенной ценности и ограничения в реализации, запрета на племенную продажу скота, затрат на проведение противолейкозных мероприятий (Гулюкин М.И., 2005, Ковалюк Н.В. и др., 2006; Смирнов П.И. , 2007). Применяемая сегодня технология диагностики лейкоза, основанная на реакции иммунной диффузии (РИД) позволяет выявлять вирусоносителей, только начиная с 6-и месячного возраста. В силу особенностей инфекционного процесса лейкоза диагностика его серологическими методами исследования не позволяет одномоментно выявить всех инфицированных животных, что приводит к практически неконтролируемому распространению заболевания у телят и существенно повышает процент вирусоносителей.

В связи с этим, актуальным является разработка высокочувствительных тест-систем для ранней диагностики по выявлению провируса лейкоза крупного рогатого скота не только в крови взрослых животных, но и в крови телят раннего постнатального развития.

По данным Гулюкина М.И. с соавторами (2005) и Шарова А.Н. (2006) известно, что метод ПЦР выявляет до 16% животных, зараженных вирусом лейкоза среди РИД-негативных животных, а число зараженных телят достигает до 11,6%. Кроме того, высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать его для рекогносцировочных исследований путем определения возбудителя в сборном молоке (Сюрин В.Н. и др., 2000, Kuckleburg et al., 2003).

Довольно часто выявляется несоответствие результатов ПЦР и РИД. ПЦР-позитивные особи выявляются среди РИД-отрицательных животных, а ПЦР-негативные - среди РИД-позитивных (Макаров В.В., Гринишин Д.П., 2005). Вполне вероятно, что, несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. Постепенно выводя из стада РИД-позитивных животных, теоретически возможно добиваться полного оздоровления хозяйства от лейкоза, но, тем не менее, в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько месяцев, или даже лет, выделяют животных с антителами к ВЛКРС. Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования, или уровень антител, находится ниже порога чувствительности РИД (Beier D. et al., 1992, Blankenstein P. et al., 1998).

Проводимая в течение ряда поколений селекция коров на повышение уровня молочной продуктивности обуславливает изменения в статусе здоровья животных (Oltenacu P.A., Broom D.M., 2010). Рост молочной продуктивности ведет к перераспределению в организме доступной энергии, увеличивая долю ее использования на синтез молока. Это приводит к отрицательному балансу энергии, для покрытия которого используются резервы организма, что, в свою очередь, ведет к потере части кондиций. Повышенная нагрузка на организм высокопродуктивных коров вследствие синтеза и секреции молока получила название метаболического груза, а обусловленное метаболическим грузом нарушение некоторых энергетических процессов в организме, влияющих, в частности, на воспроизводство и состояние здоровья, получило название метаболического стресса (Clarkson M.J. et al., 1996). Метаболический стресс, ассоциированный с лактацией, оказывает влияние на профиль иммунного ответа, что было подтверждено данными Kimura К. с соавторами (2002), наблюдавшими изменение распределения лейкоцитов у мастэктомированных коров голштинской породы по сравнению с нормально лактирующими коровами. Изменение иммунного профиля у высокопродуктивных коров связывают с их повышенной чувствительностью к заболеваниям (van Dorp Т.Е. et al., 1999, Heringstad В. et al., 2000, Heringstad B. et al., 2007, Калашников B.B. и др., 2011, Ingvartsen K.L., 2003). Так, показана положительная генетическая корреляция между уровнем удоя и чувствительностью к маститам, которая варьировала от 0,24 до 0,55 (Heringstad В. et al., 2000). Ingvartsen K.L. с соавторами (2003) установили нежелательные генетические корреляции между уровнем удоя и частотой возникновения кетозов (0,26-0,65), кист яичников (0,23-0,42), маститов (0,15-0,68), проявлением хромоты (0,24-0,48). С ростом молочной продуктивности связывают широкое распространение лейкоза среди молочного скота. У коров голштинской породы канадской селекции, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в латентной стадии, отмечен более высокий уровень удоя по сравнению с серонегативными животными (Pollary F.L. et al., 1992). Установлен более высокий генетический потенциал коров, инфицированных ВЛКРС, по удою, который для животных, находящихся в стадии персистентного лимфоцитоза составил +204 кг, а для гематологически нормальных - +136 кг по сравнению с серонегативными животными (Wu М.С. et al., 1989). На выборке коров черно-пестрой породы показана тенденция увеличения ряда продуктивных показателей у коров-первотелок -носителей ВЛКРС по сравнению с не носителями (Гладырь Е.А. и др., 2012).

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы явилось усовершенствование способов ДНК-диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота и изучение связи ВЛКРС-статуса высокопродуктивных коров различных генеалогических линий с уровнем молочной продуктивности.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Идентифицировать участок ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, характеризующегося наибольшей консервативностью, на основании мониторинга баз данных последовательностей ДНК.

2. Разработать тест-систему для диагностики ВЛКРС методом «гнездовой» ПЦР и выполнить анализ ее специфичности, чувствительности, точности (прецизионности) и воспроизводимости.

3. Изучить связь принадлежности коров к генеалогической линии с инфицированностью ВЛКРС.

4. Оценить связь статуса коров по ВЛКРС с уровнем молочной продуктивности коров черно-пестрой породы.

5. Усовершенствовать приемы диагностики ВЛКРС.

6. Определить генотипы ВЛКРС в стаде высокопродуктивных коров черно-пестрой породы.

Научная новизна исследований. Определены консервативные участки ВЛКРС как матричные последовательности для отжига праймеров. Изучено влияние номера лактации на инфицированность коров ВЛКРС. Выполнено исследование степени инфицированности ВЛКРС коров с различными продуктивными характеристиками (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка): «высокими» (более Хс?+о), «средними» (в пределах Хср.±о) и «низкими» (менее Хср.-ст). Выполнен анализ молочной продуктивности коров из разных генеалогических линий в зависимости от статуса по ВЛКРС.

Практическая значимость. Разработана тест-система диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота на основе «гнездовой» ПЦР, характеризующаяся специфичностью более 99,0%, чувствительностью не менее 6,0*10" копий/мкл, точностью (прецизионностью) и воспроизводимостью более 99,0%. Усовершенствованы приемы диагностики ВЛКРС, позволяющие идентифицировать телят-носителей провирусной формы ВЛКРС, начиная с 10-дневного возраста, и коров-носителей с использованием в качестве исходного материала пробы кожи (ушной выщип). Определены генотипы ВЛКРС в стаде высокопродуктивных коров черно-пестрой породы ФГУП «Кленово-Чегодаево».

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международной конференции «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи», г. Уфа: БашГАУ, 2010 г., на научной конференции-школе «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», п. Дубровицы: ВИЖ, 2012 г., на конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тест-система диагностики ВЛКРС, характеризующаяся высокой специфичностью, чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.

2. Увеличение доли животных со статусом ВЛКРС+ с увеличением числа лактаций.

3. Достоверное повышение степени инфицированности ВЛКРС с увеличением уровня показателей молочной продуктивности (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка).

4. Усовершенствованные приемы ДНК-диагностики ВЛКРС, позволяющие выявлять телят-носителей, начиная с 10-дневного возраста.

Публикации результатов исследований. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 5 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ («Сельскохозяйственная биология»,

Проблемы биологии продуктивных животных», «Достижения науки и техники АПК»).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 131 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 35 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 229 источников, в том числе 165 источников на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Виноградова, Ирина Валерьевна

выводы.

1. Предложена тест-система диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), основанная на методе «гнездовой» ПЦР фрагмента гена ет. По результатам проведенных исследовательских испытаний показано соответствие оцениваемых характеристик установленным требованиям: показана способность тест-системы выявлять австралийский и бельгийский типы вируса, чувствительность составила 6*1 О*3 копий/мкл, показано 100% совпадение результатов исследований референтных образцов; выявлено 100%) совпадение результатов повторных исследований 30 образцов.

2. Показано увеличение степени инфицированности коров вирусом лейкоза с увеличением числа лактаций. Исследование статуса по ВЛКРС 382 коров 1-й лактации, 253 коров 2-й лактации и 197 коров 3-й лактации показало увеличение доли коров носителей ВЛКРС с 28,5%о у коров 1-й лактации до 36,1% у коров 3-й лактации.

3. Установлена на 9,0-21,7%) достоверно более высокая степень инфицированности коров 1-й лактации ВЛКРС со «средним» (в пределах Хср±о) и «высоким» (более Хср+о) уровнем продуктивных показателей (удой, содержание жира и белка в молоке, выход молочного жира и белка) по сравнению с группами коров с «низким» (менее Хср-а) уровнем продуктивности. Выявлены наибольшие различия между группами коров с различным выходом молочного жира (18,3-21,7%), р<0,999). Установленные закономерности, в большинстве случаев, сохранялись для коров 2-й и 3-й лактаций.

4. Установлена тенденция повышения большинства продуктивных показателей (уровня удоя, содержания жира в молоке, выхода молочного жира и белка) у коров различных генеалогических линий со статусом ВЛКРС «+» по сравнению ВЛКРС «-».

5. Показана результативность разработанной тест-системы на основе «гнездовой» ПЦР в выявлении носителей ВЛКРС у телят, начиная с 10-и дневного возраста. Исследование 222 телят выявило 18,92% носителей ВЖРС.

6. Показано, что применение комплексного подхода, основанного на использовании РИД и ПЦР-анализа двух видов проб (крови и ткани уха), повышает результативность идентификации носителей ВЛКРС на 18,8-31,3% от числа выявляемых только методом РИД.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям молекулярно-генетической экспертизы и ветеринарным диагностическим лабораториям рекомендуем использовать разработанную нами тест-систему «гнездовой» ПЦР для проведения ранней диагностики телят на носительство вируса лейкоза крупного рогатого скота, начиная с 10-и дневного возраста, и в качестве элемента комплексного подхода для повышения результативности выявления коров-носителей ВЛКРС.