Биологическое обоснование отбора штаммов гриба Beauveria bassiana S.L. для снижения численности саранчовых в Казахстане тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.07, кандидат биологических наук Успанов, Алибек Маратович

• Успанов, Алибек Маратович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Успанов, Алибек Маратович

СОДЕРЖАНИЕ

стр

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Энтомопатогенные грибы - возбудители микозов саранчовых

(аналитический обзор)

1.1 Видовой состав саранчовых Казахстана

1.2 Энтомопатогенные грибы- возбудители микозов саранчовых

1.2.1 Видовой состав возбудителей и распространенность

1.2.2 Цикл развития

1.2.3 Факторы патогенности микромицетов

1.2.3.1 Ферментативная активность

1.2.3.2 Токсины

1.2.4 Культивирование

1.2.5. Препаративные формы

1.2.6 Применение энтомопатогенных гифомицетов для подавления

численности вредных саранчовых

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Место проведения исследований

2.2 Объекты исследований

2.2.1 Штаммы

2.2.2 Тест-насекомые

2.3 Методика исследований

2.3.1 Культивирование грибов

2.3.2 Изучение продуктивности при поверхностном и глубинном культивировании

2.3.3 Определение скорости прорастания конидий в капле воды

2.3.4 Определение жизнеспособности конидий

2.3.5 Лабораторная оценка биологической активности

2.3.6 Оценка биологической активности в полевых условиях

2.3.7 Обработка полученных данных

ГЛАВА 3 СКРИНИНГ ГРИБА BEAUVERIA В ASSI AN А ПО ПРИЗНАКУ 58 ВИРУЛЕНТНОСТИ В ОТНОШЕНИИ САРАНЧОВЫХ

3.1 Первичный скрининг штаммов Beauveria bassiana

3.2 Восприимчивость различных видов саранчовых к штаммам Beauveria 62 bassiana

3.3 Оценка биологической активности изучаемых штаммов на насекомых из 65 других систематических групп

3.4 Зависимость смертности личинок азиатской саранчи от концентрации 68 инокулюма

3.5 Влияние пассирования на вирулентность штаммов гриба Beauveria 73 bassiana

3.6 Оценка гетерогенности штаммов по признаку вирулентности

ГЛАВА 4 ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ГРИБА 78 ВЕЛ U VERI A BASSIANA

4.1 Влияние температуры на прорастание конидий штаммов гриба Beauveria 78 bassiana

4.2 Влияние температуры воздуха на интенсивность развития штаммов гриба

Веат?ег'ш bassiana в поверхностной культуре

4.3 Продуктивность при глубинном культивировании

4.4 Продуктивность при твердофазном культивировании

ГЛАВА 5 БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБА ВЕАиУЕША ВАБЗЫКА ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЧИСЛЕННОСТИ САРАНЧОВЫХ В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ

5.1 Биологическая активность гриба Веашепа bassiana для контроля численности саранчовых в полевых условиях

5.1.1 Оценка биологической активности водной суспензии конидий Веагмег1а Ьа551апа при обработке кулиг в полевых условиях

5.1.2 Влияние растительного масла на биологическую активность гриба 92 Веашег1а Ьа88{апа в полевых условиях

выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологическое обоснование отбора штаммов гриба Beauveria bassiana S.L. для снижения численности саранчовых в Казахстане»

ВВЕДЕНИЕ

Саранчовые в особенности стадные являются одной из наиболее вредоносных групп многоядных вредителей сельскохозяйственных культур. Их вспышки массового размножения отмечались ещё задолго до нашей эры в Древнем Египте, а позже - по всему Ближнему Востоку и в Китае (Лачининский (ред.), 2002).

На территории Казахстана обитает 270 видов и подвидов саранчовых. Наибольшую опасность сельскохозяйственным посевам и угодьям представляют 15-20 видов (Нурмуратов и др., 2000).

В странах СНГ на протяжении последних двух столетий было зарегистрировано 84 случая массовых вспышек саранчовых. Несмотря на значительные успехи в разработке химического метода проблема массовых размножений саранчовых на территории бывшего СССР в конце прошлого века не только не уменьшилась, а наоборот резко усилилась. В 1999 году саранчовые уничтожили в Казахстане только зерновые культуры на площади 220 тыс. га. При этом потери составили 15 млн. долларов США. В 2000 году площадь, обработанная инсектицидами, превысила 8,0 млн. га, что почти в 9 раз превосходила среднемноголетние объемы обработок всех предшествовавших лет. Затраты Республики Казахстан на противосаранчовые мероприятия составили в 1999 г.- 4,8 млн., а в 2000 - 23,0 млн. долларов (Камбулин и др., 2010).

Аналогичная ситуация складывается и на сопредельных территориях России. Так, в 2000 году для борьбы с саранчой химические обработки были проведены на площади 10 млн. га (Сергеев, Лачининский, 2006). В начале XXI века только в Южном Федеральном округе химические инсектициды против саранчовых ежегодно использовались на площади 300-500 тыс. га (Столяров, 2007).

В настоящее время в странах СНГ для контроля численности саранчовых используются только химические инсектициды. Однако, известно, что масштабное применение пестицидов имеет ряд существенных недостатков,

важнейшими из которых являются возникновение резистентных популяций вредителей и загрязнение окружающей среды. Кроме того, многолетний опыт борьбы с саранчовыми свидетельствует о том, что инсектициды обеспечивают обычно лишь временное снижение численности и вредоносности в местах их применения, но в целом, практически не могут повлиять кардинально на ход многолетней динамики численности. Напротив, тотальные обработки дестабилизируют экологическую ситуацию за счет истребления естественных врагов и природных эпизоотий, что удлиняет периоды массового размножения на несколько лет (Камбулин и др., 2010).

В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных экологически безопасных методов защиты растений.

Одним из таких способов подавления вредных фитофагов является микробиологический метод защиты. Особую актуальность использование биологических приемов контроля численности саранчовых приобретает для водоохранных зон и заповедных территорий, где использование химических пестицидов законодательно полностью запрещено.

Среди всего разнообразия энтомопатогенных микроорганизмов одной из наиболее перспективных групп, с точки зрения контроля численности саранчовых являются анаморфные аскомицеты из двух родов - Metarhizium и Beauveria.

Исследования с этими микроорганизмами активно проводятся во многих станах мира - США, Аргентина, Бразилия, Южно-Африканская Республика, Франция, Германия, Испания и др. (Lomer et al., 2001; Inglis et al., 2007; Charnley, Collins, 2007, Faria, Wraight, 2007). В апреле 2004 г. на заседании Консультационного комитета по пестицидам ФАО было рекомендовано расширить долю микробиологического метода в интегрированных программах контроля численности саранчовых и в первую очередь препаратов на основе энтомопатогенных грибов (Сергеев, Лачининский, 2006).

В результате проведенных за рубежом работ было создано и успешно внедрено два препарата на основе гриба Metarhizium anisopliae var. acridum -Green Muscle® (Африка) и Green Guard© (Австралия), обладающие высокой

биологической эффективностью (85-95%) против перелетной, пустынной, мароккской саранчи и кобылок (Langewald et al., 1997; Lomer et al., 2001). Ha основе В. bassiana в США созданы два экспериментальных противосаранчовых препарата - Mycocide GH® и Mycotrol®. К настоящему времени ассортимент зарубежных микоинсектицидов для контроля численности саранчовых включает 11 наименований (Faria, Wraight, 2007).

На территории СНГ исследования в этом направлении до недавнего времени были немногочисленны и носили эпизодический характер.

Кроме того, в Казахстане в начале XXI века были проведены работы по изучению видового состава возбудителей инфекционных заболеваний саранчовых, а также по испытанию препаративных форм на основе гриба Metarhizium anisopliae var. acridum и микроспоридии Nosema locusta в полевых условиях (Темрешев, 2003). Однако в результате этих исследований было показано, что коммерческие препараты (производство Китая) на основе указанных патогенов проявляют низкую биологическую активность (до 54%).

К настоящему времени в списках разрешенных к применению средств защиты растений, как в Казахстане, так и в России нет ни одного препарата на основе энтомопатогенных грибов для контроля численности вредных членистоногих и саранчовых в частности.

Уже более десяти лет в ВИЗР совместно с ИСиЭЖ СО РАН (г.Новосибирск) проводятся интенсивные работы по разработке новых микоинсектицидов (Крюков и др., 200., Левченко, 2007; Леднев и др., 2012). В последние годы к этим исследованиям активно подключились сотрудники КазНИИЗиКР и настоящая работа является составной частью данных совместных исследований.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлась скрининг новых штаммов-продуцентов микоинсектицидов на основе гриба Beauveria bassiana эффективных для подавления численности наиболее вредоносных видов саранчовых в условиях Казахстана. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отбор новых штаммов и природных изолятов казахстанского происхождения гриба В. Ъазъ'шпа по признаку вирулентности в отношении саранчовых;

2. Оценка специфичности отобранных культур гриба в отношении насекомых из других систематических групп;

3. Подбор оптимальных концентраций инокулюма для эффективного подавления численности сараранчовых;

4. Определение температурных преферендумов отобранных штаммов;

5. Оценка продуктивности перспективных культур гриба при поверхностном и глубинном культивировании;

6. Определение биологической эффективности лабораторных образцов биопрепаратов в полевых условиях.

Научная новизна. Впервые на большой выборке штаммов, выделенных на территории Казахстана, показана высокая гетерогенность В. Ъа851апа по признаку вирулентности в отношении саранчовых. Выявлено шесть штаммов гриба В. Ъа$$\апа, обладающих высокой биологической активностью для представителей данной группы вредителей. Для них подобраны оптимальные титры рабочей суспензии. Показано, что отобранные культуры обладают высокой вирулентностью и на насекомых других систематических групп. Для данных культур гриба определены температурные преферендумы и отработаны лабораторные методы глубинной и твердофазной ферментации.

Теоретическая практическая значимость работы. В качестве перспективных штаммов-продуцентов для создания новых биологических препаратов отобраны два новых штамма гриба В. Ъа88\апа казахстанского происхождения, обладающие высокой вирулентностью в отношении различных видов, саранчовых, продуктивностью и термотолерантностью. Разработаны лабораторные регламенты их производства и подобрана препаративная форма.

Показана эффективность лабораторных образцов микоинсектицидов в условиях юго-восточного Казахстана.

Основные положения, выносимые на защиту:

- отбор культур гриба В. Ъа$8\апа, выделенных из природных источников, обладающих высокими показателями по основным целевым признакам в качестве потенциальных продуцентов новых противосаранчовых микоинсектицидов. Штамм ЮК4 - 09 подтвержден инновационным патентом;

- методы культивирования (поверхностного и глубинного) отобранных культур;

- способы использования местных штаммов гриба В. Ьа&$1апа для борьбы с саранчовыми в условиях юго-восточного Казахстана.

Апробация работы. Материалы, полученные в ходе исследований, докладывались на 2-м междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010), 8-м межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока с участием зарубежных ученых, Новосибирск (Россия, 2010), Научной конференции ППС СПбГАУ (С.-Петербург, 2012), Международной молодежной конференции «Инфекционная патология членистоногих» (С.-Петербург, 2012), 14-м съезде Русского энтомологического общества. (С.-Петербург, 2012.), 3-м съезде микологов России. 10-12 октября (Москва, 2012), 2-й международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы и перспективы защиты и карантина растений» (Алматы, 2012).

Личный вклад соискателя. Сбор и выделение грибов, а также полевые испытания отобранных культур проводился диссертантом совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии КазНИИЗиКР, а также коллегами из ВИЗР Россельхозакадемии (С.-Петербург) и ИСиЭЖ СО РАН (Новосибирск). Лабораторные эксперименты, анализ и обобщение результатов исследований выполнены лично автором.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, и получен 1 инновационный патент.

Благодарности. Автор выражает благодарность к.б.н., доценту Г.Р. Ледневу (ВИЗР Россельхозакадемии) за руководство научной работой, д.б.н., академику НАН Республики Казахстан А.О. Сагитову, к.б.н. Б.А. Дуйсембекову (КазНИИЗиКР, Алматы), к.б.н. М.В. Левченко (ВИЗР Россельхозакадемии), за помощь на всех этапах исследования, Е.М. Макарову и Е.Ж. Баймагамбетову (КазНИИЗиКР, Алматы) за ценные замечания, сделанные при работе над рукописью. За помощь в проведении экспериментальной работы я признателен всем сотрудникам лаборатории биотехнологии КазНИИЗиКР, к.б.н. В.Ю. Крюкову и О.Н. Ярославцевой (ИСиЭЖ СО РАН).

ГЛАВА 1 ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ МИКОЗОВ САРАНЧОВЫХ

(аналитический обзор)

1.1 Видовой состав саранчовых Казахстана

Как уже отмечено выше на территории Казахстана обитает 270 видов и подвидов саранчовых. Наибольшую опасность сельскохозяйственным посевам и угодьям ежегодно представляют 15-20 видов. В их числе стадные саранчовые -итальянский прус (Caíliptamus italicus L.), перелетная азиатская (Locusta migratoria migratoria L.) и мароккская саранча (Dociostaurus maroccanus Thnb.); нестадных - крестовая (Arcyptera microptera F.d.W.), атбасарская (.Dociostaurus kraussi Ingen.), чернополосая (Oedaleus decorus Germ.), темнокрылая (Stauroderus scalaris F.d.W.), белополосая (Chorthippus albomarginatus DeG. (Stauroderus scalaris F.d.W.), сибирская кобылки (Aeropus sibiricus L.) и др. (Нурмуратов и др., 2000).

По данным К.А.Васильева (1965), в Центральном Казахстане итальянский прус встречается на высоком уровне численности от лесостепной до полупустынной зон. Заселяемые им местообитания наиболее разнообразны в

Ш* г г

степях, плотность популяций здесь максимальна. Но тяготение пруса к полынникам проявляется весьма отчетливо: только личинки пятого возраста и имаго начинают расселяться в другие типы местообитаний (Соболев и Сергеев, 1985).

Вместе с тем в Восточном Казахстане четко очерчен и другой район, в пределах которого численность пруса бывает, как правило, высока и где могут отмечаться его вспышки, - это территория, занятая сосновыми борами на песчаных массивах (Бунин, 1979).

На Западе Казахстана (Актюбинекая область) прус с максимальной численностью заселяет полупустыни с ковыльно-типчаково-полынной растительностью на легких супесчаных почвах, тогда как в злаковых степях и солянково-полынных пустынях его численность несколько ниже (Жасанов, 2001).

На Юге Казахстана поселения итальянского пруса связаны в основном с речными долинами и оазисами (Лепешкин, 1931, 1934; Лер, 1962). В пределах последних он может размножаться в массе и, в результате, нередко является серьезным вредителем хлопчатника и люцерны. В связи с резким сокращением тросниковых массивов в дельте Амударьи в последние десятилетия 20 века значительно расширилось местообитания итальянского пруса в Приаралье (Нурмуратов и др., 2000).

Широко расселен итальянский прус в горах Тянь-Шаня и Памиро-Алая. Здесь он предпочитает различные типы ксерофитной растительности - от низкогорных полупустынь до каменистых южных склонов (Федотова-Середина, 1982; Копанева и Дорохова, 1987). Наибольшее хозяйственное значение этот вид имеет в Центральном, Северном и Западном Казахстане (Лачининский (ред.), 2002).

Заметная вредоносность вида в северной половине республики данного вида стала отмечаться, начиная с 1975 г., что по времени совпало с активным использованием почвозащитной системы земледелия (Нурмуратов и др., 2000).

Самая масштабная вспышка начала свое развитие с 1996 года. За период с 1999 по 2002 год итальянская саранча обрела статус одного из опаснейших вредителей в республике. В это десятилетие темпы и масштабы ее нашествия превзошли все ранее регистрировавшиеся подъемы численности (Камбулин, Ыскак, 2010).

В течение 2006-2009 годов площади заселения и объемы обработок несколько стабилизировались. Такая ситуация связана с увеличением площадей обрабатываемых земель до 20 млн. га и сменой бурьяна на другую растительность на существующих пока залежных землях.

Азиатская саранча имеет обширный ареал, она гнездится по берегам рек, озер и морей, в зарослях тросника, образующих большие массивы - плавни. Наиболее крупные гнездилища азиатской саранчи - Балхаш-Алакольское, Сырдарьинское, тростниковые заросли в Западно-Казахстанской области (система Камыш-Самарских озер), в Атырауской области (низовья р. Орал, побережье

Каспийского моря). Менее крупные очаги находятся в районе Иргиза (Актюбинская область), озера Зайсан (Восточно-Казахстанская область) (Нурмуратов и др., 2000).

По своему пищевому режиму азиатская саранча - довольно узкий олигофаг, предпочитающий злаки (тросник, пырей, вейник). Соответственно из культурных растений она может повреждать зерновые, в том числе рис. При вылетах за пределы гнездилищ или при недостатке излюбленного злакового корма азиатская саранча питается очень широким кругом растений, относящимся к нескольким десяткам семейств.

В значительной степени многолетняя динамика численности данного вида связана с изменением уровня воды в водоемах по берегам которых расположены гнездилища. В 2004 - 2007 годы были полностью затоплены или подтоплены значительные участки побережья и дельты (Камбулин, Ыскак, 2010). Это явилось одной из основных причин снижения численности саранчи и, как следствие, уменьшения объемов химических обработок. Более поздняя информация показывает, что начался процесс очередного спада уровня оз. Балхаш и осушения дельты р. Иле. Спад уровней воды отмечается для Каспийского моря, оз. Сасыкколь и Алаколь. В связи, с чем следует ожидать нарастания численности азиатской саранчи.

Мароккская саранча распространена на юге и юго-востоке Казахстана. Она занимает сухие холмистые участки, в Южно-Казахстанской области, в предгорьях хребтов Казыкурт и Каржантау. В отдельные годы отмечается повышение численности между хребтами Каратау и Киргизтау в Жамбылской области. На юге находится крайняя северо-восточная точка ареала мороккской саранчи (60 км к востоку от Алматы) (Камбулин, Ыскак, 2010).

Пищей мароккской саранчи служат весьма разнообразные растения. Однако предпочитаемым ею кормом являются злаки, многие маковые, крестоцветные, некоторые бобовые и немногие другие. Из культурных растений больше всего страдают хлебные злаки, так как к моменту образования кулиг они находятся на ранних фазах развития и весьма привлекательны для саранчи. Очень большой

Ч 14

вред она может наносить также и хлопчатнику. Отмечаются случаи серьезного вреда люцерне, клеверу, огородным и бахчевым культурам.

Отмечавшаяся ранее ярко выраженная цикличность массовых размножений мароккской саранчи в последние годы не подтверждается. Сегодня она становится постоянным вредителем растений, в частности пастбищ. В последние годы в результате резкого ухудшения состояния пастбищ на обводненных территориях, усиления процесса их деградации, создаются благоприятные условия для регулярных размножений мароккской саранчи (Камбулин, Ыскак, 2010).

1.2 Возбудители микозов саранчовых 1.2.1 Видовой состав возбудителей и распространенность

По самым ориентировочным подсчетам, среди 100 тысяч существующих в природе грибов выявлено около 750 видов энтомопатогенов, отличающихся различным уровнем паразитизма на членистоногих (Вейзер, 1972; Ferron, 1978; Bürge, 1988; Федорова, 1988; Charnley, 1997). На территории бывшего СССР к середине 70-х годов было зарегистрировано свыше 450 видов энтомопатогенных ,, грибов (Коваль, 1974). К наиболее перспективным агентам биологического

контроля численности вредных членистоногих относятся 12 - 15 видов (Павлюшин, 1979; Воронина, 1989; Zimmermann, 1993; Hall, 1995; Charnley, 1997; Gelernter, Lomer, 2000).

Среди них в первую очередь следует упомянуть грибы родов Beauveria, Metarhizium, Isaria и Lecanicillium. Кроме того, в естественных биоценозах и агроценозах нередки случаи массовых грибных эпизоотий в популяциях насекомых-фитофагов, приводящих к значительному сокращению их численности. Особое значение в этом отношении имеют представители порядка Entomophthorales.

В последние годы в связи с развитием молекулярно-генетических методов в филогенетику и таксономию грибов были внесены кардинальные изменения (Blackwell, 2010). В первую очередь это связано с ликвидацией формального

отдела Deuteromycota в который включались анамофные роды и виды грибов, у которых телеоморфа (половая стадия) либо была неизвестна, либо встречается крайне редко. К этой группе и относилась значительная часть грибов патогенных для насекомых. В частности это представители родов Beauveria (Bals.) Vuill., Metarhizium (Sorok.), Isaria Pers. (=Paecilomyces (Brown et Smith)), Hirsutella (Patouil.) и Lecanicillium (W. Gams et Zare). В настоящее время данные группы микромицетов отнесены к порядку Hypocreales отдела Ascomycota. При этом если ранее указанные роды относились к одному семейству Moniliaceae (Леднев и др., 2003; Гарибова, Лекомцева, 2005), то сейчас они разнесены по трем семействам (Blackwell, 2010). Так, представители рода Metarhizium отнесены к семейству Clavicipitaceae; Akanthomyces, Beauveria, Isaria (=Paecilomyces) и Lecanicillium - к Cordycipitaceae, a Hirsutella и Hymenostilbe - к Ophiocordycipitaceae .

По оценкам разных авторов с саранчовыми ассоциированы 15-20 видов микромицетов.

С точки зрения естественной регуляции численности наибольший интерес представляет энтомофторовый гриб Entomophaga grylli (Fres.) Batko (=Entomophthora grylli Fres.) (отдел Zygomycota порядок Entomophthorales). Уникальность этих грибов заключается в том, что большинство их представителей являются облигатными паразитами членистоногих, способных в короткий срок и на обширных площадях вызывать массовые заболевания (эпизоотии) и выступать в качестве одного из главнейших механизмов регуляции численности своих хозяев (Воронина и др., 2001;).

Е. grylli поражает представителей различных семейств отряда Orthoptera, (Tettigoniidae, Gryllidae, Acrididae и др.). Наиболее часто отмечается заболевание, вызванное данным видом гриба в популяциях саранчовых (сем. Acrididae), как стадных, так и нестадных; включая такие вредоносные виды, как итальянский прус, перелетная и мароккская саранча, сибирская, голубокрылая и другие виды кобылок (Коваль, 2007).

Е. grylli считается в настоящее время видовым комплексом, включающим в себя значительное число разнообразных патотипов, отличающихся как

морфологически, так и по паразитическим свойствам, включая и круг охватываемых насекомых хозяев. Так Бидочка с соавторами (Bidochka et al., 1988) показали, что патотип III из Австралии, обозначенный также как Е. praxibulli, имеет более широкий круг хозяев и обладает повышенной агрессивностью по сравнению с североамериканскими патотипами.

Как отмечено выше, этот гриб способен вызывать массовые периодические эпизоотии в популяциях своих хозяев, и является одним из важнейших механизмов регуляции их численности. В частности отмечены массовые вспышки заболевания на итальянском прусе (Calliptamus italicus L.) (Батко, 1957). Данный гриб с большим трудом выделяется in vitro, на искусственных питательных средах растет медленно, не спороносит и быстро теряет активность (Gustaffsson, 1965). В связи с этим он не представляет интереса с точки зрения разработки биологических препаратов.

Среди представителей анамофных грибов на саранчовых отмечены -Beauveria (Bals.) Vuill., Metarhizium (Sorok.), Paecilomyces (Brown et Smith) -, a также представители родов Hirsutella (Patouil.), LecaniciUium (W. Gams et Zare), Aspergillus (Mich.) и др. (Евлахова, 1974; Огарков, 1990; Wood, Thomas, 1996, Леднев и др., 2003, Темрешев, 2003). При этом для создания микоинссктицидов, подавляющих численность саранчовых, наибольший интерес представляют представители родов Beauveria и Metarhizium (Lomer et all, 2001, Леднев и др. 2012).

Как отмечено выше в настоящее время род Beauveria относится к отделу Ascomycota, порядку Hypocreales, семейству Cordycipitaceae (Kirk et al, 2008). Половая стадия известна только у В. bassiana (Cordyceps bassiana) и была найдена впервые несколько лет назад на юге Китая (Борисов и др., 2001).

В 70-е годы XX века данный род включал только два вида В. bassiana (Bals.) Vuill и В. brongniartii (Sacc.) Petch. Позже в него включили еще 4 таксона: B.vermiconia de Hoog & Rao (1975), В. amorpha Samson & Evans (1982), B. caJedonica Bisset &Widden (1986) and B. malawiensis Rehner et al. (2006).

В связи с развитием молекулярно-генетического анализа, современная систематика рода Beauveria претерпела еще более существенные изменения, и современный род насчитывает, по меньшей мере 12 видов (Rehner et al., 2011). На основе мультилокусного филогенетического анализа в род Beauveria были включены еще 6 видов: В. kipukiae Rehner & Humber., В. varroae Rehner & Humber, В. pseudobassiana Rehner & Humber, B. sungii Rehner & Humber, B. asiatica Rehner & Humber, B. australis Rehner & Humber. При этом первые два из них морфологически и филогенетически близки к В. bassiana, последние два к В. brongniartii, а В. asiatica по морфологическим признакам близок к В. bassiana, но при этом образует сестринскую ветвь с В. brongniartii. В. sungii морфологически близок к последнему виду, но филогенетически проявляет сходство с неопределенным видом из рода Cordyceps.

При дальнейшем упоминании таксонов видового ранга мы будем придерживаться общепринятого (в широком смысле sensu lato) названия видов.

Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, или белая мюскардина, была одной из первых изученных болезней насекомых (Вейзер, 1972).

Мицелий у данного вида разветвленный септированный, обычно белого цвета или слегка окрашенный. Колонии от пушистых до порошащих. Конидиеносцы обычно собраны в рыхлые мутовки, иногда расположены вдоль гиф единично или парами друг против друга. Характерная особенность данного рода - наличие на вершине бутылевидного конидиеносца характерного зигзагообразного выроста. Фиалиды прямые, короткие. Конидии одноклеточные; яйцевидные, цилиндрические с закругленными концами или шаровидные; бесцветные, в массе белые, желтоватые или розоватые, 2-3x1,7-2,5 ц. Налёт обычно выступает на поверхности насекомого поясками из-под крыльев или между сегментами, часто покрывает весь труп. Синнемы образуются довольно редко (Леднев и др., 2003).

В. bassiana является типичным космополитом и зарегистрирован почти во всех природно-климатических зонах мира и поражает насекомых практически из всех отрядов (Огаркова и др., 1973; Евлахова, 1974; Борисов и др., 2001; Леднев и

др., 2003). Диапазон хозяев зависит от штаммов патогена, которые проявляют вирулентные свойства в отношении трипсов, растительноядных клопов, долгоносиков, различных видов жуков, включая вредителей запасов, саранчовых и др. (Вейзер, 1972; Гештовт, 2002; Микульская и др. 2003). Массовых эпизоотий патоген не вызывает; если эпизоотии и наблюдаются, то они носят локальный характер. Гриб хорошо выделяется и растет на искусственных питательных средах. В связи с этим он привлекает внимание многих исследователей как потенциальный продуцент микоинсектицидов для борьбы с вредителями лесного и сельского хозяйства.

Потенциал этого патогена как агента биоконтроля саранчовых выявлен еще в 1936 г. в Южной Африке (Гулий и др., 1981). В бывшем СССР изучение энтомопатогенных грибов, и гриба В. bassiana в частности, было одним из приоритетных направлений развития микробиометода (Федоринчик, 1974). В семидесятых годах 20-го века в ВИЗР и Украинском НИИ защиты растений на основе В. bassiana был создан препарат боверин, включенный в последствии в официальный список разрешенных для применения препаратов. Это обусловило рост большого количества исследовательских проектов, направленных на разработку технологии промышленного производства и применения боверина в борьбе с вредителями сельскохозяйственных культур (Тарасов, 1970; Гораль, 1970; Павлюшин, 1979; Борисов, 1990; Огарков, 1990; Гоголев, 1990).

Кроме В. bassiana, возбудителем белого мюскардиноза является близкий к нему вид Beauveria brongniartii (Sacc.) Petch. s.l. (=B. tenella (Delacr.) Siem). Он описан в основном на разных видах жуков (Гулий и др., 1981), зарегистрирован и как возбудитель микоза саранчовых. A.A. Нуржановым в условиях Узбекистана из пустынной саранчи был выделен штамм БТ-86, обладающий высокой активностью в отношении различных видов стадных и нестадных саранчовых (Нуржанов, Лачининский, 1987). В зависимости от концентрации, при обработке итальянского пруса суспензией конидиоспор гриба гибель вредителя составляла 60-95%. Кроме того, данный штамм обладает высокой ксерофитностью, поэтому способен проявлять высокую эффективность в условиях пониженной влажности..

По современной систематике (Sung et al., 2007) Metarhizium относится к отделу Ascomycota, порядку Hypocreales, семейству Clavicipitaceae, В роде известен только 1 вид образующий телеоморфу - Metacordyceps taii. Его анаморфой является Metarhizium guizhouense Q.T. Chen & H.L. Guo. В целом род Metarhizium включает 13 видов, при этом большинство из них до недавнего времени рассматривались в качестве подвидов или патовариантов M anisopliae (Humber, 1997; Леднев и др., 2003; Bischoff et al., 2009).

В качестве основных подвидов обычно выделяли следующие: 1) M anisopliae var. anisopliae, паразитирующий преимущественно на жуках из различных семейств, космополит; 2) M anisopliae var. majus - в основном на пластинчатоусых жуках (Coleóptera, Scarabiidae), космополит; 3) M anisopliae var. lepidiotum - на термитах и жуках, отмечен только в Австралии; 4) M. anisopliae var. acridum - на прямокрылых, выделен в основном из различных регионов Африки и Австралии.

Последний из указанных подвидов ранее относили к близкому к M anisopliae виду - M. flavoviride (Bateman et al., 1994; Thomas et al., 1997; Kooyman et al., 1997; Lomer, 1999).

Согласно последней ревизии рода (Bischoff et al., 2009) с использованием сопоставления нуклеотидных последовательностей ряда регионов ДНК М. anisopliae относится к PARB кладу, включающему 4 морфологически неразличимых вида: M. pingshaense Q.T. Chen & H.L. Guo, M. anisopliae, M. robertsii J.F. Bisch., Rehner & Humber и M. brunneum Petch. Диагностика вида основана на анализе нуклеотидных последовательностей регионов EFl-o, RPB1, RPB2, ITS, ^-tubulin (Bischoff et al., 2009).

Гриб Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) Sorokin s.l., или зеленая мюскардина, описание которого И.И. Мечниковым под названием Entomophthora anisopliae в 1879 г. положило начало исследованиям по микробиологическому методу борьбы с вредными насекомыми во всем мире (Вейзер, 1972, Борисов и др., 2001). В дальнейшем И.И.Мечников совместно с И.М. Красильщиком провели работы по массовому культивированию этого гриба М. anisopliae и его

применению против личинок и жуков обыкновенного свекловичного долгоносика.

Для данного вида характерен белый клочковато-пушистый мицелий. Спорово-мицелиальный налёт от зелёного до бурого цвета, небольшими пучками, прямые разветвленные, тесно скрученный или свободные, образуют слой. Фиалиды по две или пучками. Конидиеносцы короткие, простые или дихотомически разветвленные, на концах с короткими стеригмами, на концах которых образуются цепочки удлиненно-цилиндрических конидий, 4,8-7,2 х 1,6— 3,5 р., оливкового цвета, в массе зеленовато-оливковых, сильно порошащих. Размножение гриба внутри тела насекомых происходит при помощи распадающихся на клетки гиф, шаровидных, до 16 ц в диаметре, с двойной оболочкой (Коваль, 1974).

Также как и большинство других энтомопатогенных гифомицетов данный вид не имеет резко выраженной видовой специализации. Так, по данным Ва11Ъиг-Вгошпе (1960), М. атзорИае поражает более 70 видов насекомых.

Однако в последнее время было показано, что данный вид имеет достаточно сложную внутривидовую структуру, обусловленную в первую очередь приуроченностью к определенным группам насекомых-хозяев, что и послужило разделению данного таксона на подвиды.

По своим биологическим и паразитическим свойствам данный гриб близок к возбудителям белого мюскардиноза - так же не вызывает массовых эпизоотий и легко культивируется на искусственных питательных средах (Евлахова, 1974, Леднев и др., 2003). Космополит, распространен по всему миру и отсутствует лишь в некоторых изолированных местах (острова и т.д.). На территории России он не обнаружен только на Дальнем Востоке.

В последнее десятилетие возбудитель зеленого мюскардиноза привлекает внимание многих зарубежных исследователей в качестве перспективного агента биологического контроля саранчовых (МПпег е1 а1., 1994; Ьаг^е\уа1с1 е1 а1, 1997; Ьотег е1 а1, 2001). Данный вид является продуцентом нескольких биопрепаратов. В частности на основе М. атзорНае уаг. асг1с!ит разработаны два

микоинсектицида предназначенный для борьбы со стадными и нестадными саранчовыми - Green Muscle® на основе африканского штамма и Green guard® на базе австралийской культуры данного вида гриба (Lomer et all, 2001, Лачининский и др., 2002; Kassa, 2003). Более подробная информация о этих разработках будет приведены ниже.

1.2.2 Цикл развития

Проникновение грибов в организм насекомого-хозяина чаще всего происходит через кутикулу (перкутанно), хотя может осуществляться и через кишечник (перорально), дыхальца, поровые канальца на кутикуле (Евлахова, 1974).

Процесс заражения насекомых грибами можно условно разделить на следующие этапы: 1) адгезия; 2) развитие гриба на поверхности кутикулы; 3) проникновение и развитие гриба в кутикуле и 4) вторжение в полость тела и колонизация внутренних органов насекомого (Борисов и др., 2001).

Адгезия конидий на кутикуле происходит за счет гидрофобных взаимодействий между липидными компонентами эпикутикулы и клеточной оболочки, а также за счет неровностей и выростов (складки, щетинки, и др.) на поверхности кутикулы (Goettel, 1988). В некоторых случаях патоген адгезируется только к определенным тканям. Например, при поражении личинок комаров рода Culex энтомопатогенным грибом Metarhizium anisopliae споры гриба фиксируются на гидрофобной поверхности сифона и затем инвазируют ткань последнего (Гештовт, 2002). Этому способствует гидрофобная поверхность спор М. anisopliae, которая обеспечивает адгезию гриба и длительное нахождение его на поверхности воды.

Последующие этапы заражения наиболее полно были изучены Р. Захарук (Zacharuc, 1970) при заражении личинок щелкунов Limonlus californicus, Hypolithus bicolor, Ctenicera aeripennis и С.destructor грибом Metarhizium anisopliae.

Обычно не проросшая конидия имеет круглое, расположенное в центре, ядро. В начале или незадолго до прорастания ядро становится вытянутым и перемещается из центра споры к полюсу прорастания, где начинает делиться. Через некоторое время у одного из полюсов появляется ростковая трубка. Иногда она может появиться из середины споры, или может наблюдаться биполярное прорастание. Оставшееся в конидии ядро со временем разрушается ^асЬагис, 1970). Ростковая трубка внедряется вертикально в хитиновый покров насекомого и проникает в полость тела. Эта фаза развития гриба начинается через 10-12 часов после разбухания спор и может продолжаться несколько дней. В месте соприкосновения с покровами ростковая трубка, разрастаясь, образует аппрессориальную клетку, которая отделяется от ростковой трубки септой. Закончив свое формирование, аппрессориальная клетка начинает делиться. Дочерние клетки отделяются от материнской септами. Аппрессориальные клетки покрыты слизеподобным веществом, которое и обеспечивает плотное сцепление этих структур с эпикутикулой. Аппрессории, развивающиеся из разных ростковых трубок, могут сформировать так называемую инфекционную подушку. Она обычно содержит от 2 до 10 и более аппрессорий ^асИагис, 1970, Борисов и др. 2001).

Перед началом внедрения гриба в кутикулу наблюдается образование полостей в эпикутикуле под аппрессорием. При этом происходит расширение поровых канальцев и исчезновение воскового слоя. В образовавшиеся полости переливается эндоплазма аппрессориальных клеток и образуется проникающая трубочка. Расширение поровых канальцев, исчезновение воскового слоя и отсутствие видимого механического повреждения эпикутикулы определено действием гидролитических ферментов гриба в процессе инфицирования. Кроме того, наличие многочисленных митохондрий и диктиосом в аппрессориальных клетках может предполагать высокий уровень метаболизма и экскреторной активности (Гештовт, 2002).

После этого из проникающей платы начинают развиваться отростки, растущие латерально и/или вниз. Тонкие латеральные гифы дают затем начало

гифальным телам первого и второго порядка. Первый тип имеет неправильную форму, электронно-плотную эндоплазму и тонкую клеточную стенку. Другой, имеет более правильную форму, обычно она овальная или несколько вытянутая; с менее плотной цитоплазмой и с более толстой клеточной стенкой. Оба этих типа встречаются в виде слоев, наложенных друг на друга, цепочек или беспорядочно разбросаны среди ламелл прокутикулы. Образование гифальных тел происходит путем почкования или гифальных тел, или латеральных гиф. Первоначально развитие гриба происходит в верхней части прокутикулы. В нижележащих слоях прокутикулы вертикальная гифа имеет тенденцию к удлинению и продуцированию нескольких гифальных тел (Борисов и др., 2001).

По данным световой микроскопии, в местах внедрения гриба в гиподерму наблюдается лизис клеток этой ткани. Проникшие за пределы этой ткани гифы увеличиваются в размере и начинают делиться. Начальные этапы колонизации внутренних органов характеризуются формированием в гемолимфе звездообразных гифальных тел (бластоспор). Токами гемолимфы они разносятся по телу и через некоторое время продуцируют бластоспоры правильной элипсовидной формы (Евлахова, 1974). Прежде всего, разрушаются лимфоциты. В этот период гриб продуцирует токсины, приводящие хозяина к гибели. К моменту, когда патоген уничтожит лимфоциты, насекомое погибает. Гибель хозяина обычно наступает, в зависимости от паразитических свойств гриба, морфо-физиологических особенностей насекомого и абиотических условий среды на третьи - двадцатые сутки. Наиболее интенсивное размножение гриба в виде бластоспор наблюдается в гемолимфе насекомого- хозяина; зародышевый мицелий концентрируется в местах проникновения. Активная колонизация внутренних органов насекомого начинается лишь после его гибели. В первую очередь гриб атакует жировое тело, затем наступает очередь кишечного тракта и мальпигиевых сосудов (Леднев и др., 2003). Остальные органы заселяются обычно в следующем порядке: гиподерма — нервная система — мышечная ткань — трахеи. Нарастающая масса гиф заполняет тело хозяина, не деформируя его покров, и труп насекомого вначале имеет внутри творожную консистенцию, затем

уплотняется и мумифицируется. После этого гифы патогена начинают расти к поверхности тела и при наличии достаточной влажности прорастают на поверхность кутикулы насекомого, образуя пушистый или войлочный мицелий, который выступает на поверхность трупа поясками из-под крыльев или же прорывающий покровы между сегментами, часто покрывая все тело. Первоначальные места выхода гриба на поверхность тела приурочены к тонким частям интегументов: порам чувствительных органов и межсегментным мембранам. Однако появление гриба не ограничивается только этими местами. Он также может проникать через утолщенные участки кутикулы — склериты. Следует отметить, что очевидного разрушения органов и тканей, и особенно прокутикулы, во время роста гриба к поверхности тела может не происходить. Выход гиф на поверхность осуществляется путем разрыва покровов гифами, находящимися в прокутикуле. Споруляция начинается через сутки после появления вегетативных гиф. На мицелии формируется конидиальное спороношение в виде конидиеносцев с воздушными конидиями, которые осуществляют последующее заражение насекомых-хозяев в течение периода активного развития и возобновления паразитического цикла весной. В ряде случаев заражение может проходить и в зимний период на диапаузирующих насекомых в почве, но при этом развитие микоза происходит крайне медленно (Борисов и др., 2001).

Видовые особенности грибов и насекомых, физиологическое состояние организма последних, а также места на кутикуле, через которые происходит внедрение, могут вносить коррективы в процесс инфицирования.

Существенные различия могут быть в скорости прорастания спор энтомопатогенных грибов. По данным некоторых авторов, споры М.атъорИае

начинают прорастать через 12 ч на покровах личинок жуков-щелкунов, но

\

основная их масса прорастает в период между 24-48 ч после заражения (Гештовт 2002). В целом скорость прорастания часто бывает напрямую связана с вирулентностью штаммов — высоковирулентные прорастают в большинстве случаев раньше, чем средне- и низковирулентные (Серебров, 2000).

При заражении гусениц Ostrinia furnacalis было отмечено, что с возрастом насекомого изменяется скорость развития инфекции. Период проникновения ростковой трубки через кутикулу в гемоцель гусениц 1-2 возраста занимает 36 ч, а гусениц 3-4 возраста — 46 ч. Повреждение и разрушение тканей у гусениц 1-2 возраста начинается через 42-48 ч после заражения, у 3-4 возраста — через 72-96 ч, у гусениц последнего возраста — через 120-140 ч. Заражение М. anisopliae тлей Myzodes perslcae, Lepaphis erysimis и листоеда Psylliodes chrysophella показало, что конидии легче прорастают и удерживаются у тлей на поверхности, а у жуков — под надкрыльями. На кутикуле тлей гриб образовывал в большом количестве мелкие аппрессории, а на кутикуле жуков они иногда вообще не формировались. Хуже всего конидии удерживались и прорастали на дорсальной поверхности груди жуков. На мертвых жуках эти отличия нивелировались (Butt et al., 1995).

Во время линьки насекомых процесс инфицирования имеет некоторые особенности. Первые этапы заражения происходят так, как было описано выше. Интересной чертой заражения линяющих насекомых является формирование гифами, достигнувшими поверхности новой кутикулы, вторичных органов проникновения: аппрессориев, проникающих трубочек, плат. Из новой кутикулы впоследствии появляются вертикальные гифы, проникающие в полость тела. Развитие B.bassiana в кутикуле колорадского жука во время линьки приводило к сильной деформации ламелл прокутикулы (Борисов и др. 2001). Рост патогена в нижней части прокутикулы был несколько обильнее, чем в верхней. Высказано предположение, что это обусловлено частичным разрушением белково-хитинового комплекса ферментами экзувиальной жидкости. В целом гриб формировал гораздо меньше структур и, прежде всего гифальных тел, чем М.anisopliae при заражении личинок щелкунов во время линьки. B.bassiana, достигнув экзувиальной полости, начинала продуцировать бластоспоры, по морфологии подобные тем, что он образует в гемолимфе или в глубинной культуре. Бластоспоры были способны размножаться в экзувиальной полости. Как и М. anisopliae, возбудитель белой мюскардины формировал на поверхности вторичные органы проникновения (Zacharuc, 1970). Кроме того, заражение

насекомых во время линьки грибами часто сопряжено с развитием бактериальной инфекции. Бактерии из окружающей среды, например из почвы, через трещины на кутикуле проникают в экзувиальную полость. Многие из них при этом погибают. Но нередко через повреждения в новой кутикуле и гиподерме бактерии попадают в гемоцель, что может приводить к септицемии (Zacharuc, 1970; Vey et al., 1985).

На начальных этапах развития инфекции зараженные насекомые весьма сложно отличить от здоровых. Первым симптомом заболевания служит изменение окраски. У некоторых насекомых при инфицировании энтомопатогенными грибами регистрируются черно-бурые пятна на кутикуле (Штейнхаус, 1950; Павлюшин, 1978), которые появляются за несколько дней до гибели. Форма, размеры, расположение и количество пятен не зависят от вида гриба, но коррелируют с вирулентностью штаммов. Так, при заражении высоковирулентными штаммами M.anisopliae и B.bassiana у гусениц большой вощинной огневки (Gallería mellonella) в большом количестве регистрировали мелкие бурые пятна. Первоначально они появлялись между сегментами тела или около дыхалец, а затем и на самих сегментах. Заражение гусениц средневирулентными штаммами грибов B.bassiana приводило к появлению на одних и тех же личинках как крупных, так и массы мелких пятен. Авирулентный штамм М. anisopliae не вызывал появления пятен.

Заражение гусениц старыми культурами высоковирулентных штаммов, а также при низкой влажности приводит к появлению симптомов, характерных для слабо и средневирулентных штаммов (Серебров и др. 2000). Непосредственно перед гибелью у некоторых насекомых могут возникать судороги и паралич. После гибели хозяина происходит мумификация трупов - один из наиболее характерных симптомов при микозах, вызываемых данными группами грибов. Ткани и органы насекомого, пронизанные гифами патогена, становятся очень твердыми и полностью сохраняют свою форму. В некоторых случаях наблюдается изменение окраски тела трупа. Так при поражении В. bassiana покровы тела погибших личинок приобретают розовый оттенок. В дальнейшем в

условиях оптимальной влажности на поверхности трупов появляется воздушный мицелий, различный по плотности в зависимости от вида патогенна. На мицелии формируется конидиальное спороношение, являющиеся основным диагностическим признаком того или иного вида возбудителя. Окраска спорово-мицелиальный налета также является одним из важнейших диагностических признаков. Так, у большинства видов мицелий светлоокрашенный от белого до розового тонов - представители родов Beauveria, Lecanicillium, Paecilomyces, Tolypocladium и другие. У многих видов рода Metarhizium спорово-мицелиальный налёт от светло-зелёного до бурого цвета. Ряд видов и штаммов энтомопатогенных грибов формирует синнемы, достигающие иногда длины до 45 см (Леднев и др. 2003).

Таким образом, процесс инфицирования и последующего развития заболевания зависит как от насекомого-хозяина, так и от патогена. Кроме того, прослеживается предпочтение грибами определенных органов и тканей хозяев (Борисов и др., 2001).

1.2.3 Факторы патогенности микромицетов 1.2.3.1 Ферментативная активность

Развитие энтомопатогенных аскомицетов из анаморфных родов в организме насекомых-хозяев сопровождается гистолизом тканей и органов вокруг места проникновения гриба. Не вызывает сомнений, что уникальная способность грибов проникать в организм насекомых через кутикулу в значительной степени обусловлена наличием ферментов, разрушающих кутикулу. Поскольку главными компонентами кутикулы насекомых являются липиды, белки и хитин, то исследователями основное внимание было уделено липазам, протеазам и хитиназам энтомопатогенных грибов. В современной литературе представлена целая серия публикаций, раскрывающих роль гидролитических ферментов в проникновении энтомопатогенных грибов через кутикулу насекомых (Leger et al., 1986; Gupta et al., 1992; Butt et al., 1995; Napolitano, Juárez, 1997; Quíntela, McCoy, 1998; Серебров, 2000; Глупов и др., 2001; Борисов и др., 2001).

Кутикула членистоногих состоит из трех слоев, различающихся по биохимическому составу и строению: наружного, очень тонкого слоя -эпикутикулы и двух значительно более мощных слоев: экзо - и эндокутикулы (Brey et al., 1985). В состав эпикутикулы входят полифенолы, воск, липопротеины, тогда как для экзо - и эндокутикулы характерно наличие связанного с белками хитина (Lockey, 1988; Binnington, Retnakaran, 1991, Глупов и др., 2001).

Экспериментально было доказано, что ферменты энтомопатогенных грибов

разрушают кутикулярный материал. Так, Р. Леджер (Leger et al., 1986) изучал

синтез экстрацеллюлярных ферментов энтомопатогенными грибами на среде,

основу которой составляла измельченная кутикула саранчи. Как и на

искусственных питательных средах, грибы продуцировали разнообразные

ферменты. Автором отмечены существенные различия между штаммами и

видами грибов M.anisopliae и B.bassiana, возможно, за счет различной скорости

роста. Все штаммы обладали протеазной, аминопептидазной,

карбоксипептидазной, липазной, эстеразной, хитиназной, N-

ацетилглюкозаминазной (N-АГазной), каталазной, дезоксирибонуклеазной

(ДНКазной) и рибонуклеазной (РНКазной) активностью. Полифенолоксидазная

активность не регистрировалась в культуральной жидкости у B.bassiana и у части

изолятов М. anisopliae. Последовательность появления различных ферментов в

/

культуре грибов была одинаковой у всех видов. Эстеразная и протеолитическая активность (общая протеолитическая активность, амино- и карбоксипептидазная) регистрировалась менее чем через 24 ч после посева и резко увеличивалась к 48 ч. Хитиназная и N-АГаз-ная активность проявлялись позже, они оставались низкими в первые 3-5 суток, после чего возрастали, липазная — не обнаруживалась до 5 суток (Глупов и др., 2001).

Было показано, что во время развития грибов гидролизу сперва подвергается белковая часть кутикулы, и только после этого начинается разрушение хитина. Утилизация белков дейтеромицетами может происходить из склеротизированной и несклеротизированной частей кутикулы. Следует отметить,

что связанный с хннонами белок менее подвержен разрушению протеазами. Между ферментами грибов может наблюдаться синергизм. Так, например, предварительная обработка кутикулы протеазой значительно увеличивает эффективность хитиназы. Подобный эффект не обнаруживается между протеазой и N-АГазой, а также между протеазой и хитиназой в отношении экзувия. Кроме того, экзувий оказался более устойчивым к обоим ферментам, чем кутикула (Leger et al., 1986).

Внесение кутикулы саранчи в культуральную жидкость приводило к снижению ферментативной активности последней. Это происходит в результате адсорбции ферментов кутикулой. Основную часть адсорбированных протеолитических ферментов можно извлечь 0,2М фосфатным буфером, что указывает на неспецифическое ионное связывание ферментов с составляющими кутикулы. Одним из вероятных компонентов, участвующих в связывании белков, является хитин. Добавление 5 мг хитина к 3 мл раствора, содержащего 8,4 ед. хитиназы, приводило к связыванию 97% фермента в течение трех минут. Денатурированная хитиназа (при 100°С, 60 мин.) имела гораздо меньшее сродство к хитину. Кроме того, хитиназная активность раствора восстанавливалась после гидролиза хитина ферментом. Возможно, при разрушении субстратов ферментами образовываются специфические связи их с соответствующими компонентами кутикулы. N-АГаза и протеаза имели меньшую активность к хитину, чем хитиназа. Адсорбция может быть одним из механизмов, ответственных за локальную деградацию кутикулы (Leger et al., 1986; Глупов и др., 2001).

Таким образом, энтомопатогенные грибы синтезируют in vitro липазы, протеазы и хитиназы — внеклеточные ферменты, гидролизирующие основные компоненты кутикулы насекомых. Получены убедительные данные о корреляции активности ферментов и вирулентности (Тюльпанова и др., 1987). Подобный вывод можно сделать из данных электронно-микроскопического анализа проникновения грибов в организм насекомых (Zacharuc, 1970). Известно также, что у авирулентных клонов, появляющихся в популяциях активных штаммов

B.bassiana наблюдается пониженная протеалитическая активность (Павлюшин, 1979).

Первое детальное изучение ферментов энтомопатогенных грибов было проведено Хубером (Huber, 1958). В культуральной жидкости Aspergillus flavus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae и Cordyceps militaris он обнаружил липазы, протеазы, хитиназы и другие ферменты. Грибы могли использовать в качестве единственного источника углерода животные жиры, гликоген, белки, хитин, крахмал, декстрин, свободные аминокислоты и ряд других органических веществ. Особое внимание автор проявил к изучению хитиназной активности.

Изучение механизма индукции хитиназы на примере грибов М. anisopliae и В. bassiana выявило ряд интересных моментов. Хитиназная активность может «маскироваться» хитозаназной активностью, так как хитин частично диацетилирован, а хитозан также содержит ацетилированные остатки (Leger et al., 1992). Оказалось, что синтез хитиназы и хитозаназы у энтомопатогенных грибов регулируется продуктами гидролитического разложения хитина и хитозана через индуцировано репрессорный (стимулирующее подавляющий) механизм (Leger et al., 1986: 1992). На первом этапе при контакте спор патогена с кутикулой восприимчивых к заражению насекомых индуцируется Китобиазная (М-ацетил-ß-Д-глюкозаминидазная) активность гриба, способствующая лизису клеточной оболочки этих спор (Leger et al., 1988). Активность хитобиазы обычно невысока, но мало подвержена катаболическому подавлению (Leger at al., 1992).

В процессе развития инфекционной гифы на кутикуле растворимые олигомеры хитина и хитозана клеточной стенки гриба, высвобождающиеся, под действием хитобиазы, индуцируют увеличение хитозаназной активности патогена. Это в свою очередь способствует высвобождению растворимых олигомеров хитина из кутикулы и индуцирует резкое усиление хитиназной активности гриба, способствуя его прохождению через кутикулярный барьер (Leger et al., 1992; Leger, Staples, 1993; Paterson et al., 1994; Fenice et al., 1998, Глупов и др., 2001).

Конститутивная или адаптивная секреция хитиназы у В. bassiana зависит от штамма гриба. Сравнительный анализ авирулентных мутантов и вирулентных штаммов В. bassiana (Charnley, 1984;Kosir et al., 1991; Bello, Paccola - Meirelles, 1998) подтвердил, что хитинолитическая активность играет существенную роль в вирулентности, способствуя проникновению патогена через кутикулу хозяина.

Оптимум хитинолитической активности для гриба В. bassiana лежит в пределах 4.5 - 5.0 pH, при температуре 42 °С. В культуральной жидкости в период ферментации хитинолитическая активность появляется на третьи сутки и исчезает на пятые. При поверхностном культивировании на жидких средах хитинолитическая активность у гриба В. bassiana не обнаружена, в то время как при глубинном культивировании максимум активности наблюдали на трехсуточной культуре (Беленикина и др., 1989).

В литературе нет однозначного мнения об уровне хитинолитической активности энтомопатогенных дейтеромицетов, необходимой и достаточной для реализации их агрессивности при контакте с насекомыми. В своем аналитическом обзоре В.А. Павлюшин (1980) отмечал, что хитинолитическая активность ряда возбудителей заболеваний определенных насекомых (яблонной плодожорки, личинок колорадского жука и т.д.) коррелирует с вирулентностью, однако в других экспериментах на комнатных мухах, дрозофиле и др. получены противоположные или неоднозначные результаты.

Протеазная активность

Не менее важную роль в процессе перфорации кутикулярных покровов насекомых играют протеазы энтомопатогенных грибов. Сравнительное исследование мицелиальных экстрактов и метаболитов В. bassiana и В. brongniartii электрофорезом показало присутствие специфических фракций, большая часть которых соответствует ферментам типа химотрипсина, N -глюкозидазы и карбоксильной эстеразы (Leger et al., 1988; Shimizu et al., 1993, Глупов и др., 2001).

Известно, что химотрипсин гидролизует пептиды и эфиры главным образом на карбоксильных группах гидрофобных аминных кислот и, следовательно, обладает эстеразной активностью. Очищенные «трипсинподобные» протеазы мюскардиновых грибов М. anisopliae и В. bassiana оказывали активное воздействие на кутикулу саранчи Schistocerca gregaria, гидролизуя до 30 % кутикулярного протеина (Leger et al., 1988).

Изучен характер гидролиза высокомолекулярных белков, содержащихся в кутикуле кузнечика Melamoplus sanguinipes, протеазами грибов М. anisopliae и В. bassiana, очищенными в полиакриламидном геле дисковым электрофорезом. Показана роль определенных изоферментов грибов в деградации протеинов кутикулы насекомого. Отмечена специфичность наиболее активных изоферментов. Сделан вывод, что именно протеолитическая активность является ключевым фактором вирулентности данных грибов в отношении М sanguinipes (Bidochka, Khachatourians, 1990, 1994).

В настоящее время большое количество работ посвящено протеазам энтомопатогенных грибов, участвующим в деградации кутикулы (St. Leger, 1995; Gillespie et al., 1998; Castellanos-Moguel et al., 2007; Mohanty et al.,2008 ). Данные исследования проводятся с использованием молекулярно-генетических методов. При этом авторами показана прямая связь активности данного фермента и вирулентности микопатогенов (Leal et al., 1997; Wang et al., 2002).

Серебровым (Борисов и др., 2001) было проведено изучение протеазной и хитиназной активности коллекционных штаммов энтомопатогенных грибов M.anisopliae и В.bassiana, которые более 10 лет поддерживались в лаборатории на искусственных питательных средах. В целом, грибы характеризовались слабой ферментативной активностью. Так, желатиназной активностью обладал только один из пяти изученных штаммов M.anisopliae (ЗМ-97), а у В.bassiana — 1 из 10 (2В-97). При росте на молочной среде у большинства штаммов зоны просветления регистрировались через сутки после посева. Диаметр зон протеолиза вокруг колоний, как правило, незначительно превышал диаметр самих колоний, У штамма 2В-97 зона протеолиза в 1,3 раза превышала диаметр колонии. На

агаровой среде с коллоидным хитином грибы развивались плохо. Просветление среды наступало лишь через 4-5 сут. после инокуляции. Наиболее полное разрушение хитина обеспечивали штаммы гриба M.anisopliae. Ни у одного из коллекционных штаммов не было обнаружено существенного превышения диаметра зоны хитинолиза над диаметром колоний. Инфицирование гусениц Gallería mellonella показало отсутствие связи между хитиназной и протеазной активностью, с одной стороны, и вирулентностью — с другой.

При анализе популяций гриба М anisopliae по его способности продуцировать экзоферменты in vitro Rosato была выявлена штаммовая гетерогенность данного признака. Так, географически удаленные изоляты распределялись активностью амилазы и протеазы на три группы, а по липазе и хитиназе на четыре (Rosato et al., 1981). Повышенная вирулентность грибов В. bassiana и В. brongniartii связана с высоким уровнем их липазной активности (Павлюшин, 1979; Charnley, 1984), а гриба М. anisopliae - с отсутствием амилазной активности (Robert, Messing-Al-Aidroos, 1985; Jackson et al., 1985). Вирулентные штаммы грибов В. bassiana М. anisopliae обычно проявляют повышенную хитинолитическую активность (Samsinakova, Misikova, 1973; Charnley, 1984; Jackson et al., 1985;Gupta et al., 1994).

1.2.3.2 Токсины

Гибель насекомых, как правило, наступает до интенсивной колонизации его тканей и органов, что обусловлено, с одной стороны, механическим и ферментативным разрушением кутикулы, с другой — интоксикацией организма хозяина. Следует отметить, что токсигенность может быть обусловлена не только продуцированным грибом токсина, но и токсическими продуктами распада тканей хозяина. Наряду с ферментами токсины являются одним из основных факторов вирулентности энтомопатогенных грибов. Вклад токсинов в вирулентность зависит от конкретного штамма гриба и вида насекомого. Несмотря на то, что токсины относительно хорошо охарактеризованы с

химической точки зрения, их механизм действия пока остается не вполне ясным (Борисов и др. 2001, Глупов и др., 2001).

В целом продукты метаболизма энтомопатогенных грибов обладают низкой специфичностью. Среди них обнаружены соединения, токсичные не только для насекомых, но и для млекопитающих, растений, микроорганизмов.

Наиболее важные результаты по изучению корреляции вирулентности с токсигенностью получены Е. Уестом и Дж. Бригсом (West, Briggs, 1968). На модели B.bassiana — G.mellonella они показали, что длительно культивируемые на насекомых-хозяевах штаммы были более токсичными, чем растущие на искусственных средах. Многократный пассаж через хозяев способствовал увеличению токсигенности. Также отмечена зависимость титра токсина от времени культивирования гриба.

Наиболее хорошо изучены и описаны токсины грибов родов Beauveria, Metarhizium, Aspergillus, Penecillium.

В основном токсины грибов с известной биохимической структурой представлены низкомолекулярными циклическими пептидами (Vey et al. 1985; Vey, Riba, 1989), органическими кислотами (Claydon, 1978; Claydon Grove, 1982), высокомолекулярными белками и гликопротеинами (Mollier et al. 1994).

В качестве токсинов энтомопатогенных грибов известны: варфарин, пиридоверин, пиридомакролидин, боверицин, боверолид, бассиатин и бассианолид, продуцируемые грибами из родов Beauveria, Paecilomvces и VerticiUium (Peczynska - Czoch et al., 1991; Takahashi et al., 1998); деструктины гриба М. anisopliae (Veу et al., 1985; James, 2001).

Исследования по химической идентификации токсинов B.bassiana показали, что полярная фракция мицелия гриба обладает сильным контактным инсектицидным действием. В 1968 г. Р. Хамилем с соавторами. (Hamill et al., 1969) было выделено экстракцией метанолом из мицелия биологически активное вещество — боверицин, которое оказалось токсичным для Artemia sauna и личинок комаров. Кроме того, была установлена умеренная бактерицидная (по отношению к грамположительным бактериям) и фунгицидная активность этого

токсина. Боверицин имеет депсипептидную природу, содержит циклически повторяющуюся последовательность трех молекул Ы-метилфенилаланина и трех молекул 2-гидроксиизовалериановой кислоты. Механизм его действия связывают с нарушением транспорта ионов через клеточные мембраны. Не оказывая прямого

губительного воздействия на растения, он все же опосредовано влияет и на них,

2+

увеличивая концентрацию ионов Са в мембранах и открывая таким образом поры для различных инфекций (Ьеттепз-Сгиёег е1 а1., 2000).

Токсины, имеющие пептидную природу, широко распространены среди энтомопатогенных грибов. Здесь, прежде всего, следует назвать деструксины, впервые выделенные из грибов рода Ме1агЫгшт.. По своей химической природе они являются гексадепсипептидами, состоящими из альфа-гидрокси кислоты и пяти аминокислотных остатков (валанин, аланин, валин, изолейцин, пролин) (РеёгаБ е1 а1., 2002). В настоящее время насчитывается около 38 деструксинов или их аналогов, разделенных химически на 5 групп (РеёгаБ е1 а1., 2002; Ни е1 а1., 2006). Деструксины (А, В, Е) оказывают инсектицидную активность при инъекции в гемолимфу и при скармливании (СауеНег е1 а1., 1998; ТИотБеп и ЕПепЬе^, 2000). Действие деструксинов на клеточном уровне проявляется в морфологических изменениях клеток и развитии повреждений, отмечаемых одновременно в ядре и цитоплазме. В основном регистрируют деградацию митохондрий и пикноз ядер. Также повреждаются эндоплазматический ретикулум и рибосомы. Кроме того, деструксины обладают иммуносупрессивным действием через подавление процессов клеточного иммунитета, в частности, гранулообразования (УПстБкаБ е1 а1., 1997а). На организменном уровне главными мишенями для деструксинов служат кишечник, мальпигиевы сосуды и свободно циркулирующие гемоциты (Уеу е1 а1, 1988).

Среди токсинов пептидной природы следует также отметить следующие: боверолиды Н и I — два очень сходных циклотетрадепсипептида из В. Ьа88\апа; бассианолиды — циклодепсипептиды (состоят из четырех молекул, каждая из которых включает М-метиллизин и Э-а-гидроксиизовалериановую кислоту), выделенные из мицелия В.Ъа$8\апа и УАесапи (Krasnoff е1 а1, 1991); цитохалазины

— пергидроиндолы (имеют макроциклическое кольцо; образуются, вероятно, из фенилаланина или триптофана), блокирующие образование цитоплазматического скелета и дробление клеток. Показано, что циклоспорины подавляют иммунные реакции насекомого, цитохалазины (зигоспорины) блокируют последнюю стадию клеточного деления (2осЬег е1 а1., 1984), деструксины вызывают морфологические изменения клетки, а боверицин действует на клеточную мембрану. Однако, надо отметить, что несмотря на известную структуру механизмы действия многих метаболитов пептидной природы по-прежнему до конца неясны (Митина и др., 2003).

В целом, довольно трудно провести грань между ферментами, токсинами и веществами с иммунодепрессивными защитными свойствами. Так, в роли токсинов могут выступать многие ферменты. Экспериментально это было доказано для протеаз и хитиназ энтомопатогенных грибов (МсСаи1еи еЬ а1., 1968). Деструксины с их выраженным инсектицидным действием подавляют некоторые защитные реакции: меланизацию и инкапсуляцию (Уеу е1 а1, 1988). Кроме того, инвазионность во многом зависит от способности грибов механически разрушать интегументы хозяина.

1,3 Культивирование

Из литературы известно, что средняя гектарная норма расхода биопрепаратов на основе грибов составляет около 10 -1(Г конидии или колониеобразующих единиц (пропагул) (Берестецкий, Сокорнова, 2009). Поэтому одной из важнейших задач при разработке биологических пестицидов является получение инфекционного биоматериала, стоимость которого может конкурировать с затратами на производство пестицидов химических (Виг1еИ, ^гопзкл, 1988).

При культивировании на естественных питательных средах очень часто интенсивное накопление мицелиальной массы не сопровождается обильным спороношением грибов. На отварах овса, пшена рост гриба В. ЬаББтапа незначительный, мучнистый, но титры конидий наибольшие по сравнению с другими средами. (Огарков, 1990).

Существующие технологические регламенты производства вертициллина, боверина и метаризина (Гораль, Лаппа, 1991) позволяют нарабатывать биопрепараты на жидкой (без встряхивания) среде в виде поверхностной пленки (с последующим ее высушиванием и дезинтеграцией) и на зернах ячменя (и других культур), используя конидии в свежем виде (смыв спор с зерна). Недостатком первого способа является низкая производительность и потребность в производственных площадях, второго - невозможность сушки и длительного хранения биоматериала (Соловей, Кучеренко, 1989).

Известна технология твердофазного культивирования Ь. 1есапи, основанная на способности гриба утилизировать разнообразные искусственные среды, широко используемые в микробиологической промышленности. Не плохим носителем для таких сред и остовом (матрицей) для роста гриба и образования конидий оказалась измельченная до 3 - 5 см пшеничная солома. Испытание различных сочетаний и концентраций компонентов питания позволило подобрать среды, которые в смеси с соломой дают возможность получать от 3.5 до 6 млрд. спор с 1 г субстрата. Наиболее продуктивны сочетания технического глицерина с БВК и пивного сусла или мелассы с кукурузным экстрактом. В качестве источника питания при вышеописанном способе получения препаратов, по-видимому, можно использовать комплексные минеральные удобрения, как это предлагалось ранее Б.Н. Огарковым (1972) для другой технологической схемы мелкотоннажного производства биопрепаратов.

В последнее время наблюдается значительный прогресс в конструировании биореакторов для твердофазного культивирования, и некоторые биотехнологические компании (например, немецкая фирма РгорЬу1а,) получают конидии грибов, как основы микопестицидов исключительно этим методом (Берестецкий, Сокарнова, 2009). Для небольших производств предложены специальные «мини»-биореакторы - полипропиленовые пакеты с перфорацией (Ваг1еИ, ^гопэкл, 1988; с1е Угуе е1 а1., 2001). Полупромышленная технология получения конидий МегагЫгшт /1ауоуи-1с1е на рисе в полипропиленовых пакетах

позволяет получать примерно 1.5x10 конидий/кг субстрата при рабочем цикле 82 кг, 1.6 циклов в неделю (Jenkins et al., 1998).

Перспективным считается метод погруженного культивирования грибов -одноэтапный процесс получения конидий грибов в ферментере гидропонного типа. В отличие от ранее известных способов гидропонная ферментация дает возможность в широких пределах изменять поверхность среды культивирования за счет применения пористых наполнителей без увеличения объема питательной среды (Rombach, 1989; Swanson, 1997).

Проведены исследования факторов, лимитирующих рост и спорообразование гриба В. bassiana при поверхностном и глубинном культивировании на жидких средах. В первом случае с питательной средой контактируют только клетки субстратного мицелия. Питательные вещества к растущим клеткам воздушного мицелия доставляются путем внутригифального транспорта, что и является узким местом, лимитирующим рост биомассы гриба. При устранении лимитирующего фактора путем полного погружения биомассы производительность процесса получения увеличивается в 10 - 12 раз. Однако в этом случае гриб испытывает недостаток кислорода, что приводит к снижению образования конидий. Снятие лимитации по кислороду осуществляется путем контактной аэрации в двухфазной системе: «жидкость-газ» (Тюльпанова и др., 1989).

Для грибов В. bassiana, М. anisopliae и P. fumosoroseus разработаны технологические регламенты промышленного культивирования на жидких питательных средах в ферментерах (Лаппа, Гораль, 1976; Jenkins, Goettel, 1997), ориентированные на одноэтапное получение «глубинных» конидий. Эти конидии в отличие от бластоспор способны достаточное время храниться и служить основой биопрепаратов (Павлюшин, 1979; Ferron, .1981). В силу биологических особенностей, развитие энтомопатогенных грибов в глубинной культуре может идти по линии вегетативного (образование бластоспор) и репродуктивного (образование глубинных конидий) размножения. Вегетативное размножение гриба в глубинной культуре (Лаппа, Гораль, 1976) характеризуется появлением

гифальных тел, которые образуются по типу артроспор (расчленение септированного мицелия на отдельные клетки) или бластоспор (отчленение от мицелия отдельных клеток).

Накопление биомассы в условиях глубинного роста штаммами В. bassiana в экспоненциальной стадии роста описывалась классической S образной кривой. При этом наблюдается резкое повышение кислотности среды в стадии мицелиального роста и максимальная дыхательная активность, культур. С началом образования спор, несмотря на дальнейшее увеличение биомассы, потребление кислорода снижается, а рН среды возрастает (Чигалейчик и др., 1989).

Штаммы В. bassiana при глубинном культивировании отличаются высокой чувствительностью к составу питательных сред (Kmitowa, 1979; Павлюшин, 1979). Титр бластоспор через 72 ч роста, в зависимости от используемой жидкой питательной среды, варьирует от 2 х 106 до 1.5 х 109 спор/ мл (Гораль, 1985). Соотношение двух типов спор - бластоспор и конидий изменяется в зависимости от источника углерода (Лаппа и др., 1988; 1989; Lane et al., 1991). При утилизации глюкозы, фруктозы, лактозы и цитрата образуются, в основном, конидии, а при утилизации крахмала или мальтозы - бластоспоры (Гораль, 1985). На среде с глицерином соотношение бластоспор и конидий было одинаковым (Thomas et al., 1986). Одно из важнейших условий образования глубинных конидий -значительное обеднение питательной среды азотистыми источниками питания, в то время как бластоспоры образуются при более высоких содержаниях азота (Лаппа, Гораль, 1976; Kmitowa, 1979; Jenkins, Thomas, 1996).

Среди микологов существует мнение, что поверхностные конидии В. bassiana лучше сохраняют жизнеспособность при длительном хранении по сравнению с «глубинными» конидиями и бластопорами (Чигалейчик и др., 1989). Конидии грибов, полученные в глубинной культуре, по своим морфологическим и физиологическим свойствам могут значительно отличаться от воздушных конидий, полученных на твердом субстрате (Берестецкий, Сокорнова, 2009). Например, глубинные конидии и бластоспоры Metarhizium anisopliae var. acridum

отличались пониженной гидрофобностью поверхности (признак, который может отвечать за закрепление спор на кутикуле насекомых), но прорастали быстрее, чем воздушные конидии гриба (Leland et al., 2005).

Сроки хранения грибных препаратов, полученных глубинным способом, зависят от используемых методов высушивания или обезвоживания выращенных культур. Из известных методов в настоящее время наибольшее распространение получили распылительное, сублимационное и, конвективное высушивание, в меньшей степени применяется контактно сорбционное обезвоживание (Jackson et al., 1997; Cliquet, Jackson. 1997).

Широкое применение в практике мелкотоннажного производства препаративных форм находит технология двухэтапного получения конидии энтомопатогенных гифомицетов (Павлюшин, 1979). Суть глубинно поверхностного способа заключается в сочетании глубинного выращивания гриба с последующим поверхностным получением конидий. На глубинном этапе, проводимом в ферментере, по аналогии с развитием гриба в полости тела насекомого до его гибели, происходит разрастание мицелия и образование; бластоспор. На поверхностном этапе полученную в ферментере жидкую культуру гриба разливают в плоские сосуды для образования грибной пленки с конидиями. Поверхностный этап соответствует типу развития гриба после гибели насекомого (Лаппа, Гораль, 1976).

Использование глубинно поверхностного способа получения конидий гриба В. bassiana позволяет, по сравнению с поверхностным способом, повысить продуктивность в 1.5-2 раза и производительность в 4 - 6 раз; сократить в 2 раза общую продолжительность получения конидий и в 3 4 раза продолжительность поверхностного культивирования. При инокуляции среды на основе отходов трихограммного производства глубинной культурой гриба выход конидий достигал 1.3 х 1010 спор/ г (Лаппа и др., 1988).

В свое время за рубежом придавалось большое значение исследованиям так называемого микроцикла конидиеобразования ряда промышленно важных грибных продуцентов (Cortat, Turian, 1974; Dahlberg, Van Etten, 1982). К

сожалению, в отношении энтомопатогенных грибов мало, что известно о природе клеточной дифференцировки и механизмах индукции образования спор по данному типу.

В целом же, по мнению Андросова (1986), направления, по которым развивались исследования в области промышленной биотехнологии энтомопатогенных грибов в СССР, не привели к созданию технологических схем крупнотоннажного производства биопрепаратов. Проблема и сейчас остается столь же острой, как и 30 лет назад. Основные причины сложившегося положения связаны с отсутствием ферментационного оборудования (Работнова, 1990), отвечающего двум требованиям: поддержанию нормального физиологического состояния гриба и сохранению высоких технико-экономических показателей всей линии по производству целевого продукта. Поэтому очевидна необходимость разработки более эффективных приемов выращивания грибов, создания новых конструкций и совершенствования технологии, в частности, поверхностного твердо фазного (Огарков, 1990) и погруженного гидропонного культивирования биоматериала (Андросов, 1986).

1.4 Препаративные фермы

Успех практического использования энтомопатогенных грибов зависит от сохранения целевых свойств патогенов в процессе производства, формуляции, хранения и применения товарной продукции (Alves, Pereira, 1989; Rhodes, 1990, 1993; Stephan et al., 1996; Galani, Andrei, 1996; Swanson, 1997; Griffiths, Bateman, 1997; Bateman, 1997; Thomas et al., 1998). Препаративные формы разрабатываются с учетом предполагаемого способа их использования и производятся в виде сухих смачивающихся порошков (Prior et al., 1988; Lomer et al. 1993; Bateman 1997; Langewald et al., 1997; Maiga et al., 1999, 2000); концентратов спор в масле (Lomer et al., 2001); паст (Pereira, Roberts. 1991); гранул (Pereira, Roberts, 1990; Kreuger et al., 1992; Quimby el al„ 1999); капсул (Pereira. Roberts, 1991) или в виде приманок на различных наполнителях (Inglis, Johnson, 1996).

В расчете на перспективность микоинсектицидов в развитых странах на их совершенствование расходуются огромные средства. Так, в США крупнейшие биотехнологические компании выделяют для этой цели ежегодно 50 - 100 млн. долл., а в Германии - 42 - 45 млн. долл. В Великобритании разработкой и производством биологических пестицидов занято более 40 компаний, среди которых имеются крупные, выделяющие на эти цели 20 - 25 млн. долларов ежегодно (Хлопцева. 1992).

Совершенствование биопрепаратов на основе энтомопатогенных грибов связывают с селекцией супервирулентных штаммов избирательного спектра действия (Santharam et al., 1997; Steenberg, Humber,1999). При этом особое внимание обращается на способность штаммов сохранять свои патогенные свойства при низкой относительной влажности воздуха и повышенной температуре окружающей среды (Jackson et al., 1991; Moore et al., 1996; Fargues, Luz, 2000, Гештовт и др.2002).

Не менее важным, с технологической точки зрения, представляется улучшение препаративных форм путем включения в их состав различных физиологически активных добавок (ингредиентов), повышающих жизнеспособность и продолжительность хранения биоматериала (Moore et al., 1997; Hong et al., 1999), обеспечивающих защиту от действия ультрафиолетовых лучей (Fargues et al., 1996) способствующих прилипанию препаратов к обрабатываемым растениям (Jenkins et al., 1998) и кутикуле насекомых (Butt et al.,. 1995; James, 2001), а также более активному и синхронному прорастанию инфекционных спор (Langewald, Chery, 2000)

Экспериментальные препаративные формы гриба В. bassiana производятся в США под названием биотрол, во Франции (колеопе), в бывшей ЧСФР (боверол, боверосил) и в бывшем СССР: боверин зерновой, боверин - концентрат - БЛ, боверин гранулы (Россия), боверин жидкий (Украина). Две препаративные формы на основе гриба M. anisopliae: метакино и камбио производятся в Бразилии, метаризин - на Украине, гранулированный BIO 1020 - в Германии. Коммерческие микоинсектицидные препараты; Botani Gard® , Mycotroí™ - GH - OF, Mycotrol™ -

GH - ES, Mycotal® , Cornelia®, Naturales - ÍIM на основе гриба В. bassiana, Green Muscle® , Green Guard® - на основе M. anisopliae и ряд препаративных форм на основе гриба В. bassiana: Bio - 2561, ARSEF - 201, GHA, BB - 1200 и др. проходят регистрационные испытания, либо находятся на стадии промышленного освоения (http://www.piperpat.co.nz/biotechi.html).

В настоящее время по данным Фариа и Райта (Faria, Wraight, 2007) общее число микоинсектицидов во всем мире составляет 171 наименование. При этом 33.9% всех известных препаратов созданы на основе В. bassiana, примерно столько же на основе М anisopliae, 5.8% - Isaria fumosorosea и 4.1% - В. brongniartii. Приблизительно 75% всех перечисленных препаратов в настоящее время регистрируются или коммерчески доступны (в некоторых случаях без регистрации). Подавляющее большинство существующих микоинсектицидов предназначены для контроля численности насекомых из 48 семейств, принадлежащих к отрядам Hemiptera, Coleóptera, Lepidoptera, Thysanoptera и Orthoptera. Все существующие препараты выпускаются в виде 11 различных препаративных форм, при этом 26.3% являются техническими концентратами (колонизированный грибом субстрат), 20.5% - смачивающиеся порошки и 15.2% -масляные эмульсии. При этом приблизительно 43% всех грибных биопрепаратов были разработаны компаниями и институтами в Южной Америке.

1.5 Применение энтомопатогенных грибов для подавления численности

вредных саранчовых

Первые сообщения о перспективности использования мюскардиновых грибов как агентов биоконтроля саранчовых относятся к 1936 году, когда была показана высокая вирулентность гриба Beauveria bassiana в отношении южноафриканских популяций данной группы вредителей (Штерншис, Цветкова, 2002).

Однако до середины 80-х годов XX века работы по данной проблематике носили фрагментарный характер. Об этом в частности свидетельствует тот факт, что до 1989 в международных коллекциях культур энтомопатогенных грибов

имелось только около 30 штаммов, выделенных из насекомых отряда Orthoptera (Lomer et al., 2001).

В конце 80-х годов были начаты международные широкомасштабные исследования, направленные на разработку микоинсектицидов для подавления численности саранчовых.

К концу XX столетия количество штаммов грибов из анаморфных родов изолированных из саранчовых приближается к 300, из них около 180 выделены в Западной Африке и Омане (Shah et al., 1997). Обширные сборы были проведены также на Мадагаскаре (Nowierski et al., 1996) и в Буркина Фасо (Ouedraogo , 1993).

В последнее десятилетие возбудитель зеленого мюскардиноза привлекает внимание многих зарубежных исследователей в качестве перспективного агента биологического контроля саранчовых. Данный вид является продуцентом нескольких биопрепаратов. В частности на основе M. anisopliae var. acridum разработаны два микоинсектицида предназначенные для борьбы со стадными и нестадными саранчовыми - «Green Muscle» на основе африканского штамма и «Green guard» на базе австралийской культуры данного вида гриба (Lomer et all, 2001). Высокая эффективность против саранчовых вредителей биопрепаратов на основе этого патогена неоднократно отмечалась в разных странах африканского, южноамериканского континента (Бразилия и Колумбия) и Австралии (Гештофт, 2002; Magalhaes, Boudas, 2004)

В 1989 году была введена Международная программа LUBILOSA (Lutte Biologique Contre les Locustes et Sauteriaux), которая появилась в связи со вспышками саранчи в северо-западной Африке. В рамках этой программы предлагалось использовать в качестве альтернативы химическому методу — энтомопатогенные микроорганизмы, и, в частности, энтомопатогенные грибы. В результате исследований был разработан препарат Green Muscle® («Зеленая сила») (М anisopliae var. acridum, штамм IMI 330189) (Castrillo et al, 2005). Препарат выпускается в форме сухого порошка или масляной суспензии. Многочисленными опытами в разных странах мира продемонстрирована высокая эффективность микоинсектицида против саранчовых при ультрамалообъемном

опрыскивании. Производство препарата осуществляется глубинно-поверхностным способом двумя компаниями: «Biological control products» в Южной Африке и «Natural plant protection» во Франции (Штерншис, Цветкова, 2002).

В лабораторных опытах с использованием М. flavoviridae в борьбе с Schistocerca americana при титре конидий 1,2х 1, уровень смертности составил 69-74% через 7 дней после обработки (Sieglaff et al., 1997).

В Мексике были проведены испытания двух штаммов (MaPL32 и MaPL40)

против Schistocerca piceifrons . В этом случае смертность саранчи после обработки

12

масляной суспензией гриба с титром 2,5 х 10 на 13 сутки колебалась составила 84 и 94% соответственно (Hernandez-Velazquez et al., 2003).

В Бразилии и Колумбии использовали препарат на основе масляной суспензии М. anisopliae var. acridum, штамм CG 423 против личинок 3-го возраста Rhammatocerus schistocercoides в кулигах. Ультрамалообъемное опрыскивание препаратом, выпускаемом в виде масляной суспензии, с титром конидий Iх 10° и 2хЮь конидий на мл раствора (при норме расхода 2 л/га) привело к гибели 80-88 % вредителя на 14 сутки (Magalhaes, Boucias, 2004).

Что касается использования В. bassiana для контроля численности саранчовых, то по данным некоторых исследователей (Sieglaff et al., 1997), В. bassiana значительно уступает в эффективности М. anisopliae. Прежде всего это обусловлено повышенной чувствительностью данного вида гифомицета к высоким температурам и ультрафиолетовому излучению (Lomer et al. 2001, Штерншис, Цветкова, 2002). Но несмотря на указанные недостатки, В. bassiana имеет значительный потенциал, с точки зрения подавления численности саранчовых. Американские ученые исследовали выживание В. bassiana в почве при внесении водных и масляных суспензий под разные культуры. Результаты не зависели от препаративной формы и культуры и показали возможность управления численностью саранчовых при внесении гриба в почву (Штерншис, Цветкова, 2002).

Так, на Мадагаскаре при испытаниях, маслосодержащей препаративной формы данного гифомицета (штамм SP-16), наработанной компанией Mycotech Corp.(США), при малообъемном опрыскивании с нормой расхода - 2.5 х 1013 конидий в 5 литрах масла на гектар на 10 сутки, после обработки уровень смертности личинок саранчи Locusia migratoria capito составил 95% (Delgado et al., 1997). В Мавритании ультрамалообъёмное опрыскивание суспензией бластоспор гриба В. bassiana с титром 2.5 х 1013 обеспечивало 70-80% гибели Schistocerca gregaria (Welling et al., 1995).

В США были созданы два экспериментальных противосаранчовых препарата на основе В. bassiana - «Mycocide GH®» и «Mycotrol®» (http://www.epa.gov/pesticides/foia/reviews/128924.htm).

В целом в странах дальнего зарубежья в настоящее время применяются для контроля численности саранчовых 11 препаративных форм на основе энтомопатогенных грибов (Faria, Wraight, 2007). Из них 8 на основе В. Bassiana и 3 - М. anisopliae.

Как уже отмечалось выше на территории бывшего СССР работы в данном направлении носили фрагментарный характер.

Специальные исследования, проведённые в Средней Азии A.A. Нуржановым (1988, 1989), позволили впервые выделить из мароккской саранчи гриб Beauveria brongniartii (= В. tenella), обладающий чрезвычайно высокой вирулентностью по отношению к азиатской и итальянской саранче. Наиболее перспективный штамм Beauveria brongniartii (ВД-85) рекомендован для дальнейшей разработки на его основе микробиологического препарата против саранчовых. Так смертность личинок итальянского пруса и азиатской саранчи при применении рабочей суспензии этого штамма (титр 1x107) достигала 95% (в лабораторных условиях) на 10-е сутки заражения. При использовании более

п

высокой концентрации гриба (5х 10') в полевых опытах в Каракалпакии на площади 0,07 га к 12 дню после заражения плотность личинок 2-го возраста итальянского пруса была снижена на 60%. Заражение проводилось путем опрыскивания насекомых из ручного опрыскивателя водной суспензией гриба с

добавками детергента Тритон-Х-100 (Нуржанов, 1989). В 1989 г. были проведены испытания этого гриба в условиях Центральной Якутии на белополосой кобылке. При обработке кобылок конидиями гриба (титр 4x108) уже через неделю плотность популяции снизилась на 71,1% (Гоголев, 1990).

Проведенные в Восточной Сибири обработки травостоя против кобылок грибом В. bassiana показали возможность использования данного вида для подавления численности саранчовых, эффективность обработок составила 47-84 % (Огарков, Огаркова, 2000).

Совместными исследованиями сотрудников НГАУ и Бердского завода биопрепаратов (Новосибирская обл.) в ходе лабораторных опытов установлена эффективность Боверина против личинок итальянского пруса в полевых условиях, но первые опыты в поле были не столь успешны. Для уменьшения влияния влажности на В. bassiana предложено использовать масляную суспензию гриба (Штерншис, Цветкова, 2002). Препарат Боверин был исключен из «Списка пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ», в начале 2000-х годов.

Созданием новых эффективных микоинсектицидов занимаются не только в дальнем зарубежье, но и в странах СНГ и в первую очередь в России. Так, исследованиями, проведенными в ВИЗР под руководством Г.Р. Леднева были отобраны наиболее перспективные штаммы грибов М. anisopliae, В. bassiana и В. brongniartii, обладающие высокой биологической эффективностью (до 100%) в отношении различных видов саранчовых (Леднев и др. 2005; Lednev G.R. et al., 2007; Левченко, 2007). Авторами оптимизированы условия культивирования, определены оптимальные дозировки инокулюма и получены положительные результаты при полевых испытаниях против ряда видов саранчовых.

В Казахстане исследования в отношении использования энтомопатогенных грибов против саранчовых также проводились, однако носили фрагментарный характер. Так, И.И. Темрешевым (2003) была изучена вирулентность различных штаммов грибов на ряде видов прямокрылых, а также оценена биологическая эффективность коммерческого препарата Green Muscle® на основе гриба

Metarhizium anisopliae var. acridum (производство Китая). Однако в результате проведенных исследований было показано, что указанный препарат проявляет не достаточно высокую биологическую активность (до 54%).

Аналогичные работы были проведены и в Узбекистане (Южное Приаралье). В ходе лабораторных и полевых опытах была оценена биологическая эффективность препарата Green guard sc premium (компания Becker Underwood Ptu, Австралия) в отношении саранчовых. В лабораторных условиях биологическая активность данного препарата для личинок азиатской саранчи и итальянского пруса к десятому дню после заражения, при норме расхода 0,5 л/га составляла 100% (Медетов, 2012). Двухлетние испытания микоинсектицида против личинок младших возрастов итальянского пруса показали, что его биологическая эффективность при указанной выше норме расхода составляет 89,7% (16-е сутки после обработки) (Гаппаров, 2011).

Перечисленные выше примеры вызывают необходимость проведения комплексных исследований, направленных на разработку нового высокоэффективного микоинсектицида для контроля численности саранчовых в условиях Казахстана.

При скрининге перспективных штаммов-продуцентов мы использовали пошаговый отбор по трем основным показателям (вирулентность, термотолерантность и продуктивность), предложенный Ледневым с соавторами (Леднев и др., 2011, 2012).

Заключение диссертации по теме «Плодоводство, виноградарство», Успанов, Алибек Маратович

ВЫВОДЫ

1. Новые казахстанские штаммы гриба В. Ьаззгапа показали высокую гетерогенность по признаку вирулентности на азиатской саранче. Из тридцати трех протестированных культур высокую вирулентность показали 46% штаммов, а 37% оказались слабовирулентными. Отобрано пять культур гриба: ВСиг06, ВСи22-07, ВСо6-07, В04-07, ЮК-4, показавших лучшие результаты по скорости гибели хозяина.

2. Виды саранчовых обитающие в ксерофитных стациях (итальянский и пустынный прус, мароккская саранча) обладают повышенной восприимчивостью к микозу по сравнению с мезо- и гигрофилами (азиатская саранча, конек короткокрылый и др.).

3. На личинках азиатской саранчи и пустынного пруса наибольшую биологическую активность показали культуры ВСи22-07. ЮК-4 и ББК-1 при

1 1 титрах рабочей суспензии 1x10 и 5x10 . Отобранные культуры гриба обладают широким спектром действия. Они проявляют высокую вирулентность кроме саранчовых на личинках колорадского жука и на ряде видов вредных чешуекрылых.

4. Выявлена высокая степень гетерогенности культур по признаку термотолерантности конидий В. Ьа5з1апа в диапазоне температур от 20 до 35°С. Наибольшую лабильность к повышенным температурам показали штаммы, изолированные из ксерофитных стаций. Температура воздуха оказывает сильное влияние на интенсивность роста гриба в поверхностной культуре. Наибольшей термофильностью также обладают культуры, выделенные из материала, собранного в условиях сухих степей.

5. Из пяти протестированных культур четыре обладают высокой продуктивностью при глубинной ферментации (ВСи22-07, ББК-1, ВЭ4-07 и КЖ-4). С точки зрения твердофазного культивирования лучшим по продуктивности является эталонный штамм ББК-1. Среди новых культур максимальный выход конидий наблюдалась у культуры ВСи22-07. Оптимальным субстратом для поверхностного культивирования являются пшено и рис.

6. Применение отобранных штаммов гриба В. ЪаБзгапа в форме масляной конидиальной суспензии показывает высокую эффективность для снижения численности азиатской саранчи, итальянского и пустынного пруса.

Практические рекомендации

1. Для разработки нового микоинсектицида против вредных саранчовых предлагается использовать штаммы грибаВеатепа Ьаъъ'шпа ВСи22-07 и ЮК-4.

2. Наработку указанных штаммов рекомендуется проводить методом поверхностного твердофазного культивирования на рисе или пшене.

3. Для эффективной борьбы с саранчовыми предлагается использование отобранных штаммов в форме масляной суспензии методом малообъемного

12 опрыскивания из расчета 5x10 конидий/га по личинкам младших возрастов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Успанов, Алибек Маратович, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андросов, Г.К. Энтомопатогенные грибы таежных биогеоценозов как агенты биологической борьбы с вредными насекомыми: автореф. дис. докт. биол. наук: 03.00.09 / Андросов Геннадий Константинович. - М., 1986. - 45 с.

2. Батко, A.B. Случаи массовой гибели итальянского пруса от грибной болезни в степях Ставропольского края в 1955 г. / A.B. Батко // Сборник научных студенческих работ МГУ. - 1957. - С. 5-10.

3. Бегляров, Г.А. Механизированное получение вертициллиума / Г.А. Бегляров, В.А. Шумилов, Г.А. Девяткина, И.А. Пономарева, С.С. Мелехин // Защита растений. - 1986. - № 5. - С. 37-39.

4. Беленикина, З.В. Хитинолитическая активность энтомопатогенных грибов / З.В. Беленикина, В.Л. Ищенко, Е.В. Луговская, А.Г. Чигалейчик // Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. Тез. докл. Велегож. - 1989. - С. 212.

5. Берестецкий, А.О. Получение и хранение биопестицидов на основе микромицетов / А.О. Берестецкий, C.B. Сокорнова // Микология и фитопатология. - 2009. - Т. 43. - № 6. - С. 473-489.

6. Билай, В.И, Методы эксперементальной микологии: справочник / ВН. Билай. - Киев: Наукова Думка, 1982. - 685 с.

7. Борисов, Б.А. Проблемы создания и использования микоинсектицидных препаратов / Б.А. Борисов // Изучение энтомопатогенных микроорганизмов и разработка технологий производства и применения. Научн. раб. симп. СЭВ. - 1990. -С. 8-23.

8. Борисов, Б.А. Энтомопатогенные аскомицеты и дейтеромицеты / Б.А. Борисов, В.В. Серебров, И.И. Новикова, И.В. Бойкова // Патогены насекомых: структуральные и функциональные аспекты. - 2001. - С. 352.

9. Бунин, Л.Д. Итальянсая саранча (Calliptamus italicus L.) в зоне почвозащитного земледелия на востоке Казахстана и совершенствование мероприятий по борьбе с ней: автореф. дис. канд. биол. наук: 06.01.11 / Бунин Леонид Дмитриевич. - Л., 1979. - 24 с.

10. Вейзер, Я. Микробиологический метод борьбы с вредными насекомыми /Я. Вейзер. Москва: Колос, 1972. - 639с.

11. Воронина, Э.Г. Биологические основы использования энтомофторовых грибов в защите растений против тлей: автореф. дис. докт. биол. наук: 06.01.11 /Воронина Элина Генриховна. Л., 1989. - 45 с.

12. Воронина, Э.Г. Энтомофторовые грибы - естественные регуляторы численности насекомых / Э.Г. Воронина, Г.Р. Леднев, Т.Ю. Мукамолова // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. - 2001, - С. 271351.

13. Гаппаров, Ф.А. Эффективность микробиологического препарата "Green guard sc premium" для личинок итальянской саранчи (Calliptamus Italicus) в Узбекистане / Ф.А. Гаппаров, A.A. Нуржанов, М.Ж. Медетов, Б.Р. Эшжанов // Вестник Каракалпакского отделения Академии Наук Республики Узбекистан. -2011,-№2. - С. 27-29.

14. Гарибова, Л.В. Основы микологии / Л.В. Гарибова, С.Н. Лекомцева // Товарищество научных изданий КМК. - Москва. - 2005. - 300 с.

15. Гештовт, Н.Ю. Энтомопатогенные грибы. Биотехнологические аспекты / Н.Ю. Гештовт. - Алматы, 2002. - 288 с.

16. Гештовт, Н. Ю. Критерии селекционного отбора высоковирулентных штаммов энтомопатогенных грибов / Н.Ю. Гештовт, Ж.Б. Сулейменова, Е.Ж. Баймагамбетов // Актуальные проблемы защиты растений в Казахстане. - 2002. -Кн. 1. - С. 316-340.

17. Глупов, В.В. Механизмы резистентности насекомых / В.В. Глупов // Патогены насекомых: структуральные и функциональные аспекты. - 2001. С. 475481.

18. Гоголев, А.Н. Возможность использования энтомопатогенных грибов рода Beauveria в борьбе с нестадными саранчовыми в Центральной Якутии. / А.Н. Гоголев // Экологические проблемы защиты растений. Тез. докл. - 1990. - С 220.

19. Гораль, В.М. Биологические особенности энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. в условиях глубинно - поверхностного

культивирования: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Гораль Виктор Мартынович. - К., 1970. - 24 с.

20. Гораль, В.М. Энтомоцидная активность мускардинных грибов как функция условий культивирования / В.М. Гораль // VI съезд Украинского микробиол. о-ва. - 1985. - ч.1. - С. 186-187.

21. Гораль, В.М., Jlanna Н.В. Технология производства энтомопатогенного препарата метаризина / В.М. Гораль, Н.В. Лаппа // Теоретические и прикладные аспекты биотехнологии. Украинской акад. аграр. наук. - 1991. - С. 29-30.

22. Гулий, В.В. Микробиологическая борьба с вредными организмами / В.В. Гулий, Г.М. Иванов, М.В. Штерншис. - Москва: Колос, 1981. - 272 с.

23. Евлахова, A.A. Энтомопатогенные грибы. Систематика, биология, практическое значение. / A.A. Евлахова. Ленинград: Наука, 1974. - 260 с.

24. Жасанов, А.К. О некоторых закономерностях размножения итальянского пруса (Calliptamus italicus) в Актюбинской области / А.К. Жасанов // Защита и карантин растений в Казахстане. - 2001. - №1. - С. 27-28.

25. Ищенко, В.Л. Обоснование метода обезвоживания энтомопатогенных грибов, выращенных глубинным способом / В.Л. Ищенко, А.П. Третьяков, Н.И. Косарева, Е.В. Быстрова // Тез. докл. Всесоюзной научно-практической конф.: Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. - 1989. - С. 157.

26. Камбулин, В.Е. Динамика популяций стадных саранчовых в Казахстане/ В.Е. Камбулин, С. Ыскак, K.M. Толеубаев // Защита растений. - 2010. -№4. - С.

27. Коваль, Э.З. Определитель энтомофильных грибов СССР / Э.З. Коваль. -Киев: Наукова Думка, 1974.-260 с.

28. Коваль, Э.З. Флора грибов Украины. Зигомицеты. Энтомофторальные грибы / Э.З. Коваль. - Киев, 2007.-369 с.

29. Копанева, Л.М. Динамика численности пруса и нестадных саранчовых в горах Киргизии. Саранчовые - экология и меры борьбы / Л.М. Копанева, Г.И. Дорохова//. Сб. науч. тр. - 1987. -С. 51-57.

30. Крюков В. Ю. Влияние различных наполнителей на биологическую эффективность энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana против саранчовых в условиях Казахстана / В.Ю. Крюков, Г.Р. Леднев, М.В. Левченко, О.Н. Ярославцева, Е.М. Макаров, Е.Ж. Баймагамбетов, Б.А. Дуйсембеков, В.В. Глупов // Агрохимия. - 2010. - №12. - С. 26-30.

31. Крюков, В.Ю. Перспективы применения энтомопатогенных гифомицетов (Deuteromycota, Hyphomycetes) для регуляции численности насекомых / В.Ю. Крюков, Г.Р. Леднев, И.М. Дубовский, В.В. Серебров, М.В. Левченко, В.П. Ходырев, А.О. Сагитов, В.В. Глупов // Евроазиатский энтомологический журнал. - 2007. - Т. 6. - №2. - С. 195-204.

32. Лаппа, Н.В. Изучение и использование мускардиновых грибов в защите растений / Н.В. Лаппа, В.М. Гораль // Микробиологические методы борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений. Тр. ВИЗР. - 1976. -Т. 47. - С. 53-67.

33. Лаппа, Н.В. Сравнительное действие энтомопатогенных грибов на тепличную белокрылку / Н.В. Лаппа, В.М. Гораль, В.П. Анохина, М.В. Круть // Инф. Бюл, ВПС МОББ. - 1988. -№ 23. - С. 43-47.

34. Лаппа, Н.В. Сравнительная активность вертициллина и боверина, полученных по глубинной и поверхностной технологиям /' Н.В. Лаппа, В.М. Гораль, А.П. Третьяков, Н.И. Косарева // Тез. докл. Всесоюзной научно-практической конф.: Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. - 1989. - С. 65.

35. Лачининский, A.B. Саранчовые Казахстана, Средней Азии и сопредельных территорий./ Лачининский A.B., Сергеев М.Г., Чильдебаев М.К., Черняховский М.Е., Локвуд Дж.А., Камбулин В.Е., Гаппаров Ф.А. - Ларами, 2002.-387с.

36. Левченко, М.В. Биологическое обоснование использования энтомопатогенных гифомицетов для подавления численности вредных саранчовых: автореф. дис. канд.биол.наук: 03.00.09 / Левченко Максим Владимирович. - СПб, 2007, - 20 с.

37. Леднев, Г.Р. Возбудители микозов насекомых: пособие по диагностике / Г.Р. Леднев, Б.А. Борисов, Г.В. Митина. Санкт-Петербург, 2003.-79 с.

38. Леднев, Г.Р. Перспективы использования энтомопатогенных гифомицетов для подавления численности вредных саранчовых / Г.Р. Леднев, М.В. Левченко, Ю.С. Токарев, В.Ю. Крюков, В.А. Павлюшин, В.В. Глупов, А.К. Горбунов, А.О. Сагитов // Второй всероссийский съезд по защите растений: фитосанитарное оздоровление экосистем. - 2005. - Т. 2. - С. 75-77.

39. Леднев, Г.Р. Подходы к созданию новых микоинсектицидов и разработке стратегии их применения в защите растений для аридных зон / Г.Р. Леднев, В.Ю. Крюков, М.В. Левченко, A.M. Успанов, А.О. Сагитов, В.В. Глупов, В.А. Павлюшин // Информационный бюллетень ВГТРС МОББ. - 2011. - №43. - С. 132136

40. Леднев, Г.Р. Состояние и перспективы использования микоинсектицидов для снижения численности саранчовых/ Г.Р. Леднев, М.В. Левченко, В.Ю. Крюков, П.В. Митьковец, О.Н. Ярославцева, A.M. Успанов, В.А. Павлюшин // Защита и карантин растений. -2012. -№6. -С. 18-21.

41. Лепешкин, С.Н. Почвенно-ботанические условия местообитаний пруса и распределение залежей его кубышек в Зеравшанеком оазисе / С.Н. Лепешкин //' Сб. работ саранчовой экспед. Узб. СТАЗРа. - 1931 -С. 10-93.

42. Лепешкин, С.Н. Регистрация пруса в поливных районах Средней Азии / С.Н. Лепешкин, Л.С. Зимин, E.H. Иванов, A.A. Захваткин // Саранчовые Средней Азии. - 1934.-С.237-243.

43. Лер, П.А. Материалы по биологии туранского и пустынного прусов (Orthoptera, Calliptamus) в Чиментской области / П.А. Лер // Тр. НИИ защиты раст. Казахск. акад. с.-х. наук. - 1962. - С. 3-56.

44. Медетов, М.Ж. Фауна и формирование прямокрылых (Insecta: Orthoptera) южного Приаралья: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.09 / Медетов Махсетбай Жапакович - Т., 2012, - 24 с.

45. Микульская, Н.И. Морфологические особенности новых штаммов мускардинных грибов Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumoso-roseus и

Beauveria bassiana и их активность по отношению к некоторым сельскохозяйственным вредителям / Н.И. Микульская, Л.И. Прищепа, Е.Н. Янковская, Е.С. Герасимович // Сб. научн. трудов БелНИИЗР. - 2003. - № 27. -С.145-156.

46. Митина, Г.В. Выделение и изучение спектра действия фосфолипидов с инсектицидной активностью энтомопатогенного гриба Lecanicillium lecanii / Г.В. Митина, С.В. Сокорнова, В.А. Павлюшин // Микология и фитопатология. - 2003. -Т. 36.-№6.-С. 53-59.

47. Митьковец, П.В. Фено- и генотипические различия штаммов анаморфных аскомицетов рода Beauveria / П.В. Митьковец, Ю.С. Токарев, О.Н. Ярославцева, В.Ю. Крюков, Г.Р. Леднев, В.В. Глупов // Современная микология в России. - 2012. -Т.З.-С. 51.

48. Нуржанов, А.А. Энтомопатогенные микроорганизмы стадных саранчовых в Узбекистане / А.А. Нуржанов, А.В. Лачининский // Саранчовые. Экология и меры борьбы. - 1987. - С. 62-69.

49. Нуржанов, А.А. Энтомопатогенные микроорганизмы стадных саранчовых Узбекистана и перспективы их использования в биологической защите растений: автореф. канд. дис. биол. наук: 03.00.09 / Нуржанов Аллаберген Абцелязович. - Ленинград, 1989, - 18 с.

50. Нурмуратов, Т.Н. Саранчовые вредители сельскохозяйственных растений

«

Казахстана и рекомендации по ограничению их численности / Т.Н. Нурмуратов, В.К. Ажбенов, В.Е. Камбулин, М.К. Чильдебаев, И.А. Комисарова, Г. Жумагалиева // Asia Publishing. - 2000. - С. 1 -56.

51. Огарков, Б.Н. Биологическое обоснование способов создания и использования грибных препаратов для борьбы с насекомыми: автореф. дис. докт. биол. наук: 03.00.09 / Огарков Борис Никитович - Л., 1990. - 44 с.

52. Огаркова, Г.Р. Некоторые факторы, обуславливающие патогенность гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill (штамм 67) / Г.P. Огаркова, Г.К. Андросов, Б.Н. Огарков // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в лесном и сельском хозяйстве. - 1973. -№1. - С. 137

53. Огарков, Б.Н. Энтомопатогенные грибы Восточной Сибири / Б.Н. Огарков, Г.Р. Огаркова // И. -. 2000. 134 с.

54. Павлюшин, В.А. Факторы вирулентности гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. и патогенез мускардиноза насекомых: дис. канд. биол. наук: 06.01.11 / Павлюшин Владимир Алексеевич. - Л., 1979. - 205 с.

55. Работнова, И.Л. Физиология микроорганизмов и управляемое культивирование / И.Л. Работнова // Успехи микробиологии. - 1990. - №24. - С. 8899.

56. Сергеев, М.Г. Стадные саранчовые: начало грядущего века / М.Г. Сергеев, А.В. Лачининский // Энтомологические исследования в Северной Азии. -2006. - С. 284-286.

57. Серебров, В.В. Детоксицирующие ферменты насекомых при микозах: дис. канд. биол. наук: 03.00.09 / В.В. Серебров-Н., 2000. - 123 с.

58. Соболев, Н.Н. Популяционная динамика саранчовых в агроценозах Северного Казахстана / Н.Н. Соболев, М.Г. Сергеев // Антропоген. воздействие на сообщества насек. - 1985. - С. 96-104.

59. Соловей, Е.Ф. Технологические проблемы получения, биопрепарата на основе Verticillium lecanü / Е.Ф. Соловей, Е.Н. Кучеренко // Тез. докл. Всесоюзной научно-практической конф. Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. - 1989. - С. 113.

60. Столяров, М.В. Особенности мониторинга стадных саранчовых и противосаранчовых кампаний на юге России./ М.В. Столяров // Защита и карантин растений, - 2007. - №4. - С. 40-43.

61. Стрельников И.Д. Действие солнечной радиации и микроклимата на температуру тела и поведение личинок саранчи Locustae migratoria L./ Труды Зоологического института АН СССР. 1935 т. 2. №4. с. 637-733

62. Тарасов, Л.Г. Разработка одноэтапной технологии производства боверина и испытание его инсектицидной активности: автореф. дис. канд. биол. наук: шифр / Тарасов Л.Г. - Л., 1970. - 22 с.

63. Темрешев, И.И. Биологическое обоснование использования энтомопатогенных микроорганизмов против саранчовых вредителей в Казахстане: автореф. дис. канд.биол.наук: 06.01.11 / Темрешев Избасар Исатаевич. - А., 2003. -23 с.

64. Тюльпанова, В.А. Метаболические особенности гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. при поверхностном и глубинном культивировании / В.А. Тюльпанова, В.Г. Тюльпанов, Т.Л. Козлова, А. Малиновский // Микология фитопатология. -1987.-Т.21.-№3.-С. 259.

65. Тюльпанова, В.А. Факторы, лимитирующие рост и спорообразование энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. / В.А. Тюльпанова, Т.Д. Козлова, А.Л. Малиновский, А. Нечаев // Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов. - 1989. - С. 4-7.

66. Федоринчик, Н.С. Микробиологический метод борьбы с вредителями с болезнями сельскохозяйственных растений / Н.С .Федоринчик // Биологические средства защиты растений. - 1974. - С. 263-280.

67. Федорова, С.Ж. Энтомопатогенные бактерии и грибы регуляторы численности клещей Argas persicus Oken. / С.Ж. Федорова // Илим. - 1988. - С. 148.

68. Федотова-Середина Е.Л. Экология короткокрылого итальянского пруса (Calliptamus italicus reductus Rme)(Orthoptera, Acrididae) на южном склоне Гиссарского хребта / Е.Л. Федотова-Середина // Морфо-экол. адаптации насек, в наземных сообществах. - 1989. С. 99-109.

69. Хлопцева Р.И. В ожидании большого скачка / Р.И. Хлопцева // Защита растений. - 1992. - № 7. - С. 17-19.

70. Чигалейчик, А.Г. Физиологические особенности некоторых энтомопатогенных грибов и условиях глубинного культивирования / А.Г. Чигалейчик, P.A. Степанова, Н.И. Косарева, H.A. Клюева //Тез. докл. Всесоюзной научно-практической конф. Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. - 1989. - С. 209.

71. Штейнхауз, Э. Микробиология насекомых / Э. Штейнхауз. - Москва: Изд-во иностранной литературы, 1950. - 778 с.

72. Штерншис, М.В. Изучение энтомопатогенного гриба М. anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых-фитофагов / М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В. Гулий // Вестник ТГУ. - 2008. - № 313. - С. 232-236.

73. Штерншис, М.В. Микробиологический метод контроля саранчовых / М.В. Штерншис, В.П. Цветкова // Защита и карантин растений. - 2002. - № 6. - С. 26-27.

74. Alves, S.B. Production of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. and Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. in plastic trays / S.B. Alves, R.M. Pereira // Ecosistema. - 1989. - V. 14. - P. 188-192.

75. Bateman, R.P. Methods of Appl. of microbial pesticide formulations for the control of locusts and grasshoppers / R.P. Bateman // Memoirs Entomol. Canad. Soc. -1997.-V. 171.-P. 69-80.

76. Bateman, R.P. The enhanced infectivity of Metarhizium flavoviride in oil formulations to desert locusts at low humidities / R.P. Bateman, M. Carey, D. Moore, C. Prior // Ann.Appl. Biol. -1993. -P. 51 -52.

77. Bello, V.A. Localization of auxotrophic and benomyl resistance markers through the parasexual cycle in the Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. Entomopathogen / V.A. Bello, L.D. Paccola-Meirelles // J. invert. Pathol. - 1998. - V. 72. - N 2. - P. 97-103.

78. Bidochka, M.J. Genetic groups of the insect-pathogenic fungus Beauveria bassiana are associated with habitat and thermal growth preferences / M.J. Bidochka, F.V. Menzies, A.M. Kamp // Arch. Microbiology. - 2002. - V. 178. - № 6. - P. 531-537.

79. Bidochka, M.J. Identification of Beauveria bassiana extracellular protease as a virulence factor in pathogenicity toward the migratory grasshopper, Melanoplus sanguinipes / M.J. Bidochka, G.G. Khachatourians // J. Invert. Pathol. - 1990. - V. 56. -P. 362-370.

80. Bidochka, M.L. Protein hydrolysis In Grasshopper cuticulars by Entomopathogenic fungal extracellular proteases / M.L. Bidochka, G.G. Khachatourians //J. Invert. Pathol. - 1994. - V. 63. - P. 7-14.

81. Bidochka, M.J. Regulation of extra- cellular protease in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana / M.J. Bidochka, G.G. Khachatourians // Exp. Mycol. - 1988; -P. 161-168.

82. Binnington, K. Epidermis a biologically active target for metabolic inhibitors / K. Binnington, A. Retnakaran // Physiology of insect epidermis. East Melbourne: Inkata Press Pty Ltd. - 1991. - P. 307-334.

83. Bischoff, J.F. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anispliae lineage / J.F. Bischoff, S.A. Rehner, R.A. Humber // Mycologia. - 2009. - V. 101. - № 4. - P. 512530.

84. Blackwell, M. Fungal evolution and taxonomy. Fungal evolution and taxonomy. / M. Blackwell // BioControl. - 2010. - V.55. - P. 7-16.

85. Blanford, S. Role of thermal biology in disease dynamics / S. Blanford, M.B. Thomas // Aspec ts Appl. Biol. - 1999. - V. 53. - P. 73-82.

86. Braga, G.U.L. Effect of UV-B on conidia and germlings of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae / G.U.L. Braga, S.D. Flint, C.L. Messias, A.J. Anderson, D.W. Roberts // Mycol. Res. - 2001. - V. 105. - № 7. - P. 874882.

87. Brey, P.T. IJltrastructure and chemical composition of the outer layers of the cuticle of the pea aphid s Acyrthosiphon pisum (Harris) / P.T. Brey, H. Ohayon, M. Lesourd, J.P. Latge // Comp. Biocem. Physiol. - 1985. - V. 82. - P. 401-411.

88. Bugeme, D.M. Influence of temperature on virulence of fungal isolates of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to the two-spotted spider mite Tetranychus urticae / D.M. Bugeme, M. Knapp, H.I. Boga, A.K. Wanjoya, N.K. Maniania // Mycopathologia. - 2009. - V. 167. - №4. - P. 221-227.

89. Burge, M.N. The scope of fungi in biological control / M.N. Burge // Fungi in biological control systems. - 1988. - P. 1-18.

90. Barlett, M.C. Mass production of entomogenous fungi for biological control of insects / M.C. Barlett, S.T. Jaronski // In: Fungi in biological control systems. - 1988. - P. 61-88.

91. Butt, T.M. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticules / T.M. Butt, L. Ibrahim, S.J. Clare, A. Beckett // My col. Res. - 1995. - V. 99. - P. 945

92. Cagan, L. The influence of ultraviolet Light on pathogenicity of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin to europian corn borer, Ostrinia nubilalis Hbn. (Lepidoptera: Crambidae) / L. Cagan, M. Svercel // J. Centr. Europ. Agric. - 2001. - V. 2. - № 3. - P. 235-240.

93. Castellanos-Moguel, J. Virulence testing and extracellular subtilisin-like (Prl) and trypsin-like (Pr2) activity during propagule production of Paecilomyces fumosoroseus isolates from whiteflies (Homoptera: Aleyrodidae) / J. Castellanos-Moguel, M. Gonzalez-Barajas, T. Mier, M. del Rocio-Reyes-Montes, E. Aranda, C. Toriello // Rev. Iberoam Micol. - 2007. - V. 24. - P. 62-68.

94. Castrillo, L.A. The fungal past, present, and future: Germination, ramification and reproduction / L.A. Castrillo, D.W. Roberts, J.D. Vanderberg // Invertebrate Pathology. - 2005, - V. 89.

95. Charnley, A.K. Entomopathogenic fungi and their role in pest control / A.K. Charnley // The Mycota IV. - Environmental and microbial relationships. - D. Wicklow and M. Soderstrom, Eds. - Springer - Veriag. - 1997. - P. 185-201.

96. Charnley, A.K. Physiological aspects of destructive pathogenesis in insects by fungi: A speculative review / A.K. Charnley // Brit. Mycol. Soc. Symp. - 1984. - V. 6. -P. 132.

97. Charnley, A.K. Entomopathogenic Fungi and Their Role in Pest Control / A.K. Charnley, S.A. Collins // Environmental and Microbial Relationships. The Mycota: A Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research. - 2007. - P. 159-187.

98. Claydon, N. Insecticidial secondary metabolites from the entomopathogenic fungus Entomophthora virulenta / N. Claydon // Invert. Pathol. - 1978. - V. 32. - N. 3. -P. 319.

99. Claydon, N. Insecticidal secondary metabolic products from the entomopatogenous fungus Verticillium lecanii / N. Claydon, P.D. Grove // Invert. Pathol. - 1982. - V. 40. - N. 3. - P. 413-418.

100. Cliquet, S. Comparison of air - drying methods for evaluating the desiccation tolerance of liquid culture - produced blastospores of Paecilomyces fumosoroseus / S. Cliquet, M.A. Jackson // Microbiol. Biotech. - 1997. - V. 13. - P. 299-303.

101.Cortat, M. Conidiation of Neurospora crassa in submerged culture without mycelial phase / M. Cortat, G. Turian // Arch. Microbiol. - 1974. - V. 95. - P. 305-309.

102. Dahlberg, K.R. Physiology and biochemistry of fungal sporulation / K.R. Dahlberg, J.L. Van Etten // Ann. Rev. Phytopathol. - 1982. - V. 20. - P. 281-301.

103. De Crecy, E. Directed evolution of a filamentous fungus for thermotolerance /

E. De Crecy , S. Jaronski, B. Lyons, T.J. Lyons, N.O. Keyhani // BMC Biotechnology. -2009. -V 9.- №1,- P. 74.

104. De Vrije, T. The fungal biocontrol agent Coniothyrium minitans: production by solid-state fermentation, application and marketing / T. De Vrije, N. Antoine, R.M. Buitelaar, S. Bruckner, M. Dissevelt, A. Durand, M. Gerlagh, E.E. Jones, P. Liith, J. Oostra, W.J. Ravensberg, R. Renaud, A. Rinzema, F.J. Weber, J.M. WhiPs // Appl. Microbiol. Biotec'nnol. - 2001. - V. 56. - P. 58-68.

105.Delgado, F.X. Small-scale field trials with entomopathogenic fungi against Locusta migratoria capito in Madagascar and Oedaleus senegalensis in Cape Verde /

F.X. Delgado, J.H. Brittonl, M.L. Lobo-Lima, E. Razafindratiana, W. Swearingen // New Strategies in Locust Control. Basel. - 1997. - P. 171-176

106. Dimbi, S. Effect of constant temperatures on germination, radial growth and virulence of Metarhizium anisopliae to three species of African tephritid fruit flies / S. Dimbi, N.K. Maniania, S.A. Lux, J.M. Mueke // BioControl. - 2004. - V. 49. - P. 83-94.

107. Edgington, S. Photoprotection of Beauveria bassiana: testing simple formulations for control of the coffee berry borer / S. Edgington, H. Segura, W. de La Rosa, T. Williams // Int. J. PestManag. - 2000. - V. 46. - № 3. - P. 169-176.

108. Fargues, J. Influence of temperature on in vitro growth of entomopathogenic hyphomycetes / J. Fargues, N.K. Maniania, J.C. Delmas, N. Smits // Agronomie. - 1992. - V. 12. -№7. - P. 557-564.

109. Fargues, J. Effects of fluctuating moisture and temperature regimes on the infection potential of Beauveria bassiana for Rhodnius prolixus / J. Fargues, C. Luz // Invert Pathol. - 2000. - V. 75. - N. 3. - P. 202-211.

110. Fargues, J. Variability in susceptibility to simulated sunlight of conidia among isolates of entomopathogenic hyphomycetes / J. Fargues, M.S. Goettel, N. Smits, A. Ouedraogo // Mycopathologia. - 1996. - V. 35. - P. 171-181.

111.Faria, M. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. / M. Faria, S.P. Wraight // Biological Control. - 2007. - P. 237-256.

112. Fenice, M. Chitinolytic activity at low temperature of an Antarctic strain (A3) of Verticillium lecanii / M. Fenice, L. Selbmann, R. Di Giambattista, F. Federici // Res. Microbiol. - 1998. - V. 149. - N. 4. - P. 289.

113. Fernandes, E.K.K. Cold activity of Beauveria and Metarhizium, and thermotolerance of Beauveria / E.K.K. Fernandes, D.E.N. Rangel, A.M.L. Moraes, V.R.E.P. Bittencourt, D.W. Roberts // J. Invertebr. Pathol. - 2008. - V. 98. - №1. - P. 69= 78.

114. Ferron, P. Biological control of insect pests by entomogenous fungi / P. Ferron // Ann. Rev. Entomol. - 1978. - V. 3. - P. 409-442.

115. Ferron, P. Pest control by the fungi Beauveria and Metarhizium / P. Ferron // Microbiol Control of Pests and Plant Diseases. - 1981. - P. 465-482.

116. Galani, G. Effect of some formulation substances on germination and virulence of Beauveria bassiana and Verticillium lecanii conidia / G. Galani, A.M. Andrei // Insect pathogenes and insect parasitic nematodes. Bull. IOBC. - 1996. - V. 19. - N. 9. - P. 218220.

1 17. Gelernter, W.D. Success in biological control of above - ground insects by pathogens / W.D. Gelernter, C.J. Lomer // Measures of Success in Biological Control. -2000. - P. 127-139.

118. Gillespie, J.P. The immune response of the desert locust Schistocerca gregaria during mycosis of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var acridum / J.P. Gillespie, C. Burnett, A.K. Charnley // J. Insect Physiol. - 2000. - V. 46. - P. 429437.

119. Goettel, M.S. Pathogenesis of the hyphomycete Tolypocladium cylindrosporum in the mosquito Aedes aegypti / M.S. Goettel // J. Inverteb. Pathol. -1988,-V. 51,-№3,-P. 259-274.

120. Griffiths, J. Evaluation of the Francome Mkll exhaust nozzle sprayer to apply oil - based formulations of Metarhizium flavoviride for locust control / J. Griffiths, R. Bateman//Pesticide Sci. - 1997. -V. 51. - P. 176-184.

121. Gupta, S.C. Insect cuticle - degrading enzymes from the entomogenous fungus Beauveria bassiana / S.C. Gupta, T.D. Leathers, G.N. El-Sayed // Exp. Mycol. - 1992. -V. 16. - P. 132-137.

122. Gupta, S.C. Relationships among enzyme activities and virulence paramétrés in Beauveria bassiana infection of Galleria mellonella and Trichoplusia / S.C. Gupta, T.D. Leathers, G.N. El-Sayed, C.M. Ignoffo // Invert. Pathol. - 1994. - V. 64. - P. 13-17.

123. Gustafsson, M. On species of the genus Entomophthora Fres. in Sweden. 1 Classification and distribution /' M. Gustafsson // Landbr'hogsk. Annl. - 1965. - V. 31. -P. 103-212.

124. Hall, F.R. Biorational pest control agents: formulation and delivery / F.R. Hall // ACS Symposium. - 1995. - V. 595. - P. 306.

125. Hamill, R.L. The structure of beauvericin, a new depsipeptide antibiotic toxic to Artemia salani / R.L. Hamill, C.E. Higgens, H.E. Boaz, M. Gorman // Tetrahedron Letters. - 1969. - V. 49. - P. 4255-4258.

126. Hernandez-Velazquez, V.M. Susceptibility of (Orthoptera: Acrididae) to Metarhizium anisoplia var. acridum (Deuteromycotina: Hyphomycetes): laboratory and field trials / V.M. Hernandez-Velazquez, D.M. Hunter, L. Barrientos-Lozano, R. Lezama-Gutierrez, F. Reyes-Villanueva // Orthoptera Res. - 2003. - V 12. - N 1. - P. 8992.

127. Hong, T.D. Fluctuating temperature and the longevity of conidia of Metarhizium flavoviride in storage / T.D. Hong, N.E. Jenkins, R.H. Ellis // Biocontrol Sci. Technol. - 1999. - V. 9. - P. 165-176.

128. Hu, Q.B. Investigation of destruxin A and B from 80 Metarhizium strains in China, and the optimization of cultural conditions for the strain MaQlO / Q.B. Hu, S.X. Ren, J.H. Wu, J.M. Chang, P.D. Musa // Toxicon. - 2006. - V. 48. - №5. - P. 491-498.

129. Huber, J. Untersuchungen zur Physiologic insektentotenden Pilze / J. Huber // Arch. Mikrobiol, -1958. - P. 257-276.

130. Humber, R.A. Fungi: Identification. Manual of techniques in insect pathology / R.A. Humber//Ed. Lacey L.A. Academic Press. - 1997.-P. 153-185.

131.1nglis, G.D. Effect of bait substrate and formulation on infection of grasshopper nymphs by Beauveria bassiana / G.D. Inglis, D.L. Johnson, M.S. Goettel // Biocontrol Sci. Technol. - 1996. - V. 6. - P. 35-50.

132. Inglis, G.D. Grasshoppers and locusts / G.D. Inglis, M.S. Goettel, M.A. Erlandson, D.K. Weaver // Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Application and Evaluation of Pathogens for Control of Insects and other Invertebrate Pests. - 2007. - P. 627-654.

133. Jackson, A.M. Effects of temperature, pH and water potential on growth of four fungi with disease biocontrol potential / A.M. Jackson, J.M. Whipps, J.M. Lynch // Microbiol. Biotechnol. - 1991. - V. 7. - P. 494-501.

134. Jackson, C.W. Traits associated with virulence to the aphid Mcicrosiphoniella sanborni in eighteen isolates of Verticillium lecanii / C.W. Jackson, J.B. Heale, R.A. Hall //Ann Appl. Biol. - 1985. - V. 106. - P. 39-48.

135. Jackson, M.A. Liquid culture production of dedication tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus / M.A. Jackson, M.R. McGuire, L.A. Lacey, S.P. Wraight//Mycol. Res. - 1997. -V. 101. - P. 35-41.

136. James, R.R. Effect of exogenous nutrients on conidial germination and virulence against the silverleaf whitefly for two Hyphomycetes / R.R. James // Invert. Pathol. - 2001. - V. 77. - N.2. - P. 99-107.

137. Jenkins, N.E. Development of mass production technology for aerial conidia for use as mycopesticides / N.E. Jenkins, G. Heviefo, J. Langewald, A.J. Cherry, C.J. Lomer // Biocontrol News and Information. - 1998. - V. 19. - №1. - P. 21-31.

138. Jenkins, N.E. Methods for mass production of microbial control agents of grasshoppers and locusts / N.E. Jenkins, M.S. Goettel // Memoirs Entomol. Canad. Soc. -1997.-V. 171.-P. 37-48.

139. Jenkins, N.E. Development of mass production technology for aerial conidia for use as mycopesticides / N.E. Jenkins, G. Heviefo, J. Langewald, A.J. Cherry, C.J. Lomer // Biocontrol News Info. - 1998. - V. 19. - P. 21-31.

140. Jenkins, N.E. Effects of formulation and Appl. method on the efficacy of aerial and submerged conidia of Metarhizium flavoviride for locust and grasshopper control / N.E. Jenkins, M.B. Thomas // Pesticide Sci. - 1996. - V. 46. - P. 299-306.

141. Kassa, A. Development and testing of mycoinsecticides based on submerged spores and aerial conidia of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) for control of locusts, grasshoppers and storage pests: Dissertanionn /Kassa Adane - Gottingen, 2003. - 169 p.

142. Kirk P.M. Dictionary of the Fungi / P.M. Kirk, P.F. Cannon, D.W. Minter, J.A. Stalners // 10th ed. Wallingford. - 2008. - P. 771.

143. Kmitowa, K. The effect of different amounts of nitrogenous compounds in the culture medium on the growth and pathogenicity of entomopathogenic fungi / K. Kmitowa // Bull. Acad. Pol. Sci. - 1979. - V. 2. - N. 27. - P. 949-952.

144. Kooyman, C. Operational scale application of entomopathogenic fungi for control of Sahelian grasshoppers / C. Kooyman, R.P. Bateman, J. Langewald, C.J. Lomer // Proc. Royal Society. - 1997. - V. 264. - P. 541-546.

145. Kosir, J.M. Genomic analysis of a virulent and a less virulent strain of the entomopathogenic fungus / J.M. Kosir, J.M. MacPherson, G.G. Khachatourians // Can. Microbiol. - 1991. - V. 37. - N 7. - P. 534.

146. Krasnoff, S.B. / S.B. Krasnoff, S. Gupta, R.J. Leger, J.A. Renwick, D.W. Roberts // Invertebr. Pathol. - 1991. - V 58. - P. 180-188.

147. Kreuger, S.R. Efficacy of soil Appl.s of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin conidia, and standard and lyophilized mycelial particles against Scarab grubs / S.R. Kreuger, M.G. Villani, A.S. Martins, D.W. Roberts // Invert. Pathol. - 1992. - V. 59. - P. 54-60.

148. Lane, B.S. Influence of cultural conditions on the virulence of conidia and blastospores of Beauveria bassiana to the green leafhopper, Neaphotettix virescens / B.S. Lane, A.P.J. Trinci, A.T. Gillespie // Mycol. Res. - 1991. - V. 95. - N 7. - P. 829-833.

149. Langewald, J. Field treatment of Desert Locust (Schistocerca gregaria Forskel) hoppers in the field in Mauritania with an oil formulation of the entomopathogenic fungus Metarhizium flavoviride / J. Langewald, C. Kooyman, O.K. Douro-Kpindou, C. Lomer // Biocontrol Sci. Technol. - 1997. - V. 7. - P. 603-611.

150. Langewald, J. Prospects for microbial control in West Africa / J. Langewald, A. Cherry // Biocontrol News Info. - 2000. - V. 21. - P. 51-56.

151. Leal, S.C.M. Amplification and restriction endonuclease digestion of the Prl gene for the detection and characterization of Metarhizium strains / S.C.M. Leal, D.J. Bertioli, T.M. Butt, J.H. Carder, P.R. Burrows, J.F. Peberdy// Mycol. Res. - 1997. -V. 101.-№3.-P. 257-265.

152. Lednev, G.R. Screening of new strains of entomopathogenic hyphomycetes to control locusts and grasshoppers (Orthoptera, Acrididae) / G.R. Lednev, M.V. Levchenko, Y.S. Tokarev, V.Y. Krykov, V.A. Pavlyushin, V.V. Glupov // Abstracts of XV Congress of European Mycologist. - 2007. - P. 85-86.

153. Leger R.J. Cuticle - degrading enzymes of entomopathogenic fungi: synthesis in culture on cuticle / R.J. Leger, A.K. Chamley, R.M. Cooper // Invert. Patrol. - 1986. -V. 48. -N. 1. - P. 85-89.

154. Leger, R.J. Role of extracellular chymoelastase in the virulence of Metarhizium anisopliae for Manduca sexta / R.J. Leger, P.K. Durrands, A.K. Charnley, R.M. Cooper // Invert. Pathol. - 1988. - V. 52. - N. 2. - P. 285-293.

155. Leger, R.J. Molecular cloning and regulatory analysis of the cuticle -degrading - protease structural gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium

anisopliae / R.J. Leger, D.C. Frank, D.W. Roberts, R.C. Staples // Eur. J. Biochem. -1992. -V. 204. -N. 3. - P. 991-1001.

156. Leger, R.J. Entomopatogenic isolates of Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Aspergillus flavus product multiple extracellular chitinase isoensymes / R.J. Leger, R.C. Staples // Invert. Pathol. - 1993. - V 61. - P. 81

157. Leland, J.E. Effects of media composition on submerged culture spores of the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae var. acridum Part 2: Effects of media osmolality on cell wall characteristics, carbohydrate concentrations, drying stability, and pathogenicity / J.E. Leland, D.E. Mullins, L.J. Vaughan, H.L. Warren // Biocontrol Sci. Technol. - 2005. - V. 15. - №4. - P. 393-409.

158. Lemmens-Gruber, R. The effect of the Fusarium metabolites beauvericin on electromechanical and -physiological properties in isolated smooth and hearth muscle preparations of guinea pigs / R. Lemmens-Gruber, B. Rachoy, E. Steininger, K. Kouri, P. Saleh, R. Krska, R. Josephs, M. Lemmens // Mycopathologia. - 2000. - P. 5-12.

159. Lockey, K.H. Lipids of the insect cuticle origin, composition and function / K.H. Lockey // Comp. Biochem. Physiol. - 1988. - P. 595-602.

160. Lomer, C.J. Biological control of locusts and grasshoppers / C.J. Lomer, R.P. Bateman, D.L. Johnson, J. Langewald, M.B. Thomas // Ann. Review Entomol. - 2001. -V. 46. - P. 667-702.

161. Lomer, C.J. Development of strategics for the incorporation of microbial pesticides into the integrated management of migratory pests / C.J. Lomer, R.P. Bateman, D. Dent, H. DeGroote // Agricultural and Forest Entomology. - 1999. - V. 1. -P. 71.

162. Lomer, C.J. Field infection of Zonocerus variegatus following Appl. of an oil based formulation of Metarhizium flavoviride conidia / C.J. Lomer, R.P. Bateman, 1. Godonou, D. Kpindou // Biocontrol Sci. Technol. - 1993. - V. 3. - P. 337-346.

163. Magalhaes, B.P. Effects of drying on the survival of conidiosphores of Metarhizium anisopliae var. acridum Driver and Milner / B.P. Magalhaes, D.G. Boucias //Journal of Orthoptera Research. - 2004. -№13. - P. 155-159.

164. Maiga, I.H. Pratiques paysannes et utilisation potentielle de Metarhizium flavoviride Gams and Rozsypal en lutte antiacridienne au Niger / l.H. Maiga, O.K. Douro-Kpindou, C.J. Lomer // Insect Sei. and its Appl. - 2000. - V. 19. - P. 163-171.

165. Maiga, I.H. Utilisation de Metarhizium flavoviride Cams and Rozsypal centre les sauteriaux dans des essais participatifs en milieu paysan au Niger / I.H. Maiga, O.K. Douro-Kpindou, C.J. Lomer, J. Langewald // Insect Sei. and its Appl. - 1999. - V. 18. -P. 279-284.

166. Milner, R.J. Control of Phaulacridium vittatum (Sjustedt) (Orthoptera: Acrididae), in field cages using an oil - based spray of Metarhizium flavoviride Gams and Rozsypal (Deuteromycotina: Hyphomycetes) / R.J. Milner, T.R. Hartley, G.G. Lutton, C. Prior // J. Austral. Entomol. Soc. - 1994. - V. 33. - P. 165 - 167.

167. Mohanty, S.S. Induction of chymoelastase (Prl) of Metarhizium anisopliae and its role in causing mortality to mosquito larvae / S.S. Mohanty, K. Raghavendra, A.P. Dash // World J Microbiol Biotechnol. - 2008. - V. 24. - №10. - P. 2283-2288.

168. Mollier, P. A glycoprotein highly toxic for Galleria mellonella larvae secreted by the Entomopathogenic fungus Beauveria sulfyrescens / P. Mollier, J. Lagnel, B. Foumet, A. Aioun, G. Riba // Invert. Pathol. - 1994. - V. 64. - P. 200-207.

169. Moore, D. Effects of moisture content and temperature on storage of Metarhizium flavoviride conidia / D. Moore, O.K. Douro-Kpindou, N.E. Jenkins, C.J. Lomer // Biocontrol Sei. Technol. - 1996. - V. 6. - P. 51 -61.

170. Moore, D. Effects of rehydration on the conidial viability of Metarhizium flavoviride mycopesticide formulations / D. Moore, J. Langewald, F. Obognon // Biocontrol Sei. Technol. - 1997. - V. 7. - P. 87-94.

171. Morley-Davies, J. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures / J. Morley-Davies, D. Moore, C. Prior//Mycol. Res. - 1996. - V. 100. - №1. - P. 31-38.

172. Napolitano, R. Entomopathogenous fungi degrade epicuticular hydrocarbons of Triatoma infestans / R. Napolitano, M.P. Juarez // Arch. Biochem. Biophys. - 1997. -V. 311. - N. l.-P. 208.

173. Ouedraogo, A. Effect of temperature on vegetative growth among isolates of Metarhizium anisopliae and M. flavoviride / A. Ouedraogo, J. Fargues, M.S. Goettel,

C.J. Lomer // Mycopathologia. - 1997. - V. 137. - P. 37-43.

174. Ouedraogo, R.M. Behavioral thermoregulation in the migratory locust: a therapy to overcome fungal infection / R.M. Ouedraogo, M.S. Goettel, J. Brodeur // Oecologia. - 2004. - V. 138. - P. 312-319.

175. Paterson, I.E. Specific induction of a cuticle - degrading protease of the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae / I.E. Paterson, A.K. Charnley, R.M. Cooper, J.M. Clarkson//Microbiology. - 1994. -V. 140. - P. 185-189.

176. Peczynska-Czoch, W. Formation of beauvericin by selected strains of Beauveria bassiana / W. Peczynska-Czoch, M.J. Urbanczyk, S. Balazy // Archivum immunologiae ettherapiae experimentalis. - 1991. - V. 39 (1-2). - P. 175-179.

177. Pedras M.S.C., Zaharia L.I., Ward D.E. The destruxins: synthesis, biosynthesis, biotransformation, and biological activity / M.S.C. Pedras, L.l. Zaharia,

D.E. Ward // Review Phytochemistry. - 2002. - V. 59. - № 6. -P. 579-596.

178. Pereira, R.M. Alginate and cornstarch mycelial formulations of entomopathogenic fungi, Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae / R.M. Pereira, D.W. Roberts // Econ, Entomol. - 1991. - V. 84. - P. 1657-1661.

179. Pereira, R.M. Dry mycelium preparations of entomopathogenic fungi, Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana / R.M. Pereira, D.W. Roberts // Inver. Pathol. - 1990. - V. 56. - P. 39-46.

180. Prior, C. Infectivity of oil and water formulations of Beauveria bassiana (Deyteromicotina: Hyphomycetes) to the cocoa weevil pest Pantorhytes plutus (Coleoptera: Curculionidae) / C. Prior, P. Jollands, G. Patourel // Invert. Pathol. - 1988. -V. 52. - P. 66-72.

181. Quimby, P.C. A simple method for stabilizing and granulating fungi / P.C. Quimby, N.K. Zidack, C.D. Boyette, W.E. Grey // Biocontrol Sci. Technol. - 1999. - V 9. - P. 5-8.

182. Quintela E.D. Conidial attachment of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to the larval cuticle of Diaprepes abbreviatus (Coteoptera: Curculionidae)

treated with imidacloprid / E.D. Quintela, C.W. McCoy // Invert. Pathol. - 1998. - V. 72. -N 3. - P. 220.

183. Rehner, S.A. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria / S.A. Rehner, A.M. Minnis, Sung Gi-Ho, J.J. Luangsa-ard, L. Devotto, R.A. Humber // Mycologia. -2011. - №103. - P. 1055-1073.

184. Rhodes, D.J. Formulation of biological control agents / D.J. Rhodes // Exploitation of microorganisms. - 1993. - P. 411-439.

185. Rhodes, D.J. Formulation requirements for biological control agents / D.J. Rhodes // Aspects Appl. Biol. - 1990. - V. 24. - P. 145-153.

186. Robert, A. Acid production by Metarhizium anisopliae: effect on virulence against mosquites and detection of in vitro amylase, protease and lipase activity / A. Robert, K. Messing-Al-Aidroos // Invert. Pathol. - 1985. - V. 45. - P. 9-15.

187. Rombach, M.C. Production of Beauveria bassiana (Deuteromycotina Hyphomycetes) sympoduloconidia in submerged culture / M.C. Rombach // Entomophaga. - 1989. -V. 34. -N 1. - P. 45-52.

188. Rosato, Y.B. Production of extracellular enzymes by isolated of Metarhizium anisopliae / Y.B. Rosato, C.J. Messias, J.L. Azevedo // Invert. Pathol. - 1981. - V. 38. -p i

189. Samsinakova, A. Enzyme activities in certain entomophagous representatives of Deuteromycetes (Moniliales) in relationship to their virulence / A. Samsinakova, S. Misikova // Ceska mycologie. - 1973. - V. 27. - N. 1. - P. 55-60.

190. Santharam, G. Possibility of increasing the pathogenicity of the white halo fungus Cephalosporium lecanii on coffee green bug Coccus viridis during summer / G. Santharam, S. Easwaramoorthy, A. Regupathy, S.I. Jayaraj // Plantation Crops. - 1997. -V. 5. -P. 121-122.

191. Shah, P. A. Surveys for fungal pathogens of locusts and grasshoppers in Africa and the Near East / P.A. Shah, C. Kooyman, A. Paraiso // Memoirs Entomol. Soc. Canada. - 1997.-V. 171.-P. 27-35.

192. Shimizu, S. Serology and substrate specificity of extracellular proteases from four species of Entomopathogenic Hyphomycetes / S. Shimizu, Y. Tshuchitani, T. Matsumoto// Invert. Pathol. - 1993. - V. 61. - P. 192-195.

193. Sieglaff, D.H. Pathogenicity of Beauveria bassiana and Metarhizium flavoviride (Deuteromycotina) to Schistocerca americana (Orthoptera: Acrididae) / D.H. Sieglaff, R.M. Pereira, J.L. Capinera // Journal of Economic Entomology. - 1997. - №90. -P. 1539-1545.

194. St. Leger, R.J. The role of cuticle-degrading proteases in fungal pathogenesis of insects/R.J. St. Leger //Can. J. Bot. - 1995. - V. 73. - P. 1119-1125.

195. Steenberg, T. Entomopathogenic potential of Verticillium and Acremonium species (Deuteromycotina: Hyphomycetes) / T. Steenberg, R.A. Humber // Invert. Pathol. - 1999. - V. 73. - N. 3. - P. 309-314.

196. Stephan, D. Locust control with Metarhizium flavoviride; formulation and Application of blastospores / Insect pathogenes and insect parasitic nematodes / D. Stephan, M. Welling, G. Zimmerman //Bull, IOBC/WPRS. - 1996. - V. 19. - N. 9. - P. 232-235.

197. Sung, G.H. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi / G.-H. Sung, N.L. Hywel-Jones, J.-M. Sung, J.J. Luangsa-ard, B. Shrestha, J.W. Spatafora // Stud. Mycol. - 2007. - V. 57. - P. 5-59.

198. Swanson, D. Economic feasibility of two technologies for production of mycopesticides in Madagascar / D. Swanson // Memoirs Entomol. Canad. Soc. - 1997. -V. 171. -P. 101-113.

199. Takahashi, S. Pyridovericin and pyridomacrolidin: novel metabolites from entomopathogenic fungi Beauveria bassiana / S. Takahashi, N. Kakinuma, K. Uchida, R. Hashimoto // Antibiot. Tokyo. - 1998. - V. 51. - N. 6. - P. 596-604.

200. Thomas, K.C. Production and properties of Beauveria bassiana conidia cultivated in submerged culture / K.C. Thomas, G.G. Khachatourians, W.M. Ingledew // Can. Microbiol. - 1986. - V. 33. - P. 12-20.

201. Thomas, M.B. Experimental studies to evaluate spray Apples of a mycoinsecticide against the rice grasshopper, Hieroglyphus daganensis, in Northern

Benin / M.B. Thomas, S. Blanford, C. Gbongboui, C.J. Lomer // Entomol. Exper. App. -1998.-V. 87.-P. 93-102.

202. Thomas, M.B. Reduction of feeding by the variegated grasshopper, Zonocerus variegalus, following infection by the fungal pathogen. Metarhizium flavoviride / M.B. Thomas, S. Blanford, C.J. Lomer// Biocontrol Sei. Technol. - 1997. - V 7. - P. 327-334.

203. Thomsen, L. Time-concentration mortality of Pieris brassicae (Lepidoptera: Pieridae) and Agrotis segetum (Lepidoptera: Noctuidae) larvae from different destruxins / L. Thomsen, J. Eilenberg // Environ. Entomol. - 2000. - V. 29. - №5. - P. 1041-1047.

204. Vey, A. Toxemie d'origine fongique chez les invertebres et ses consequences cytotoxiques: etude sur V infection a Metarhizium anisopleae (Hyphomycetes, Moniliales) chez les Lepidopteres et les Coleopteres / A. Vey, J.M. Quiot, M. Pais // C.R. Soc. Biol. Montpellier. - 1988.-V. 180.-P 105-112.

205. Vey, A. Effect immunodépresseur de toxines fongiques: Inhibition de la reaction d'encapsulement multicellulaire par les destruxines / A. Vey, J.M. Quiot, C. Vago, J. Fargues // C. R. Acad. Sei. - 1985. - V. 300. - N. 3. - P. 647.

206. Vey, A. Toxines insecticides issues de champignons entomopathogenes. Etat actuel des conaissances dutilsation de leurs activités / A. Vey, G. Riba // C. R. Acad. Agr. - 1989. - V.75. - N. 6. - P. 143-149.

207. Vilcinskas, A. Effect of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana on the humoral immune response of Galleria mellonella larvae (Lepidoptera: Pyralidae) / A. Vilcinskas, V. Matha // European Journal of Enthomology. - 1997. - V. 94. - P. 461-472.

208. Wang, C.' Detection and characterisation of prl virulent gene deficiencies in the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae / C. Wang, M.A. Typas, T.M. Butt //FEMS Microbiology Letters. - 2002. - V. 213. - №2. - P. 251-255.

209. Welling, M. Metarhizium spp. isolates from Madagascar Morphology and effect of high temperature on growth and infectivity to the migratory locust / M. Welling, G. Nachtigall, G. Zimmermann //Entomophaga. - 1994. - V. 39. - P. 351-361

210. West, E.J. In vitro toxin production by the fungus Beauveria bassiana and bioassay in greater wax moth larvae / E.J. West, J.D. Briggs // Econom. Entomol. - 1968. - V. 61. -N. 3. - P. 684-689.

211. Wood, S.N. Space, time and persistence of virulent pathogens / S.N. Wood, M.B. Thomas // Proceed. Royal Soc. - 1996. - V. 263. - P. 673.

212. Wraight, S.P. Fungi // Field manual of techniques in invertebrate pathology. Application and evaluation of pathogens for control of insects and other invertebrate pests / S.P. Wraight, G.D. Inglis, M.S. Goettel // Springer. - 2007. - P. 223-248.

213. Zacharuk, R.Y. Fine structure of the fungus Metarhizium anisopliae infecting three species of larvae Elateridae (Coleoptera). Conidial germ tubes and appressoria / R.Y. Zacharuk // Invert. Pathol. - 1970. - V. 15. - N. 3. - P. 81-91.

214. Zimmermann, G. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and its potential as a biocontrol agent / G. Zimmermann // Pesticide Sci. - 1993. - V. 37. - P. 375-379.

215. Zocher, R. Biosintesis of cyclosporin A / R. Zocher, N. Madry, H. Peters, H. Kleinkhauf // Phitochemestry. - 1984. - V.23. - P. 540-551.