Белки с доменом холодового шока растения-экстремофита Thellungiella salsuginea в процессе адаптации растений к низким температурам тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Таранов, Василий Васильевич

• Таранов, Василий Васильевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Таранов, Василий Васильевич

Оглавление

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Повреждение растений при низкотемпературном стрессе

1.2 Механизмы закаливания

1.3 Восприятие низких температур

1.4 Регуляция экспрессии генов низкими температурами

1.4.1 Регуляция транскрипции

1.4.2 Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов 22 1.4.2.1. Процессинг мРНК и экспорт из ядра

1.4.2.3 Малые некодирующие РНК в ответе растений на низкотемпературный стресс

1.4.2.4 Посттрансляционная регуляция экспрессии белков в ответ на низкотемпературный стресс

1.5 Белки с доменом холодового шока

1.5.1 Структура домена холодового шока 3 О

1.5.2 Белки с доменом холодового шока бактерий

1.5.3 Белки с доменом холодового шока животных

1.5.3.1 Y-box семейство

1.5.3.2 Lin28

1.5.3.3 UNR

)

1.5.4 Белки с доменом холодового шока растений

Цели работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследований

2.2. Выделение РНК и синтез первой цепи кДНК

2.3. Выделение геномной ДНК из тканей растений

2.4. Полимеразная цепная реакция и электрофорез ДНК

2.6. Приготовление компетентных клеток

2.7. Клонирование ПЦР-продуктов методом TA-cloning

2.8. Идентификация генов TsCSDP в растениях Thellungiella salsuginea

2.9 Оценка морозоустойчивости и способности к закаливанию клеток

суспензионной культуры Thellungiella salsuginea

2.10. Измерение экспрессии генов в растениях и клетках суспензионной культуры Thellungiella salsuginea

2.10.1. Получение растительного материала 5

2.10.2 ОТ-ПЦР в режиме реального времени

2.11. Комплементация мутантных бактерий штамма ВХ04

2.12. Создание векторов для трансформации растений

2.13. Трансформация растений Arabidopsis thaliana методом "Floral dip" созданными генетическими конструкциями

2.14 Биологический анализ трансгенных растений

2.14.2 Определение содержания Сахаров в трансгенных растениях

арабидопсиса со сверхэкспрессией TsCSDP3

2.14.3. Измерение экспрессии генов, индуцируемых Холодовым стрессом, в трансгенных растениях А. thaliana со сверхэкспрессией TsCSDP3

2.15.1. Установление и анализ нуклеотидной последовательности промотора гена TsCSDP 1

2.16 Статистика

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Идентификация генов С SDP

3.2 Анализ экспрессии генов TsCSDP 1-4 в растениях

Thellungiella salsuginea

3.3 Идентификация промоторной области TsCSDP 1

3.4 Анализ экспрессии генов TsCSDP 1-4 в клетках суспензионной культуры Thellungiella salsuginea

3.5 Комплементация роста бактерий мутантного штамма Е.coli ВХ04 при пониженной температуре

3.6 Трансформация А thaliana генами TsCSDP2 и TsCSDP3 и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений

Определение содержания Сахаров в трансгенных растениях

арабидопсиса со сверхэкспрессией TsCSDP3

Измерение экспрессии индуцируемых холодом генов в трансгенных растениях А. thaliana

с экспрессией TsCSDP3

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

CBF/DREB C-repeat binding factor(cj)aKTop связывающий C-

noBTop)/dehydration responsive element binding (элемент реакции на обезвоживание)

CSD Домен холодового шока

CaMV 35S Промотор вируса мозаики цветной капусты

CSP Белок холодового шока

ZnF Мотив цинковых пальцев

CSDP Белок с доменом холодового шока

АФК Активные формы кислорода

IPTG Изопропил-р-Э-тиогалактозид

LB Питательная среда Лурия-Бертани

SOB Питательная среда Super Optimal Broth

МАРК Митоген-активируемая протеинкиназа

nptll Неомицинфосфотрансфераза

PBD Protein Data Base (база данных по белкам)

Pfu ДНК полимераза Термостабильная ДНК полимераза из

Pyrococcus furiosus

RACE Rapid amplification of cDNA ends

ROS Реактивные формы кислорода

X-Gal 5 -бромо-4-хлоро-З -индоил-бета-D-

галактопиранозид

a.o. Аминокислотных остатков

н.п. Нуклеотидных пар

NCBI Национальный центр биотехнологической

информации

IRES Участок внутренней посадки рибосомы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Белки с доменом холодового шока растения-экстремофита Thellungiella salsuginea в процессе адаптации растений к низким температурам»

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярные механизмы устойчивости растений к абиотическому стрессу являются одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии растений. Повышенный интерес к исследованиям в этой области объясняются тем, что научные вопросы соприкасаются с экономическими проблемами. Низкотемпературный стресс негативно влияет на рост сельскохозяйственных растений, ограничивая их географическое распространение и снижая их продуктивность. В этой связи большое значение имеет изучение механизмов устойчивости сельскохозяйственных культур к низким температурам, результатом которого может быть создание новых холодостойких сортов, а также расширение посевных площадей. К примеру, увеличение морозостойкости озимой пшеницы всего лишь на 2°С может распространить ее производство на обширные площади, используемые сейчас под яровую пшеницу, урожайность которой на 25 - 40% ниже (Колесниченко и Войников, 2003). Методы классической селекции, направленные на повышение морозоустойчивости пшеницы, длительны и трудоемки и не всегда позволяют достигнуть желаемого результата. В настоящее время благодаря достижениям современной науки появилась возможность создания устойчивых сортов сельскохозяйственных культур при помощи методов генетической инженерии путем целенаправленного изменения экспрессии собственных генов или путем введения в геном культурных растений генов из других видов и семейств. Несмотря на большие усилия мирового научного сообщества в решении проблемы повышения устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды, успехи в создании устойчивых сортов сельскохозяйственных растений генно-инженерными методами весьма скромны. И связано это,

прежде всего, с недостатком фундаментальных знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе устойчивости растений к холоду и морозу. Известно, что при выдерживании растений в течение нескольких дней при низких положительных температурах они приобретают повышенную устойчивость к отрицательным температурам. Этот процесс называется закаливанием. При этом процессе в растениях индуцируются изменения в метаболизме, что в конечном итоге приводит к повышению их морозоустойчивости (Трунова, 2007). Эти изменения включают в себя

л i

модификации мембран растений, накопление Са в цитозоле, увеличение уровня ROS, активацию систем утилизации ROS, изменения в синтезе белков и Сахаров, накопление пролина и биохимические изменения, влияющие на фотосинтез.

Большая часть информации, касающейся молекулярных механизмов устойчивости, получена в работах с Arabidopsis thaliana, растением с небольшим геномом, нуклеотидная последовательность которого определена полностью. Холодоустойчивость принято связывать с функционированием факторов транскрипции CBF/DREB (Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998), факторов, так или иначе модулирующих структуру мембран (Uemura et al., 1999), гена неизвестной функции Eskimo 1 (Xin et al., 1998) и белков с древним, высококонсервативным доменом холодового шока (CSD) (Скабкин и др., 2004).

В последнее время в качестве модельного объекта для изучения устойчивости растений к различным стрессам стали использовать растение Thellungiella salsuginea (halophila). Это близкородственное A. thaliana растение отличается гораздо большей холодо- и солеустойчивостью (Amtman 2005). Молекулярные механизмы, лежащие в основе повышенной устойчивости Т. salsuginea к абиотическим стрессам, пока остаются

малоизученными. Особенно это касается холодового стресса. Исходя из литературных данных о возможном участиии белков с доменом холодового шока (CSDP) в адаптации растений к холодовому стрессу (Kim et al., 2009) мы попытались выяснить, может ли повышенная холодоустойчивость Т. Salsuginea объясняться особенностями первичной структуры CSDP и/или их синтезом в этом растении в ответ на охлаждение, а также оценить перспективность использования генов CSDP растения Т. salsuginea для модификации культурных растений с целью повышения их устойчивости к абиотическому стрессу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Повреиадение растений при низкотемпературном стрессе

Понятие низкотемпературного стресса включает в себя всю совокупность ответных реакций растений на действие холода и мороза. Эти реакции проявляются на разных уровнях организации растительного организма, от молекулярного до организменного (Трунова, 2007).

Для понимания влияния низких температур на растения надо разделять низкие, но положительные и отрицательные температуры. Понижение температуры термодинамически снижает кинетику метаболических реакций. Экспозиция растений при низких температурах сдвигает термодинамическое равновесие, нарушая регуляцию метаболизма. (Zhu et al., 2007). Низкие температуры увеличивают жесткость мембран, что ведет к нарушению всех мембранных процессов (например: открытие ионных каналов, связанные с мембранами реакции переноса электронов, и т.д.). Кроме того, низкие положительные температуры ассоциированы с аккумуляцией активных форм кислорода (АФК), что объясняется снижением активности ферментов, утилизирующих АФК под воздействием низких температур. Накопление АФК оказывает губительное действие на биологические мембраны. Низкие температуры способствуют образованию вторичных структур в РНК, тем самым влияя на экспрессию генов и белков. (Smallwood and Bowles 2002; Zhu et al., 2007) Способность растений выдерживать низкие положительные температуры названа холодостойкостью.

Воздействие низких отрицательных температур более губительно для растений. В естественных условиях растения охлаждаются медленно, что приводит к внеклеточному образованию льда. Различие в химическом

потенциале, создающееся за счет роста кристаллов льда, приводит к оттоку клеточной воды во внеклеточную среду, вызывая дегидратацию клеток и плазмолиз (Dowgert and Steponkus, 1984). Степень обезвоживания клеток зависит от степени и скорости снижения температуры. В итоге лед может проникать через симпласт (Gusta et al., 2004), вызывая повреждения внутриклеточных структур и отмирание тканей. Способность растений переносить снижение температуры ниже 0°С, сопровождающееся образованием межклеточного льда, с последующим наименьшим ущербом для своей жизнедеятельности, роста и развития названа морозостойкостью.

Экспозиция растений при низких положительных может запускать каскад реакций, которые вызывают изменения в экспрессии генов и тем самым приводят к биохимическим и физиологическим изменениям, повышающим их морозоустойчивость (Новикова и др., 2007; Ruelland et al., 2009). Этот феномен известен как закаливание (cold acclimation). Большинство растений умеренного климата способны к закаливанию и приобретают устойчивость к образованию внеклеточного льда в своих тканях. Многие важнейшие сельскохозяйственные культуры, такие как рис, кукуруза, соя и хлопок чувствительны к холоду и не способны к закаливанию. Тем не менее, температурный порог для повреждений холодом холодочувствительных растений снижается после их предварительной экспозиции при субоптимальных пониженных температурах.

1.2 Механизмы закаливания

Механизмы закаливания включают в себя физиологические изменения, происходящие в мембранах растительных клеток, накопление цитозольного Са2+, повышение уровня АФК и активацию системы антиоксидантной

защиты, изменения в экспрессии генов, изменения в синтезе белков и Сахаров, накоплении пролина и биохимические изменения, влияющие на фотосинтез. В первую очередь от низкотемпературного стресса повреждаются мембраны растительных клеток. В ряде исследований показано, что под воздействием низкотемпературного стресса увеличивается жесткость мембран, что сопровождается перестройкой цитоскелета, притоком кальция и активацией МАРК-каскада, запускающего механизм ответа на низкие температуры (Orvar et al., 2000; Xin and Browse, 2000; Sangwan et al, 2002). Состав липидов плазматических мембран в закаленных растениях изменяется таким образом, что температура, при которой появляются повреждения, становится существенно ниже по сравнению с мембранами незакаленных растений (Uemura and Steponkus, 1999). Это достигается за счет увеличения текучести мембран закаленных растений благодаря росту содержания ненасыщенных жирных кислот (Vogg et al., 1998).

На физиологическом уровне холод сильно воздействует на фотосинтез. Прекращение роста в результате действия низких температур сильно снижает потенциал для использования энергии, из-за чего происходит ингибирование фотосинтеза (Ruelland and Zachowski, 2010). В закаленных однолетних зимующих растениях фотосинтетическая активность сохраняется благодаря увеличению количества и активности нескольких ферментов цикла Кальвина (Goulas et al., 2006). Это связано с повышеным уровнем тилакоидного пластохинона, защищающего реакционные центры фотосистемы 2 от чрезмерного возбуждения (Krol et al., 1999), и сопутствующим значительным ростом пула межсистемных доноров электронов фотосистемы 1 (Ваепа-Gonzalez et al., 2001). Руланд и Заховски (Ruelland and Zachowski, 2010)

сообщили, что диссипация энергии и транспорт электронов не только усиливались после закаливания, но и способствовали защите от повреждений, вызванных окислительным стрессом.

I

Значительная роль при закаливании принадлежит Са . Кальций действует как посредник в процессах регулирования роста растений, развития и реакций на изменения условий внешней среды (Sanders et al., 2002; Du and Poovaiah, 2005). Под действием низких температур плазматические мембраны увеличивают свою жесткость. Это сопровождается активацией пока не известных каналов Са2+ и увеличением

■у I

уровня цитозольного Са (Sangwan et al., 2001; Catala et al., 2003). Высвобождение внутриклеточных резервов Ca2+ опосредовано инозит-1,4,5-трифосфатом и происходит до активации факторов транскрипции CBF и COR генов в путях передачи сигнала низкотемпературного стресса (Chinnusamy et al., 2007, 2010). Доэрти с соавторами представили дополнительные доказательства связи между кальцием и индукцией пути CBF, показав, что кальмодулин, связывающийся с транскрипционным фактором САМТА, взаимодействует с регуляторным элементом в промоторе гена CBF2 (Doherty et al., 2009).

■у i

Помимо Са в устойчивости растений к пониженным температурам большое значение имеют активные формы кислорода (АФК). Роль АФК в абиотических стрессах стала предметом серьезных научных обсуждений и особенно в участии в процессах, приводящих к закаливанию (Suzuki et al., 2011). Это связано с тем, что АФК являются не просто токсичными побочными продуктами, а действуют как сигнальные молекулы, модулирующие экспрессию различных генов, в том числе тех, которые кодируют антиоксидантные ферменты и модуляторы продукции АФК (Neill

et al., 2002; Gechev et al., 2003; Suzuki et al., 2011). Кроме того, низкотемпературный стресс индуцирует значительное увеличение уровня растворимых неферментативных антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота и глутатион, а также при нем повышается активность основных дегидрогиназ, генерирующих NADPH (Airaki et al., 2011).

1.3 Восприятие низких температур

Практически все живые организмы от бактерий до растений и животных живут в постоянно изменяющихся температурных условиях и, следовательно, вынуждены адаптироваться к ним. Поэтому в поисках рецепторов холода у высших растений представляется возможным обратить внимание на ортологичные системы других эукариотических организмов.

У млекопитающих рецепторами холода являются TRP каналы (катионные каналы транзиторного рецепторного потенциала), локализующиеся на плазмалемме и переносящие ионы Са в клетку. К сожалению, эта информация мало способствует пониманию рецепции холода растениями, поскольку биоинформатический анализ геномов растений показал отсутствие у них TRP каналов. Первой работой, указывавшей на роль Са в рецепции холода у растений, была работа Минорского и Спансвика, опубликованная в 1989 году (Minorsky and Spanswick, 1989). С тех пор накопилось большое количество данных, доказывающих роль чувствительных к холоду Са каналов растений (Ding and Pickard, 1993; Carpaneto et al., 2007). Предполагается, что они являются первичными сенсорами холода (Plieth, 1999; White, 2009), но на молекулярном уровне не

"У А-

идентифицирован ни один чувствительный к холоду Са канал (Knight and Knight, 2012).

Помимо кальциевых каналов за восприятие низких температур могут отвечать плазматические мембраны, что продемонстрировано на примере цианобактерий. (Murata and Los, 1997; Los and Murata, 2000). Низкая температура путем прямого физического воздействия приводит к снижению текучести мембран. Это может восприниматься как сигнал снижения температуры и приводить к активации индуцируемых холодом генов. Таким образом, в цианобактериях мембраны выступают в качестве клеточных термометров. Эти данные позволили предположить, что текучесть мембран может выступать в качестве сенсора низких температур и в высших растениях. В цианобактериях за восприятие изменений в текучести мембран отвечают определенные гистидинкиназы, например, в Synechocystis Hik33 (Mikami et al., 2002). Однако, как и в случае с рецепторами животных, в растениях ортологов этих специфических киназ не найдено. Показано, что химические вещества, способные увеличивать или уменьшать текучесть мембран, влияют на экспрессию индуцируемых холодом генов. Так, бензил алкоголь увеличивает текучесть мембран и приводит к потере чувствительности к холоду транскриптомом растений. Диметилсульфоксид (ДМСО), напротив, снижает текучесть мембран и таким образом имитирует действие низких температур, индуцируя изменения экспрессии реагирующих на холод генов в отсутствии низкотемпературного стресса (Orvar et al., 2000). Проверка гипотизы о роли текучести мембраны в восприятии холодового стресса была проведена в экспериментах на мутантных растениях с нарушенным синтезом ненасыщенных жирных кислот. Эти эксперименты показали, что, несмотря на существенные изменения в насыщенности липидов, различия в ответе транскиптомов на холодовой стресс между растениями дикого типа и растениями-мутантами по генам белков FAD1

(fabl), FAD 2-2 (fad2-2) и тройного мутанта fad3/fad7/fad8 отсутствуют (Knight and Knight, 2012).

Предположение о том, что текучесть биологических мембран является датчиком температуры, не может в полной мере объяснить, как клеточный «термометр» может сообщать об абсолютной температуре, поскольку биофизические изменения в текучести мембраны представляют собой дискретные фазовые переходы. Это затруднение может быть преодолено, если предположить, что небольшие области мембраны (микродомены) ответственны за восприятие и передачу сигнала о стрессе в различных диапазонах температур.

Помимо влияния на текучесть мембран холодовой стресс может приводить к конформационным изменениям белков. Так, в растениях ячменя ДНК-связывающая способность фактора транскрипции CBF2 зависит от температуры (Хие, 2003). HvCBF2 не связывается с CTR/DRE мотивом при 30°С, однако его связывающая активность постепенно увеличивается с понижением температуры. Поскольку активация HvCBF2 является обратимой и достигается в бесклеточной системе исключительно под действием температуры, скорее всего она является следствием изменения его конформации (Хие, 2003).

Кроме влияния на отдельные белки и их активность, низкие температуры влияют на многомерные пептидные структуры. Показано, что цитоскелет может участвовать в восприятии низких температур до притока ионов Са . Химические вещества, стабилизирующие микрофиламенты, снижают восприимчивость к низким температурам, тогда как вещества, дестабилизирующие микрофиламенты, могут индуцировать процессы,

происходящие под действием холода даже при нормальных температурах (Orvar et al., 2000). Показаны динамические изменения в структуре микрофиламентов, происходящие до притока кальция в клетку. Это согласуется с прямыми измерениями динамики Са2+. Показано, что вещества, дестабилизирующие микротрубочки, увеличивают амплитуду

I

изменения концентрации Са в реакции на холод. (Mazars et al., 1997). Однако, стабилизация микрофиламентов химическими веществами не полностью подавляла изменения в экспрессии генов, реагирующих на низкие температуры (Orvar et al., 2000). Таким образом, изменения в цитоскелете, выполняя определенную фунцию в рецепции температуры, не являются абсолютно необходимыми для реакции растений на низкие температуры. Вероятно, выполняя функцию рецептора температуры, цитоскелет не является основным сенсором низких температур.

Помимо описанных выше можно предположить существование и других температурных сенсоров. В цианобактерии Synechocystis с понижением температуры увеличивается степень сверхсперализации ДНК в области генома, содержащей регуляторные элементы гена desB, иницирующегося при холодовом стрессе. Новобиотин, ингибитор ДНК-гиразы ингибирует увеличение сверхспирализации и полностью подавляет индукцию транскрипции desB в условиях холодового стресса (Los, 2004). Возможно, что температура может регулировать структуру ДНК в митохондриях и хлоропластах растительных клеток, в которых, как и в цианобактериях, отсутствуют гистоны, на что указывает ингибирующее влияние новобиоцина на экспрессию генов в хлоропластах гороха Pisum sativum (Lam and Chua, 1987).

Известно, что при понижении температуры стабилизируются вторичные структуры РНК. Этот эффект может использоваться для восприятия снижения температуры растительной клеткой. Многие этапы процессинга РНК, такие как сплайсинг и экспорт из ядра регулируются путем стабилизации вторичных структур. Показано, что холод влияет на скорость альтернативного сплайсинга (Iida et al., 2004; Filichkin et al., 2010). Таким образом, альтернативный спласинг может использоваться для восприятия низкой температуры растениями. Восприятие холода путем стабилизации вторичных структур РНК лучше всего изучено у прокариот. Некоторые бактериальные мРНК имеют регуляторные последовательности, образующие вторичные структуры, маскирующие сайт связывания рибосомы, который становится доступным для рибосом под воздействием низких температур. Так, одним из первых детектируемых событий после холодового шока в E.coli является сильная индукция экспрессии белка холодового шока A (CspA), необходимого для адаптации бактерий к низким температурам (Phadtare, 2011; Jiang, et al., 1997). Транскрипты cspA чрезвычайно неустойчивы при 37°С (период полураспада не более 20 секунд), но резко стабилизируются путем глобальной реорганизации своей вторичной структуры при понижении температуры до 10°С (период полураспада 30 минут) (Yamanaka et al., 1999). Кроме того, встроенный «РНК-термодатчик» повышает экспрессию cspA при низких температурах на уровне трансляции (Giuliodori et al., 2010).

мРНК cspA в клетках может образовывать две взаимоисключающие альтернативные вторичные структуры. При 37°С элементы инициации трансляции скрыты в двуцепочечных структурах, которые ограничивают эффективность трансляции. Структура мРНК CspA при +10°С более

эффективно транслирутся и менее восприимчива к деградации, чем при 37°С (Giuliodori et al., 2010). Это объясняется увеличением доступности для малой субъединицы рибосомы последовательности Шайна-Дальгарно, а также тем, что стартовый кодон оказывается в неустойчивой спирали.

Инициация трансляции большинства эукариотических генов происходит по cap- зависимому механизму и в отличие от прокариот не предполагает узнавания комплексом инициации трансляции каких-либо последовательностей в 5' нетранслируемой области мРНК. Однако подобный механизм может существовать в случае инициации трансляции по сор-независимому механизму для мРНК содержащих IRES элементы в 5' нетранслируемых областях. Также не исключено, что конформационнные изменения в мРНК могут влиять на связывание с ними белков, регулирующих трансляцию по cap- зависимому механизму. Для установления возможной роли конформационных изменений РНК в восприятии низких температур у растений необходимы дальнейшие исследования.

1.4 Регуляция экспрессии генов низкими температурами 1.4.1 Регуляция транскрипции

Секвенирование геномов растений и использование ДНК-микрочипов привели к накоплению данных об изменениях их транскриптомов в ответ на холодовой стресс. Во время закалки растений происходит изменение экспрессии многих генов. Анализ экспрессии 8000 генов у Arabidopsis thaliana показал, что примерно 20% генов изменяют свою экспрессию в ответ на понижение температуры (Provart et al., 2003). Всего было обнаружено изменение экспрессии 1457 генов, при этом экспрессия 532 генов возрастала

под воздействием низких температур, а 925 генов снижалась в два и более раз. Эти гены кодируют транскрипционные факторы, сигнальные молекулы, переносчики ионов и молекул, ферменты, вовлеченные в синтез клеточной стенки и в ответ на окислительный стресс

Наиболее изученными факторами транскрипции, вовлеченными в закаливание, являются CBF1-4 или DREB 1-4, открытые в 1998 году независимо двумя группами (Jaglo-Ottosen et al., 1998; Liu et al., 1998). Показано, что сверхэкспрессия CBF достаточна для активации экспрессии COR (cold-responsive) генов и индукции адаптации к холоду даже при нормальной температуре. CBF регулируют экспрессию генов, кодирующих белки, вовлеченные в метаболизм фосфоинозитидов, транскрипцию, биосинтез осмолитов, детоксикацию АФК, мембранный транспорт, метаболизм гормонов, сигналинг и другие белки с известными или предполагаемыми защитными функциями. Гомологи CBF генов клонированы как из морозоустойчивых (пшеница, ячмень и рапс), так и из чувствительных к морозу культур (рис, кукуруза, томаты и ячмень). Экспрессия CBF генов Arabidopsis thaliana в различных видах растений способна повышать холодо/морозоустойчивость и, наоборот, сверхэкспрессия CBF из других видов растений в Arabidopsis thaliana может повышать морозоустойчивость этого растения (Chinnusamy et al., 2007). Таким образом, факторы трансрипции CBF играют центральную роль в регуляции генов во время закаливания в эволюционно различных видах растений.

се1*

ф

МАР Шптт

$ишоу1аиоп

асЫуо * **

У

- ЭОяфгакМкт

Й*

Св£?/Х)ЯГ£в1Д

4

Рис. 1 Путь передачи сигнала, в котором учавствуют 1СЕ1 и СВРЗЛЖЕВ1А (ЫзБагте а!., 2010).

Уровень транскрипции СВР начинает расти уже через 15 минут экспозиции растений при низких температурах, а экспрессия генов, регулируемая СВР/ЕЖЕ факторами, возрастает примерно через 2 часа (МаМук е1 а1., 1995). Такая скорость индукции возможна, если предположить, что имеется конститутивно экспрессирующийся транскрипционный фактор, который активируется при снижении температуры, индуцируя экспрессию СВР генов. Такой регулятор был идентифицирован и назван индуктором экспрессии СВР 1 (1СЕ1). Он расположен на шаг раньше относительно СВР генов в последовательности реакции растений на низкие температуры (СЫппиБату е1 а1., 2003). 1СЕ1 фосфорилируется под действием низких температур, связывается с

промотором CBF3 и активирует его экспрессию (Рис.1). В растениях, мутантных по icel гену, блокируется индукция CBF3 во время экспозиции при низких температурах и снижается экспрессия многих генов CBF пути, однако никаких изменений в регуляции экспрессии CBF1 и CBF2 не наблюдается. (Chinnusamy et al., 2003, 2004). В то время как ICE1 в первую очередь влияет на экспрессию CBF3/DREB1A (Chinnusamy et al., 2003), ICE2, гомолог ICE1, в основном влияет на экспрессию CBF1/DREB1B (Fursova et al., 2009). Таким образом, ICE1 и ICE2 играют ключевую роль в регуляции транскрипции CBF/DREB генов (Miura et al., 2011).

Методом ДНК-микрочипов было показано, что факторы транскрипции CBF регулируют экспрессию примерно 12% генов, реагирующих на низкие температуры (Fowler and Thomashow, 2002). Исходя из этого, можно заключить, что помимо CBF существуют и другие независимые от CBF транскрипционные факторы, регулирующие оставшуюся большую часть чувствительных к холоду генов. Это предположение подтверждается экспериментальными данными. Так, мутант Arabidopsis thaliana eskimol накапливает большое количество пролина и конститутивно морозоустойчив (Xin and Browse, 1998). В результате анализа ответа транскриптома у этого мутанта на холодовой стресс было идентифицировано 312 генов с измененной экспрессией, причем только 12 из них показали повышенную экспрессию как в eskimol, так и в трансгенных растениях Arabidopsis thaliana, сверхэкспрессирующих CBF2. Таким образом, морозоустойчивость рецесивного мутанта eskimol имеет различный молекулярный базис с адаптацией, определяемой факторами транскрипции CBF (Xin et al., 2007).

В Arabidopsis thaliana был идентифицирован фактор транскрипции -HOS9. Нокаут мутанты Arabidopsis thaliana по гену hos9 менее устойчивы к

морозу по сравнению с диким типом как до, так и после закаливания, хотя индукция СВБ генов в мутантах сходна с диким типом. Анализ экспрессии генов в мутантных растениях и в растениях дикого типа методом «гшсгоаггау» показал, что регулон Н089 отличается от регулона СДР ^Ьи е1 а1., 2004).

Дополнительно к вышесказанному, сверхэкспрессия индуцируемого холодом транскрипционного фактора МУВ4 (Я2ЯЗ-тип МУВ) в трансгенном АгаЫс1ор818 МаНапа увеличивает экспрессию СОЯ генов, уровень пролина и морозоустойчивость по СВР независимому пути (Уапшш е1 а1., 2004).

1.4.2 Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов

Помимо транскрипционной регуляции экспрессия генов регулируется на посттранскрипционном уровне с участием процессинга мРНК, регуляции стабильности мРНК, экспорта из ядра и на уровне трансляции. Недавние исследования (ТЬеосЬапз et а1., 2012) выявили, что посттранскрипционная регуляция играет важную роль в процессе закаливания растений.

1.4.2.1. Процессинг мРНК и экспорт из ядра

Сплайсинг пре-мРНК - важный этап синтеза функциональных мРНК генов, содержащих интроны. Этот процесс напрямую влияет на экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. Благодаря альтернативному сплайсингу в разные периоды развития организма или в разных тканях, а также в зависимости от изменяющихся условий внешней среды из одной пре-мРНК могут синтезироваться разные варианты зрелой мРНК, и, как следствие, разные белки. Показано, что альтернативному сплайсингу подвержены как минимум 42% генов АгаЫс1орз13 ЖаНапа, содержащих интроны (РШсИклп а1., 2010).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Таранов, Василий Васильевич, 2013 год

Список литературы

1. Елисеева И.А., Ким Е.Р., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П., Лябин

Д.Н. (2011) Y-бокс-связывающий белок (YB-1) и его функции. Успехи биол. химии 51, 65-132.

2. Колесниченко А. В., Войников В. К. (2003) Белки низкотемпературного стресса растений. Иркутск: Арт-Пресс,196 с.

3. Новикова Г.В., Мошков И.Е., Лось Д.А. (2007) Белковые сенсоры и передатчики холодового и гиперосмотического стресса у цианобактерий и растений. Молекулярная биология 41, 478-490.

4. Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю. (2006) ПНР "в реальном времени": подходы к анализу данных. Прикладная биохимия и микробиология 42, 520-528

5. Скабкин М.А., Скабкина О.В., Овчинников Л.П. (2004) Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биол. химии. 44, 3-52.

6. Трунова Т.И. (2007) Растение и низкотемпературный стресс. 64-е Тимирязевское чтение М: Наука, 54 с.

7. Abaza I., Coll О., Patalano S., Gebauer F. (2006) DrosophilaUNR is required for translational repression of male-specific lethal 2 mRNA during regulation of X-chromosome dosage compensation.Genes Dev 20, 380-9.

8. Airaki M., Leterrier M., Mateos R.M., Valderrama R., Chaki M., Barroso J.B., Del Rio L.A., Palma J.M., Corpas F.J. (2011) Metabolism of reactive oxygen species and reactive nitrogen species in pepper (Capsicum annuum L.) plants under low temperature stress. Plant Cell Environ 35,281-295.

r ■

9. Amtmann, A., H. J. Bohnert and R. A. Bressan (2005). Abiotic stress and plant genome evolution. Search for new models. Plant Physiol 138(1): 127130.

10.Baena-Gonzalez E., Gray J.C., Tyystjarvi E., Aro E.M., Maenpaa P.

(2001) Abnormal regulation of photosynthetic electron transport in a chloroplast ycf9 inactivation mutant. J Biol Chem 276, 20795-20802.

1 l.Borsani O., Zhu J., Verslues P.E., Sunkar R., Zhu J.K. (2005)

Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123, 1279-1291.

12.Boussadia O., Amiot F., Cases S., Triqueneaux G., Jacquemin-Sablon H., Dautry F. (1997). Transcription of unr (upstream of N-ras) down-modulates N-ras expression in vivo. FEBS Lett 420, 20-4.

13.Boussadia O., Niepmann M., Créancier L., Prats A.C., Dautry F., Jacquemin-Sablon H. (2003) Unr is required in vivo for efficient initiation of translation from the internal ribosome entry sites of both rhino virus and poliovirus.J Virol 77, 3353-9.

14.Bouvet P. and Wolffe A.P. ( 1994) A role for transcription and FRGY2 in masking maternal mRNA with in Xenopus oocytes. Cell 77, 931-41.

15.Brandi A., Spurio R., Gualerzi C. O. and Pon C. L. (1999) Massive presence of the Escherichia coli major cold-shock protein CspA under non-stress conditions. EMBO J. 18, 1653 - 1659.

lô.Broeze R. J., Solomon C. J. and Pope D. H. (1978) Effects of low

temperature on in vivo and in vitro protein synthesis in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens. J. Bacteriol. 134, 861-874.

17.Brown E.C., Jackson R.J. (2004) All five cold-shock domains of unr (upstream of N-ras) are required for stimulation of human rhinovirus RNA translationJ Gen Virol 85: 2279-87.

18.Carpaneto A., Ivashikina N., Levchenko V., Krol E., Jeworutzki E., Zhu J.K., Hedrich R. (2007) Cold transiently activates calcium-permeable channels in Arabidopsis mesophyll cells. Plant Physiology 143, 487-494.

19.Catala R., Santos E., Alonso J.M., Ecker J.R, Martinez-Zapater J.M., Salinas J. (2003) Mutations in the Ca 2+/H+ transporter CAX1 increase CBF/DREB1 expression and the cold-acclimation response in Arabidopsis. Plant Cell 15, 2940-2951.

20.Chaikam V., and Karlson D. (2008). Functional charac-terization of two cold shock domain proteins from Oryza sativa. Plant Cell Environ. 31, 9951006.

21.Chinnusamy V., Ohta M., Kanrar S., Lee B.H., Hong X., Agarwal M.,

Zhu J.K. (2003) ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance inArabidopsis. Genes Develop 17,1043-1054

22.Chinnusamy V., Schumaker K., Zhu J.K. (2004) Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants. J Exp Bot 55,225-236

23.Chinnusamy V., Zhu J., Zhu J.K. (2007) Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends Plant Sci 12,444-451.

24.Chinnusamy V., Zhu J.K., Sunkar R. (2010) Gene regulation during cold stress acclimation in plants. Methods Mol Biol 639,39-55

25.Clough S.J. and Bent A.F. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J, 16, 735-43.

26.Cole C.N. and Scarcelli J.J. (2006) Transport of messenger RNA from the nucleus to the cytoplasm. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 299-306.

27.Coles LS, Diamond P, Occhiodoro F, Vadas MA, Shannon MF. (1996). Cold shock domain proteins repress transcription from the GM-CSF promoter. Nucleic Acids Res 24, 2311-7

28.Deng Z., Li Y., Xia R., Wang W., Huang X., Zhang L., Zhang S., Yang C., Zhang Y., Chen M., Xie Q. (2009) Structural analysis of 83Akb genomic DNA from Thellungiella halophila: sequence features and microcolinearity between salt cress and Arabidopsis thaliana. Genomics. 94, 324-32.

29.Ding J.P. and Pickard B.G. (1993) Modulation of mechanosensitive calcium-selective cation channels by temperature. Plant Journal 3, 713—720.

30.Doherty C.J., Van Buskirk H.A., Myers S.J., Thomashow M.F. (2009) Roles for Arabidopsis CAMTA transcription factors in cold-regulated gene expression and freezing tolerance. Plant Cell 21, 972-984.

31.Dong C.H, Hu X., Tang W., Zheng X., Kim Y.S., Lee B.H., Zhu J.K. (2006) A putative Arabidopsis nucleoporin AtNUP160 is critical for RNA export and required for plant tolerance to cold stress. Mol. Cell. Biol. 26, 9533-9543.

32.Dong C.H., Agarwal M., Zhang Y., Xie Q., Zhu J.K. (2006) The negative regulator of plant cold responses, HOS1, is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 8281-8286

33.Dormoy-Raclet V, Markovits J, Malato Y, Huet S, Lagarde P, Montaudon D, Jacquemin-Sablon A, Jacquemin-Sablon H. (2007) Unr, a cytoplasmic RNA-binding protein with cold-shock domains, is involved in control of apoptosis in ES and HuH7 cells. Oncogene 26, 2595-605.

34.Dowgert M. F. and Steponkus P. L. (1984). Behavior of the plasma membrane of isolated protoplasts during a freez-thaw cycle. Plant Physiology 75, 1139-1151.

35.Du L., Poovaiah B.W. (2005) Ca2+/calmodulin is critical for brassi-nosteroid biosynthesis and plant growth. Nature 437, 741-745.

36.Duncan K., Grskovic M., Strein C., Beckmann K., Niggeweg R., Abaza I., Gebauer F., Wilm M., Hentze M.W. (2006) Sex-lethal imparts a sex-specific function to UNR by recruiting it to the msl-2 mRNA 3' UTR: translational repression for dosage compensation.Genes Dev 20, 368-79.

37.Ermolenko, D. N. and Makhatadze, G. I. (2002) Bacterial cold-shock proteins. Cell. Mol. Life Sci. 59,1902-1913

38.Evans J.R., Mitchell S.A., Spriggs K.A., Ostrowski J., Bomsztyk K., Ostarek D., Willis A.E. (2003). Members of the poly (rC) binding protein family stimulate the activity of the c-myc internal ribosome entry segment in vitro and in vivo.Oncogene 22, 8012-20.

39.Evdokimova V., Ruzanov P., Anglesio M.S., Sorokin, A.V., Ovchinnikov L.P., Buckley J., Triche T.J., Sonenberg N., Sorensen P.H.B. (2006) Mol. Cell. Biol., 26, 277-292.

40.Evdokimova V., Tognon C., Ng T., Ruzanov P., Melnyk N., Fink D., Sorokin A., Ovchinnikov L.P., Davicioni E., Triche T.J., Sorensen P.H. (2009) Translational activation of snail 1 and other developmentally regulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesenchymal transition. Cancer Cell 15, 402-15.

41.Evdokimova V.M., Kovrigina E.A., Nashchekin D.V., Davydova E.K., Hershey J.W., Ovchinnikov L.P. (1998) The major core protein of messenger ribonucleoprotein particles (p50) promotes initiation of protein biosynthesis in vitro.J Biol Chem 273, 3574-81.

42.Ferrer N., Garcia-Espana A., Jeffers M., Pellicer A. (1999). The unr gene: evolutionary considerations and nucleic acid-binding properties of its long isoform product. DNA Cell Biol 18, 209-18.

43.FiIichkin S.A., Priest H.D., Givan S.A., Shen R., Bryant D.W., Fox S.E., Wong W.K., Mockler T.C. (2010) Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Genome Res. 20,45-58.

44.Fowler S. and Thomashow M.F. (2002) Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell 14,1675-1690

45.Fujii, S., Nakasone, K. and Horikoshi, K. (1999) Cloning of two cold shock genes, cspA and cspG, from the deep-sea psychrophilic bacterium Shewanella violaceastrain DSS12. FEMS Microbiol. Lett. 178, 123 - 128

46.Fursova O.V., Pogorelko G.V., Tarasov V.A. (2009) Identification of ICE2, a gene involved in cold acclimation which determines freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. Gene 429, 98-103

47.Fusaro A. F., Bocca S. N., Ramos R. L., Barroco R. M., Magioli C., Jorge V. C., Coutinho T. C., Rangel-Lima C. M., De Rycke R., Inze D., Engler G., Sachetto-Martins G. (2007). AtGRP2, a cold-induced nucleo-cytoplasmic RNA-binding protein, has a role in flower and seed development. Plantan225, 1339-1351.

48.Gechev T., Willekens H., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W., Toneva V, Minkov I. (2003) Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress. J Plant Physiol 160, 509-515.

49.Gilmour S.J., Zarka D.G., Stockinger E.J., Salazar M.P., Houghton J.M., Thomashow M.F. (1998). Low temperature regulation of the

Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold induced COR gene expression. Plant J. 16, 433-442.

50.Giuliodori A. M. (2010) The cspA mRNA is a thermosensor that modulates translation of the cold-shock protein CspA. Mol. Cell 37, 21-33

51.Giuliodori, A. M., Brandi, A., Gualerzi, C. O. and Pon, C. L. (2004) Preferential translation of cold-shock mRNAs during cold adaptation. RNA 10, 265-276.

52.Goldstein, J., Pollitt, N. S., Inouye, M. (1990) Major cold shock protein of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 283 - 287.

53.Gong Z., Lee H., Xiong L., Jagendorf A., Stevenson B., Zhu J.K. (2002) RNA helicase-like protein as an early regulator of transcription factors for plant chilling and freezing tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 11507-11512.

54.Goulas E., Schubert M., Kieselbach T., Kleczkowski L.A., Gardestrom P., Schroder W., Hurry V. (2006) The chloroplast lumen and stromal proteomes of Arabidopsis thaliana show differential sensitivity to short- and long-term exposure to low temperature. Plant J 47, 720-734.

55.Guo Y, Chen Y, Ito H, Watanabe A, Ge X, Kodama T, Aburatani H. (2006) Identification and characterization of lin-28 homolog B (LIN28B) in human hepatocellular carcinoma. Gene, 384, 51-61.

56.Gusta L.V., Wisniewski M., Nesbitt N.T., Gusta M.L. (2004).The effect of water, sugars, and proteins on the pattern of ice nucleation and propagation in acclimated and non-acclimated canola leaves. Plant Physiol. 135, 1642-1653.

57.Hanahan D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids". Journal of Molecular Biology 166 (4), 557-580.

58.Heo I., Joo C., Cho J., Ha M., Han J., Kim V.N. Lin28 mediates the terminal uridylation of let-7 precursor MicroRNA. Mol Cell 2008, 32,276284.

59.Hofweber, R., Horn, G., Langmann, T., Balbach, J., Kremer, W., Schmitz, G. and Kalbitzer, H. R. (2005) The influence of cold shockproteins on transcription and translation studied in cell-free model systems. FEBS J. 272, 4691 -4702.

60.Horn G., Hofweber R., Kremer W., Kalbitzer H.R. (2007) Structure and function of bacterial cold shock proteins. Cell Mol Life Sci.. 64(12), 145770.

61.1ida K, Seki M, Sakurai T, Satou M, Akiyama K, Toyoda T, Konagaya A, Shinozaki K. (2004) Genome-wide analysis of alternative pre-mRNA splicing in Arabidopsis thaliana based on full-length cDNA sequences. Nucleic Acids Res. 32(17), 5096-103.

62.1nan G., Zhang Q., Li P., Wang Z., Cao Z., Zhang H., Zhang C., Quist T.M., Goodwin S.M., Zhu J., Shi H., Damsz B., Charbaji T., Gong Q., Ma S., Fredricksen M., Galbraith D.W., Jenks M.A., Rhodes D., Hasegawa P.M., Bohnert H.J., Joly R.J., Bressan R.A., Zhu J.K. (2004). Salt cress. A halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135(3), 1718-1737.

63.Jacquemin-Sablon H., Triqueneaux G., Deschamps S., le Maire M., Doniger J., Dautry F. (1994) Nucleic acid binding and intracellular localization of unr, a protein with five cold shock domains. Nucleic Acids Res. 22, 2643-50.

64.Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. (1998) Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science 280,104-6

65.Jiang W., Hou Y., Inouye M. (1997) CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone. J. Biol. Chem. 272, 196-202.

66. Jones P. G. and Inouye M. (1996) RbfA, a 30S ribosomal binding factor, is a cold-shock protein whose absence triggers the cold-shock response. Mol. Microbiol. 21, 1207-1218.

67. Jones P. G., VanBogelen R. A. and Neidhardt F. C. (1987) Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli. J Bacteriol. 169, 2092-2095.

68. Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P., Bartel B. (2006) MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 19-53.

69.Karlson D. and Imai R. (2003) Conservation of the cold shock domain protein family in plants. Plant Physiol. 131, 12-15.

70.Karlson, D., Nakaminami, K., Toyomasu, T., and Imai, R. (2002). A cold-regulated nucleic acid-binding protein of winter wheat shares a domain with bacterial cold shock proteins. J. Biol. Chem. 277, 35248-35256.

71.Kim J.S., Park S.J., Kwak K.J., Kim Y.O., Kim J.Y., Song J., Jang B., Jung C.H., Kang H. (2007) Cold shock domain proteins and glycineArich RNA binding proteins from Arabidopsis thaliana can promote the cold adaptation process in Escherichia coli. Nucl. Acids Res. 35, 506-516.

72.Kim M.H., Sonoda Y., Sasaki K., Kaminaka H., Imai R., (2013) Interactome analysis reveals versatile functions of Arabidopsis COLD SHOCK DOMAIN PROTEIN 3 in RNA processing within the nucleus and cytoplasm. Cell Stress Chaperones. 18(4), 517-25.

73.Kim, J. S., Jung, H. J., Lee, H. J., Kim, K. A., Goh, C. H., Woo, Y., Oh, S. H., Han, Y. S., and Kang, H. (2008). Glycine-rich RNA-binding protein 7 affects abiotic stress responses by regulating stomata opening and closing in Arabidopsis thaliana.V\mi J. 55, 455^66.

74.Kim, M. H., Sasaki, K., Imai, R. (2009). Cold shock domain protein 3 regulates freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 284, 23454-23460.

75.Knight M.R. and Knight H. (2012) Low-temperature perception leading to gene expression and cold tolerance in higher plants. 195(4),737-51.

76.Kohno K, Izumi H, Uchiumi T, Ashizuka M, Kuwano M. (2003) The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-l.Bioessays 25, 691-8.

77.Koiwa H., Barb A.W., Xiong L., Li F., McCully M.G., Lee B.H., Sokolchik I., Zhu J., Gong Z., Reddy M., Sharkhuu A., Manabe Y., Yokoi S., Zhu J.K., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (2002) C-terminal domain phosphatase-like family members (AtCPLs) differentially regulate Arabidopsis thaliana abiotic stress signaling, growth, and development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 10893-10898.

78.Krol M., Ivanov A.G., Jansson S., Kloppstech K., Huner N.P. (1999) Greening under high light or cold temperature affects the level of xanthophyll-cycle pigments, early light-inducible proteins, and light-harvesting polypeptides in wild-type barley and the Chlorina f2 mutant. Plant Physiol 120, 193-204.

79.Kunst F.,Ogasawara N.,Moszer I., Albertini A.M., Alloni G., Azevedo V., Bertero, M.G., Bessieres P., Bolotin A., Borchert S. et al., (1997) The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390, 249-256.

80.Lam E, Chua NH. (1987) Chloroplast DNA gyrase and in vitro regulation of transcription by template topology and novobiocin. Plant Mol Biol, 8(5), 415-24

81.Lee H., Xiong L., Gong Z., Ishitani M., Stevenson B., Zhu J.K. (2001) The Arabidopsis HOS1 gene negatively regulates cold signal transduction and encodes a RING finger protein that displays cold-regulated nucleo-cytoplasmic partitioning. Genes Dev. 15, 912-924.

82.Lee, S. J., Xie, A., Jiang,W., Etchegaray, J. P., Jones, P. G. and Inouye, M. (1994) Family of the major cold-shock protein, CspA (CS7.4), of Escherichia coli, whose members show a high sequence similarity with the eukaryotic Y-box binding proteins. Mol. Microbiol. 11, 833 - 839.

83.Lissarre M., Ohta M., Sato A., Miura K. (2010) Cold-responsive gene regulation during cold acclimation in plants. Plant signaling and behaviour 5(8), 948-52.

84.Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. (1998). Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low temperature responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell. 10, 1391-1406.

85.Los D.A. (2004) The effect of low-temperature-induced DNA supercoiling on the expression of the desaturase genes in synechocystis. Cell Mol Biol 50(5), 605-12.

86.Los D.A. and Murata N. (2000) Regulation of enzymatic activity and gene expression by membrane fluidity. Sci STKE. 62, pel.

87.MastrangeIo A.M., Belloni S., Barilli S., Reperti B., Di Fonzo N., Stanca A.M., Cattivelli L., (2005) Low temperature promotes intron retention in two e-cor genes of durum wheat. Planta, 221, 705-715.

88.Mastrangelo A.M., Belloni S., Barilli S., Ruperti B., Di Fonzo N., Stanca A.M., Matsumoto K. and Wolffe A.P. (1998) Gene regulation by Y-box proteins: coupling control of transcription and translation.Trends Cell Biol 8, 318-323.

89.Matsumoto K, Wolffe AP. (1998) Gene regulation by Y-box proteins: coupling control of transcription and translation. Trends Cell Biol. 8(8):318-23.

90.Matsumoto K., Tanaka K.J., Aoki K., Sameshima M., Tsujimoto M.

(2003) Visualization of the reconstituted FRGY2-mRNA complexes by electron microscopy. Bio-chem Biophys Res Commun 306, 53-8.

91.Mazars C., Thion L., Thuleau P., Graziana A., Knight M.R., Moreau M., Ranjeva R. (1997) Organization of cytoskeleton controls the changes in cytosolic calcium of cold-shocked Nicotiana plumbaginifolia protoplasts. Cell Calcium 22, 413-420.

92.Mikami K., Kanesaki Y., Suzuki I., Murata N. (2002) The histidine kinase Hik33 perceives osmotic stress and cold stress in Synechocystis sp PCC 6803. Molecular Microbiology 46, 905-915.

93.Minorsky P.V. and Spanswick R.M. (1989) Electrophysiological evidence for a role for calcium in temperature sensing by roots of cucumber seedlings.Plant, Cell and Environment 12, 137-143.

94.Mitchell S.A., Brown E.C., Coldwell M.J., Jackson R.J., Willis A.E. (2001). Protein factor require-ments of the Apaf-1 internal ribosome entry segment: roles of polypyr-imidine tract binding protein and upstream of N-ras. Mol Cell Biol 21, 3364-74.

95.Miura K., Jin J.B., Lee J., Yoo C.Y., Stirm V., Miura T., Ashworth E.N., Bressan R.A., Yun D.J., Hasegawa P.M. (2007) SIZ1-mediated

sumoylation of ICE 1 controls CBF3/DREB1A expression and freezing tolerance mArabidopsis. Plant Cell 19, 1403-1414

96.Miura K., Ohta M., Nakazawa M., Ono M., Hasegawa P.M. (2011) ICE1 Ser403 is necessary for protein stabilization and regulation of cold signaling and tolerance. Plant J 67, 269-279

97.Muller P.Y., Janovjak H., Miserez A.R., Dobbie Z. (2002) Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques, 32(6), 1372-4, 1376, 1378-9.

98.Murata N. and Los D.A. (1997) Membrane fluidity and temperature perception. Plant Physiology 115, 875-879.

99.Nakaminami K., Hill K., Perry S. E., Sentoku N., Long J.A., Karlson D.T. (2009). Arabidopsis cold shock domain proteins: relationships to floral and silique development. J. Exp. Bot. 60, 1047—1062.

100. Nakaminami K., Karlson D. T., Imai R. (2006). Functional conservation of cold shock domains in bacteria and higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103,10122-10127.

101. Nakaminami K., Sasaki K., Kajita S., Takeda H., Karlson D., Ohgi K., Imai R. (2005). Heat stable ssDNA/RNA-binding activity of a wheat cold shock domain protein. FEBS Lett. 579, 4887-4891.

102. Nakashima K., Kanamaru K., Mizuno T. and Horikoshi K. (1996) A novel member of the cspA family of genes that is induced by cold shock in Escherichia coli. Bacteriology 178, 2994 - 2997.

103. Nam Y., Chen C., Gregory R.I., Chou J.J., Sliz P. (2011) Molecular basis for interaction of let-7 microRNAs with Lin28. Cell 147, 10801091

104. Neill S.J., Desikan R., Clarke A., Hurst R.D., Hancock J.T. (2002) Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants. J Exp Bot 53, 1237-1247.

105. Nekrasov M.P., Ivshina M.P., Chernov K.G., Kovrigina E.A., Evdokimova V.M., Thomas A.A., Hershey J.W., Ovchinnikov L.P. (2003) The mRNA-binding protein YB-1 (p50) prevents association of the eukaryotic initiation factor eIF4G with mRNA and inhibits protein synthesis at the initiation stage. J Biol Chem 278, 13936-43

106. Newman M.A., Thomson J.M., Hammond S.M. (2008) Lin-28 interaction with the Let-7 precursor loop mediates regulated microRNA processing. RNA. 14, 1539-1549.

107. Oh D.H., Dassanayake M., Haas J.S., Kropornika A., Wright C., d'Urzo M.P., Hong H., Ali S., Hernandez A., Lambert G.M., Inan G., Galbraith D.W., Bressan R.A., Yun D.J., Zhu J.K., Cheeseman J.M., Bohnert H.J. (2010). Genome structures and halophyte-specific gene expression of the extremophile Thellungiella parvula in comparison with Thellungiella salsuginea {Thellungiella halophila) and Arabidopsis. Plant Physiol 154(3), 1040-1052.

108. Orvar B.L., Sangwan V., Omann F., Dhindsa R.S. (2000) Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity. Plant J 23, 785-794.

109. Park S. J., Kwak K. J., Oh T. R., Kim Y. O., Kang H. (2009) Cold shock domain proteins affect seed germination and growth of Arabidopsis thaliana under abiotic stress conditions. PlantCell Physiol. 50, 869-878.

110. Parry G., Ward S., Cernac A., Dharmasiri S., Estelle M. (2006) The Arabidopsis suppressor of auxin resistance proteins are nucleoporins with an

important role in hormone signaling and development. Plant Cell 18, 15901603.

111. Patalano S., Mihailovich M., Belacortu Y., Paricio N., Gebauer F.

(2009). Dual sex-specific functions of Drosophilaupstream of N-ras in the control of X chromosome dosage compensation.Development 136, 689-98.

112. Peng S., Chen L.L., Lei X.X., Yang L., Lin H., Carmichael G.G., Huang Y. (2011) Genome-wide studies reveal that Lin28 enhances the translation of genes important for growth and survival of human embryonic stem cells. Stem Cells. Mar; 29(3), 496-504.

113. Phadtare S. (2011) Unwinding activity of cold shock proteins and RNA metabolism. RNA Biol. 8, 394-397

114. Pisarev A.V., Skabkin M.A., Thomas A.A., Merrick W.C., Ovchinnikov L.P., Shatsky I.N. (2002). Positive and negative effects of the major mammalian messenger ribonucleoprotein p50 on binding of 40S ribosomal subunits to the initiation codon of beta-globin mRNA. J Biol Chem 277, 15445-154451.

115. Piskounova E., Viswanathan S.R., Janas M., LaPierre R.J., Daley G.Q., Sliz P., Gregory R.I. (2008) Determinants of microRNA processing inhibition by the develop-mentally regulated RNA-binding protein Lin28.J Biol Chem. 283,21310-21314.

116. Plieth C. (1999) Temperature sensing by plants: calcium-permeable channels as primary sensors - a model. Journal of Membrane Biology 172,121-127

117. Polesskaya A., Cuvellier S., Naguibneva I., Duquet A., Moss E.G., Harel-Bellan A. Lin-28 binds IGF-2 mRNA and participates in skeletal myogenesis by increasing translation efficiency. Genes Dev 2007, 21,1125— 1138.

118. Provart N.J., Gil P., Chen W., Han B., Chang H.S., Wang X., Zhu T.

(2003) Gene expression phenotypes of Arabidopsis associated with sensitivity to low temperatures. Plant Physiol 132(2),893-906.

119. Ruelland E. and Zachowski A. (2010) How plants sense temperature. Environ Exp Bot. 69,225-232.

120. Ruelland E., Vaultier M., Zachowski A., Hurry V. (2009) Cold signalling and cold acclimation in plants. Adv. Bot. Res. 49, 36-150.

121. Rybak A., Fuchs H., Smirnova L., Brandt C., Pohl E.E., Nitsch R., Wulczyn F.G. (2008) A feedback loop comprising lin-28 and let-7 controls pre-let-7 maturation dur-ing neural stem-cell commitment. Nat Cell Biol. 10,987-993.

122. Sanan-Mishra N., Pham X.H., Sopory S.K., Tuteja N. (2005) Pea DNA helicase 45 overexpression in tobacco confers high salinity tolerance without affecting yield. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 509-514.

123. Sanders D., Pelloux J., Brownlee C., Harper J.F. (2002) Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell 14(Suppl), S401-S417.

124. Sangwan V., Foulds I., Singh J., Dhindsa R.S. (2001) Cold-activation of Brassica napus BN115 promoter is mediated by structural changes in membranes and cytoskeleton, and requires Ca2+ influx. Plant J 27,1-12

125. Sangwan V., Orvar B.L., Beyerly J., Hirt H., Dhindsa R.S. (2002) Opposite changes in membrane fluidity mimic cold and heat stress activation of distinct plant MAP kinase pathways. Plant J 31,629-638.

126. Sasaki K. and Imai R. (2012) Pleiotropic roles of cold shock domain proteins in plants. 2,116.

127. Sasaki K., Kim M. H., and Imai R. (2007) Arabidopsis COLD SHOCK DOMAIN PROTEIN2 is a RNA chaperone that is regulated by cold and developmental signals. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 633-638.

a

128. Sasaki K., Kim M.H., Imai R. (2013) Arabidopsis COLD SHOCK DOMAIN PROTEIN 2 is a negative regulator of cold acclimation. New Phytol. 198(1), 95-102.

129. Smallwood M., Bowles D.J. (2002) Plants in a cold climate. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 357, 831-846.

130. Sunkar R. and Zhu J.K. (2004) Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell 16, 2001-2019.

131. Sunkar R., Kapoor A., Zhu J.K. (2006) Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by down regulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell 18,2051-2065.

132. Suzuki N., Koussevitzky S., Mittler R., Miller G. (2011) ROS and redox signaling in the response of plants to abiotic stress. Plant Cell Environ 35,259-270

133. Taji, T., M. Seki, M. Satou, T. Sakurai, M. Kobayashi, K. Ishiyama, Y. Narusaka, M. Narusaka, J. K. Zhu and K. Shinozaki (2004). Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-YQlated halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiol 135(3), 1697-1709.

134. Theocharis A., Clément C., Barka E.A. (2012) Physiological and molecular changes in plants grown at low temperatures. Planta. 235(6), 1091105.

135. Thornton J.E., Gregory R.I. (2012) How does Lin28 let-7 control development and disease? 22(9), 474-82.

136. Tinton S.A., Schepens B., Bruynooghe Y., Beyaert R., Cornelis S. (2005) Regulation of the cell-cycle-dependent internal ribosome entry site of the PITSLRE protein kinase, roles of Unr (upstream of N-ras) protein and

phosphorylated translation initiation factor eIF-2 alpha. Biochem J 385, 155-63.

137. Triqueneaux G., Velten M., Franzon P., Dautry F., Jacquemin-Sablon

H. (1999). RNA binding specificity of Unr, a protein with five cold shock domains. Nucleic Acids Res 27, 1926-34.

138. Uemura M., Steponkus P.L. (1999) Cold acclimation in plants: relationship between the lipid composition and the cryostability of the plasma membrane. J Plant Res 112, 245-254.

139. Ulrich H.D. (2005) Mutual interactions between the SUMO and ubiquitin systems: A plea of no contest. Trends Cell Biol. 15, 525-532

140. Vannini C., Locatelli F., Bracale M., Magnani E., Marsoni M., Osnato M., Mattana M., Baldoni E., Coraggio I. (2004) Overexpression of the rice Osmyb4 gene increases chilling and freezing tolerance of Arabidopsis thaliana plants. Plant J. 37, 115-127.

141. Viswanathan S.R, Daley G.Q., Gregory R.I. Selective blockade of MicroRNA processing by Lin-28.Science 2008. 320, 97-100.

142. Viswanathan S.R., Powers J.T., Einhorn W., Hoshida Y., Ng T.L., Toffanin S., O'Sullivan M., Lu J., Phillips L.A., Lockhart V.L., Shah S.P., Tanwar P.S., Mermel C.H., Beroukhim R., Azam M., Teixeira J., Meyerson M., Hughes T.P., Llovet J.M., Radich J., Mullighan C.G., Golub T.R., Sorensen P.H., Daley G.Q. (2009) Lin28 promotes transformation and is associated with advanced human malignancies. Nat. Genet. 41,843-848

143. Vogg G., Heim R., Gotschy B., Beck E., Hansen J. (1998) Frost hardening and photosynthetic performance of Scots pine (Pinus sylvestris L.). II. Seasonal changes in the fluidity of thylakoid membranes. Planta 204,201206.

f

144. Wang N., Yamanaka K. and Inouye M. (1999) Cspl, the ninth member of the CspA family ofEscherichia coli,is induced upon cold shock. J. Bacteriol. 181, 1603-1609.

145. White P.J. (2009) Depolarization-activated calcium channels shape the calcium signatures induced by low-temperature stress.New Phytologist 183, 6-8.

146. Wilbert M.L., Huelga S.C., Kapeli K., Stark T.J., Liang T.Y., Chen S.X., Yan B.Y., Nathanson J.L., Hutt K.R., Lovci M.T., Kazan H., Vu A.Q., Massirer K.B., Morris Q., Hoon S., Yeo G.W. (2012) LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Mol Cell. 48(2), 195-206.

147. Willimsky, G., Bang, H., Fischer, G. and Marahiel, M. A. (1992) Characterization of cspB, aBacillus subtilis inducible cold shock gene affecting cell viability at low temperatures. J. Bacteriol. 174, 6326 - 6335

148. Wong C.E, Li Y., Labbe A., Guevara D., Nuin P., Whitty B., Diaz C., Golding G.B., Gray G.R., Weretilnyk E.A., Griffith M., Moffatt B.A. (2006). Transcriptional profiling implicates novel interactions between abiotic stress and hormonal responses in Thellungiella, a close relative of Arabidopsis. Plant Physiol 140(4), 1437-1450.

149. Xin Z. and Browse J. (1998) eskimol mutants of Arabidopsis are constitutively freezing tolerant. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 77997804

150. Xin Z., Browse J. (2000) Cold comfort farm: the acclimation of plants to freezing temperatures. Plant Cell Environ 23,893-902.

151. Xin Z., Mandaokar A., Chen J., Last R.L., Browse J. (2007) Arabidopsis ESK1 encodes a novel regulator of freezing tolerance. Plant J. 49(5),786-99.

152. Xiong L., Lee H., Ishitani M., Tanaka Y., Stevenson B., Koiwa H., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Zhu J.K. (2002) Repression of stress-responsive genes by FIERY2, a novel transcriptional regulator in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 10899-10904.

153. Xu B., Zhang K., Huang Y. (2009) Lin28 modulates cell growth and associates with a subset of cell cycle regulator mRNAs in mouse embryonic stem cells. RNA. 15,357-361.

154. Xue G.P. (2003) The DNA-binding activity of an AP2 transcriptional activator HvCBF2 involved in regulation of low-temperature responsive genes in barley is modulated by temperature. Plant J. 33(2),373-83.

155. Yamanaka K, Mitta M, Inouye M. (1999) Mutation analysis of the 5' untranslated region of the cold shock cspA mRNA of Escherichia coli. J Bacteriol. 181(20), 6284-91.

156. Yamanaka K. and Inouye M. (1997) Growth-phase-dependent expression of cspD, encoding a member of the CspA family in Escherichia coli .J. Bacteriol. 179, 5126 - 5130.

157. Yamanaka K., Mitani T., Ogura T., Niki H., Hiraga S. (1994) Cloning, sequencing, and characterization of multi-copy suppressors of amuk B mutation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 13, 301 — 312.

158. Yang, Y., and Karlson, D. T. (2011). Overexpression of AtCSP4 affects late stages of embryo development in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 62, 20792091.

159. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J., Jonsdottir G.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin I.I., Thomson J.A. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920

160. Zhang X., Henriques R., Lin S.S., Niu Q.W., Chua N.H. (2006) Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc, 1(2), 641-6.

161. Zhu J., Shi H., Lee B.H., Damsz B., Cheng S., Stirm V., Zhu J.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. (2004) An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9873-9878

162. Zhu J.H., Dong C.H., Zhu J.K. (2007) Interplay between cold-responsive gene regulation, metabolism and RNA processing during plant cold acclimation. Curr Opin Plant Biol, 10, 290-295.

163. Zimmermann P., Hirsch-Hoffmann M., Hennig L., Gruissem W. (2004) GENEVESTIGATOR. Arabidopsis microarray database and analysis toolbox. Plant Physiol., 136, 2621-2632.

164. Zuther E., Schulz E., Childs L.H., Hincha D.K. (2012) Clinal variation in the non-acclimated and cold-acclimated freezing tolerance of Arabidopsis thaliana accessions. Plant Cell Environ. 35(10),1860-78.