Деление липидной нанотрубки осмотическим давлением тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.05, кандидат физико-математических наук Евсеев, Алексей Игоревич

• Евсеев, Алексей Игоревич
• кандидат физико-математических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Евсеев, Алексей Игоревич

Введение.

Обзор литературы.

Структура биологических мембран.

Искусственные мембраны.

Механические параметры БЛМ и методы их определения.

Эндоцитоз.

Липидная нанотрубка.

Цели и задачи исследования.

Материалы и методы.

Результаты и обсуждение.

Возможность использования осмотического давления для сжатия и деления

Измерение модуля изгиба НТ в растворах различной ионной силы.

Осмотическое деление НТ.

Зависимость величины критического радиуса от липидного состава мембраны.

Модель деления липидной нанотрубки.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Деление липидной нанотрубки осмотическим давлением»

Мембрана является важнейшим селективным барьером, отделяющим содержимое клетки и ее органелл от окружающего раствора. Она играет ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании клетки. В клетке постоянно происходит обмен веществом с внешней средой и между различными органеллами. Роль переносчиков в этих процессах играют маленькие мембранные пузырьки — везикулы. Транспортируемые вещества могут содержаться как внутри везикул, так и в их мембране. Везикулы образуются на поверхности органелл или плазматической мембраны клетки в процессе эндоцитоза, в котором принимает участие большое количество специализированных белков. Часть из этих белков отвечает за первоначальную инвагинацию поверхности мембраны (эпсины) [НтпсЪзеп Ь. е! а1. (2006)], другие обеспечивают формирование самой везикулы (клатрин, кавеолин, СОР-комплексы) [МсМаЬоп Н.Т. (2007)]. При этом везикула остается связанной с материнской мембраной посредством тонкого мембранного перешейка. Отщепление везикулы от образующей поверхности происходит в результате разрыва соединяющего их перешейка. Топологическое преобразование липидного бислоя, в результате которого из одного замкнутого мембранного компартмента образуются два, в литературе получило название деление мембран. Помимо эндоцитоза деление мембран лежит в основе целого ряда фундаментальных клеточных процессов, таких как митоз, мейоз, формирование новых органелл и т.д.

Для сохранения замкнутости объемов делящихся структур деление соединяющего их мембранного перешейка должно сопровождаться формированием, так называемой, структуры полуделения, когда внутренний монослой перешейка локально сливается, а внешний остается интактным [Кх^оУБку ¥., Ког1оу М. (2003)]. Эти перестройки сопряжены с большими изгибными деформациями мембраны. В клеточных системах они создаются за счет кооперативного взаимодействия белковых структур, собирающихся на» поверхности перешейка, который при этом зачастую представляет собой цилиндрическую мембранную нанотрубку (НТ) [Вгос1ш а1 (2000)].

Согласно последним исследованиям критическим параметром деления мембранного перешейкаявляется его радиус в самом тонком месте [Ког1оу М.М.

1999, ВазЫагоу е{;. а1. 2008], значение которого должно определяться физикохимическими свойства липидного бислоя. Однако связанные с мембраной белки сильно затрудняют интерпретацию измеряемых критических параметров деления из-за наличия белок - белковых и белок - мембранных взаимодействий.

В нашей лаборатории разработана методика вытягивания нанотрубок из плоской бислойной липидной мембраны с помощью пэтч-пипетки [Рго1оу УА et а1

2003)]. Радиус получаемых таким образом НТ сопоставим с радиусом мембранного перешейка, образующегося в результате эндоцитоза.

Электрохимические методы позволяют вести наблюдение за ионной проводимостью внутреннего просвета НТ в режиме реального времени, а также 4 определять геометрические и механические параметры НТ [Башкиров 2007]. Поэтому мембранные НТ представляют собой удобную модель для исследования процесса "безбелкового" деления липидного бислоя и выявления его критических параметров, что является важной и актуальной задачей необходимой для развития общей теории деления мембран и детального описания молекулярного механизма, лежащего в его основе в различных клеточных процессах.

Обзор литературы.

Структура биологических мембран. Биологическая мембрана — это динамическая высокоорганизованная система. Биологическая мембрана состоит из участков липидного бислоя и белковых макромолекул, лежащих на поверхности или прошивающих мембрану насквозь (жидко-мозаичная модель Сингера и Николсона) [Singer S.J., Nicolson G.L. (1972)].

Основные структурообразующие липиды биологических мембран являются амфифильными соединениями. Они состоят из полярной головки и неполярного углеводородного хвоста. Среди них важнейшую роль играют фосфолипиды, у которых два хвоста и головка, содержащая фосатную группу, связаны с глицерином.

Основным структурным компонентом мембраны является липидный бислой. Впервые эта гипотеза была предложена Даниэлли и Давсоном в 1935 г. в унитарной модели биологической мембраны [Danielli J.F., Davson Н. (1935)].

Липиды, входящие в состав клеточной мембраны, обычно имеют нейтральный или отрицательный заряд и представлены в различном соотношении. В общем липидный состав мембраны выглядит примерно так:

Липиды Заряд головной группы Процент содержания (диапазон)

Фосфоглицериды 0 - -2 50-90%

Фосфатидилхолин 0 40-60%

Фо сфатидилэтано ламин 0 20-30%

Фосфатидилсерин -1 5-15%

Кардиолипин -2 0-20%

Фосфатидилинозитол- -1 5-10%

Сфингомиелин 0 5-20%

Холестерин 0 0-10%

Таблица 1. Содержание различных липидов в составе клеточных мембран.

Относительное содержание липидов и белков в мембране примерно одинаково [Woodin A.M., Wieneke A.A. (1966)]. Согласно современной точке зрения не весь липид в составе биологической мембраны находится исключительно в жидкокристаллическом фазовом состоянии [Chapman D. (1966)]. Частично липид в составе мебраны находится в жидко-упорядоченном состоянии. Упорядоченная фаза обычно формирует домены, содержащие большое количество сфинголипидов и холестерина [Brown D.A., London Е. (1998)]. Они называются «рафтами». В состав рафта входит небольшое число молекул, порядка десятков или сотен [Edidin М. (2001)]. Их образование часто наблюдают вокруг трансмембранных белков [Brown D.A., London Е. (1998)]. Ассоциация белков с рафтами играет определенную роль в функционировании клеточной мембраны.

Она может выражаться, например, в усилении передачи сигнала через высокоафинный рецептор для IgE, связанный с рафтом [Brown D.A. and London Е. (1998)].

Молекулы липнда в составе бислоя ориентированы таким образом, что полярные головки находятся снаружи и контактируют с водой, а гидрофобные ацильные цепи обращены друг к другу. Площадь, приходящаяся на одну

2 2 , судя по данным Н

ЯМР [Seelig J., Seelig А. (1980)].

При физиологических температурах основная масса липидов в биологических мембранах находится в ламеллярной жидко-кристаллической фазе L«. По данным дифракции рентгеновских лучей, прилегающие к полярным головкам участки углеводородных цепей довольно жестко фиксированы, а ацильные цепи в центре бислоя обладают высокой подвижностью [Seeling J., Browning J.L. (1978)]. В жидком состоянии мембраны молекулы белков и липидов могут диффундировать вдоль поверхности мембраны с довольно высокой скоростью. Коэффициент диффузии белков - 3-Ю"10 см2с-1, липидов - 3-10"8 cmV1 [Jacobson К. (1983)]. При понижении температуры липиды переходят в ламеллярную гелевую фазу Lp.'В этой фазе молекулы упакованы.более плотно, а ацильные цепи намного более упорядочены и находятся в полностью-транс-конфигурации. Поскольку цепи максимально вытянуты, толщина бислоя в фазе геля выше, чем в жидкокристаллической фазе. Температуру фазового перехода обычно называют температурой плавления Tf. Жидкокристаллическое состояние липидного матрикса имеет важное значение для нормального функционирования биомембран. Изменение фазового 8 состояния липидного бислоя сказывается на «транспорте веществ через мембрану и функциональном состоянии связанных с ней белков.

Кроме фазового состояния для нормального функционирования биомембран важны и механические свойства липидного бислоя. Это обусловлено тем, что многие физиологические процессы связаны с трансформацией форм как самой клетки, так и ее органелл, и появлением в мембране упругих натяжений [Evans Е.А., Hochmuth R.M. (1976)].

Искусственные мембраны. Для изучения свойств липидного матрикса широко» применяются искусственные системы. Их можно разделить на три типа: монослои, плоские бислои и липосомы.

Монослои. Молекулы липида адсорбируются на границе раздела фаз вода -воздух, образуя мономолекулярный слой. При этом головки ориентированы к воде, а хвосты обращены в воздух. Такой слой можно исследовать либо непосредственно на границе раздела, либо перенеся его на подложку. Такие монослои традиционно изучают с помощью весов Лэнгмюра. Для формирования нерастворимого монослоя известное количество липида в летучем растворителе наносят на поверхность воды. Весы Лэнгмюра позволяют точно измерить площадь поверхности А и поверхностное давление монослоя ж. Следует отметить, что давление ж, измеренное для монослоя, на самом деле представляет собой разность между поверхностным натяжением на поверхности с нанесенным монослоем у и поверхностным натяжением на границе раздела вода — воздух без монослоя у0: ж = (у0- у).

Возможность точно измерять площадь А и давление ж сделало метод особенно полезным не только для изучения липидов, способных формировать монослой на границе раздела фаз, но и для изучения таких ферментов, как липазы, которые функционируют на границе раздела липид - вода [Dennis Е.А. (1983)].

Плоские бислои. Попытки сформировать устойчивые липидные бислои предпринимались в ряде работ [Danielli J.F. (1936)] [Lengmuir J. (1938)]. Но впервые устойчивые плоские бислои удалось получить Мюллеру и др. [Mueller

P.et al (1962)] путем нанесения капельки раствора липида на отверстие в 0 перегородке двухкамерной тефлоновой ячейки, заполненной электролитом. По мере утончения капелька липидного раствора превращалась, из толстой «цветной» пленки в «черную» бислойную мембрану, имеющую толщину 30-60 Â. Формируемые по методу Мюллера мембраны включали значительное количество органического растворителя, что отражалось на их толщине и других свойствах. В связи с этим возникла необходимость получения мембран, не содержащих растворителя. Эта задача была решена Монталом с соавторами [Montai M. et al (1974)]. Кроме метода сведения монослоев для получения «сухих» мембран применяются и другие методы. Можно формировать плоскую мембрану из монослоя на границе раздела фаз раствора« и на кончике пипетки, погружая ее в раствор под положительным давлением, затем вынимая. Потом пипетку снова погружают в раствор, и на ее кончике формируется бислой.

Важным преимуществом плоских мембран является возможность проведения на них электрических измерений. Эта система особенно полезна для изучения пор, каналов и переносчиков, которые отвечают за процесс переноса заряда через бислой.

Липосомы. Многие фосфолипиды при диспергировании в воде самопроизвольно образуют гетерогенную смесь везикулярных структур. Это свойство амфифильных молекул было отмечено еще в 1913 году МакБейном [МсВат (1913)]

Обычно липосомы получают путем встряхивания или обработки ультразвуком водных суспензий фосфолипидов. Метод основан на том, что липид формирует монослойную пленку на границе раздела вода-воздух. Искусственно создаваемые возмущения на поверхности воды приводят к формированию двух видов сферических мицелл: те, в которых содержится воздух, и те, в которых содержится вода. Мицеллы с воздухом нестабильны, поэтому сливаются с поверхностью раздела. Мицеллы с водой стабилизируются в воде, набирая растворенные молекулы липида во внешний монослой. Липосомы могут быть сформированы из индивидуальных фосфолипидов, как природных, так и синтетических, а также из смеси фосфолипидов.

В изучении свойств клеточных мембран большую роль играют гигантские униламеллярные везикулы, в которых липид формирует единый бислой.

Механические параметры Б JIM и методы их определения. В последнее время исследования показали, что мембраны ведут себя как двумерные конгломераты линейно-упругих полимеров [Evans Е., Rawics W. (1990)]. В большинстве случаев конфигурационная энтропия ацильных цепей вносит основной вклад в свободную энергию мембраны, определяя форму поверхности. Так же как полимерная цепь, поверхность эластичной мембраны при высоких температурах принимает "мятые" формы. На макроскопическом уровне физические свойства мембран определяются её поведением при изгибах и растяжениях [Hamm М. and Kozlov М.М.]. Изгибная энергия характеризуется модулем изгиба /?, принимающим значения ~10 кТ на монослой. Энергия растяжения характеризуется модулем растяжения-сжатия Кл, принимающим значения -200 мН/м. Типичный пример - температурные колебания плоских и изогнутых БЛМ, обладающих большой площадью, и резкие изменения формы замкнутых мембран - везикул и клеток. Теория, успешно описывающая деформации и свободную энергию мембраны, была предложена Хельфрихом [Deuling H.J., Helfrich W. (1976)].

Рис. 1 Изогнутая пленка с обозначенными главными кривизнами Cj = 1/Rj и С2 = 1/R-2- Полная кривизна определяется как J = Ci + С2 и Гауссова кривизна как К2 = CiC2. Для цилиндра J = Cj К= 0, для сферы J/2 = Су = С2 = К [Marsh D. (2006)].

Суть этой теории заключается в том, что мембрана представляется сплошной плёнкой и, соответственно, единственными переменными, определяющими энергетику системы являются характеристики кривизны [Не1£пс11 W. (1973)]. Это полная I и Гауссова К кривизны. Энергия изгиба мембраны в таком случае записывается следующим образом

Е = \ , (1), У где ^ - площадь поверхности, ¡5 - локальный модуль изгиба, р' - нелокальный модуль изгиба и/в- спонтанная кривизна. J и К выражаются через основные кривизны СI, С2 = С]+С2, К2 = С ¡С2, см. рис. 1 и подписи к нему). Для примера имеет смысл рассмотреть два простых случая формы бислоя: сферу и цилиндр. В рассмотрении для простоты не будем учитывать спонтанную кривизну, т.к. суммарная спонтанная кривизна симметричного бислоя равна нулю, в то время как спонтанные кривизны монослоев могут быть отличны от нуля.

Для сферы главные кривизны одинаковы и равны С/ = С2 = 1/г. Энергия изгиба сферической мембраны запишется как

1 . Л* л^Р 1 2 + — \Г О (2).

Площадь поверхности сферы составляет А = 4тгГ. Окончательное выражение для энергии изгиба сферы имеет вид

Е = —-^-4яг2 -Ътфл-Ъф1 (3^

2 г 2 г 4

Получается, что сферический бислой любого радиуса обладает одинаковой изгибной энергией.

В случае цилиндра только одна из главных кривизн отлична от нуля и составляет Су = 1/г, в то время как другая равна нулю С2 =;; 0. Гауссова кривизна равна нулю. Записываем энергию изгиба цилиндрической мембраны еЛ 2

1+0 1 Л (4).

Площадь поверхности цилиндра равна А = 2жгЬ. Изгибная энергия цилиндрической мембраны будет определяться выражением Р 1 „ г о1

2 Г г 4 '

Изгибная энергия цилиндрической мембраны, в отличии от сферической, зависит от его длины Ь и радиуса г.

В системе с плоской БЛМ липид распределен между собственно бислоем и мениском. Свободная энергия липида в бислое и стандартный химический потенциал в мениске различны, что в равновесии приводит к появлению латерального натяжения а на поверхности. К выражению для энергии добавляется член, определяемый натяжением: оА, где А - площадь поверхности мембраны. Способность менять локально натяжение играет огромную роль в нормальном функционировании клетки. В работе [Dai J. et al (1997)] было показано, что процессы экзо- и эндоцитоза в клетке напрямую связаны с натяжением на мембране: чем больше натяжение тем меньше способность клетки к этим процессам. Таким же образом большое натяжение влияет и на АТФазную активность миозина при мышечном сокращении [Smith, et al (1995)].

О© С1Ш

4>о 4=о 4<о

Рис. 2 Иллюстрация формы молекулы липида в зависимости от спонтанной кривизны.

Большой ряд как теоретических, так и экспериментальных работ был посвящен изучению механических параметров мембраны в зависимости от липидного состава. Было показано, что основной вклад, определяющий механические свойства мембраны, вносит геометрия молекул образующих БЛМ. Основные типы геометрии липидной молекулы в зависимости от спонтанной кривизны приведены на рис. 2. А

Был введён безразмерный параметр упаковки [Izraelachvili (1985)] S= V/а/, где V

- объём гидрофобной части молекулы, а - площадь полярной головы и / — критическая длина гидрофобного хвоста, определяемая из выражения / = 1.5 + t »

1.265п с А, где п с — количество атомов углерода, погружённых в гидрофобную прослойку, обычно меньше чем полное количество атомов углерода. В зависимости от значения S липиды при гидратации образуют различные структуры, при S < Уз - сферические мицеллы, Уз < S < Уг — цилиндрические мицеллы (гексагональная фаза Нг), У> < S < 1 - бислой, и при S > 1 — гексагональная фаза Нц. В работе [Kumar V.V. (1991] было выдвинуто предположение, что параметр упаковки является аддитивной величиной, т.е. структуры, которые образуют смеси липидов, зависят от среднего значения S. В этой работе было показан линейный рост S для фосфатидилхолиновых (PC) мембран от мольной концентрации в них фосфатидлэтаноламина. (РЕ) и холестерина, так как для холестерина и РЕ S > 1, а для PC S = 0.7. Когда средний параметр упаковки достигал значения 1, липидная смесь не образовывала бислоя. В частности было показано, что для липидного состава РС:РЕ 1:1 S = 1.

Так же теоретические исследования показали, что основными параметрами, от которых зависит локальный модуль изгиба, являются толщина мембраны (J.-B. Fournier, 1998) и площадь приходящаяся на одну ацильную цепь [Szleifer I. et al (1988)]. Причём в последней работе было показано, что при увеличении площади с 30 А2 до 36 А2, модуль изгиба уменьшался с 38 кТ до 5 кТ . Особое внимание уделялось зависимости локального модуля изгиба Р от состава гидрофобной прослойки мембраны.

В процессе исследования было разработано несколько моделей для определения механических параметров БЛМ. Например, в работе [Chen Z., Rand R.P. (1997)] в качестве модели служили гексагональные (фаза Нп) липидные структуры, внутренний радиус которых зависел от значения локального модуля изгиба.

Рис. 3 Схематическая диаграмма структуры гексагональной фазы Нц. Указаны параметры, определяемые из рентгенографических данных и используемые для структурного и энергетического анализа [Chen Z., Rand R.P. (1997)].

Свободная энергия липида в фазе Нц аппроксимируется изгибной энергией F = V2ßAp(l/Rp-l/Rop)2, где ß - модуль изгиба, Ар и R0p - площадь молекулы и радиус спонтанной кривизны, считая от центральной плоскости. Параметр Rp определяются с помощью дифракции рентгеновских лучей. Энергия липида в составе фазы Нп определяется работой, произведенной осмотическим давлением П. В итоге получается TJRP = 2ß(l/Rp-l/R0p). Построив зависимость T7Rp2 от Rp, можно определить ß по углу наклона прямой и Rop по отсечению на оси ординат.

В результате получаются значения модуля изгиба от 9 (чистый DOPC) до 15,4 (30% холестерина) кТ при различных соотношениях DOPC/DOPE/Chol. Данная система содержит несколько недостатков. Во-первых в данной системе всегда присутствовал растворитель (16% - тетрадекана), во-вторых эта система геометрически сильно неоднородна: в одном месте хвосты молекул, образующих соседние цилиндры, находятся непосредственно вблизи друг к другу («соприкасаются»), в другом хвосты их обращены в растворитель («болтаются свободными»).

Другую модель предложил Эванс с коллегами. Они использовали в качестве модели везикулы [Evans Е., Rawics W. (1990)]. В свободном состоянии поверхность везикулы ундулирует, постоянно происходят мелкие деформации, поэтому видимая площадь мембраны меньше её истинного значения [Dobereiner, Evans (1996)]. Причём амплитуда этих колебаний зависит от температуры и модуля изгиба.

Apparent Area Expansion -^L Ten sior>~6.2 m N/m

Рис. 4 Зависимость видимого увеличения площади от натяжения и кадры видеомикроскопии при определении флуктуаций видимой площади мембраны [Evans Е., Rawics W. (1990)]. a) Везикула с низким натяжением. b) Везикула с высоким натяжением. Изменение проекции AL пропорционально изменению видимой площади А А.

Опыт заключался в следующем: мембрану всасывали в пипетку и смотрели, насколько изменяется её видимая площадь, после чего строили зависимость приращения площади от натяжения. Оно определялось всасывающим давлением в пипетке. При слабых натяжениях увеличение видимой площади обусловлено уменьшением амплитуд тепловых колебаний поверхности, площадь на одну липидую головку считается неизменной. Зависимость натяжения от увеличение видимой площади приближается экспонентой, откуда определяется модуль изгиба р. Форма зависимости относительного приращения площади а от натяжения <т имеет вид а = (кТ/8л/3)*1п(1+coA/j3) + а/КА, где с - коэффициент равный 1/24п% а А — видимая площадь, откуда 1п(о/аь) ~ (8я/3/кТ)АА/А0, где <70 начальное натяжение, ЛА - изменение видимой площади и А0 - начальная видимая площадь. При дальнейшем увеличении натяжения, когда уже исчезают флуктуации видимой площади везикулы, происходит увеличение площади, приходящейся на липидную головку. Рост увеличения видимой площади становится линейным, из чего определяется модуль растяжения-сжатия Кл. За нулевую точку бралось натяжение, при котором исчезали флуктуации видимой площади поверхности везикулы. Измеренные таким образом модули изгиба

1 *} составляли 0,44 - 2,46-10" дин-см.

Хенриксен и Ипсен использовали тот же метод, что и Эванс. В своей работе [Henriksen J.R., Ipsen J.H. (2004)] они более подробно анализировали геометрию везикулы и учитывали поправку на растяжение мембраны (изменение площади на молекулу липида) в условиях низкого натяжения. В результате значения модуля изгиба для аналогичных мембран получались примерно в полтора раза больше, чем у Эванса с кол., 34,2 - 40,7 кТ.

Еще один способ определения модуля изгиба был предложен в работе [William С. et al (1997)] как следствие определения энергии связи мембраны с цитоскелетом. Клетка с адсорбированными латексными шариками всасывается в микропипетку. Шарик ловится в вилочку V-образного кантеливера и оттаскивается с постоянной скоростью, вытягивая за собой трубочку. fiber deflection microptpette

2R

1er her Z * V w I p p* tatex bead

Рис. 5 Схема опыта определения энергии связи мембраны клетки с цитоскелетом и значения модуля изгиба [William С. et al (1997)].

Выражение для определения модуля изгиба выглядит следующим образом: ß = ß.t/2ir, f - измеряемая по отклонению кантеливера сила, R, - радиус трубки. Он определяется с помощью оптического микроскопа из выражения R, = Rp(-dLp/dLJ (I-R/RJ, Rp - радиус пипетки, Rc - радиус клетки, Lp - длина затянутой в пипетку части клетки, L, - длина трубки. Измеренный в данной работе изгибный модуль мембраны красной кровяной клетки составил 2.0-1С)"19 Дж.

Было показано, что ß кардинальным образом зависит от длины хвоста липида и от количества двойных связей [Rawics W. et al (2000)]. Если для липидов с 13-ю углеродами 0.56* 10"19 Дж, то с 18-ю атомами углерода 0.92*10"19Дж, в то время как для той же молекулы липида с двумя и с тремя двойными связями 0.44*10"19 Дж и 0.38* 10"19 Дж соответственно. Та же самая зависимость локального модуля изгиба от длин гидрофобных хвостов была получена в теоретической работе [Szleifer I. et al and Didier R., Gelbart W.M. (1988)]. Причём в этой работе было отмечено, что локальный модуль изгиба для мембраны, образованной из смеси короткоцепочечных и длинноцепочечных молекул иногда меньше, чем для однокомпонентных мембран.

Эндоцитоз. Плазматическая мембрана является поверхностью, через которую клетки взаимодействуют с окружающей средой. Для правильного взаимодействия клетки с окружающей средой состав и свойства плазматической мембраны должны своевременно регулироваться клеткой.

Эндоцитоз представляет собой образование внутренних мембранных структур из плазматической мембраны. В этом процессе липидный бислой вместе с трансмембранными белками и частью внеклеточного раствора полностью оказывается внутри клетки.

В результате экзоцитоза вновь синтезированные липиды и белки транспортируются на поверхность мембраны.

Большое количество работ сосредоточено на изучении клатрин-опосредованного эндоцитоза. Большинство белков, участвующих в формировании интермедиатов этого вида эндоцитоза хорошо изучено. о Y Y

Рис. 6 Схематическое изображение этапов эндоцитоза [Doherty G.J. and McMahon H.T. (2009)].

Все начинается со связывания рецептора с белком адаптином, который катализирует сборку клатриновой оболочки формирующейся везикулы [Schmid Е.М., McMahon H.T. (2007)]. На этой стадии важную роль играют белки-адапторы клатрина [Schmid Е.М. et al (2006)], создающие начальную инвагинацию плазматической мембраны. Искривление мембраны происходит за счет взаимодействия так называемого BAR домена этих белков с липидным бислоем [Peter B.J et al (2004)]. Есть версия, что изменение кривизны липидного бислоя происходит спонтанно под действием тепловых флуктуаций [Frost A. et al (2009)], a BAR домен белка играет роль фиксатора этого изменения. Важную роль в изменении формы мембраны играют не только белки, но и сами липиды, из которых она состоит. В дополнение к кривизне, создаваемой белками, искривление происходит и за счет локального изменения молекулярной геометрии липидов. На внутренней стороне плазматической мембраны клетки действует фермент фосфолипаза; она гидролизует головку фосолипида, что приводит к отщеплению одного углеводородного хвоста. В результате молекула липида приобретает форму обратного конуса, что ведет к изменению значения спонтанной кривизны монослоя в положительную сторону [Chen Y.G. et al (1997)]. Наличие положительной кривизны на внутреннем монослое плазматической мембраны способствует ее прогибу и образованию сферической везикулы. Этот эффект увеличивается, если спонтанная кривизна внешнего монослоя становится отрицательной. Такое наблюдается при. формировании и отделении везикул от аппарата Гольджи. Специальный фермент CtBP3/BARS добавляет углеводородный хвост лизолипиду, придавая молекуле форму конуса с отрицательной кривизной [Weigert R. et al (1999)]. Таким образом, связанный с рецептором адаптер указывает место плазматической мембраны, в котором начнется формирование окаймленной ямки.

К белку-адаптору присоединяется клатрин [Wolfe , B.L., Trejo J*. (2007).

Функциональная единица клатрина представляет собой тример в виде трехконечной звезды [Crowther R.A., Pearse В.М. (1981)]. Центром он связывается с белком-адаптором, а лучами между собой. В результате объединения таких тримеров образуется структура, напоминающая футбольный мяч. Образование клатринового покрытия на мембране влечет за собой изменение ее формы и продавливание внутрь. Дальнейшая- полимеризация клатрина приводит превращению ямки в сферическую везикулу, связанную с

24 плазматической мембраной тонким перешейком. На нем1 полимеризуется белок деления динамин [Hinshaw J.E. (2000)]. Он использует энергию, запасенную в трифосфате ГТФ, для деления мембранного перешейка [Oh Р. et al (1998)].

Деление перешейка может происходить и без участия белка динамина. В этом случае происходит его сильное сжатие за счет BARS доменов клатринового комплекса [Spang, А. et al (1998)]. Оно дополняется^ работой фосфолипазы D2, добавляющей положительную кривизну внешнему монослою [Jia-Shu Yang et al. (2008)]. За счет этого происходит деление мембраны перешейка.

В результате окаймленная , клатрином везикула замыкается и' отделяется от плазматической мембраны. Внутри клетки клатриновая оболочка везикулы разбирается с помощью белков ауксина и БТШ70 [Xing Y. et al- (2010)]. Освободившаяся от оболочки! везикула использует транспортные пути клетки, чтобы в.конце концов доставить свой груз к месту назначения-путем слияния с внутриклеточным мембранным компонентом [Clague M.J. et al (1998)].

65% вирусов гриппа попадают в клетку путем клатрин-опосредованного эндоцитоза, остальные используют другие виды эндоцитоза, чтобы в конечном счете оказаться в области ядра клетки.[Marsh М, Helenius (2006)].

Из всех этапов формирования* эндосомы в процессе эндоцитоза наиболее интересным с точки зрения науки о мембранах является отделение сформированной везикулы от плазматической мембраны. Этот процесс сопряжен с возникновением больших изгибных деформаций мембраны, приводящих к их топологической перестройке. В результате происходит формирование независимых мембранных,структур. При этом должна сохраняться замкнутость

25 объемов делящихся структур. Это достигается формированием, так называемой структуры полуделения [Y. Kozlovsky and М.М. Kozlov (2003)]. Она представляет собой промежуточный этап деления мембраны, когда произошло слияние внутреннего монослоя, а внешнего еще нет.

Нанотрубка. В нашей лаборатории разработан метод вытягивания НТ с помощью пэтч-пипетки из плоской БЛМ в растворе электролита [V. A. Frolov et al (2003)]. Метод позволяет следить за состоянием вытягиваемой трубки по изменению проводимости ее внутреннего просвета. При увеличении расстояния между БЛМ и пэтч-пипеткой сначала образуется мембранная микротрубка (МТ), имеющая форму катеноида. Случай для симметричного катеноида описан в работе [Меликян Г.Б. и др. (1984)]. Его уравнением является кривая положение точки максимального сужения. В нашем случае он не симметричен, т.к. радиус плоской БЛМ составляет 50 рм., а радиус пэтч-пипетки около 1 рм . Для описания формы такого катеноида необходимо решение системы уравнений с граничными условиями катеноида в месте наибольшего сужения, Хо

L — н

Rx — а ■ ch^———^

Система уравнений имеет действительные решения при Ь < Ьс . Критическая длина зависит только от радиусов колец Я} и и равняется максимальному значению функции Ь(Я1,и2,а)

L(Rl,Rz,a) = a

С R R ^ arccos /?(—) + arccos /?(—) а а у

Lc = max{L(^! ,R2,a),a = O.J?,} (7).

Формально уравнение катеноида получается из задачи на нахождение минимальной площади квазицилиндрической поверхности, стягивающей два кольца [Platen J.А. (1863)]. Поэтому катеноид хорошо описывает форму МТ только когда основной вклад в энергию дает поверхностное натяжение [Меликян Г.Б. и др. 1984]. Однако если учесть изгибную энергию, то функционал полной энергии запишется в виде

F = |^+|(C1+C2-U^dA (8), где о - латеральное натяжение, /? - модуль изгиба, С; и С? - главные кривизны, Jo - спонтанная кривизна. Для мембран с нулевой спонтанной кривизной решением будет снова катеноид, так как он обладает нулевой суммарной кривизной в каждой точке, что выполняется при условии свободных концов (граница в виде кольца не гнет БЛМ, т.е. изгибный момент равен нулю). Таким образом, в системах с масштабами до нескольких микрометров энергия МТ определяется исключительно натяжением.

0.90

0.80

ОЛО

Е/Е1 1.10

1.00

О 0,2 0.4 ОЛ 0.Я 1 ии

Рис.7 Энергия, отнесенная к энергии двух плоских мембран на концах, микротрубки (треугольники), нанотрубки (ромбики) и нестабильного катеноида (кружки). Стрелки обозначают переход между микротрубкой и нанотрубкой.

На рис. 7 показана зависимость энергии МТ, НТ и неустойчивого катеноида от длины. Неустойчивый катеноид тоже является решением задачи о минимизации энергии системы, но в отличии от устойчивого катеноида имеет максимальную площадь для семейства поверхностей, удовлетворяющих граничным условиям (7). Энергия нормирована на сумму энергий двух дисков радиуса Я] = \ рм. и Я2 = 50 (хм., длина нормирована на £с.Так как поверхностная энергия МТ описывается линейной функцией площади, то можно сделать вывод, что I площадь растет пр увеличении длины МТ. При длине ~0,8 Ьс площадь катеноида равна сумме площадей дисков, т.е. в этой точке энергия поверхностного натяжения МТ сравнима с энергией двух плоских мембран. Однако МТ в этой точке остается стабильной. Только при достижении Ьс МТ теряет стабильность и переходит в НТ (на рис. 7 это показано стрелкой). Такое поведение обусловлено наличием-1 энергетического барьера для перехода МТ в НТ. Предполагается, что" величина барьера определяется разницей энергий устойчивого и неустойчивого катеноидов. При Ь = Ьс энергии устойчивого и неустойчивого катеноидов сравниваются. В этой точке, являющейся точкой бифуркации, исчезает локальный минимум энергии, соответствующий устойчивому решению задачи минимизации энергии, и катеноид претерпевает коллапс. Энергия НТ много меньше энергии двух плоских мембран, поэтому ее можно не учитывать на данном этапе.

Обратный переход НТ в МТ показан стрелкой от синей к черной-кривой. Такой переход становится возможным при Ь <0,8 Ьс так-как энергия МТ становится» меньше энергии двух плоских мембран, связанных НТ. Величина энергетического- барьера определяется разницей- энергий двух плоских мембран и неустойчивого-катеноида1. Из рис. видно, что величина барьера резко убывает с уменьшением длины НТ (разница между красной и синей кривыми). При длине меньше 0,4ЬС энергии тепловых флуктуаций- становится* достаточно для* преодоления энергетического барьера, и НТ переходит в МТ.

Липидная нанотрубка может служить удобной» моделью для изучения деления мембран. Деление трубок, вытянутых из липосом, наблюдалось в работе [Коих

А. е1 а1 (2005)]. Липидный состав подбирался таким образом, чтобы в мембране липосомы присутствовали обе фазы. В трубке, вытянутой из такой липосомы, преобладает фаза Ь(Ъ в то время как в самой липомоме большая часть поверхности находится в фазе Из чего делался вывод о перераспределении

29 липида при формировании нанотрубки (фазы L„ и Lp имеют различный липидный состав). Деление инициировалось индукцией фазового разделения в трубке. Из теоретических оценок следует, что при доведении диаметра мембранного перешейка до критических размеров происходит спонтанное деление мембран через промежуточное состояние, т.н.структура полуделения [Kozlovsky Y. and Kozlov M.M. (2003)]. Используя имеющуюся модельную систему можно добиться деления трубки, прикладывая разность давлений между полостью трубки и внешним раствором. Либо можно использовать белки деления, например, динамин. Так, в работе [Danino D. et al. (2004)] использовалась смесь динамина с липосомами, за которой наблюдали с помощью криоэлектронной микроскопии. Динамин, сорбируясь на поверхности мембраны, сам делает из липосом вытянутые цилиндрические трубки. Добавление ГТФ к такой системе приводило к разделению покрытых динамином мембранных трубок на множество фрагментов. На основе анализа полученных данных делается вывод о том, что динамин является механохимической машиной, способной индуцировать перестройки в липидном бислое. Однако, используя данные методы, не удалось ответить на вопрос: как и какие именно перестройки индуцируются в липидном бислое при сжатии его динамином.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключается в исследовании механизма "безбелкового" деления липидного бислоя и в определении критических параметров данного процесса с использованием электрохимических методов в модельной системе, представляющей собой липидную НТ, вытянутую из плоской бислойной мембраны. Для этого была разработана экспериментальная система, позволяющая контролируемым образом изменять радиус кривизны НТ вплоть до ее деления. Сжатие осуществлялось с помощью осмотического давления. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать возможность использования разности концентрации соли между растворами электролита внутри и снаружи НТ для контролируемого изменения радиуса ее внутреннего просвета. Подобрать наиболее оптимальные экспериментальные условия для проведения работ по исследованию "безбелкового" деления НТ.

2) Определить зависимость механических свойств НТ от липидного состава и ионной силы раствора электролита.

3) Исследовать особенности процесса "безбелкового" деления НТ и определить его критические параметры в зависимости от липидного состава мембраны.

4) На основе полученных и литературных данных предложить модель "безбелкового" деления НТ.

Материалы и методы.

Формирование мембраны. Мембраны формировали по методу Рудина-Мюллера на отверстии в специальной ячейке, заполненной электролитом. В экспериментах использовались следующие растворы липидов в хлороформе 10 мг/мл 1,2-диолиалил-5п-глицеро-3-фосфатидилхолин (DOPC), 1,2-диолиалил-8п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE) и холестерин (Cholesterol) (Avanti Polar Lipids Inc., США) в сквалане.

Использовались буферные растворы с различной ионной силой от 0.01 М KCl до 0.5 М KCl, 10 мМ HEPES pH 7.0. Отверстие обрабатывалось раствором липида 10 мг/мл в октане и высушивалось в аргоне. После погружения ячейки в раствор электролита на отверстие кисточкой наносилась капля раствора липида в сквалане (Sigma, Германия), которая в течение нескольких минут спонтанно образовывала бислойную липидную мембрану (БЛМ).

Формирование НТ и измерение её проводимости. Для формирования и исследования свойств мембран и НТ использовали установку, состоящую из универсального генератора PAR-175 (Princeton Applied Research, США), пэтч-кламп усилителя ЕРС-8 (Warner Instruments Corp., США), четырехполюсного фильтра F-900 (Frequency Devices, США) и осциллографа OS-1420 (GOULD, Англия). Для контроля положения пипетки использовали контролеры движения Newport Motion Controller (Model 860-C2) и Newport |i-Drive Controller (Model

ESA-CSA). Последний - для более плавного перемещения (пьезоконтролер). Bf режиме фиксации потенциала (voltage-clamp режим усилителя-* РС-505) на мембрану с помощью РС-505 подавалось постоянное либо переменное напряжение. Данные: ток через НТ, преобразованный пэтч-кламп усилителем в напряжение (коэффициенты усиления от 1мВ/пА до ЗОмВ/пА), командные потенциалы и данные с индикатора пьезоконтролера, записывались на жесткий диск компьютера после предварительной оцифровки с помощью АЦП L-1210 (L-card, Россия). Частота опроса- была 1 кГц, перед вводом,в компьютер сигналы пропускались через фильтр низких частот (F-900); частота среза-устанавливалась в. 2 раза меньше частоты опроса: Для управления платами сбора данных семейства L-card и последующей обработки оцифрованного сигнала использовалось программное обеспечение, ранее разработанное в лаборатории. Общая* схема установки, на которой проводились» измерения, представлена на рис. 8.

В экспериментах с регистрацией проводимости НТ исходная мембрана формировалась на отверстии диаметром -100 рм в тефлоновой. пленке, расположенной горизонтально. В* процессе формирования Б JIM на хлорсеребряные электроды посредством пэтч-кламп усилителя подавался пилообразный сигнал с генератора и измерялся емкостный ток через мембрану.

Процесс образования липидного бислоя фиксировался по резкому увеличению емкости и одновременно по исчезновению изображения в микроскопе (толщина

БЛМ ~ 40А - много меньше длины волны видимого света). Затем с помощью пьезо контроллера пипетка подводилась вплотную к мембране, и образовывался плотный контакт между кончиком микропипетки и мембраной (сопротивление контакта более 10 ГОм), что было видно по исчезновению ёмкостного тока. Для разрушения мембраны в месте контакта в пипетке скачком менялось гидростатическое давление, что приводило к появлению тока проводимости. После этого на пипетку подавалось постоянное напряжение 25-200 мВ.

20 ММ

Рис. 8 Установка для регистрации электрического тока проводимости через раствор электролита внутри мембранного перешейка.

1 - НТ, сформированная из БЛМ,

2 - Пэтч-кламп усилитель ЕРС-8

3 - АЦП, Ь-сагс! Ь-1210

4 - Компьютер.

Для плавного вытягивания НТ применялся пьезоконроллер, позволяющий менять длину НТ с точностью до 0,1 мкм. Микропипетка равномерно отводилась до момента коллапса МТ в НТ. пэтч-кламп усилитель пэтч-кламп усилитель I е&В

Рис. 9 Схема формирования нанотрубок а - исходная плоская бислойная мембрана б - образования плотного контакта между пипеткой и мембраной в - формирования МТ г - формирование НТ.

При переходе МТ в НТ ток проводимости резко падал на несколько поядков, после чего движение пипетки останавливалось. Дальше усиливали сигнал от тока проводимости в 10-30 раз и, приближая пьезоконтролером пипетку к мембране, снимали изменения тока проводимости. Если наблюдалось увеличение тока, то можно было сказать о наличии НТ между пипеткой и мембраной. После чего снимали зависимость силы тока проводимости от положения микропипетки. Л

ЖК-М

I ' I

208 216 224 232 время, сек

G, пСм

G, нСм

Рис. 10 Данные, регистрируемые во время эксперимента. Верхний график -изменение проводимости со временем, нижний - изменение положения пипетки со временем. В самом верху схематически отображено состояние мембранной трубки (МТ или НТ)

1 - постепенное уменьшение проводимости МП с увеличением длины заканчивается коллапсом (шкала в нС)

2 - последующее увеличение длины приводит к росту проводимости МН и переходу ее в МН (шкала в пС)

Определение радиуса НТ. Для оценки геометрических параметров НТ строились зависимости проводимости от положения микропипетки. Для этого показания, снятые с пьезоконтроллера в милливольтах, переводились в микрометры с помощью заранее снятой калибровочной кривой. Проводимость получали, исходя из простого соотношения G = I/U, где U - подаваемый на пипетку потенциал, а / - ток проводимости, определяемый по формуле / = V/k, мкм

376 380 384 388 392 время, сек где V - сигнал тока проводимости (измеряемый в мВ), а к — коэффициент усиления пэтч-кламп усилителя. Используя программное обеспечение Origin 7.5, строили зависимость проводимости G (пС) от положения микропипетки L (|дм). Проводимость цилиндрической трубы вычисляется по формуле

G = (9), pL где ГуГ - радиус полости трубки, L - длинна трубки, ар- удельное сопротивление раствора. В опыте мы регистрируем только смещение микропипетки по вертикальной оси и не знаем истиной длины НТ. Также измеряемая нами проводимость включает в себя ток утечки в месте контакта мембраны с микропипеткой. Полученную зависимость проводимости от длины с учётом неопределённости начального значения длины (считаем, что при изменении положения микропипетки меняется только длина НТ) и проводимости аппроксимировали гиперболической функцией следующего вида

G=lfk+i'3 (10)' где pi - проводимость НТ единичной длины, р2 - офсет длины, рЗ - офсет проводимости. Аппроксимация проводилась методом наименьших квадратов. Соответственно радиус НТ определялся по формуле

800-, в, пС

600400200

0-Н-1-"-1-'-1-■-1-1-1

27 28 29 30 31

1-, |ХМ

Рис. 11 Экспериментальная зависимость проводимости нанотрубки от длины, аппроксимированная гиперболой.

Определение механических параметров НТ.

Выражение для энергии мембраны НТ запишем в виде

Е = |(сг+Ж +32-ЛМ [НеШсЬ (1973)] (12), где J^> J2 - главные кривизны мембранной поверхности, а ,]0 - спонтанная кривизна (в дальнейшем для нашей модели считаем равной нулю), р - модуль изгиба, а - латеральное натяжение. Если считать, что НТ представляет собой цилиндрическую мембранную поверхность длины Ь и радиуса г, то полная энергия такой системы будет находится по формуле:

Е = (13). г

Радиус внутреннего просвета НТ связан с радиусом нейтральной поверхности как г = гт + Ь/ 5 где к — толщина гидрофобной части БЛМ.

Из условия минимума значения свободной энергии, с1Е/с1г = 0, получаем уравнение, связывающее механические и геометрические параметры липидной нанотрубки:

Ч = (14). р т

Таким образом, экспериментально определяемый радиус просвета НТ г зависит от соотношения латерального натяжения и модуля изгиба. Для того чтобы определить каждый из них отдельно, необходимо контролируемым образом менять один из параметров.

Для этого рассмотрим цилиндрическую мембранную трубку, к концам которой приложено напряжение V (см. рисунок 12). Это приводит к появлению трансмембранного потенциала, который меняется от 0 со стороны земляного электрода до V со стороны пэтч-пипетки.

Рис. 12 Отклонение формы трубки от цилиндрической. Сверху подается напряжение С/, снизу и сбоку - 0. о

Натяжение вдоль оси такой НТ меняется в зависимости от трансмембранного потенциала и определяется по формуле Липпмана для НТ (см. формулу (пб) в Приложении). Это приводит к отклонению радиуса НТ от равновесного. Однако при таком отклонении сохраняется линейная зависимость электрического сопротивления НТ от ее длины. Это дает возможность в ходе эксперимента определить из гиперболической зависимости проводимости НТ от длины радиус Гф считая форму НТ эффективным цилиндром. Он имеет такую же длину и сопротивление, как и искривленная приложенным напряжением НТ. Определяемый радиус эффективного цилиндра связан с механическими параметрами НТ и приложенным напряжением следующим образом:

1 =2ст0 СЯЦ2 п .

4 Р ЪР ^ где Ст - удельная емкость мембраны И - толщина гидрофобной части БЛМ.

Подробный вывод формулы (15) описан в Приложении.

В процессе измерений на мембрану подавалось напряжение от 25 до 200 мВ и определялся радиус нанотрубки. Строилась зависимость —Ц- от и2, которую г еДГ аппроксимировали прямой. Из ее наклона находилось значение Р, а из свободного члена — значение ао. и2, мВ2

Рис. 13 Зависимость обратного квадрата радиуса НТ от квадрата напряжения, подаваемого на мембрану. Из угла наклона находится значение локального модуля изгиба, а из точки пересечения с осью ординат значение латерального натяжения.

Результаты и обсуждение

Возможность использования осмотического давления для сжатия и деления НТ. В процессе деления происходит сильное сжатие перешейка, соединяющего делящиеся мембраны [Ког1оу М.М. 1999, ВаБЫогоу е!:. а1. 2008]. В клетках такое сжатие осуществляется специализированными белковыми машинами. В представленной работе сжатие НТ осуществлялось осмотическим давлением, путем повышения концентрации соли в окружающем НТ растворе.

Проницаемость бислойной липидной мембраны для воды (50цм/с) на несколько порядков превосходит проницаемость для небольших ионов (менее 10"6 цм/с), поэтому при увеличении концентрации соли в растворе электролита, Г окружающем НТ, возникает осмотический поток воды сквозь мембрану НТ из ее внутреннего канала наружу. В свою очередь отток воды из просвета НТ компенсируется ее притоком с отрытых концов нанотрубки. При этом внутри НТ развивается отрицательное избыточное давление, -Р, которое сжимает НТ. Если трубка короткая, то отток воды через ее боковую поверхность быстро компенсируется притоком с открытых концов и сжимающего давления не возникает. Однако если трубка имеет достаточную длину, такую что отток через боковую поверхность не успевает компенсироваться притоком с концов, то будет наблюдаться сжатие трубки. И чем больше длина трубки, тем менее скомпенсирован отток через боковую поверхность, что в предельном случае ведет к чисто осмотическому сжатию НТ вдалеке от свободных концов.

Рис. 14 Схема движения воды в НТ при появлении разности концентраций соли между внутренним просветом НТ и наружным раствором.

Все дальнейшие вычисления будем вести в двух приближениях: форма НТ мало отличается от цилиндрической, яРг/йЬ2 « 1 /г и радиус трубки, г = г0 + Аг, мало отклоняется от радиуса, г0, при нулевом осмотическом дисбалансе, А г « г0. Радиус НТ, г(х), и давление внутри, Р0 - Р(г), определяются двумя условиями: балансом потоков воды и механическим равновесием мембраны.

Рассмотрим поток воды, проходящий через участок трубки высотой йг. Общий поток воды 3 через сечение НТ состоит из входящего потока из верхнего или нижнего конца НТ и уходящего вдоль НТ и через ее стенки. Он описывается уравнением

УсЬ 20 ск т] У ЯТ) К где Р - разность гидростатического давления снаружи и внутри НТ, г] вязкость воды, У„ - молярный объем воды, р/ - коэффициент проницаемости

43 липидного бислоя для воды, А С — разница концентрации электролита снаружи и внутри НТ.

В стационарном случае для любого элементарного объема внутри трубки втекающий через верхнее сечение поток равен вытекающему через нижнее сечение и стенки НТ (рис. 14): ж4 d2P „ ,Р

-ТТ = 2m'v^P / - AC>/r 8Г] dz RT

17),

Далее, помещая начало координат в центр НТ и считая длину НТ равной 2Ь и Р(±Ь) = 0, из (17) находим зависимость гидростатического давления на стенки НТ от продольной координаты г

P(z) = A CRT г ( -cosh

1 — v А-ь у cosh

Lchj)

18), где LCh - характерная длина: L с!Г r RT 16// Vwpf

19).

Так, при L » Lch избыточное давление в центре НТ Р(0) = Posm= A CRT. Таким образом, заметное сжатие НТ возможно при фиксации НТ на длине, заведомо превышающей Lch и при создании достаточной разности концентраций соли между внутренним просветом НТ и окружающим раствором.

Условие механического равновесия задает связь между избыточным давлением Р и параметрами НТ г 2 г3 Р [Попов С.В. и др. (1991)]

20).

Для случая малых отклонений Лг радиуса нанотрубки г от равновесного значения г0 из выражений (18) и (20) и уравнения связи равновесного радиуса НТ с механическими параметрами мембраны (14) получим: д ßp^CRTß

4<Jn

4<7п с W cosh

Lch . cosh

LchJ

21).

Таким образом, при создании разности концентраций соли внутри и снаружи НТ будет возникать сжимающее гидростатическое давление, прямо пропорциональное разности концентраций соли. При этом сжатие в силу незамкнутости концов НТ происходит неравномерно вдоль продольной оси: наибольшее сжатие достигается в центре, что необходимо учитывать при интерпретации результатов.

Измерение модуля изгиба НТ в растворах различной ионной силы. В основе экспериментов по делению НТ лежит создание разности концентраций соли между ее внутренним просветом и окружающим раствором.

Для получения зависимости модуля изгиба от ионной силы раствора проводились измерения на нанотрубках, сформированных из DOPC с добавлением 40% холестерина, в растворах с различной концентрацией соли KCl, от 10 до 500 мМ. г, нм

10. 98 765 4

10 т-П

100

1000 [КС1], мМ

Р.кТ

40 л

30

20

10

0-+-ГТ-10

-гтт

100

1000

КС1], тМ

Рис. 15 Значения геометрических и механических параметров нанотрубки прп различной ионной силе раствора. а - значения радиуса нанотрубки при различных концентрациях электролита б - значения модуля изгиба при различных концентрациях электролита Каждая точка - результат усреднения по 3-5 экспериментам.

Из полученных данных видно, что измеряемые значения радиуса НТ и модуля изгиба не зависят от ионной силы раствора, в котором проводятся измерения.

Сохранение свойств-мембраны НТ в растворах различной ионной силы имеет большое значение для проведения дальнейших экспериментов по делению НТ. Если бы ионная сила влияла на механические параметры НТ, то появилась бы необходимость учитывать эти изменения при сжатии и делении НТ. Для липидов, имеющих заряд на гидрофильной головке, существует зависимость модуля изгиба от ионной силы.раствора. Так, жесткость мембран из БОРО (1,2-дио леоил-^и-глицеро-3-фо сфо-3-лизил-1 -глицерол), имеющего суммарный положительный заряд +2, возрастает при увеличении концентрации соли [ОаеззепБ М. М. А. Е. et а1 (2004)]. Наличие в мембране НТ заряженных липидов при подведении к ней пипетки с концентрированным раствором соли приводило бы изменению ее жесткости и соответственному изменению радиуса. Эти явления в- силу условий проведения эксперимента невозможно зафиксировать. Поэтому в нашем случае используются только нейтральные липиды.

Кроме того этот результат дает возможность обобщать данные по определению механических параметров мембран, полученные при использовании гигантских липосом, которые формируются исключительно в условиях низкой ионной силы, до 100 цМ

Осмотическое деление НТ. Для деления НТ необходимо обеспечить ее сильное локальное сужение [Kozlov М.М. 1999, Bashkirov et. al. 2008]. В качестве сжимающего фактора вместо белков.деления было использовано осмотическое давление, возникающее за счет повышения'концентрации соли в окружающем НТ растворе.

Для исследования деления НТ осмотическим давлением использовали НТ, вытягиваемые из БЛМ состоящих из фосфолипидов DOPC, DOPE и холестерина, чья концентрация варьировалась от 20 до 55 %. Радиусы таких НТ составляют, примерно, 5 нм. Из выражения (19) следует, что для Т= 300 К, Г] = 1 сПуаз, г = 5 нм, Vw = 18 мл/моль, pf= 50|1м/с [Olbrich К. et al (2000)], Lch = 0,8 \хм.

Для наблюдения эффекта, оказываемого изменением концентрации соли снаружи НТ на ее форму, длину НТ подбирали таким образом, чтобы ее значение превышало 2Lch и одновременно с этим отношение сигнала к шуму превышало 10. Обычно длина НТ составляла 2-3 мкм. Необходимая для деления НТ концентрация соли оценивалась по формуле (22), в предположении, что при этом изменение радиуса НТ Аг в самом узком месте (в середине НТ) должно быть порядка начального радиуса г0, т.е.

Р АСКТ 2 4<т0 2£70

Для длины НТ Ь = 1.5 мкм получается, что АС должно быть порядка 1М.

Необходимая концентрация соли в окружающем НТ растворе создавалась подведением к ней перфузионной пипетки с диаметром кончика 10-20 рм, заполненной концентрированным раствором хлорида калия ЗМ (рис 17). Разница гидростатического давления на границе кончика перфузионной пипетки с раствором равнялась нулю, так что концентрация КС1 около НТ увеличивалась только за счет диффузионных потоков. Пипетка подводилась сверху с помощью микромотора, а ее положение в горизонтальной плоскости регулировалось микро винтами. Пипетку подводили к НТ так, что расстояние от ее кончика до НТ составляло 10-20 рм, одновременно с этим регистрировали изменение проводимости О.

Рис. 16 Схема опыта по делению НТ.

1 - подведение пипетки с концентрированным раствором соли к НТ.

2 - Разница концентраций соли внутри и снаружи НТ приводит к появлению сжимающего давления.

3 - Деление сжатой НТ.

На рис. 17 приведены записи нормированной проводимости О с момента времени, предшествующего сжатию, которое показано на рис. 17а стрелкой, до падения проводимости в ноль. За единицу принята проводимость НТ в отсутствии внешнего воздействия. Сам момент подведения перфузионной пипетки к НТ на расстояние, необходимое для сжатия, в силу условий проведения эксперимента не мог быть точно фиксирован: при проведении эксперимента сначала пипетка подводилась сверху примерно на уровень пэтч-пипетки, а далее следовала корректировка ее положения в горизонтальной плоскости вплоть до момента заметного падения проводимости.

Рис. 17 Примеры изменения во времени нормированной проводимости О после приложения осмотического давления. Стрелкой на а отмечен момент, когда начинается падение проводимости, вызванное уменьшением радиуса просвета НТ. С* - уровень нормированной проводимости непосредственно перед актом деления. Л1 - время, за которое происходит падение проводимости на величину /Ю.т- время ожидания деления.

Изначально фиксированная на определенной длине 2Ь НТ имела стационарную проводимость Со (рис. 17а). Приложение внешнего давления (отмечено стрелкой на рис. 17а) в ряде случаев приводило к резкому падению проводимости на величину АС?, как видно- например, на рис. 17а и е., до некоторого нового стационарного значения проводимости Сг*. Более плавное падение проводимости представлено на рис. 176 и д. В случаях б и г имеются промежуточные скачки проводимости между началом ее падения и последним скачком до нуля. Природа этих скачков проводимости не ясна. После чего через некоторое время ожидания, которое варьировалось от 2 до 25 секунд проводимость резко (порядка 1 мс) и необратимо падала до 0, что свидетельствовало о делении НТ. Стоит отметить, что во всех экспериментах деление НТ не сопровождалось формированием проводящих дефектов, что свидетельствует о том, что деление НТ вызванное осмотическим сжатием, как и в клеточных системах, идет через образование структуры полуделения.

Так как длина НТ в ходе всего эксперимента фиксирована, то изменение проводимости обусловлено сжатием НТ. То есть в результате приложения внешнего давления НТ сжимается с исходного равновесного радиуса г до критического радиуса г*, при достижении которого происходит переход к делению.

Из предыдущих рассуждений следует, что гидростатическое давление распределяется неравномерно вдоль оси НТ. Оно практически отсутствует на концах и достигает максимального значения в середине. Для того, чтобы оценить наименьший радиус, до которого сжимается НТ, нужно учесть неравномерность ее сжатия и связать получившуюся форму с измеряемой экспериментально проводимостью.

Как видно из выражения (22) отклонение формы НТ от цилиндрической прямо пропорционально приложенному давлению Р(г) (19). Разложив в ряд эту зависимость и ограничившись первым неисчезающим порядком, получаем квадратичную зависимость радиуса от координаты г вдоль вертикальной оси НТ вида ф) = г*+(г0-г*)^- (24), удовлетворяющую граничным условиям г(0)-г*;г(1) = г о. Воспользовавшись этим приближением, можно аналитически вычислить электрическое сопротивление неравномерно сжатой НТ: 2 р г ¿¿г 2 рЬ °(г*+(г0-г*)^-)2 ч—, * агсзт(->/1 -а) а т]а(1-а) г*

25),

Подставляя в это выражение Я = 7/(7*, соответствующее проводимости сжатой НТ перед делением, получаем

1 1 ■ ( г,-\ яг,2

- + —====• агсБш ^,= — (26). а ^а{\-а) Х ' 2 рШ* к }

Численное решение этого уравнения и подстановка экспериментально измеряемых величин дают значение критического радиуса г* = 1.4±0.25 нм в самом узком месте.

Полученные выражения для определения размеров НТ по ионной проводимости ее внутреннего просвета справедливы в случае ровной поверхности мембраны. В работе использованы Мюллер-Рудиновские бислои в качестве модели клеточных мембран. В основе создания плоского бислоя лежит самопроизвольное вытеснение растворителя, который, как известно, вытесняется не полностью [Montai M. and Mueller P. (1972)]. Оставшийся в плоском бислое растворитель образует так называемые микролинзы, состоящие из смеси растворителя и липида. Они располагаются между монослоями, в гидрофобной области мембраны. Даже в данном случае, не смотря на использование вместо декана более разветвленного и высокомолекулярного сквалана, может происходить образование микролинз. Несомненно, наличие микролинз в мембране влияет на ее толщину и механические параметры. Однако в данной- работе определение механических параметров мембраны осуществляется посредствам измерения радиуса1 вытягиваемой HT. При этом определяемые значения модуля изгиба и латерального натяжения находятся в соответствии с полученными различными методами данными других исследовательских групп. Соответствие данных, полученных с помощью нанотрубок и других методов, свидетельствует об отсутствии микролинз в - вытягиваемой из плоской мембраны HT. Кроме того, определяемые размер и механические параметры HT не зависят от используемой пипетки. Результат определения радиуса HT не зависит от места БЛМ, из которого они вытянуты. Из этого можно заключить, что при вытягивании HT из плоского бислоя не происходит перехода микролинз растворителя в мембрану формирующейся трубки.

Для проверки утверждения о том, что разность концентраций соли между внутренним просветом HT и окружающим раствором действительно приводит к возникновению давления, изменяющего размеры HT, был проведен обратный эксперимент. Вместо концентрированного раствора соли- пипетка была

53 заполнена дистиллированной водой. Наблюдалось изменение проводимости НТ фиксированной длины при создании пониженной концентрации соли в окружающем растворе. сек

Рис. 18 Изменение проводимости НТ при подведении пипетки с дистиллятом. Стрелкой показан момент подведения дистиллята, за которым следует повышение проводимости НТ.

Подведение пипетки с дистиллятом вместо концентрированного раствора соли к НТ приводит к обратному эффекту - локальному понижению концентрации соли в окружающем растворе. Вследствие этого возникает положительное гидростатическое давление, направленное изнутри на стенки трубки. Как видно из графика на рис. 18, подведение пипетки с дистиллятом приводит к росту проводимости НТ, связанному с увеличением ее радиуса. В приведенном на рисунке опыте значение радиуса увеличивается с 5,1 до 6,2 нм. Отведение пипетки с дистиллятом приводит к восстановлению начальной концентрации соли снаружи НТ. Давление на стенки исчезает, и радиус внутреннего просвета уменьшается.

Зависимость величины критического радиуса от липидного состава мембраны. При исследовании процесса деления НТ необходимо учитывать ее свойства, которые, прежде всего, зависят от состава мембраны, из которой они образованы. Применяемые в работе электрохимические методы дают возможность определить, как изменяются свойства НТ при варьировании содержания каждого компонента в составе мембраны. Это позволяет контролируемым образом изменять радиус просвета и жесткость получаемых НТ.

Для определения зависимости свойств НТ от фосфолипидного состава в мембранообразующей смеси варьировалось соотношение липидов DOPCrDOPE от 1:2 до 3:1. Молекулы DOPC и DOPE имеют почти одинаковую структуру и отличаются химической группой гидрофильной головки, что влияет на их геометрию. DOPC имеет форму цилиндра, его спонтанная кривизна близка к нулю. Головка DOPE меньше, поэтому молекула по форме ближе к конусу и обладает отрицательной спонтанной кривизной. Содержание холестерина оставалось постоянным, 20%. а

10-1 г, нм р,кТ 9

30876 И I 1 I 20: 1 * 1 * { *

1054 0

30

40

50

60

30

40

50 60 РОРС РОРС

Рис. 19 Значения определяемых геометрических и механических параметров нанотрубки при различном липидном составе мембраны, а - значения радиуса НТ при различных концентрациях БОРС б - значения модуля изгиба при различных концентрациях БОРС Каждая точка - усреднение по 3-4 экспериментам.

Определяемые значения радиуса НТ и модуля изгиба не зависят от соотношения БОРС:БОРЕ в мембране. Значение радиуса НТ зависит от соотношения жесткости и натяжения мембраны (см. формулу 14). Спонтанная кривизна может влиять на величину поверхностного натяжения, которое помимо всего прочего зависит от концентрации липида в мениске. В нашей системе концентрация липида в мениске варьируется от эксперимента к эксперименту, следовательно, меняется и натяжение. Поэтому оценить вклад спонтанной кривизны в определяемый радиус НТ не представляется возможным.

Отсутствие зависимости измеряемого модуля изгиба от спонтанной кривизны липидов в данном случае подтверждает тот факт, что изгибная жесткость незаряженной мембраны в первую очередь зависит от длины и насыщенности углеводородных хвостов [Ка\уюг еЛ. а1 (2000)]. Используемые в работе фосфолипиды имеют одинаковые углеводородные хвосты с одной ненасыщенной связью и длиной цепи 18 атомов.

Вывод о независимости определяемых значений радиуса НТ и модуля изгиба от ионной силы раствора и значения спонтанной кривизны липидного состава основаны на статистической обработке результатов. Считалось, что экспериментальное распределение получаемых точек нормально. Проверка проводилась путем попарного сравнения математических ожиданий всех выборок с помощью критерия Стьюдента. В результате получилось, что с вероятностью более 67% определяемые значения радиуса и модуля изгиба имеют одно и то же математическое ожидание.

НТ различного диаметра получались при добавлении различного количества холестерина в пределах физиологической концентрации в клетках (от 0 до 20% с шагом 5%) к мембране с постоянным составом фосфолипидов фОРС.БОРЕ 1:1). а г, нм

8-, 7 6 5 4 3 2

I— 10

I—

15

I— 20 б

25

Р,кТ

2015105

10 Хол

15 20 Хол

Рис. 20 Зависимость определяемых геометрических и механических параметров нанотрубки от содержания холестерина в мембране, а - зависимость радиуса НТ от концентрации холестерина б - зависимость модуля изгиба от концентрации холестерина Каждая точка - усреднение по 3-6 экспериментам.

Из графика.на рис. 20 видна монотонно возрастающая зависимость локального модуля изгиба от содержания холестерина.

Проведя статистическую проверку полученных данных, можно сказать, что достоверность различимости механических параметров при различном содержании холестерина превышает 75%.

Радиус НТ является функцией механических параметров БЛМ. Эти параметры определялись на основе уравнения (14). Используемый' в работе метод сильно отличается от методов, используемых другими исследователями. До сих пор исследования проводятся» главным образом на везикулах, из которых различными методами вытягиваются мембранные нити [Evans Е., Rawics W.

1990)] [Heinrich V., Waugh R.E. (1996)] или на системах, образующих гексагональную фазу [Chen Z., Rand R.P. (1997)]. Основные отличия между липидными нанотрубоками, получаемыми из везикул и плоской БЛМ' начальные условия и ограничения, накладываемые Hat систему в целом. Трубки, вытянутые из БЛМ заметно меньше тех, что получены из везикулы. В везикуле практически отсутствует натяжение, в то время как в плоской БЛМ оно существенно. Отсюда такая разница в размерах получаемых трубок. В используемой в данной работе методике есть резервуар липида (мениск), поэтому разность площадей монослоев не меняется. Еще одно отличие заключается в методе контроля геометрических параметров. До этого все наблюдения проводились визуально, что в некоторых случаях требовало наличия флуоресцентных красителей в системе. Присутствие флуоресцентных меток на молекулах липидов может оказывать влияние на определяемые параметры мембран. Использование электрических методов определения' геометрических параметров позволяет от этого отказаться и дает возможность исследовать гораздо более мелкие объекты. Чувствительность оказывается намного выше.

Используя данный метод, были определены натяжение и модуль изгиба для мембран различного состава. Связи между натяжением БЛМ и липидным составом обнаружено не было. Модуль изгиба растет с увеличением концентрации холестерина. Полученные значения механических параметров находятся в согласии с данными, ранее полученными при работе с везикулами [Evans Е. et al (2000), Marsh D. (2006)]. Они несколько больше, чем в случае использования систем с гексагональной фазой [Chen Z., Rand R.P. (1997)]. Это может быть объяснено наличием растворителя в гексагональной липидной фазе. Монотонный рост модуля изгиба с увеличением концентрации холестерина можно объяснить эффектом конденсации. Холестерин, встраиваясь под полярные головы фосфолипидов, уменьшает количество конформационных состояний гидрофобных хвостов [Mattjus Р. et al (1995)], тем самым уменьшая энтропию, что и приводит к увеличению модуля изгиба [Stockton G.W., Smith I.C (1976)].

Отсутствие разницы в изгибных модулях и радиусах нанотрубок с различным соотношением фосфолипидов может свидетельствовать об отсутствии перераспределения на таких кривизнах (порядка 0,2 нм"1). Используемый в данной работе теоретический аппарат и экспериментально полученные результаты свидетельствуют о том, что механические и геометрические параметры НТ не зависят от спонтанной кривизны липидов, образующих мембрану.

Холестерин в качестве регулятора геометрических и механических параметров дает возможность варьировать радиус НТ в пределах от 4 до 7 нм, увеличивая их жесткость. Так же он может влиять и на критические параметры деления мембран. Было исследовано влияние исходного размера и жесткости НТ на величину критического радиуса. Для этого была проведена серия опытов по делению НТ с различным содержанием холестерина.

Г, НМ 8 64I I

20

30

I—

40

50 Хол

Рис. 21 Значения исходного (квадраты) и критического (треугольники) радиуса НТ при различном содержании холестерина. Каждая точка - усреднение по 4 - 6 экспериментам.

На рис. 21 показана зависимость значений равновесного и критического радиусов НТ от содержания холестерина в составе мембраны. Видно, что при различных начальных размерах НТ, критический радиус, начиная с которого происходит самопроизвольное деление, остается постоянным. Это может быть связано с наличием перераспределения липидов в монослоях НТ. Оно-возможно благодаря наличию резервуара липида в мениске. Большая кривизна сжатой трубки стимулирует увеличение доли липидов с отрицательной спонтанной кривизной во внутреннем монослое и с положительной во внешнем. Так понижается свободная энергия системы. Перераспределение липида может приводить к тому, что липидный состав сильно сжатой НТ, а соответственно и ее параметры, почти не зависят от состава плоской мембраны. Поэтому величина критического радиуса- не зависит от липидного состава мембранообразующей смеси.

Модель деления липидной нанотрубки. На основании полученных данных предложена модель деления НТ. Процесс деления состоит из нескольких стадий.

В исходном' состоянии, радиус НТ определяются соотношением- натяжениямембраны и ее модулем, изгиба. Приложение внешнего давления на- первой< стадии приводит к сжатию* НТ до критического радиуса. Время, за которое происходит это сжатие, определяется скоростью ухода* липида из НТ через плоскую часть мембраны в мениск: Она зависит от величины приложенного' давления и силы трения, возникающей из-за взаимодействия молекул липида в монослое (внутримонослойное трение) и скольжения одного монослоя относительно другого (межмонослойное трение). Последнее обусловлено тем, что объем уходящего липида в монослоях одинаков. Однако площадь сечения, через которое проходит объем липида, во внутреннем монослое меньше, поэтому скорость выхода липида в нем больше. Оценка времени выхода липида при

61 сжатии НТ дает величину 10 секунд при коэффициенте межмонослойного трения порядка 1016 Н-с/м, что согласуется с известными литературными данными [Evans et al (1992)].

12 3 4

Рис. 22 Стадии деления НТ.

1 - исходная НТ

2 - сжатие внешним давлением до критического радиуса

3 - самопроизвольное слияние внутренних монослоев с образованием структуры полуделения

4 - завершение деления НТ

Внизу схематически показано изменение свободной энергии системы.

Схема деления выглядит следующим образом. Разность концентраций соли между внутренним просветом НТ и окружающим раствором приводит к возникновению сжимающего давления на стенках НТ. Сжатие идет до тех пор, пока внешнее давление не будет уравновешено возрастающей изгибной энергией, стремящейся вернуть НТ исходную равновесную форму. В случае, если давление достаточно велико, то трубка доходит до критического радиуса, при котором ее энергия сопоставима с работой, необходимой для начала деления. Оно идет через образование структуры полуделения, которая образуется в результате слияния внутренних монослоев трубки между собой. Схожая картина наблюдается в процессе слияния мембран, в этом случае образуется структура полуслияния. Структура полуделения отличается от нее цилиндрической симметрией. Состояния сжатой трубки и структуры полуделения разделены энергетическим барьером, который необходим преодолеть для того, чтобы перезамкнуть гидрофобные области внутреннего монослоя НТ. Скорее всего, переход происходит за счет тепловых флуктуаций и характеризуется временем ожидания деления, которое составляет от 2 до 20 сек. Переход к полуделению происходит спонтанно при дожатии трубки до критического радиуса, при котором трубке становится энергетически выгодно поделиться и образовать две мембраны, понизив таким образом энергию системы. Похожая ситуация рассмотрена в работе [У Ког1оУ8ку, М.М. Ког1оу (2003)], где теоретически рассмотрено отделение везикулы от плазматической мембраны за счет ее искривления клатрином: Показано, что большая кривизна в месте перехода от плоской мембраны к сферической везикуле приводит к самопроизвольному замыканию последней. т

Рис. 23 Гистограмма распределения времен ожидания деления НТ.

Время ожидания деления зависит от соотношения энергии сжатой НТ и величины энергетического барьера. Образующаяся структура полуделения структурно аналогична структуре полуслияния. В обоих случаях происходит слияние одного монослоя. В случае слияния монослои принадлежат различным мембранам, в случае деления сливается внутренний монослой одной мембраны. Разница в форме образуемых структур обусловлена начальной формой участвующих мембран: в слиянии участвуют две плоские (или выпуклые) мембраны, при делении исходно имеется цилиндрическая либо катеноидальная мембрана. Но в процессе перехода системы к образованию структур полу слияния и полуделения возникают аналогичные изгибные деформации. Для перехода к структуре полуделения или полуслияния необходимо преодоление энергетического барьера. Молекула липида имеет гидрофильную головку, обращенную в бислое в сторону водного раствора, и углеводородный хвост, находящийся во внутренней гидрофобной части бислоя. Чтобы образовать структуру полуделения, молекулам липида внутреннего монослоя нужно образовать единую'гидрофобную область. Такая перестройка связана с выходом углеводородного хвоста липида из своей гидрофобной области в гидрофильную область липидных головок и заполненный водным раствором просвет НТ для последующего перезамыкания с углеводородными« хвостами противоположной части внутреннего монослоя. Поэтому в момент перехода энергия системы сильно увеличивается, что обусловлено контактом между водой и несмачиваемыми гидрофобными хвостами. Кроме того, в ходе структурной реорганизации бислоя возникают, большие изгибные деформации. Для начала слияния внутреннего монослоя необходимо повернуть часть молекул липид на некоторый угол, обеспечивающий контакт хвостов липидов с противоположных сторон НТ. Такое смещение молекул липида относительно исходного расположения в монослое энергетически очень затратно. После преодоления энергетического барьера и завершения' деления система приходит в новое равновесное положение, соответствующее двум раздельным мембранам.

Теоретические расчеты дают величину энергетического барьера около 20 кТ [ВазЫскоу Р. е! а1 (2008)]. Расчет времени для преодоления энергетического барьера 40 кТ дает величину порядка 1 мин. [Киггшп Р. а1 (2001)]. В силу этого полученное в работе время ожидания деления порядка 10с., необходимое для преодоления энергетического барьера 20 кТ, согласуется с имеющимися литературными данными.

Продолжительность времени ожидания имеет положительную корреляцию с величиной критического сжатия НТ. Увеличение энергии трубки при сжатии

65 ведет к уменьшению разности между свободной энергией системы и высотой энергетического барьера, что уменьшает время его преодоления. Иными словами, чем сильнее сжата трубка, тем быстрее происходит переход к делению. При этом время ожидания не зависит от липидного состава мембраны, что обусловлено наличием перераспределения липида в сжатой трубке и понижением эффективного модуля изгиба.

Перераспределение липидов между внешним и внутренним монослоями нанотрубки имеет место при создании большой кривизны при сжатии НТ. Для начала рассмотрим перераспределение в НТ равновесного радиуса. Формирующие мембрану фосфолипиды имеют различную спонтанную кривизну: для DOPC -87,3 Ä, а для DOPE -28,7 Ä [Chen Z., Rand R.P. (1997)]. Они находятся в бислойной мембране нанотрубки, у которой радиус кривизны внешнего монослоя составляет примерно +8,5 нм., внутреннего - -6,5 нм. Можно оценить соотношение липида между внешним и внутренним монослоями, пользуясь распределением Больцмана. Энергия в пересчете на одну молекулу липида в трубке имеет вид

W = {£(J-J0)2 -|./(;+ö-)a0 (27), где а0 = 0,65 нм2 — площадь молекулы липида.

В соответствии с распределением Больцмана отношение содержания липида между внутренним и внешним монослоями определяется выражением дг W-W ß 9 — ехр(—т"-1-) = exp(ikje2 -2JeJ0 - +2J,J0)a0) (28), где N, - количество молекул во внутреннем монослое, Ne — во внешнем.

Оцененное таким образом отношение содержания липида во внутреннем монослое с отрицательной кривизной к его содержанию во внешнем с положительной кривизной составляет 1,17 для DOPC, для DOPE - 1,69. Для

DOPC это значение получилось меньше, чем для DOPE. Это очевидный результат, т.к. молекула DOPC имеет близкую к цилиндрической форму и почти одинаково хорошо встраивается в структуры как с отрицательной, так и положительной кривизной. Молекула DOPE, напротив, имеет резко выраженную коническую форму, поэтому гораздо легче встраивается в структуры с отрицательной кривизной, т.е. во внутренний монослой трубки. В случае НТ равновесного радиуса определяемые параметры не менялись в ответ на изменение значения спонтанной' кривизны, что может быть связано с погрешностью измерений или недостаточно большой кривизной трубки.

В случае сжатой до критического радиуса НТ вклад перераспределения липида возрастает, т.к. сильно увеличивается кривизна монослоев. Радиус кривизны внутреннего монослоя становится -1,5 нм., внешнего +3,5 нм. Отношение содержания липида во внутреннем монослое к его содержанию во- внешнем монослое сжатой НТ незначительно увеличивается по сравнению с НТ исходного размера до 1,26 для DOPC. Для DOPE это соотношение сильно меняется и достигает значения 5,08. Как уже было сказано выше, это связано с более выраженной отрицательной спонтанной кривизной у DOPE по сравнению с DOPC. Молекула холестерина имеет спонтанную кривизну -33 А. Таким образом его перераспределение между монослоями близко к таковому у DOPE. В

67 сжатой до критического радиуса НТ соотношение содержания холестерина составляет уже 7,02. Кроме1 того у холестерина большой уровень флип-флоп перехода в силу его гидр о ф о бно сти, что ускоряет его перераспределение между монослоями по сравнению с фосфолипидами, перераспределение которых в основном происходит путем обмена с плоской мембраной и мениском.

Перераспределение липида между внутренним и внешним монослоями в соответствии со значением его спонтанной кривизны приводит к понижению свободной энергии системы. Это приводит к уменьшению площади поверхности НТ путем уменьшения, ее радиуса. При1 этом натяжение остается» постоянным. Такое уменьшение радиуса НТ в соответствии с формулой (14) происходит вследствие наблюдаемого понижения эффективного модуля изгиба1.

На последней, третьей стадии происходит преодоление энергетического барьера и слияние внутреннего► монослоя, в то время как внешний монослой остается интактным. Образуется структура полуделения, что обеспечивает замкнутость делящихся структур, не допуская смешивания, содержимого клетки с окружающим раствором в процессах образования везикул путем эндоцитоза или баддинга и деления клетки. После этого происходит окончательное разделение мембран. Переход между сжатой НТ и окончательным разделением мембран происходит очень быстро, менее чем за 2мс, и безутечечно.

Изложенные выше результаты позволяют лучше понять механизм действия белков деления. На последней стадии клеточных процессов, связанных с делением мембран, делящиеся структуры остаются связанными тонким мембранным перешейком. Как показано в данной работе, для его деления

68 необходимо сжатие его до критического радиуса, отличного от нуля. После чего деление происходит самопроизвольно в силу свойств липидного бислоя. Можно предположить, что задача белков деления заключается именно в совершении работы по сжатию мембранного перешейка до критического состояния. Так, динамин в процессе эндоцитоза полимеризуется, накручиваясь на мембранный перешеек, и сжимает его до критического радиуса [Bashkirov Р. et al (2008)]. В этой же работе показано, что при освобождении сжатой НТ от витка динаминовой спирали в результате кооперативного гидролиза молекул ГТФ, мембране может быть энергетически выгодно прогнуться внутрь и перейти к делению вместо возвращения в исходное равновесное положение. Белковые комплексы СОР и ESCRT участвуют как в формировании начальной инвагинации мембраны, так и в критическом сужении образовавшегося перешейка в процессах эдоцитоза, формирования новых вирионов и клеточного деления [Y. Kozlovsky and М. Kozlov (2003), G. Fabrikant et al (2009)].

Выводы

1. Разработан новый метод "безбелкового" деления липидной нанотрубки. Вместо белков деления для сжатия и деления нанотрубки использовано осмотическое давление, возникающее при создании разности концентрации соли между внутренним просветом нанотрубки и окружающим раствором. Метод позволяет наблюдать кинетику процесса в реальном времени.

2. Определена зависимость геометрических и механических параметров нанотрубки от липидного состава мембран. Радиусы получаемых нанотрубок и жесткость мембран возрастают с увеличением концентрации холестерина, поверхностное натяжение остается постоянным.

3. Показано, что деление происходит самопроизвольно при достижении критического радиуса, отличного от нуля, значение которого составило 1,4 ± 0,25 нм. При этом в момент деления не наблюдается увеличения проводимости утечки, что говорит о сохранении замкнутости делящихся структур.

4. Показано, что значение критического радиуса одинаково для НТ различного исходного радиуса и модуля изгиба. Это связано с перераспределением липидов между монослоями, приводящим к изменению модуля изгиба сильно сжатой НТ.

5. Предложена модель деления НТ, включающая следующие последовательные стадии: сжатие до критического радиуса, образование структуры полуделения и наконец, полное деление нанотрубки.

Приложение

Выражение для отклонения формы НТ от цилиндрической под действием приложенного напряжения было выведено совместно с П.И. Кузьминым.

Рассмотрим цилиндрическую мембранную трубку радиуса г, соединенную с резервуаром липида, к мембране которой приложено напряжение и. Свободная энергия Г зависит от числа частиц п, площади кривизны J и приложенного напряжения 17. Дифференциал F для такой системы записывается как

И< = 1к1п + а/5 + 5ДИ/ - дсШ = ш1п + а/5 + 5/Ш/ - СтШи (п1)5 где /л - химический потенциал, () = 5С„,С7 - заряд мембраны, Ст - удельная емкость бислоя.

Учитывая, что п и $ - экстенсивные переменные, а,/ и и— интенсивные, можно записать выражение для свободной энергии и ее полный дифференциал

Г = ¿ип + о8 с1Р = ¡Мп + пс1[л + <х15 + Зс1<г (п2)

Сравнивая это выражение с дифференциалом F выше, получаем соотношение Гиббса-Дюгема ф = а(/Ш/ С тШЩ (п3), где а = 5/п - площадь на одну молекулу липида. Для несжимаемой мембраны оно постоянно. Проинтегрируем это выражение и получим химический потенциал

Ш2 С и2 = //„-ас+а^--(п4)> где |Ло - стандартный химический потенциал.

В равновесии химический потенциал липида в мембране постоянен и равен потенциалу липида в резервуаре. В плоской части мембраны напряжение не приложено и натяжение равно а0 = //0-а<70 (п5).

Приравняем его к химическому потенциалу цилиндрической части и получим обобщенную формулу Липпмана и2 с„,и2 .

7 = ---(п 6).

Теперь рассмотрим равновесие цилиндрической мембраны при изменении ее радиуса (или ./). Учтем, что £ = 2жЬ/3 и с18 = -2пЬс1Х{]2. Вариация Р при переменном / и постоянных п и и в равновесии равна нулю. ар=■+ БДШ = 2яЦ-0/Г- + /?)сП = 0 (п7) откуда сг = уа/2 (п8)

Сравнивая это выражение для натяжения с обобщенной формулой Липпмана (пб), получаем

Р Г тт2 Р т-с.и =-т (п9)5 где го = " радиус НТ при нулевом напряжении.

Теперь рассмотрим НТ длиной Ь к одному концу которой приложено напряжение 17, а другой заземлен. Потенциал снаружи трубки равен нулю. Таким образом, внутри трубки течет ток I, а потенциал внутри и напряжение на мембране изменяется от 0 до 17. Радиус трубки тоже будет изменяться вдоль нее.

Введем ось 2 вдоль НТ с началом в заземленном конце. Продифференцируем выражение (п10), считая [/иг функциями г

Сяи<Ю = ЩЦ- (п10).

Запишем закон Ома для участка длиной п11).

70- к 7

Подставим это выражение для с11У в (п10)

1р ¡С^, <Лг

Интегрируя вдоль трубы получаем уравнение, которое определяет неявным образом зависимость г(г) = г0 + а(г) яг„ V Р

7-^

2 + —

V - - - 4 Г° г г 1 + -+

Г0 Ко г агссоз/г(—) (п13). го

Для удобства последующих операцией введем безразмерный параметр д

2 ст0 Р п14).

Обозначим через ~ Р~Т - сопротивление цилиндра радиуса г0. Я ж0 сопротивление НТ. Используя эти обозначения и безразмерный параметр д (п14) перепишем выражение (п13) фф = 3,000*^) (п15) ь к

Заметим, что 8 « 1, т.к. Ко/Я ~ 1 и г/Ь <1. Теперь введем параметр ^ = —• —. Радиус НТ будет г = г0 собЬС^-) (П16). л

Сопротивление внутреннего просвета искривленной приложенным полем НТ найдем путем интегрирования по всей длине ¿г й! , рЬК х , ,Я0 ~ В. , Д . „ 8

К = Р[— = ^апЬ(Т) = = = Я0 (П17).

I ж лг0 Я щ;И0д К о Я агсЛапА(д) 4 '

Из последнего выражения видно, что Я по-прежнему линейно зависит от Ь, т.е. проводимость НТ сохраняет гиперболическую зависимость от длины, как и в случае приближения НТ цилиндром, и определяемый в процессе аппроксимации радиус НТ является неким эффективным радиусом цилиндра Гф имеющего ту же проводимость, что и деформированная приложенным полем НТ

-¡Л*-= , (П18)

В итоге получаем окончательное выражение, связывающее механические параметры НТ, определяемый эффективный радиус и приложенное к концам НТ напряжение ге/ агс1апВД 3 ЪР 0

Или, если учесть выражение для связи равновесного радиуса с механическими параметрами НТ (14),

1 2а0 Стиг ~~—я---Тя~

V Р ЪР

Работы, опубликованные по материалам диссертации Печатные статьи

• А.И. Евсеев. П.В. Башкиров. 2008. Деление мембранной нанотрубки, вызванное осмотическим давлением. Биологические мембраны 2008 Том 25 № 4 стр. 308-313.

Версия на английском:

A.I. Evseev, P.V. Bashkirov. Fission of membrane nanotube induced by osmotic pressure. Biochemistry (Moscow) Supplemental Series A: Membrane and Cell Biology 2008 Vol. 2 No. 3 pp. 271-275.

• Pavel V. Bashkirov, Sergey A. Akimov, Alexev I. Evseev, Sandra L. Schmid, Joshua Zimmerberg and Vadim A. Frolov. GTPase Cycle of Dynamin Is Coupled to Membrane Squeeze and Release, Leading to Spontaneous Fission. Cell 2008 No. 135(7) pp. 1276-1286.

Материалы конференций

1. А.И. Евсеев, П.В. Башкиров. Деление липидной нанотрубки осмотическим давлением. Конференция молодых ученых Института Физической Химии и Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН 2007,2008

2. А.И. Евсеев, П.В. Башкиров. Деление липидной нанотрубки. XX зимняя международная молодежная научная школа "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ". Москва. 11-15 февраля 2008.

3. Bashkirov P.V., Akimov S.A., Evseev A.I., Schmid S.L., Zimmerberg J. and Frolov V.A. Pathway of dynamin-driven membrane fission revealed with lipid nanotubes. Pavia, Italy. The Golgi Meeting. 4-9 September 2008.

4. Bashkirov P.V., Akimov S.A., Evseev A.I. Schmid S.L., Zimmerberg J. and Frolov V.A. Mechanism of membrane fission: lessons from lipid nanotubes and dynamin. Pavia, Italy. The Golgi Meeting. 4-9 September 2008.

5. Евсеев А.И. Батищев О.В., Инденбом А.В. Экспериментальные и теоретические исследования самоорганизации сложных белковых структур. Международная научная конференция "ИОННЫЕ КАНАЛЫ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ". Санкт-Петербург 17-18 марта 2009.

6. Evseev A.I. Bashkirov P.V. Fission of lipid nanotubes caused by osmotic stress San Francisco, USA Biophysical Society 54th Annual Meeting 20-24 February 2010.

Список литературы.

1. Albillos A., Dernick G., Horstmann H., Aimers W., Alvarez De Toledo'G and

Lindau M. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature Vol. 389 pp. 509-512 (1997)

2. Benlimame N., Simard D., Nabi I.B. Autocrine motility factor receptor is a marker for a distinct membranous tubular organelle. J. Cell Biol. Vol. 129(2) pp. 459-471 (1995)

3. Bloch K. The biological synthesis of cholesterol. Science Vol. 150(692) pp. 19-28 (1983)

4. Bo L., Waugh R.E., Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys. J. Vol. 55(3) pp. 509-517(1989)

5. Bohinc K., Kralj-Iglic V. and May S. Interaction between two cylindrical inclusions in a« symmetric lipid bilayer. J. Chem. Phys. 119:7435-7444 (2003)

6. Brodin L., Low P., Shupliakov O. Sequential steps in clatlirin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Curr Opin Neurobiol Vol. 10(3) pp. 312-320 (2000)

7. Brown D.A. and London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. Vol. 14 pp. 111-136 (1998)

8. Brown D.A., London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. Vol. 14 pp. 111-36 (1998)

9. Chapman D. Liquid crystals and cell membranes. Ann N Y Acad Sci. Vol. 137(2) pp. 745-54 (1966)

10. Chen Y.G., Siddhanta A., Austin C.D., Hammond S.M., Sung T.C., Frohman M.A. et al. Phospholipase D stimulates release of nascent secretory vesicles from the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 138: 495-504 (1997)

11. Chen Z., Rand R.P. The influence of cholesterol on phospholipid membrane curvature and bending elasticity. Biophys. J. Vol. 73(1) pp. 267-276 (1997)

12. Chong. P.L. Evidence for regular distribution of sterols in liquid crystalline phosphatidylcholine bilayers. PNAS Vol. 91(21) pp. 10069-10073 (1994)

13. Claessens M». M. A. E., B. F. van Oort, F. A. M. Leermakers, F. A. Hoekstra and Mi A. Cohen Stuart. Charged Lipid Vesicles: Effects of Salts on Bending Rigidity, Stability, and Size. Biophys. J. Vol. 87, 3882-3893 (2004)

14. Clague M J. Molecular aspects of the endocytic pathway. Biochem J. Vol. 336 ( Pt 2) pp. 271-82 (1998)

15. Crowther R.A., Pearse B.M. Assembly and packing of clathrin into coats. J Cell Biol Vol. 91(3 Pt 1) pp 790-797 (1981)

16. Dabora S.L., Sheetz M.P. Cultured cell extracts support organelle movement on microtubules in vitro. Cell Motil. Cytoskeleton Vol. 10(4) pp. 482-495 (1988)

17. Dai J., Ping Ting-Beal H.,Sheetz M.P. The Secretion-coupled endocytosis correlates with membrane tension changes in RBL 2H3 Cells. J. Gen. Physiol. Vol. 110 pp. 1-10(1997)

18. Dai J., Sheetz M.P! Mechanical properties of neuronal growth cone membranes studied-by tether formation with laser optical tweezers. Biophys. J. Vol. 68(3) pp. 988-996(1995)

19. Danielli J.F., Davson H. A contribution to the theory of permeability of thin Films. J. Cell Comp. Physiol Vol. 5 pp. 495-508 (1935)

20. Dennis E.A. Phospholipases, the enzymes (P.D. Boyer, Ed.), 16, 307-353, Academic Press, New York (1983)

21. Deuling H.J., Helfrich W. Red, blood cells as explained on the basis of curvature elasticity. Biophys. J. Vol. 16 pp. 861-868 (1976)

22. Doherty G.J. and McMahon H.T. Mechanisms of Endocytosis. Annu. Rev. Biochem. vol. 78 pp. 857-902 (2009)

23. Edidin M. Shrinking patches and slipeery rafts: scales of domains in the plasma membrane. Trends in Cell Biology Vol. 11(12) pp. 492-496 (2001)

24. Evans E., Rawics W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid Membranes. Phys. Rev. Letters Vol. 64(17) pp. 2094-2097 (1990)

25. Evans E.A., Hochmuth R.M., Membrane viscoelasticity. Biophys. J. Vol. 16(1) pp. 1-11 (1976)

26. Finegold L., Singer M.'A. (Dholesterol-multilipid interactions in.bilayers. Chem. Phys. Lipids Vol! 58 pp. 169-173 (1993)

27. Frolov V.A., Lizunov V.A., Dunina-Barkovskaya A.Ya., Samsonov A.V., Zimmerberg J. Shape bistability of a membrane neck: a toggle switch to control vesicle content release. PNASVol. 100(15) pp. 8698-8703 (2003)

28. Frost A., Unger V.M., De Camilli P. The BAR domain superfamily: membrane molding macromolecules. Cell Vol: 137(2) pp: 191-196 (2009)

29. Fuller N. and Rand R.P. The influence of lysolipids on the spontaneous curvature and bending elasticity of phospholipid membranes. Biophys. J. 81:243-254 (2001)

30. Guidelli R. (Edit.) Electrified^ interfaces in physics, chemistry andf biology, Kluwer Acad. Pub: Dordrecht/Boston/London (1992)^

31. Heinrich V., Waugh R.E. A piconewton. force transducer and. its application to measurement of the1 bending stiffness of phospholipid membranes. Ann Biomed EngNoV. 24(5) pp/ 595-605 (1996)

32. Helfrich W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z: Naturforsch Vol'. 28c pp. 693-703 (1973)

33. HenriksenJ.R., Ipsen J.H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration; Eur. Phys. J. Vol. 14 pp: 149-167 (2004)

34. Hinrichsen L., Meyerholz A., Groos S., Ungewickell E.J. Bending a membrane: how clathrin affects budding. Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 103(23) pp. 8715-20 (2006)

35. Hinshaw J.E. Dynamimand its role in membrane fission. Annu Rev Cell Dev Biol. Vol. 16 pp; 483-519 (2000)

36. Hochmuth R.M., Mohandas N., Blackshear P.L. Jr. Measurement of the elastic modulus for red cell membrane using a fluid mechanical technique, Biophys J. Vol. 13(8) pp. 747-762 (1973)

37. Huang J. Exploration of molecular interactions in cholesterol superlattices: effect of multibody interactions, Biophys J. Vol. 83(2) pp. 1014-1025 (2002)

38. Huang J., Feigenson G.W. A microscopic interaction model of maximum solubility of cholesterol in lipid bilayers, Biophys J. Vol. 76(4) pp. 2142-2157 (1999)

39. Jacobson K. Lateral diffusion in membranes, Cell Motil. J. Vol. 3 pp. 367-373 (1983)

40. Jia-Shu Yang, Helge Gad, Stella Y. Lee, Alexander Mironov, Leiliang Zhang, Galina V.Beznoussenko, Carmen Valente, Gabriele Turacchio, Akua N. Bonsra, Guangwei Du, Gianluca Baldanzi, Andrea Graziani, Sylvain Bourgoin, Michael A. Frohman, Alberto Luini, and Victor W. Hsu. COPI vesicle fission: a role for phosphatidic acid and insight into Golgi maintenance. Nat Cell Biol. October ; 10(10) 1146-1153 (2008)

41. Kozlov M.M. Dynamin: possible mechanism of "Pinchase" action. Biophys. J. Vol 77(1) pp. 604-616(1999)

42. Kozlov M.M. Fission of biological membranes: interplay between dynamin and lipids. Traffic. 2:51-65 (2001)

43. Kozlovsky Y. and Kozlov M.M. Membrane fission: model for intermediate structures, Biophys. J. Vol. 85 pp. 85-96 (2003)

44. Kumar V.V. Complementary molecular shapes and additivity of the packing parameter of lipids. PNAS Vol. 88 pp. 444-448 (1991),

45. Kuzmin P.I., Zimmerberg J.,Chizmadzhev Yu.A. and Cohen F.S. A quantitative model for membrane fusion based on low-energy intermediates. Proc Natl Acad Sci USA. 98:7235-40 (2001)

46. Ling Miao et al From lanosterol to cholesterol: structural evolution and differential effects on lipid bilayers. Biophys. J. Vol. 82 pp. 1429-1444 (2002)

47. Markin V.S. and Albanesi J.P. Membrane fusion: stalk model revisited. Biophys. J: Vol. 82 pp. 693-712 (2002)

48. Marsh D. Elastic curvature constants of lipid monolayers and bilayers. Chem. Phys. Lipids Vol. pp. (2006)

49. Marsh M, Helenius A. Virus entry: open sesame. Cell 124:729-40 (2006)

50: Mattjus P., Bittman R., Vilcheze C., Slotte J.P. Lateral' domain formation in cholesterol/phospholipid monolayers as affected" by the sterol' side . chain conformation. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1240(2) pp. 237-47 (1995)

51. McBain Trans. Faraday Soc., 9, 99 (1913)

52. Montai M. and Mueller P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 69(12) pp. 3561-6 (1972)

53. Montai M. Formation of biomolecular membranes from lipid monolayers. Method in Enzym. Vol. 32 pp. 545-556 (1974>

54. Mueller P., Rudin D., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell' membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature Voli 194 pp. 979-980 (1962)

55. Needham- D. and Nunn R.S. Elastic deformations and failure of lipid* bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. Vol. 58 pp. 997-1009 (1990)

56. Niggemann G:, Kummrow Mi and Helfrich W. The bending rigidity of phosphatidylcholine bilayers - dependences on experimental method, sample cell sealing and temperature. J. de Physique II. 5:413-425 (1995)

57. Niggemann G., Kummrow M-. and Helfrich W. The bending rigidity of phosphatidylcholine bilayers - dependences on experimental method, sample cell sealing and temperature. J. de Physique II. Vol. 5 pp. 413-425 (1995)

58. Oh P., Mcintosh D.P., Schnitzer J.E. Dynamin at the neck of caveolae mediates their budding to form transport vesicles by GTP-driven fission from the plasma membrane of endothelium. J Cell Biol Vol. 141(1) pp. 101-114 (1998)

59. Olbrich K, Rawicz W, Needham D, Evans E. Water permeability and mechanical strength of polyunsaturated lipid bilayers. Biophys J. Vol. 79 321-7 (2000)

60. Oldfield E., Gilmore R. Glaser M., Gutowsky H.S., Hshung J.C., Kang S.Y., King T.E., Meadows M., Rice D. Deuterium nuclear magnetic resonance investigation of the effects of proteins and polypeptides on hydrocarbon chain order in model membrane systems. PNAS Vol. 75(10) pp. 4657-4660 (1978)

61. Peter B.J., Kent H.M., Mills EG., Vallis Y., Butler P.J., et all BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure: Science Vol. 303 pp. 495-99 (2004)

62. Plateu J.A. Experimental and theoretical researches on the figures of liquid mass withdraw from the action of gravity Annn. Rep. Board Reg. Smithson Inst. pp. 207-285 (1863)

63. Polishchuk E.V., Di Pentima A., Luini A., Polishchuk R.S., Mechanism of constitutive export from, the golgi: bulk flow via the formation, protrusion; and en bloc cleavage of large trans-golgi network tubular domains. Mol. Biol. Cell Vol. 14(11) pp. 4470-4485 (2003)

64. Rawics W., Oldrich K.C., Mcintosh T., Needham D., Evans E. Effect of Chain Length and Unsaturation on Elasticity of Lipid Bilayers. Biophys. J. Volt 79 pp. 328-339 (2000)

65. Roux A., Cuvelier D., Nassoy P., Prost J., Bassereau P., Goud* B. Role of curvature and phase transition in lipid sorting and fission of membrane tubes, The EMBO Journal, 24, 1537-1545 (2005)

66. Rukmini R., Rawat S.S., Biswas S.C. and Chattopadhyay A. Cholesterol Organization in Membranes at Low Concentrations: Effects of Curvature Stress and'Membrane Thickness. Biophys. J. Vol. 81 pp. 2122-2134 (2001)

67. Rukmini R., Rawat S.S., Biswas S.C., and Chattopadhyay A. Cholesterol Organization in Membranes at Low Concentrations: Effects of Curvature Stress and Membrane Thickness. Biophys. J. Vol. 81 pp. 2122-2134 (2001)

68. Rustom A., Saffrich R., Markovic I., Walther P., Gerdes H.-H. Nanotubular Highways for intercellular organelle transport, Science, 303, 1007-1010 (2004)

69. Saffman P.G., Delbrück M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Nail. Acad. Sei. USA. Vol. 72 pp. 3111-3113 (1975)

70. Schmid E.M., Ford M.G., Burtey A., Praefcke G.J., Peak-Chew S.Y., Mills I.G., Benmerah A., McMahon H.T. Role of the AP2 beta appendage hub in recruiting partners for clathrin-coated vesicle assembly. PLoS Biol. Vol. 4(9):e262 (2006)

71. Schmidt E.M., McMahon H.T. Integrating- molecular and network biology to décode endocytosis. Nature Vol 448(7156) pp. 883-888 (2007)

72. Seelig J., Seelig A. Lipid Conformation in modël membranes and. biological' bembranes, Quart. Rev. Biophys., 13, 19-61 (1980)

73. Seeling J., Browning J.L. General features of phospholipid conformation in. membranes. FEBS Lett. Vol. 92 pp. 41-44 (1978)

74. Singer S .J:, Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes , Science, 175, 720-731- (1972)

75. Spang, A., Matsuoka K., Hamamoto S., Schekman R. and Orci L. Coatomer, Arflp, and nucleotide arc required* to bud coat protein complex I-coated vesicles from large synthetic, liposomes. Broc. Natl. Acad. Sci. Vol! 95 pp.* Ill99—11204 (1998)

76» Stockton G.W., Smith I.C. A deuterium nuclear magnetic resonance study of the. condensing effect of cholesterol on- egg phosphatidylcholine bilayer membranes, Chem. Phys. Lipids, 17,251-263 (1976)

77. Szleifer I.,Kramer D., Ben-ShauLA., Roux.D., Gelbart W.M: Curvature elasticity of pure and mixed surfactant, films, Phys. Rev. Lett., 60(19)- 1966-1969 (1988)

78. Tien H.TL Bilayer lipid membranes (BLM) theory and practice, Marcell Dekker, Inc., New York (1974)

79: Waugh R.E., Song J, Svetina S, Zeks B:, Local and nonlocali curvature elasticity in bilayer membranes by tether formation from lecithin vesicles. Biophys. J., 61(4), 974-982 (1992)

80. Waugh R.E., Surface viscosity measurements from large bilayer vesicle tether formation, Biophys. Ji, 38(1), 19-37 (1982)

81. Weigert R., Silletta M.G., Spano S., Turacchio G., Cericola C., Colanzi A. et al. CtBP/BARS induces fission of Golgi membranes by acylating lysophosphatidic acid. Nature Vol. 402 pp. 429-433 (1999)

82. William C., Hwang, Waugh R.E. Energy of dissociation of lipid bilayer.from the membane skeleton of red blood cells, Biophys. J., 72,2669-2678 (1997>

83. Wolfe B.L., Trejo J. Clathrin-dependent mechanisms of G protein-coupled receptor endocytosis. Traffic Vol. 8 pp. 462-470 (2007)

84. Woodin A.M., Wieneke A.A. Composition and properties of a cell-membrane fraction from the polymorphonuclear leucocyte. Biochem J. Vol. 99(2) pp. 493500 (1966)

85. Xing Y., Booking Т., Wolf M., Grigorieff N., Kirchhausen Т., Harrison S.C. Structure of clathrin coat with bound Hsc70 and auxilin: mechanism of Hsc70-facilitated disassembly. EMBO J. Vol. 29(3) pp. 655-65 (2010)

86. Zhang W., Sloan-Lancaster J., Kitchen J., Trible R.P. and Samelson L.E. LAT: the ZAP-70 tyrosine kinase substrate that links T cell receptor to cellular activation. Cell 92:83-92 (1998)

87. Волькенштейн Биофизика, изд-во «Наука», Глав. ред. физ.-мат. лит-ры, Москва (1981)

88. Геннис Р. БИОМЕМБРАНЫ Молекулярная структура и функции, изд-во «Мир», Москва (1997)

89. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физизка том VI ГИДРОДИНАМИКА, изд-во «Наука», Глав. ред. физ.-мат. лит-ры, Москва (1988)

90. Меликян Г.Б., Козлов М.М., Черномордик Л.В., Маркин B.C. Деление бислойной липидной трубки Доклады Академии Наук СССР т. 274 с. 948951 (9184)

Благодарности

Автору хотелось бы выразить искреннюю признательность научному руководителю П.В. Башкирову за постоянное внимание и поддержку при работе над диссертацией. За помощь и плодотворные дискуссии хотелось бы выразить особую благодарность Ю.А. Чизмаджеву. Автор также выражает искреннюю признательность С.А. Акимову и П.И. Кузьмину за помощь в решении теоретических задач. Хочется поблагодарить всех сотрудников лаборатории биоэлектрохимии за помощь в работе и конструктивные дискуссии.