Анализ механизмов действия стрессовых факторов на функционирование ферментов метаболизма 2-оксоглутарата в листьях кукурузы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Анохина Галина Борисовна

• Анохина Галина Борисовна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Анохина Галина Борисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика ферментов, участвующих в метаболизме 2ОГ

1ЛЛСтруктурно-функциональные особенности 2ОГДК

1.1.1.1 Структурно-функциональные особенности функционирования 2-оксоглутаратдегидрогеназы

1.1.1.2. Структура дигидролипоамидсукцинилтрансферазы и ее роль в клетке

1.1.1.3 Структурно- функциональные особенности липоамиддегидрогеназы21

1.1.1.4. Биохимические аспекты функционирования 2ОГДК

1.1.1.5. Молекулярно-генетические особенности функционирования 2ОГДК

1.1.2. Структурно-функциональная характеристика ГДГ

1.1.2.1. Кинетические свойства ГДГ

1.1.2.2. Молекулярно-генетические аспекты функционирования ГДГ

1.1.3. Структурно-функциональная характеристика ОД

1.2. Роль 2ОГ в адаптивной реакции клеточного метаболизма к действию различных стрессовых факторов

1.2.1. Влияние стрессоров различной природы на метаболизм растений

1.2.1.1. Влияние солевого стресса на метаболизм растений

1.2.1.2. Влияние светового режима на метаболизм растений

1.2.1.3. Влияние низких концентраций кислорода на метаболизм растительной клетки

Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ

2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Объекты исследования

2.2.2 Методы исследования

2.2.2.1 Постановка эксперимента по индукции солевого стресса

2.2.2.2 Постановка эксперимента по влиянию света различных длин волн

2

2.2.2.3 Постановка эксперимента по действию гипоксии

2.2.2.4 Обработка рутением красным и ЭГТА

2.2.2.5. Выделение энзимов

2.2.2.5.1. Изоплотностное центрифугирование

2.2.2.5.2 Выделение митохондрий

2.2.2.6. Определение активности энзимов

2.2.2.6.1. Определение активности 2ОГДК

2.2.2.6.2. Определение активности ГДГ

2.2.2.6.3. Определение активности ОД

2.2.2.7. Схема очистки ГДГ

2.2.2.8. Определение концентрации белка

2.2.2.9. Электрофоретическое исследование белков

2.2.2.9.1. Неденатурирующий электрофорез в ПААГ

2.2.2.9.2. Денатурирующий электрофорез в ПААГ

2.2.2.9.3. Окрашивание белков на гомогенность

2.2.2.9.4. Специфическое проявление белков

2.2.2.9.4.1. Специфическое проявление 2ОГДГ

2.2.2.9.4.2. Специфическое проявление ГДГ

2.2.2.10. Определение молекулярной массы нативного белка

2.2.2.11. Исследование кинетических характеристик регуляции активности ферментов

2.2.2.13. Количественный анализ пролина

2.2.2.14. Выделение ДНК

2.2.2.15. Конверсия ДНК бисульфитом натрия

2.2.2.16. Выделение РНК

2.2.2.17. Электрофорез в агарозном геле

2.2.2.18. Реакция обратной транскрипции

2.2.2.19. Полимеразная цепная реакция

2.2.2.20. Анализ промоторной области генов на наличие СрО-островков

2.2.2.21. Проведение метил-специфичной ПЦР

2.2.2. 22. Бисульфитное секвенирование

3

2.2.2.23. Статистическая обработка данных

Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние солевого стресса на функционирование ферментов, участвующих в метаболизме 2ОГ

1. 1. Изменение содержание пролина при действии солевого стресса

1.2. Влияние солевого стресса на функционирование 2ОГДК

1.2.1. Субклеточная локализация 2ОГДК

1.2.2. Изоферментный состав 2ОГДК

1.2.3 Изменение активности 2ОГДК

1.2.4.Изменение экспрессионной активности генов ферментов 2ОГДК

1. 2. 2. 4. 1. Изменение экспресии генов 2ОГДГ

1. 2. 2.4.1.1. Анализ промоторов генов 2ОГДГ на наличие CpG-островков

1. 2. 2.4.1.2. Динамика изменения степени метилирования отдельных СpG-динуклеотидов в составе промоторов

1. 2.2.4.2. Изменение экспрессии генов ДЛСТ

1. 2.2.4.3. Изменение экспресии генов ДЛД

1. 3. Влияние солевого стресса на функционирование ГДГ

1.3.1. Субклеточная локализация ГДГ

1.3.2. Очистка ГДГ

1.3.3. Определение оптимума работы полученных препаратов ГДГ

1.3.4. Определение сродства полученных препаратов ГДГ к субстратам

1.3.5. Влияние солевого стресса на каталитическую активность ГДГ

1.3.6. Изоферментный состав ГДГ в условиях солевого стресса

1.3.7. Изменение экспрессионной активности генов ГДГ в условиях действия солевого стресса

1.4. Влияние солевого стресса на функционирование ССАДГ

1.4.1. Изменение экспрессионной активность генов ССАДГ

1.5. Влияние солевого стресса на функционирование ОД

1. 5. 1. Субклеточная локализация ОД

1.5.2. Изменение активности ОД в листьях кукурузы в условиях действия солевого стресса

1.5.3. Влияние солевого стресса на экспрессию генов ОД

1.6. Изменения метаболизма 2ОГ в условиях солевого стресса

Влияние света различного спектрального состава на функционирование ферментов, участвующих в метаболизме 2ОГ

2.1. Влияние света различного спектрального состава на функционирование 2ОГДК

2.1.1. Влияние света различного спектрального состава на активность 2ОГДК

2.1.1. Влияние света различной длинны волны на экспрессию 2ОГДГ

2.1.1.1. Влияние различной длинны волны на экспрессию генов 2ОГДГ в листьях кукурузы

2.1.1.2. Влияние света различной длинны волны на экспрессию генов 2ОГДГ А. МаНапа

2.1.2. Изменение степени метилирования СрО- динуклеотидов в составе промоторов генов

2.2. Влияние света различного спектрального состава на функционирование ГДГ

2.2.1. Влияние света различного спектрального состава на активность ГДГ

2.2.2. Влияние света различного спектрального состава на изоферментный состав ГДГ

2.2.3. Влияние света различного спектрального состава на транскрипцию генов ГДГ

2.2.4. Влияние света различного спектрального состава на функционирование ГДГ при обработке рутением красным и ЭГТА

2.3. Влияние света различной длинны волны на функционирование ССАДГ

2.3.1. Влияние света различной длинны волны на транскрипцию генов ССАДГ

2.4. Влияние света различной длинны волны на функционирование ОД

2.4.1. Влияние света различной длинны волны на каталитическую активность ОД

2.4.2. Влияние светового спектра на транскрипцию генов ОД

2.5. Изменения метаболизма 2ОГ при облучении светом различного спектрального состава

3. Влияние гипоксии на функционирование ферментов, участвующих в метаболизме 2ОГ

3.1. Влияние гипоксии на функционирование 2ОГДК

3.1.1. Влияние гипоксии на активность 2ОГДК

3.1.2. Влияние гипоксии на транскрипцию генов 2ОГДГ

3.2. Влияние гипоксии на функционирование ГДГ

3.2.1. Влияние гипоксии на активность ГДГ

3.2.2. Влияние гипоксии на экспрессию генов ГДГ

3.3. Влияние гипоксии на функционирование ССАДГ

3.3.1. Влияние гипоксии на экспрессию генов ССАДГ

3.4. Влияние гипоксии на функционирование ОД

3.4.1. Влияние гипоксии на активность ОД

3.4.2. Влияние гипоксии на экспрессию генов ОД

3.5. Изменения метаболизма 2ОГ в условиях дефицита кислорода

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2-ОГ - 2-оксоглутарат;

- электрофоретическая подвижность белка; АБК - абсцизовая кислота; АДФ -аденозиндифосфат;

АРБЦ - аминокислоты с разветвленными боковыми цепями;

АТФ - аденозинтрифосфат;

АФК - активные формы кислорода;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

БФС - бромфеноловый синий;

ГАД - глутаматкарбоксилаза;

ГАМК-у-Аминомасляная кислота;

ГАМК-Т - ГАМК-трансаминаза;

ГМК -у-гидроксимаслянная кислота;

ГОГАТ -глутамин-2-оксоглутаратаминотрансфераза;

ГС - глутаматсинтаза;

ГТФ -гуанозинтрифосфат;

ДКС - дальний красный свет;

ДТТ - дитиотреитол;

КС - красный свет;

мРНК - матричная РНК;

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид (окисленный);

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный);

НСТ- нитросиний тетразолий;

ОЦ - оксицитрат, гидроксицитрат;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПВП- Поливинилпирролидон;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

СДС - додецилсульфат натрия;

СС - синий свет;

ССА - сукциниловый семиальдегид или полуальдегид янтарной кислоты;

ТДФ - тиаминдифосфат;

ТРИС - трис(гидроксиметил)аминометан;

ФАД - флавинадениннуклеотид;

ФМС - феназинметасульфат;

ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид;

ЦТК -цикл трикарбоновых кислот;

ЭГТА- этиленгуанинтетраацетат;

ЭДТА - этилендиаминтетроацетат;

ЭТЦ - электрон транспортная цепь;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ механизмов действия стрессовых факторов на функционирование ферментов метаболизма 2-оксоглутарата в листьях кукурузы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В настоящее время биологические науки большое внимание уделяют исследованиям адаптивных процессов в клетках как животных, так и растений. Изменения условий среды, в которых обитает тот или иной организм, выход за границы оптимальных значений показателей приводит к ответу на различных уровнях организации живого: начиная от ответа на уровне генома и заканчивая изменением численности популяции. Стоит отметить, что абиотические стрессовые факторы всегда вызывали интерес среди исследователей, так как они являются естественными и, как правило, регулярными стрессорами, воздействиям которых подвергаются, в том числе, и растительные организмы. В виду особенностей образа жизни, растения наиболее сильно подвержены влиянию абиотических стрессов: невозможность смены места обитания при засолении, затоплении, засухе и т.п. привела к появлению действенных, четко скоординированных и узко-регулируемых механизмов адаптации к изменяющимся условиям среды.

Метаболические пути обеспечивают клетку энергией и субстратами для осуществления различных биохимических процессов. Регуляция работы ферментов ключевых метаболических путей способствует быстрому клеточному ответу на любое внешнее воздействие, в том числе и на действие стрессовых факторов.

Процесс дыхания представляет собой совокупность четырёх взаимозависимых и взаимодополняющих друг друга метаболических процессов: гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, электрон-транспортная цепь митохондрий и собственно фосфорилирование, осуществляемое за счет процессов окисления внутри митохондриальной мембраны[186]. Синтез энергии в виде АТФ непосредственно связан с митохондриями, также как и синтез многих других соединений, таких как кофакторы, витамины, аминокислоты, а также различные метаболиты, осуществляющие важную роль в росте и развитии клетки, а также обеспечивающие передачу

различных сигналов как в клетку, так и в ядро[29, 135]. Метаболизм митохондрий обеспечивает клетку энергией и сопряжен с процессами дыхания, ассимиляции азота, окислительно-восстановительным балансом, а у растений еще и с фотосинтезом[135]. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) -центральное звено дыхательного метаболизма, скорость которого лимитирует 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (2ОГДК). Таким образом происходит регуляция потока всего 2-оксоглутарата (2ОГ) [28; 29; 30]. 2ОГ- важнейший интермедиат, который используется для синтеза первичной аминокислоты -глутамата в результате чего происходит перенос аминогрупп и ассимиляция N43. Из всех соединений, поставляющих углеродные скелеты для биосинтеза аминокислот, 2-оксоглутаровая кислота играет главную роль, так как является наиболее реакционно-способным промежуточным акцептором ^ЫН2-групп [92, 153]. Предполагается, что 2-ОГ играет роль регулятора цитозольной пируваткиназы и фосфоенолпируваткарбоксилазы, а также митохондриальной цитратсинтазы и альтернативной оксидазы [87]. Ранее были высказаны предположения о том, что 2-ОГ играет роль сигнального метаболита у растений [38]. Шунт у-аминомасляной кислоты (ГАМК) - особый обходной путь ЦТК, в некотором смысле, резервный[161], который активируется в тех случаях, когда клетке необходим дополнительный приток энергии[104]. Этот метаболический путь, осуществляется посредством функционирования трёх энзимов, первый из которых - глутаматдекарбоксилаза (ГАД, КФ 4.1.1.15), катализирует преобразование глутамата в у-аминомасляную кислоту с поглощением протона и высвобождением СО2. Впоследствии, ГАМК трансаминируется ферментом ГАМК-трансаминазой (ГАМК-Т, КФ 2.6.1.19) в сукциниловый семиальдегид (ССА), который затем преобразуется в сукцинат под действием сукцинатсемиальдегиддегидрогеназы (ССАДГ; КФ 1.2.1.24) [176]. Сукцинат поступает в цикл трикарбоновых кислот[161]. По сути, ГАМК- шунт это маленькая страховка клетки на случай непредвиденных обстоятельств. Именно его наличие в клетке говорит о том, насколько скоординирована и

функционально организована клеточная регуляция и сигнализация на случай изменения внешних условий[176]

Связь между ЦТК и ГАМК-шунтом осуществляется посредством функционирования глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3), которая обеспечивает либо синтез 2ОГ из глутамата, либо его аминирование[113].

Известно, что в некоторых растениях, таких, например , как Hibiscus и Garcinia, накапливается оксицитрат (ОЦ), роль которого в растительной клетке до сих пор практически не изучена. Оставался неясным вопрос, с какой целью в растительных клетках происходит его накопление. Ранее была показана возможность метаболизации ОЦ до 2ОГ с помощью оксицитратдегидратазы декарбоксилирующей (ОД, КФ 4.2.1.9)[170; 6]. Однако данный энзим в основном изучался с точки зрения катализа реакции биосинтеза аминокислот с разветвленными боковыми цепями [148]. Более того, роль ОЦ, как источника 2ОГ для поддержания некоторых биохимических процессов, не установлена.

Несмотря на достаточно большой объем информации о механизмах адаптации клеточного метаболизма к стрессовым факторам, всё еще остается неясной роль 2ОГ и ферментов, участвующих в его метаболизации, в этом процессе. Также до конца не изучены изменения в катаболических и анаболических путях клеточного метаболизма. В связи с тем, что 2ОГ-ключевой интермедиат и метаболизма углерода, и метаболизма азота, целесообразным представляется исследовать особенности функционирования 2ОГДК, ГДГ, ОД, принимающих участие в метаболизме 2-оксоглутаровой кислоты в стрессовых условиях [32].

Цель и задачи. Целью работы являлось изучение физиолого-биохимических аспектов ферментативной регуляции метаболизма 2-оксоглутарата в листьях некоторых растений С3 и С4 типа в условиях солевого стресса, гипоксии, а также при облучении светом различного

спектрального состава. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить субклеточную локализацию энзимов, метаболизирующих 2-оксоглутаровую кислоту, а также изменения их изоферментного состава в стрессовых условиях;

2. Получить высокоочищенные препараты ГДГ из С3 (Triticum aestivum L.) и С4 (Zea mays L.) растений и провести сравнительный анализ некоторых кинетических характеристик полученных белков;

3. Исследовать биохимические и физиологические аспекты функционирования 2ОГДК, ГДГ, ОД в растениях (Zea mays L., Beta vulgaris L., Arabidopsis thaliana L.) in vivo в условиях действия солевого стресса, гипоксии и при облучении светом различного спектрального состава;

4. Выявить роль процесса метилирования CpG-динуклеотидов промотора в регуляции транскрипции генов, кодирующих 2ОГДГ, ГДГ, ОД в условиях действия различных стрессовых факторов.

Научная новизна и значимость работы. Проведенное исследование динамики активности 2ОГДК и ГДГ в стрессовых условиях позволило выявить изменения в клеточном метаболизме заключающиеся в индукции «стрессового пути». Показано, что регуляция функционирования энзимов осуществляется генетически. Впервые исследовано влияние различных стрессовых факторов на активность ОД по реакции образования 2ОГ. Получение высокоочищенных препаратов изоферментов ГДГ из листьев кукурузы и пшеницы, дало возможность выявить отличия в их кинетических характеристиках. Обнаружено участие фитохромной и криптохромной систем в трансдукции светового сигнала к генам исследуемых белков. Выявлена важная роль Ca2+ как мессенджера фитохромного сигнала к генам семейства GDH. Анализ паттерна экспрессии генов DHAD1 и DHAD2 позволил определить роль каждой изоформы ОД: ген DHAD1 кодирует полипептид, катализирующий протекание реакции окисления ОЦ до 2ОГ, в то время как

изофермент, кодируемый геном DHAD2, участвует в биосинтезе аминокислот с разветвленными боковыми цепями. Анализ нуклеотидной последовательности промоторов генов OGDH1, OGDH3, GDH1, GDH2, DHAD1, DHAD2 выявил в составе некоторых из ниx CpG-островки. Впервые установлено, что функционирование 2ОГДК и ГДГ в условиях засоления и гипоксического стресса регулируется на эпигенетическом уровне через изменение метильного статуса СG-динуклеотидов генов OGDH1, OGDH3, GDH1, GDH2. Выявленное увеличение транскрипции гена DHAD2 при солевом стрессе также сопряжено со снижением степени метилирования СG-динуклеотидов. Экспрессия гена DHAD1 ОД регулируется путем метилирования/деметилирования СpG-нуклеотидов его промотора при изменении освещенности листьев кукурузы и при гипоксии. Практическая значимость. Результаты исследования могут иметь значение в области фундаментальной науки, для понимания процессов регуляции клеточного метаболизма при адаптации растительного организма к внешним факторам.

Выявленный характер регуляции работы ферментов может быть использован при создании генно- модифицированных линий растений, обладающих повышенной продуктивностью, урожайностью, и устойчивых к действию различных стрессоров.

Адаптированная методика выделения и очистки ГДГ может служить для получения высокоочищенных и гомогенных препаратов из растений, кроме того, для проведения вестерн-блоттинга при создании поликлональных и моноклональных антител, а также в качестве вспомогательного фермента в биохимических реакциях.

Разработанные праймеры для МС-ПЦР и бисульфитного секвенирования могут быть использованы при исследовании эпигенетических аспектов регуляции энзимов.

Модифицированная методика выделения ОД и определения её активности могут применяться в научных исследованиях в качестве метода определения

активности изофермента дегидратазы дигидроксикислот, который в хлоропластах обеспечивает превращение оксицитрата в 2-оксоглутарат.

Данные, представленные в диссертационной работе, будут использоваться в образовательном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений, спецкурсов, спецпрактикумов.

Положения, выносимые на защиту

1. Установлена хлоропластная локализация изоферментов ОД. Показано значение изоферментов ОД в протекании реакции синтеза 2ОГ за счёт экспрессии гена ВИЛБ1 и его метаболизации для образования аминокислот с разветвленными боковыми цепями за счёт синтеза полипептида, кодируемого геном ОИЛБ2.

2. Изменения в функционировании 2ОГДК, ГДГ и ОД в различных условиях обусловлены дифференцировкой экспрессии их генов, при этом ключевую роль в перераспределении потока 2ОГ играет ГДГ. Солевой стресс и гипоксия вызывают индукцию пути «стрессового ответа». Регуляция в этом случае осуществляется на биохимическом, генетическом и эпигенетическом уровнях.

3. Гипоксия ингибирует активность 2ОГДК и активирует функционирование ГДГ. Регуляция активности исследуемых энзимов при дефиците кислорода обусловлена изменением экспрессии их генов (ООБИ1, ООБИЗ, ОБИ1, ОБИ2, БИЛЫ, ВИЛБ2).

4. Белый свет ингибирует функционирование 2ОГДК и ГДГ, разнонаправленно воздействуя на активность изоферментов ОД. Трансдукция светового сигнала осуществляется с участием фитохрома А, криптохромов.

5. Метилирование СрО-динуклеотидов в составе промотора играет ключевую роль в регуляции транскрипции генов, кодирующих 2ОГДК, ГДГ и ОД при адаптации растительной клетки к действию стрессовых факторов. Апробация работы. Результаты прошли апробацию на общероссийских и международных конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (2019, 2021); 9-й

14

Съезд общества физиологов растений России, (Казань, 18-24 сентября 2019г.); Годичное собрание Общества физиологов растений России: Всероссийская научная конференция с международным участием и школой молодых ученых (Иркутск, 10-15 июля 2018 г.); Межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021); ежегодных Научных сессиях отчетных конференций студентов (2017) и преподавателей и сотрудников (2020) ВГУ.

Публикации. Основные результаты работы изложены в 18 публикациях, из них 8 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 6 из них индексированы в Web of Science и Scopus.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 169 страницах основного текста, диссертация включает в себя 74 рисунка, 14 таблиц и 203 источника литературы.

Глава I . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика ферментов, участвующих в

метаболизме 2ОГ 1.1.1Структурно-функциональные особенности 2ОГДК

Клетки растений уникальны тем, что они содержат четыре вида комплексов дегидрогеназ а-кетокислот: пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК, КФ 1.2.1.104), 2-оксоглутарат дегидрогеназный комплекс (2ОГДК, КФ 1.2.1.105) и комплекс дегидрогеназ а-кетокислот с разветвленной цепью (КФ 1.2.1.25). Все комплексы включают несколько копий трех компонентов: 2-оксоглутаратдегидрогеназы (или 2-оксоглутаратдекарбоксилазы), дигидролипоилацилтрансферазы и дигидролипоилдегидрогеназы [138].

2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (2-ОГДК, КФ 1.2.4.2), являясь участником цикла трикарбоновых кислот, осуществляет окисление 2-оксоглутарата (2ЮГ) в сукцинил-КоА одновременно восстанавливая НАД+ до НАДН (Рис. 1) [146]. 2ЮГДК играет важную роль в метаболизме растений, катализируя, во-первых, лимитирующий этап митохондриального дыхания, а во-вторых, является ключевым участником в углерод-азотных взаимодействиях [146, 136].

2ОГДК представляет собой мультиферментный комплекс, состоящий из трех каталитически-активных компонентов, которые нередко в зарубежной литературе называют субъединицами, что в некотором смысле, все же не совсем верно. Первый компонент, обозначаемый обычно как Е1 -2-оксоглутаратдегидрогеназа (2ОГДГ, К.Ф. 1.2.4.2.); второй компонент -дигидролипоилсукцинилтрансфераза (ДЛСТ, К.Ф. 2.3.1.61), и третий фермент - участник 2ОГДК - Е3, дигидролипоилдегидрогеназа ( ДЛД, К.Ф. 1.8.1.4.) [135, 136].

Я СО СООП + НАД+ + СоАЯН —И-СО-Я-СГоА + НАДН + Н+ + Ш2

СоЛЗП Н-С-в-СоЛ

длст

Рис. 1 Общая схема реакции 2ОГДК

Помимо этого, для нормального катализа необходим тиаминдифосфат, М§ , липоевая кислота и кофакторы ФАД [43]. Компоненты 2ОГДГ и ДЛД регулируются соответствующими субстратами и эффекторами, включая кооперативные взаимодействия активных сайтов.

2ОГДК, выделенный из митохондрий цветной капусты, активируется 1 мМ АМФ [136, 192]. Связывание AMФ с 2ОГДГ снижает величину константы Михаэлиса по 2-оксоглутарату, тем самым увеличивая сродство фермента к субстрату, а следовательно максимальную скорость реакции [136, 56]. Реакция, катализируемая 2ОГДК, также может регулироваться активностью мтхПДК и цитратсинтазы посредством конкуренции за митохондриальный пул Со-БИ [60]. Как и все комплексы дегидрогеназ-кетокислот, 2ОГДК является субстрат-специфическим. Скорость восстановления НАДН за счет работы 2ОГДК в клубнях картофеля с использованием в качестве субстрата пирувата и изовалериата составляет менее 2% от скорости с 2-оксоглутаратом [135, 136]. Структура 2ОГДК млекопитающих имеет молекулярную массу примерно 2 МДа. Гомодимеры 2ОГДГ и ДЛД расположены вокруг 24-мерного ядра ДЛСТ [106]. 2ОГДК из картофеля имеет коэффициент седиментации (Б) 25±2, что соответствует молекулярной массе примерно 1.7 МДа. Согласно данным, полученным методом гель- хроматографии, 2ОГДК значительно меньше, чем мтхПДК [135, 136]. Несмотря на то, что 2ОГДК является наименее изученным из всех

растительных комплексов, сходство молекулярной массы 2ОГДК млекопитающих и растений предполагает сохранение 24-мерной структуры ДЛСТ.

2-ОГДК имеет строго упорядоченное и компактное строение. В пределах структуры комплекса, весьма фиксированной, протекают всё химические превращения субстратов. Многочисленные полипептидные цепочки белков закреплены плотно и определенным образом. Следует отметить, что промежуточные продукты, образующиеся в ходе множеств каталитических реакций, в среду не выделяются [162].

Дигидролипоамидсукцинилтрансфераза выполняет каталитическую и структурные функции. Что касается флавопротеиновых компонентов обоих комплексов, то они являются взаимозаменяемыми. Выделенная из пируватдегидрогеназного комплекса липоилдегидрогеназа способна включаться в 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс при реконструкции, и при этом каталитические свойства не нарушаются. Возможна и обратная ситуация. Отмечается, что в качестве субстрата для 2-ОГДК пируват подходит плохо, однако, связанный с комплексом ФАД он восстанавливает полностью. Имеются предположения, что 2-ОГДК может иметь пируватдегидрогеназу (ПДГ) и 2 оксоглутаратдегидрогеназу (2-ОГДГ) в качестве Е1 компонента [118]. Расположенные на противоположных сторонах два центра связывания обеспечивают локализацию 2оксоглутаратдегидрогеназного комплекса на внутренней мембране митохондрий. Существует мнение, что метаболон цикла трикарбоновых кислот взаимодействует с мультиферментными комплексами электрон-транспортной цепи [103, 125, 172].

1.1.1.1 Структурно-функциональные особенности функционирования 2-

оксоглутаратдегидрогеназы

Первый компонент 2ОГДК - 2-оксоглутаратдегидрогеназа (2-ОГДГ, К.Ф. 1.2.4.2), принадлежащая семейству дегидрогеназ, представляет собой гомодимер, катализирующий превращение 2-оксоглутарата в сукцинат семиальдегид. В качестве кофактора в реакции участвует тиаминдифосфат (ТДФ). 2-ОГДГ является холоферментом, а соответственно для его функционирования необходимы ионы магния. Белок, кодируемый геном oGDH, локализован в митохондриальном матриксе. Субъединицы гомодимера соединены между собой кислотными остатками, что увеличивает основные свойства димера [202].

Как ранее уже упоминалось, 2ОГДГ является тиамин-зависимым энзимом. В кристаллической структуре 2ОГДГ E. coli обнаруживается характерная складка, которая связывает тиаминдифосфат, и которая сходна с a2ß2 гетеротетрамерными 2ОГДГ других мультиферментных комплексов 2-оксокислот, за исключением того, что в 2ОГДГ субъединицы а и ß слиты в один полипептид (Рис. 2А). Расширенный сегмент, который связывает а-подобные и ß-подобные домены, образует карман, занимаемый АМФ, который распознается специфически. Для 2ОГДГ также характерны N-концевые удлинения центральной складки, которые могут опосредовать взаимодействия с другими компонентами 2ОГДК. Карман активного сайта содержит группу из трех остатков гистидина и одного серина, которые, по -видимому, придают субстратную специфичность и способность принимать оксалоацетат из ЦТК. Оксалоацетат подавляет активность 2ОГДГ при физиологических концентрациях, что, по предположениям Франк (Frank, 2007) c соавторами, обеспечивает скоординированную работу ЦТК [76].

Рис.2 А- Кристаллическая структура 2ОГДГ Escherichia coli K-12 [76];

Б- Кристаллическая структура ДЛСТ Escherichia coli K-12 [26];В-Кристаллическая структура дигидролипоамиддегидрогеназы из Thermus

thermophilus HB8 [101].

1.1.1.2. Структура дигидролипоамидсукцинилтрансферазы и ее роль в

клетке

Дигидролипоамидсукцинилтрансфераза (ДЛСТ, К.Ф. 2.3.1.61) -фермент семейства трансфераз, специализирующихся на переносе групп, не являющихся аминоацильными; представляющий собой Гомо24мер, то есть состоит из 24 гомологичных субъединиц с 432-точечной групповой симметрией (Рис.2Б). Молекулярная масса одной субъединицы ДЛСТ Escherichia coli составляет 26.11 кДа [26]. Катализирует реакция превращение сукцинилаСо-А с образованием Со-А и фермента N6-(S-сукцинилдигидролипоил) лизин. Дигидролипоамидсукцинилтрансфераза выполняет каталитическую и структурные функции.

Недавнее исследование показало, что ДЛСТ 2ОГДК у Arabidopsis thaliana проявляет свойства сукцинат -связывающего белка [118]. Второй компонент 2-ОГДК принимает участие в ЦТК, а также в деградации лизина. Каталитический домен второго компонента 2-ОГДК катализирует перенос сукцинильной группы из S-сукцинилдигидролипоильного фрагмента в кофермент-А[118]. Имеются сведения об участии ДЛСТ в эпигенетической регуляции работы генома за счет обеспечения процесса сукцинилирования в

ядре за счет связывания с лизин-ацетилтрансферазой 2А (KAT2A) из промоторных областей генов [191].

1.1.1.3 Структурно- функциональные особенности липоамиддегидрогеназы

Липоамиддегидрогеназа (ДЛД, К.Ф. 1.8.1.4.) - фермент, обеспечивающий окисление дигидролипоамида до липоамида. ДЛД является митохондриальным ферментом, играющим важную роль в энергетическом метаболизме эукариот. Фермент представляет собой флавопротеин, который содержит реакционно способный дисульфидный мостик, а также ФАД -кофактор[101;173]. Именно они непосредственно участвуют в катализе. Структурно ДЛД представляет собой сильно связанный между собой гомодимер (Рис. 2В).

Мультиферментная структура 2ОГДК важна для регуляции как физиологических, так и побочных реакций. С 24 копиями второго компонента комплекса - ДЛСТ, образующими ядро 2ОГДК, к которым прикреплены множественные копии периферических компонентов Е1 и Е3 [40], 2ОГДК можно рассматривать как клеточный микрокомпартмент липоевой кислоты. В этом микрокомпартменте не только значительно ускоряется и регулируется общая реакция [43], но также можно строго контролировать ряд побочных реакций многоступенчатого катализа [31]. В частности, стабильность тиольного радикала, обеспечиваемая взаимодействиями липоильных остатков, способствует эффективной регуляции активности 2ОГДК по образованию АФК в соответствии с вышеупомянутой инактивацией 2ОГДГ[18], позволяя 2ОГДК реагировать на интегральный сигнал метаболического состояния клеток, кодируемый соотношением его субстратов и продуктов[31]. Как акцептор тиольных радикалов[31], тиоредоксин предотвращает инактивацию 2ОГДГ, облегчая производство сукцинил-КоА в условиях, при которых комплекс обычно

инактивирован, то есть при низком уровне НАД+ или при высоком соотношении НАДН / НАД+. Биологическое значение этой регуляции подтверждается независимыми наблюдениями, что наиболее эффективная регуляция митохондриального 2ОГДК обеспечивается узнаваемым митохондриальным тиоредоксином, а ДЛСТ связывает тиоредоксин [40]. Однако, защищая 2ОГДГ от инактивации тиольными радикалами, тиоредоксин увеличивает продукцию АФК с помощью 2ОГДК [43].

Подавление 2ОГДГ у Solanum lycopersicum значительно снижает активность 2ОГДК[29, 30]. Вместе эти результаты показывают, что модификации в различных компонентах 2ОГДК могут влиять на активность всего мультиферментного комплекса [118].

1.1.1.4. Биохимические аспекты функционирования

2ОГДК

2ОГДГ, который катализирует начальную, субстрат-специфичную и необратимую стадию общей реакции окисления 2ОГ до сукцинил-СоА, имеет самую низкую каталитическую активность («число оборотов») среди компонентов и, как таковой, ограничивает скорость всего процесса [118]. Было показано, что в процессе, катализируемом 2ОГДГ, реакция является самой медленной [43]. «Ограничивающая скорость» роль 2ОГДГ, очевидно, ответственна за тот факт, что именно на этот компонент влияет большинство регуляторов всего процесса [43] и экспрессия которого часто увеличивается в ответ на нарушения работы 2ОГДК. Помимо этого исследуемый мультиферментный комплекс также катализирует несколько побочных реакций, потенциально имеющих биологическое значение [143]: активность 2ОГДК по продуцированию АФК, когда соотношение субстратов и / или продуктов 2ОГДК способствует избыточному образованию промежуточного дигидролипата, 2ОГДК катализирует окисление последнего молекулярным

кислородом с образованием супероксид-анион-радикала и тиольного радикала комплексно-связанного липоата [118].

Весь комплекс является предметом аллостерической регуляции первого компонента с помощью продукта ДЛД - НАДН. Кроме того, повышенные

соотношения НАДН/НАД+ и сукцинил-CoA/CoA ингибируют 2-ОГДК, тогда

2 +

как Ca и АМФ, а в растительных организмах ГТФ, аллостерически активируют E1 при субнасыщающих концентрациях 2-ОГ за счет увеличения сродства 2ОГДГ к ее субстрату [178;43]. Ингибирование 2-ОГДК в клубнях картофеля (Solanum tuberosum) с помощью специфических ингибиторов приводит к нарушениям как дыхания, так и углеродно-азотных взаимодействий [31].

Ранее уже упоминалось, что 2ОГДК регулируется с помощью различных механизмов, в том числе и аллостерически в ответ на воздействие вторичных мессенджеров и метаболических индикаторов, таких как Ca2+, ATФ / AДФ( АМФ), тиоловые / дисульфидные группы, НАДН / НАД , ацил-CoA / CoA [43]. Эти механизмы включают белковые медиаторы, такие как рецепторы, связанные с G-белками, участвующими в стимуляции синтеза инозитолфосфата [42; 76] или индуцируемый гипоксией фактор пролилгидроксилазы [46, 130]. Более того, клеточная рецепция соотношения 2ОГ / глутамат, по крайней мере, у нефотосинтезирующих видов, вовлечена в ретроградную передачу сигналов митохондрий ядру, что приводит к адаптации при митохондриальных нарушениях [42]. 2ОГ также сигнализирует о дефиците азота [86, 47, 48] при связывании либо с фактором транскрипции NTcA в цианобактериях [47], либо с фосфорилируемым белком PII (продукт glnBgene), обнаруженным у бактерий и растений [86,47]. Наконец, ОГ действует как репрессор чувствительных к катаболизму генов в E. coli, частично за счет снижения синтеза цАМФ [58].

Химическое ингибирование 2-ОГДК показало, что этот мультиферментный комплекс играет важную роль в ассимиляции нитратов, а также в метаболизме аминокислот[31]. Более того, антисмысловое

23

ингибирование 2-ОГДК в томатах (Solanum lycopersicum) привело к изменениям в развитии растений, которые были связаны с уменьшением общего количества аминокислот и нитратных пулов[30]. Более того, было замечено, что подавление 2ОГДГ увеличивает поток через ГАМК-шунт, компенсируя снижение продукции сукцината через ЦТК[30]. Суммируя вышеизложенные данные, можно сделать вывод, что реакция, катализируемая 2-ОГДК, представляет собой точку метаболического разветвления, соединяющую ЦТК с ассимиляцией азота, в которой 2ОГ либо превращается 2ОГДК в сукцинил CoA и НАДН, либо обеспечивает углеродные скелеты для ассимиляции азота с помощью работы глутаматдегидрогеназы [86, 136, 54].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Анохина Галина Борисовна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гарник Е. Ю. и др. Экспрессия гена глутаматдегидрогеназы GDH2 арабидопсиса индуцируется под влиянием ингибитора синтеза тетрапирролов норфлуразона //Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2013. - Т. 9. - №. 4.

2. Генкель П. А. Физиология жаро-и засухоустойчивости растений. -Наука, 1982.

3. Детерман Г. Гель-хроматография. / Г. Детер- ман. — М.: Мир. — 1970. — 252 с

4. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: -Пер с англ. -М.: Мир, 1982. Т.1 - 392 с

5. Епринцев А. Т. Идентификация и исследование экспрессии генов / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, Д. Н. Федорин. - Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 2008. - 63 с.

6. Землянухин А. А., Землянухин Л. А. Метаболизм органических кислот растений //Воронеж: изд во Воро неж. ун та. - 1995. - Т. 152.

7. Келешян С. К. и др. Влияние активности глутаматдегидрогеназы на синтез L-пролина //Прикладная биохимия и микробиология. - 2017. -Т. 53. - №. 5. - С. 470-476.

8. Кирнос М. Д., Александрушкина Н. И., Ванюшин Б. Ф. 5-метилцитозин в пиримидиновых последовательностях ДНК растений и животных: специфичность метилирования //Биохимия. - 1981. - Т. 46. - №. 12. -С. 1458-1474.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - Москва: Высш. шк., 1990. -351с.

10. Лукьянова Л. Д. и др. Действие интервальной нормобарической гипоксии на кинетические свойства митохондриальных ферментов

//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144. - №. 12. - С. 644-652.

11.Лукьянова Л. Д., Кирова Ю. И., Сукоян Г. В. Новое о сигнальных механизмах адаптации к гипоксии и их роли в системной регуляции //Патогенез. - 2011. - Т. 9. - №. 3. - С. 4-14.

12.Маурер Г. Диск-электрофорез: Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле: Пер. с нем. - Мир, 1971.

13.Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование . М.: Наука, 1981. - 288 с.

14.Прусакова Л. Д., Юсуфов А. Г. Алехина НД, Балнокин ЮВ Гавриленко ВФ, Жигалова ТВ, Мейчик НР, Носов АМ, Полесская ОГ, Харитонашвили ЕВ, Чуб ВВ Физиология растений/Под. ред. Ермакова ИП, М.:" Академа", 2005 //Агрохимия. - 2006. - №. 3. - С. 89-91.

15.Рябушкина Н. А., Омашева М. Е., Галиакпаров Н. Н. Специфика выделения ДНК из растительных объектов //Биотехнология. Теория и практика. - 2012. - №. 2. - С. 9-26.

16.Солдатенков С. В., Щипарёв С. М. О превращениях оксилимонной кислоты в растениях //Вестн. Ле-нингр. ун-та. - 1970. - №. 9. - С. 155159.

17. Сцик-Миранда К. и др. Механизмы трансляционного контроля, действующие в растениях кукурузы при недостатке кислорода //Физиология растений. - 2003. - Т. 50. - №. 6. - С. 865-878.

18.Титов А.Ф. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур / Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Топчиева Л.В. //. М.: Наука. - 2006. - С. 143

19.Феденко Е. П., Касумов К. К., Лапко В. Н. Система цАМФ как посредник фитохрома при действии света //Физиология и биохимия культурных растений. - 1995. - Т. 27. - №. 1-2. - С. 3.

20.Флоренская Т.Г.; Космачевская О.В.; Топунов А.Ф.: Молекулярные формы глутаматдегидрогеназы корней сои. / Науч.-исслед. ин-т сел. хоз-ва Крыма. Симферополь. - 2017- №4(12). - С. 18-30

21.Щипарёв С. М., Солдатенков С. В. Изучение образования и превращения оксилимонной кислоты в листьях кенафа // Физиология растений. - 1972. - Т. 19. - №. 6. - С. 1261-1265

22.Akfay N. et al. Contribution of Gamma amino butyric acid (GABA) to salt stress responses of Nicotiana sylvestris CMSII mutant and wild type plants //Journal of Plant Physiology. - 2012. - V. 169. - №. 5. - P. 452-458.

23.Almaas E. et al. Global organization of metabolic fluxes in the bacterium Escherichia coli //Nature. - 2004. - V. 427. - №. 6977. - P. 839-843.

24.Amsterdam A. et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2004. -V. 101. - №. 35. - P. 12792-12797.

25.Anderson B. M. et al. Purification and characterization of Clostridium difficile glutamate dehydrogenase //Archives of biochemistry and biophysics. - 1993. - V. 300. - №. 1. - P. 483-488.

26.Andi B. et al. Structure of the dihydrolipoamide succinyltransferase catalytic domain from Escherichia coli in a novel crystal form: a tale of a common protein crystallization contaminant //Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. - 2019. - V. 75. - №. 9. - P. 616-624.

27.Antonio C. et al. Regulation of primary metabolism in response to low oxygen availability as revealed by carbon and nitrogen isotope redistribution //Plant physiology. - 2016. - V. 170. - №. 1. - P. 43-56.

28.Araujo W. L. et al. 2-Oxoglutarate: linking TCA cycle function with amino acid, glucosinolate, flavonoid, alkaloid, and gibberellin biosynthesis //Frontiers in plant science. - 2014. - V. 5. - P. 552.

29.Araujo W. L. et al. Metabolic control and regulation of the tricarboxylic acid cycle in photosynthetic and heterotrophic plant tissues //Plant, cell & environment. - 2012. - V. 35. - №. 1. - P. 1-21.

30.Araûjo W. L. et al. Phosphonate analogs of 2-oxoglutarate perturb metabolism and gene expression in illuminated Arabidopsis leaves //Frontiers in plant science. - 2012. - V. 3. - P. 114.

31.Araujo W. L. Inhibition of 2-oxoglutarate dehydrogenase in potato tuber suggests the enzyme is limiting for respiration and confirms its importance in nitrogen assimilation, / W. L. Araujo [et al.] // Plant Physiology. — 2008.

— Vol. 148. - №. 4. — P. 1782-1796.

32.Ashapkin V. V., Kutueva L. I., Vanyushin B. F. Aging as an epigenetic phenomenon //Current genomics. - 2017. - V. 18. - №. 5. - P. 385-407.

33.Baker P. J. et al. Subunit assembly and active site location in the structure of glutamate dehydrogenase //Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 1992. - V. 12. - №. 1. - P. 75-86.

34.Binder S. Branched-chain amino acid metabolism in Arabidopsis thaliana //The Arabidopsis Book/American Society of Plant Biologists. - 2010. -V.8.

35.Blokhina O. B., Tôrônen P., Fagerstedt K. V. Oxidative stress components explored in anoxic and hypoxic global gene expression data //Low-oxygen stress in plants. - Springer, Vienna, 2014. - P. 19-39.

36.Bouché N. et al. Mitochondrial succinic-semialdehyde dehydrogenase of the y-aminobutyrate shunt is required to restrict levels of reactive oxygen intermediates in plants //Proceedings of the National Academy of Sciences.

- 2003. - V. 100. - №. 11. - P. 6843-6848.

37.Bouche N., Fromm H. GABA in plants: just a metabolite? //Trends in plant science. - 2004. - V. 9. - №. 3. - P. 110-115.

38.Bourrellier A. B. F. et al. Metabolite regulation of the interaction between Arabidopsis thaliana PII and N-acetyl-l-glutamate kinase //Biochemical and biophysical research communications. - 2009. - V.387. - №4. - P. 700-704

39.Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Analytical biochemistry. - 1976. - V. 72. - №. 1-2. - P. 248-254.

40.Brautigam C. A. Crystal structure of human dihydrolipoamide dehydrogenase: NAD+/NADH binding and the structural basis of disease-causing mutations/ C. A. Brautigam [et al.] // Journal of Molecular Biology.

- 2005. - V350 . - №3 - p. 543-552

41.Breitkreuz K. E. et al. A novel y-hydroxybutyrate dehydrogenase: identification and expression of an Arabidopsis cDNA and potential role under oxygen deficiency //Journal of Biological Chemistry. - 2003. - V. 278. - №. 42. - P. 41552-41556.

42.Bunik V. I. et al. Enzyme-catalyzed side reactions with molecular oxygen may contribute to cell signaling and neurodegenerative diseases //Neurochemical research. - 2007. - V. 32. - №. 4. - P. 871-891.

43.Bunik V. I., Fernie A. R. Metabolic control exerted by the 2-oxoglutarate dehydrogenase reaction: a cross-kingdom comparison of the crossroad between energy production and nitrogen assimilation //Biochemical Journal.

- 2009. - V. 422. - №. 3. - P. 405-421..

44.Cammaerts D., Jacobs M. A study of the role of glutamate dehydrogenase in the nitrogen metabolism of Arabidopsis thaliana// Planta. -1985. -V.163 -P. 517-526

45.Carillo P. GABA shunt in durum wheat //Frontiers in Plant Science. - 2018.

- V. 9. - P. 100.

46.Chandel N.S., Schumacker P.T. Cellular oxygen sensing by mitochondria: old questions, new insight / N.S. Chandel, P.T. Schumacker // J. Appl. Physiol. - 2000. - V. 88. - N 5. - P. 1880-1889.

47.Chen H. et al. Studying the signaling role of 2-oxoglutaric acid using analogs that mimic the ketone and ketal forms of 2-oxoglutaric acid //Chemistry & biology. - 2006. - V. 13. - №. 8. - P. 849-856.

48.Chen Y. M. et al. The PII signal transduction protein of Arabidopsis thaliana forms an arginine-regulated complex with plastid N-acetyl glutamate kinase //Journal of Biological Chemistry. - 2006. - V. 281. - №. 9. - P. 5726-5733

49.Che-Othman M. H. et al. Wheat mitochondrial respiration shifts from the tricarboxylic acid cycle to the GABA shunt under salt stress //New Phytologist. - 2020. - V. 225. - №. 3. - P. 1166-1180.

50.Chomczynski P., Sacchi N. Singlestep-method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - V. 162. - P. 156-159

51.Chu T. N. et al. Plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas PS01 induces salt tolerance in Arabidopsis thaliana //BMC research notes. - 2019.

- V. 12. - №. 1. - P. 1-7.

52.Commichau F. M., Forchhammer K., Stulke J. Regulatory links between carbon and nitrogen metabolism //Current opinion in microbiology. - 2006.

- V. 9. - №. 2. - P. 167-172.

53.Condori Apfata J. A. et al. Physiological and metabolic analysis of Arabidopsis thaliana with low expression of 2-oxoglutarate dehydrogenase subunits. - 2016.

54.Condori-Apfata J. A. et al. The Arabidopsis E 1 subunit of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex modulates plant growth and seed production //Plant molecular biology. - 2019. - V. 101. - №. 1. - P. 183202.

55.Consalvi V. et al. NAD-dependent glutamate dehydrogenase from the thermophilic eubacterium Bacillus acidocaldarius //Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. - 1994. -V. 109. - №. 4. - P. 691-699.

56.Craig D. W., Wedding R. T. Regulation of the 2-oxoglutarate dehydrogenase lipoate succinyltransferase complex from cauliflower by nucleotide. Steady state kinetic studies //Journal of Biological Chemistry. -1980. - V. 255. - №. 12. - P. 5763-5768.

57.Creux N., Harmer S. Circadian rhythms in plants //Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2019. - V. 11. - №. 9. - P. a034611.

58.Daniel J., Danchin A. 2-Ketoglutarate as a possible regulatory metabolite involved in cyclic AMP-dependent catabolite repression in Escherichia coli K12 //Biochimie. - 1986. - V. 68. - №. 2. - P. 303-310.

59.Devin A., Rigoulet M. Mechanisms of mitochondrial response to variations in energy demand in eukaryotic cells/ A.Devin, M. Rigoulet // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2007. - V. 292 - №1. -P. 52-58.

60.Dry I. B., Wiskich J. T. 2-Oxoglutarate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase activities in plant mitochondria: interaction via a common coenzyme A pool //Archives of biochemistry and biophysics. - 1987. - V. 257. - №. 1. - P. 92-99.

61.Dubois F. et al. Glutamate dehydrogenase in plants: is there a new story for an old enzyme? //Plant Physiology and Biochemistry. - 2003. - V. 41. - №. 6-7. - P. 565-576.

62.Du C. Q. et al. Overexpression of an NADP (H)-dependent glutamate dehydrogenase gene, TrGDH, from Trichurus improves nitrogen assimilation, growth status and grain weight per plant in rice //Breeding science. - 2019. - P. 19014.

63.Edwards J. W., Coruzzi G. M. Photorespiration and light act in concert to regulate the expression of the nuclear gene for chloroplast glutamine synthetase //The Plant Cell. - 1989. - V. 1. - №. 2. - P. 241-248.

64.El Moukhtari A. et al. How does proline treatment promote salt stress tolerance during crop plant development? //Frontiers in plant science. -2020. - V. 11. - P. 1127.

65.Engel P. C. Glutamate dehydrogenases: the why and how of coenzyme specificity //Neurochemical research. - 2014. - V. 39. - №. 3. - P. 426-432.

66.Eprintsev A. T. et al. Expression and promoter methylation of succinate dehydrogenase and fumarase genes in maize under anoxic conditions //Journal of plant physiology. - 2017. - V. 216. - P. 197-201

67.Eprintsev A. T. et al. Regulation of expression of the mitochondrial and peroxisomal forms of citrate synthase in maize during germination and in response to light //Plant Science. - 2018. - V. 272. - P. 157-163.

68.Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Cherkasskikh M.V., Igam-berdiev A.U. Expression of succinate dehydrogenaseand fumarase genes in maize leaves is mediated by cryptochrome // J. Plant Physiol. - 2018. - V. 221. - P. 81.

69.Eprintsev A. T., Fedorin D. N., Igamberdiev A. U. Ca is involved in phytochrome A-dependent regulation of the succinate dehydrogenase gene sdh1-2 in Arabidopsis //Journal of plant physiology. - 2013. - V. 170. - №. 15. - P. 1349-1352.

70.Farissi M. et al. Variations in leaf gas exchange, chlorophyll fluorescence and membrane potential of Medicago sativa root cortex cells exposed to increased salinity: The role of the antioxidant potential in salt tolerance //Archives of Biological Sciences. - 2018. - V. 70. - №. 3. - P. 413-423.

71.Fedorin D. N., Eprintsev A. T. Regulation of aconitate hydratase activity in maize leaves with red and blue light //Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2017. - V. 13. - №. 3.

72.Flint D. H., Emptage M. H. Dihydroxy acid dehydratase from spinach contains a [2Fe-2S] cluster //Journal of Biological Chemistry. - 1988. - V. 263. - №. 8. - P. 3558-3564.

73.Fontaine J. X. et al. Characterization of a NADH-dependent glutamate dehydrogenase mutant of Arabidopsis demonstrates the key role of this enzyme in root carbon and nitrogen metabolism //The Plant Cell. - 2012. -V. 24. - №. 10. - P. 4044-4065.

74.Fontaine J. X. et al. Further insights into the isoenzyme composition and activity of glutamate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana //Plant signaling & behavior. - 2013. - V. 8. - №. 3. - P. e23329.

75.Forde B. G., Lea P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling //Journal of experimental botany. - 2007. - V. 58. - №. 9. - P. 2339-2358.

76.Frank R. A. W. et al. Crystal structure of the E1 component of the Escherichia coli 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complex //Journal of molecular biology. - 2007. - V. 368. - №. 3. - P. 639-651.

77.Franklin K. A. et al. Phytochromes B, D, and E act redundantly to control multiple physiological responses in Arabidopsis //Plant Physiology. - 2003.

- V. 131. - №. 3. - P. 1340-1346.

78.Gayral M. et al. Responses to hypoxia and endoplasmic reticulum stress discriminate the development of vitreous and floury endosperms of conventional maize (Zea mays) inbred lines //Frontiers in plant science. -2017. - V. 8. - P. 557.

79.Gilliham M., Tyerman S. D. Linking metabolism to membrane signaling: the GABA-malate connection //Trends in plant science. - 2016. - V. 21. - №. 4. - P. 295-301.

80.Grabowska A. et al. Molecular cloning and functional analysis of the second gene encoding glutamate dehydrogenase in triticale //Acta Physiologiae Plantarum. - 2017. - V. 39. - №. 1. - P. 1-11.

81.Grabsztunowicz M., Jackowski G. Isolation of intact and pure chloroplasts from leaves of Arabidopsis thaliana plants acclimated to low irradiance for studies on Rubisco regulation //Acta Societatis Botanicorum Poloniae. -2013. - V. 82. - №. 1.

82.Grzechowiak M. et al. Structural studies of glutamate dehydrogenase (isoform 1) from Arabidopsis thaliana, an important enzyme at the branchpoint between carbon and nitrogen metabolism //Frontiers in Plant Science.

- 2020. - V. 11. - P. 754.

83.Hachiya T., Sakakibara H. Interactions between nitrate and ammonium in their uptake, allocation, assimilation, and signaling in plants //Journal of Experimental Botany. - 2017. - V. 68. - №. 10. - P. 2501-2512.

84.Hare P. D., Cress W. A., Van Staden J. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress //Plant, cell & environment. - 1998. - V. 21. -№. 6. - P. 535-553.

85.Hasanuzzaman M., Nahar K., Fujita M. Plant response to salt stress and role of exogenous protectants to mitigate salt-induced damages //Ecophysiology and responses of plants under salt stress. - Springer, New York, NY, 2013. -P. 25-87.

86.He W. et al. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors //Nature. - 2004. - V. 429. - №. 6988. - P. 188-193

87.Hodges M. Enzyme redundancy and the importance of 2-oxoglutarate in plant ammonium assimilation //Journal of experimental botany. - 2002. - V. 53. - №. 370. - P. 905-916.

88.Hossain M. A., Uddin S. N. Mechanisms of waterlogging tolerance in wheat: Morphological and metabolic adaptations under hypoxia or anoxia //Australian journal of crop science. - 2011. - V. 5. - №. 9. - P. 1094-1101.

89.Hsieh C. L. Evidence that protein binding specifies sites of DNA demethylation //Molecular and cellular biology. - 1999. - V. 19. - №. 1. -P. 46-56.

90.Hudson R. C., Daniel R. M. L-glutamate dehydrogenases: distribution, properties and mechanism //Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. - 1993. - V. 106. - №. 4. - P. 767-792.

91.Huergo L. F., Dixon R. The emergence of 2-oxoglutarate as a master regulator metabolite //Microbiology and Molecular Biology Reviews. -2015. - V. 79. - №. 4. - P. 419-435.

92.Huppe H. C., Turpin D. H. Integration of carbon and nitrogen metabolism in plant and algal cells //Annual review of plant biology. - 1994. - V. 45. - №. 1. - P. 577-607.

93.Igamberdiev A. U. et al. Phytochrome-mediated regulation of plant respiration and photorespiration //Plant, cell & environment. - 2014. - V. 37. - №. 2. - P. 290-299.

94.Igamberdiev A. U., Bykova N. V., Hill R. D. Nitric oxide scavenging by barley hemoglobin is facilitated by a monodehydroascorbate reductase-

mediated ascorbate reduction of methemoglobin //Planta. - 2006. - V. 223. - №. 5. - P. 1033-1040.

95.Igamberdiev A. U., Hill R. D. Plant mitochondrial function during anaerobiosis //Annals of botany. - 2009. - V. 103. - №. 2. - P. 259-268.

96.Iqbal Z. et al. Plant defense responses to biotic stress and its interplay with fluctuating dark/light conditions //Frontiers in Plant Science. - 2021. - V. 12. - P. 297.

97.Isayenkov S. V., Maathuis F. J. M. Plant salinity stress: many unanswered questions remain //Frontiers in Plant Science. - 2019. - V. 10. - P. 80.

98. Jena B. S. et al. Chemistry and biochemistry of (-)-hydroxycitric acid from Garcinia //Journal of agricultural and food chemistry. - 2002. - V. 50. - №. 1. - P. 10-22.

99.Ji J. et al. Responses of GABA shunt coupled with carbon and nitrogen metabolism in poplar under NaCl and CdCl2 stresses //Ecotoxicology and environmental safety. - 2020. - V. 193. - P. 110322.

100. Joshi V., Jander G. Arabidopsis methionine y-lyase is regulated according to isoleucine biosynthesis needs but plays a subordinate role to threonine deaminase //Plant physiology. - 2009. - V. 151. - №. 1. - P. 367378.

101. Juan E. C. M. et al. Two different lipoamide dehydrogenases (E 3 s) from Thermus thermophilus: crystal structures and their evolutionary relationship. Acta Crystallographica, Section A - Acta crystallogr A. -2006. - V. 62. - pp. S138-S138.

102. Kami C. et al. Light-regulated plant growth and development //Current topics in developmental biology. - 2010. - V. 91. - P. 29-66.

103. Kholodenko B.N., Lyubarev A.E., Kurganov B.I. Control of the metabolic flux in the system with high enzyme concentrations and moiety-conserved cycles: the sum of the flux control coefficients can drop significantly below unity // European Journal of Biochemistry. - 1992. - V. 210. - P. 147—153.

104. Kinnersley A. M., Turano F. J. Gamma aminobutyric acid (GABA) and plant responses to stress //Critical Reviews in Plant Sciences. - 2000. -V. 19. - №. 6. - P. 479-509.

105. Klose C. et al. Molecular mechanisms for mediating light-dependent nucleo/cytoplasmic partitioning of phytochrome photoreceptors //New Phytologist. - 2015. - V. 206. - №. 3. - P. 965-971.

106. Koike M., Koike K. Structure, assembly and function of mammalian alpha-keto acid dehydrogenase complexes //Advances in biophysics. - 1976. - P. 187-227.

107. Kujo C., Ohshima T. Enzymological characteristics of the hyperthermostable NAD-dependent glutamate dehydrogenase from the archaeon Pyrobaculum islandicum and effects of denaturants and organic solvents //Applied and environmental microbiology. - 1998. - V. 64. - №. 6. - P. 2152-2157.

108. Kumar R. G., Shah K., Dubey R. S. Salinity induced behavioural changes in malate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase activities in rice seedlings of differing salt tolerance //Plant Science. - 2000. - V. 156. -№. 1. - P. 23-34.

109. Labboun S. et al. Resolving the role of plant glutamate dehydrogenase. I. In vivo real time nuclear magnetic resonance spectroscopy experiments //Plant and cell physiology. - 2009. - V. 50. - №. 10. - P. 1761-1773.

110. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmly // Nature. — 1970. — V. 77. - №. 4. — P.680-683.

111. Lasa B. et al. Role of glutamate dehydrogenase and phosphoenolpyruvate carboxylase activity in ammonium nutrition tolerance in roots //Plant Physiology and Biochemistry. - 2002. - V. 40. - №. 11. - P. 969-976.

112. Lea P. J., Miflin B. J. Alternative route for nitrogen assimilation in higher plants //Nature. - 1974. - V. 251. - №. 5476. - P. 614-616.

113. Lea P. J., Miflin B. J. Nitrogen assimilation and its relevance to crop improvement //Annu. Plant Rev. - 2011. - V. 42. - P. 1-40.

114. Lehmann T., Ratajczak L. The pivotal role of glutamate dehydrogenase (GDH) in the mobilization of N and C from storage material to asparagine in germinating seeds of yellow lupine // J. Plant. Physiol. -2008. - V.165. - N.2. - P. 149 - 58.

115. LI C. R. et al. Unravelling mitochondrial retrograde regulation in the abiotic stress induction of rice ALTERNATIVE OXIDASE 1 genes //Plant, cell & environment. - 2013. - V. 36. - №. 4. - P. 775-788.

116. Li J. et al. Phytochrome signaling mechanisms //The Arabidopsis Book/American Society of Plant Biologists. - 2011. - V. 9.

117. Li W., Li Q. Effect of environmental salt stress on plants and the molecular mechanism of salt stress tolerance //Int. J. Environ. Sci. Nat. Res. - 2017. - V. 7. - №. 3. - P. 555714.

118. Liao Y. et al. Salicylic acid binding of mitochondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase E2 affects mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transport chain components and plays a role in basal defense against tobacco mosaic virus in tomato //New Phytologist. -2015. - V. 205. - №. 3. - P. 1296-1307.

119. Lippman E. O. Über eine neue im Rubensaff vorkommende Saure //Ber. Deut. Chem. - 1883. - V. 16. - №. 1078. - P. 10.1002.

120. Loulakakis K.A. The seven NAD(H)-glutamate dehydrogenase isoenzymes exhibit similar anabolic and catabolic activities. / Loulakakis K.A., Roubelakis-Angelakis K.A. // Physiol Plant. - 1996. - V. 96 - P. 2935

121. Lowry O. H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent //Journal of biological chemistry. - 1951. - V. 193. - P. 265-275.

122. Lu J. et al. Characterization and modification of enzymes in the 2-ketoisovalerate biosynthesis pathway of Ralstonia eutropha H16 //Applied microbiology and biotechnology. - 2015. - V. 99. - №. 2. - P. 761-774.

123. Lu Y., Yao J. Chloroplasts at the crossroad of photosynthesis, pathogen infection and plant defense //International journal of molecular sciences. - 2018. - V. 19. - №. 12. - P. 3900.

124. Ludewig F. et al. Mutants of GABA transaminase (POP2) suppress the severe phenotype of succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) mutants in Arabidopsis //PloS one. - 2008. - V. 3. - №. 10. - P. e3383

125. Lyubarev A.E., Kurganov B.I. Supramolecular organization of tricarboxylic acid cycle enzymes // BioSystems. - 1989. - V. 22. - P. 91102.

126. Maas E. V., Hoffman G. J. Crop salt tolerance—current assessment //Journal of the irrigation and drainage division. - 1977. - V. 103. - №. 2. -P. 115-134.

127. Marchi L. et al. Glutamate dehydrogenase isoenzyme 3 (GDH3) of Arabidopsis thaliana is regulated by a combined effect of nitrogen and cytokinin //Plant physiology and biochemistry. - 2013. - V. 73. - P. 368374.

128. Marchi L. et al. Glutamate dehydrogenase isoenzyme 3 (GDH3) of Arabidopsis thaliana is less thermostable than GDH1 and GDH2 isoenzymes //Plant physiology and biochemistry. - 2014. - V. 83. - P. 225-231.

129. Marchi L. et al. How to easily detect plant NADH-glutamate dehydrogenase (GDH) activity? A simple and reliable in planta procedure suitable for tissues, extracts and heterologous microbial systems //Plant Science. - 2021. - V. 304. - P. 110714.

130. Matsumoto K. et al. 2-oxoglutarate downregulates expression of vascular endothelial growth factor and erythropoietin through decreasing hypoxia-inducible factor-1a and inhibits angiogenesis //Journal of cellular physiology. - 2006. - V. 209. - №. 2. - P. 333-340.

131. Matz M. V. Amplification of representative cDNA samples from microscopic amounts of invertebrate tissue to search for new genes //Green Fluorescent Protein. - Humana Press. - 2002. - P. 3-18.

132. McLain A. L., Szweda P. A., Szweda L. I. a-Ketoglutarate dehydrogenase: a mitochondrial redox sensor //Free radical research. - 2011. - V. 45. - №. 1. - P. 29-36.

133. Mekonnen D. W., Flügge U. I., Ludewig F. Gamma-aminobutyric acid depletion affects stomata closure and drought tolerance of Arabidopsis thaliana //Plant Science. - 2016. - V. 245. - P. 25-34.

134. Miflin B. J., Lea P. J. Ammonia assimilation //Amino Acids and Derivatives. - Academic Press, 1980. - C. 169-202.

135. Millar A. H. et al. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants //Annual review of plant biology. - 2011. - V. 62. - P. 79-104.

136. Millar A.H., Hill S. A., Leaver C. J. Plant mitochondrial 2-oxoglutarate dehydrogenase complex: purification and characterization in potato //Biochemical Journal. - 1999. - V. 343. - №. 2. - P. 327-334

137. Miyashita Y., Good A. NAD(H)-dependent glutamate dehydrogenase is essential for the survival of Arabidopsis thaliana during dark-induced

carbon starvation // Journal of Experimental Botany. - 2008. - V.59. -P.667 - 680

138. Mooney B. P., Miernyk J. A., Randall D. D. The complex fate of a-ketoacids //Annual review of plant biology. - 2002. - V. 53. - №. 1. - P. 357-375.

139. Nagel M. et al. Glutamate dehydrogenase from Medicago sativa L., purification and comparative kinetic studies of the organ-specific multiple forms //Zeitschrift für Naturforschung C. - 1980. - V. 35. - №. 5-6. - P. 406-415.

140. Naliwajski M. R., Sklodowska M. The relationship between carbon and nitrogen metabolism in cucumber leaves acclimated to salt stress //PeerJ. - 2018. - V. 6. - P. e6043.

141. Narsai R. et al. Comparative analysis between plant species of transcriptional and metabolic responses to hypoxia //New Phytologist. -2011. - V. 190. - №. 2. - P. 472-487.

142. Negrao S., Schmöckel S. M., Tester M. Evaluating physiological responses of plants to salinity stress //Annals of botany. - 2017. - V. 119. -№. 1. - P. 1-11.

143. Nemeria N. S. et al. Evidence for functional and regulatory cross-talk between the tricarboxylic acid cycle 2-oxoglutarate dehydrogenase complex and 2-oxoadipate dehydrogenase on the l-lysine, l-hydroxylysine and l-tryptophan degradation pathways from studies in vitro //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. - 2018. - V. 1859. - №. 9. - P. 932939.

144. Nicolas B., Hillel F. GABA in plants: just a metabolite //Trends Plant Sci. - 2004. - V. 9. - №. 3. - P. 110-115.

145. Noor S., Punekar N. S. Allosteric NADP-glutamate dehydrogenase from aspergilli: purification, characterization and implications for metabolic regulation at the carbon-nitrogen interface //Microbiology. - 2005. - V. 151. - №. 5. - P. 1409-1419.

146. Nunes-Nesi A. et al. Regulation of the mitochondrial tricarboxylic acid cycle //Current opinion in plant biology. - 2013. - V. 16. - №. 3. - P. 335-343.

147. Oliveira T. et al. Crystal structure of NAD+-dependent Peptoniphilus asaccharolyticus glutamate dehydrogenase reveals determinants of cofactor specificity //Journal of structural biology. - 2012. - V. 177. - №. 2. - P. 543-552.

148. Oliver J. D. et al. The Aspergillus fumigatus dihydroxyacid dehydratase Ilv3A/IlvC is required for full virulence// PlosOne. - 2012. - V. 7 - №9 - P. 1-11

149. Parida A. K., Das A. B., Mittra B. Effects of salt on growth, ion accumulation, photosynthesis and leaf anatomy of the mangrove, Bruguiera parviflora //Trees. - 2004. - V. 18. - №. 2. - P. 167-174.

150. Peterson P.E. The structure of bovine glutamate dehydrogenase provides insights into the mechanism of allostery / P.E. Peterson, T.J. Smith // Structure. - 1999. - V. 7 - P. 769-782

151. Pirrung M. C., Ha H. J., Holmes C. P. Purification and inhibition of spinach. alpha.,. beta.-dihydroxyacid dehydratase //The Journal of Organic Chemistry. - 1989. - V. 54. - №. 7. - P. 1543-1548.

152. Plaut G. W. E., Beach R. L., Aogaichi T. Substrate activity of structural analogs of isocitrate for isocitrate dehydrogenases from bovine heart //Biochemistry. - 1975. - V. 14. - №. 12. - P. 2581-2588.

153. Popova T. N., de Carvalho M. Â. A. P. Citrate and isocitrate in plant metabolism //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. - 1998.

- V. 1364. - №. 3. - P. 307-325.

154. Pucciariello C. et al. Reactive oxygen species-driven transcription in Arabidopsis under oxygen deprivation //Plant Physiology. - 2012. - V. 159.

- №. 1. - P. 184-196.

155. Pucciariello C., Perata P. The oxidative paradox in low oxygen stress in plants //Antioxidants. - 2021. - V. 10. - №. 2. - P. 332.

156. Purnell M. P., Botella J. R. Tobacco isoenzyme 1 of NAD (H)-dependent glutamate dehydrogenase catabolizes glutamate in vivo //Plant physiology. - 2007. - V. 143. - №. 1. - P. 530-539.

157. Qin S. et al. Aquaporins and their function in root water transport under salt stress conditions in Eutrema salsugineum //Plant Science. - 2019.

- V. 287. - P. 110199.

158. Qiu X. M. et al. Signaling role of glutamate in plants //Frontiers in plant science. - 2020. - V. 10. - P. 1743.

159. Quail P.H. Phytochromes: photosensory perception and signal transduction/ P.H. Quail, M.T. Boylan, B.M. Parks // Science. - 1995. - V. 268 - №. 5211. - P. 675.

160. Ramputh A. I., Bown A. W. Rapid [gamma]-aminobutyric acid synthesis and the inhibition of the growth and development of oblique-banded leaf-roller larvae //Plant Physiology. - 1996. - V. 111. - №. 4. - P. 1349-1352.

161. Renault H. et al. The Arabidopsis pop2-1 mutant reveals the involvement of GABA transaminase in salt stress tolerance //BMC plant biology. - 2010. - V. 10. - №. 1. - P. 1-16.

162. Rice J. E., Dunbar B., Lindsay J. G. Sequences directing dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) binding are located on the 2-oxoglutarate dehydrogenase (E1) component of the mammalian 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complex //The EMBO journal. -1992. - V. 11. - №. 9. - P. 3229-3235.

163. Robinson, S. Regulation of glutamate dehydrogenase activity in relation to carbon limitation and protein catabolism in carrot cell suspension cultures / S. Robinson, G. Stewart, R. Phillips // Plant Physiology. - 1991. -V. 98. - P. 1190-1195.

164. Roosens N. H. et al. Proline metabolism in the wild-type and in a salttolerant mutant of Nicotiana plumbaginifolia studied by13C-nuclear magnetic resonance imaging //Plant physiology. - 1999. - V. 121. - №. 4. -P. 1281-1290.

165. Saddhe A. A. et al. Reactive nitrogen species: paradigms of cellular signaling and regulation of salt stress in plants //Environmental and Experimental Botany. - 2019. - V. 161. - P. 86-97.

166. Saglio P., Germain V., Ricard B. The response of plants to oxygen deprivation: role of enzyme induction in the improvement of tolerance to

165

anoxia //Plant responses to environmental stresses. - Routledge, 2018. - C. 373-393.

167. Sakakibara H., Fujii K., Sugiyama T. Isolation and characterization of a cDNA that encodes maize glutamate dehydrogenase //Plant and cell physiology. - 1995 - V. 36. - N. 5. - P. 789 - 797

168. Sarasqueta Gómez A. et al. Nitrogen Source and External Medium pH Interaction Differentially Affects Root and Shoot Metabolism in Arabidopsis// Front. Plant Sci.. 2016. - V. 7. - P. 1-12

169. Selye H. A syndrome produced by diverse nocuous agents //Nature. -1936. - V. 138. - №. 3479. - P. 32-32.

170. Shchiparev S., Sazanova K., Grigoriev S. Hydroxycitrate as dominating acid in leaves of ambary (Hibiscus cannabinus L.) //Biological Communications. - 2013. - №. 2. - P. 41-46

171. Shevchenko A. et al. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels //Analytical chemistry. - 1996. - V. 68. -№. 5. - P. 850-858.

172. Shigeoka S. Occurrence of thiamin pyrophosphate-dependent 2-oxoglutarate decarboxylase in mitochondria of Euglena gracilis/ S. Shigeoka [et al.] // FEBS Lett. - 1986. - V. 195. - P. 43-47.

173. Shin D. et al. Dihydrolipoamide dehydrogenase regulates cystine deprivation-induced ferroptosis in head and neck cancer //Redox biology. -2020. - V. 30. - P. 101418.

174. Shtereva L. A., Vassilevska-Ivanova R. D., Karceva T. V. Effect of salt stress on some sweet corn (Zea mays L. var. saccharata) genotypes //Archives of Biological Sciences. - 2015. - V. 67. - №. 3. - P. 993-1000.

175. Skopelitis D. S. et al. Abiotic stress generates ROS that signal expression of anionic glutamate dehydrogenases to form glutamate for proline synthesis in tobacco and grapevine //The Plant Cell. - 2006. - V. 18. - №. 10. - P. 2767-2781.

176. Snedden W. A. Regulation of the y-aminobutyrate-synthesizing enzyme, glutamate decarboxylase, by calcium-calmodulin: a mechanism for rapid activation in response to stress //Plant Responses to Environmental Stresses. - Routledge, 2018. - P. 549-574.

177. Stone S. R., Copeland L., Kennedy I. R. Glutamate dehydrogenase of lupin nodules: purification and properties //Phytochemistry. - 1979. - V. 18.

- №. 8. - P. 1273-1278.

178. Strumilo S. Short-term regulation of the a-ketoglutarate dehydrogenase complex by energy-linked and some other effectors //Biochemistry (Moscow). - 2005. - V. 70. - №. 7. - P. 726-729.

179. Sweetlove L. J. et al. Not just a circle: flux modes in the plant TCA cycle //Trends in plant science. - 2010. - V. 15. - №. 8. - P. 462-470.

180. Thurman, D.A. Isoenzymatic nature of L-glutamic dehydrogenase of higher plants / D.A. Thurman, C. Palin, M.V. Laycock // Nature. - 1965. -V. 207. - № 4993. - P. 193-194.

181. Tripathi A., Narayanan S. Potassium doped graphitic carbon nitride with extended optical absorbance for solar light driven photocatalysis //Applied Surface Science. - 2019. - V. 479. - P. 1-11.

182. Turano F. J. et al. Characterization and expression of NAD (H)-dependent glutamate dehydrogenase genes in Arabidopsis //Plant Physiology. - 1997. - V. 113. - №. 4. - P. 1329-1341.

183. Turano F. J. et al. Purification of mitochondrial glutamate dehydrogenase from dark-grown soybean seedlings //Plant Physiology. -1996. - V. 112. - №. 3. - P. 1357-1364.

184. Uhrig R. G., Ng K. K. S., Moorhead G. B. G. PII in higher plants: a modern role for an ancient protein //Trends in plant science. - 2009. - V. 14.

- №. 9. - P. 505-511.

185. Van Buskirk E. K., Decker P. V., Chen M. Photobodies in light signaling //Plant physiology. - 2012. - V. 158. - №. 1. - P. 52-60.

186. Van Dongen J. T. et al. Regulation of respiration in plants: a role for alternative metabolic pathways //Journal of plant physiology. - 2011. - V. 168. - №. 12. - P. 1434-1443.

187. Van Zelm E., Zhang Y., Testerink C. Salt tolerance mechanisms of plants //Annual Review of Plant Biology. - 2020. - V. 71. - P. 403-433.

188. Verbruggen N., Hermans C. Proline accumulation in plants: a review //Amino acids. - 2008. - V. 35. - №. 4. - P. 753-759.

189. Voskresenskaya N. P. Blue light and carbon metabolism //Annual review of plant physiology. - 1972. - V. 23. - №. 1. - P. 219-234.

190. Voskresenskaya N. P. Effect of light quality on carbon metabolism //Photosynthesis II. - Springer, Berlin, Heidelberg, 1979. - P. 174-180.

191. Wang Y. et al. KAT2A coupled with the a-KGDH complex acts as a histone H3 succinyltransferase //Nature. - 2017. - V. 552. - №. 7684. - P. 273-277.

192. Wedding R. T., Black M. K. Nucleotide activation of cauliflower a-ketoglutarate dehydrogenase //Journal of Biological Chemistry. - 1971. - V. 246. - №. 6. - P. 1638-1643.

193. Yamaya T. et al. Synthesis of [15N] glutamate from [15N] H4+ and [15N] glycine by mitochondria isolated from pea and corn shoots //Plant physiology. - 1986. - V. 81. - №. 3. - P. 754-757.

194. Yamaya T., Oaks A., Matsumoto H. Characteristics of glutamate dehydrogenase in mitochondria prepared from corn shoots //Plant physiology. - 1984. - V. 76. - №. 4. - P. 1009-1013.

195. Yang N. et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming //Nature methods. - 2017. - V. 14. - №. 6. - P. 621-628.

196. Zahra N. et al. Hypoxia and Anoxia Stress: Plant responses and tolerance mechanisms //Journal of Agronomy and Crop Science. - 2021. -V. 207. - №. 2. - P. 249-284.

197. Zar J. H. Biostatistical analysis. - Pearson Education India, 1999.

198. Zhang C. et al. Dihydroxyacid dehydratase is important for gametophyte development and disruption causes increased susceptibility to salinity stress in Arabidopsis //Journal of experimental botany. - 2015. - V. 66. - №. 3. - P. 879-888.

199. Zhang Y. et al. New insights into physiological effects of anoxia under darkness on the iconic seagrass Zostera marina based on a combined analysis of transcriptomics and metabolomics //Science of The Total Environment. - 2021. - V. 768. - P. 144717.

200. Zheng J. L. et al. Exogenous proline reduces NaCl-induced damage by mediating ionic and osmotic adjustment and enhancing antioxidant defense in Eurya emarginata //Acta physiologiae plantarum. - 2015. - V. 37. - №. 9. - P. 1-10.

201. Zheng P. F. et al. Identification of Phytochrome-Interacting Factor Family Members and Functional Analysis of MdPIF4 in Malus domestica //International journal of molecular sciences. - 2020. - V. 21. - №. 19. - P. 7350.

202. Zhou J. et al. A multipronged approach unravels unprecedented protein-protein interactions in the human 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complex //Journal of Biological Chemistry. - 2018. - V. 293. -№. 50. - P. 19213-19227.

203. Zhu J. K. Salt and drought stress signal transduction in plants //Annual review of plant biology. - 2002. - V. 53. - №. 1. - P. 247-273

ПРИЛОЖЕНИЕ

Праймеры к генам 2ОГДК, ГДГ, ОД и ССАДГ

Ген Организм Праймер Нуклеотидная последовательность Температура отжига, оС

OGDH1 Zea mays Прямой ATTCCAATGACCGTGACAGG 59

Обратный AAAAATCGGCGCATCCAATG

OGDH3 Zea mays Прямой GAAGCCATGACTACTCTGCC 61

Обратный GCTCCGCATCTTGGTTCATA

DLST1 Zea mays Прямой TCTGAGCTGAGGATACCGAG 61

Обратный AGCAGCTCTATTGCTCTTGC

DLST2 Zea mays Прямой AAAGAAAGCAAC TGAGGGGG 60

Обратный GAAGAAGACAGCCTCTCTGC

DLD1 Zea mays Прямой CTACCGTGAGTGAAGCCCTC 60

Обратный CAAGGAAGCACAAAACCCCG

DLD2 Zea mays Прямой TCCATCCAAGGCTCTTCTGC 60

Обратный TGGGAGGTCCACTTCCAGAT

OGDH1 Beta vulgaris Прямой GCTGTGGACCGAGATGAAAC 59

Обратный AGAGAGCTGAAGCGGTATCC

DLST1 Beta vulgaris Прямой ACTATCTGACCACCGACCAC 59

Обратный AGAGAGCTGAAGCGGTATCC

OGDH1 Arabidopsis thaliana Прямой TCTTCACAATCGGAAATAATGAAGC 60

Обратный CAGCACGAAACCACACCATT

OGDH2 Arabidopsis thaliana Прямой CGTCTAGTCCTCTGCTCTGG 60

Обратный ATCGGCTCTTCTTGACACCA

GDH1 Zea mays Прямой GCGGAGAACAAGGGGATCAA 58

Обратный ACAGGATCTCGTCTGCCTCT

GDH2 Zea mays Прямой TGATCCAGAGGCAGACGAGA 58

Обратный GTAATGCGCGGTCAATGGTC

DHAD1 Zea mays Прямой AAGACGGAGGAAATGGACCC 60

Обратный TGCCACATGCAAAACCGAAC

DHAD2 Zea mays Прямой TATGCCCTGAAGCACAGGAA 60

Ген Организм Праймер Нуклеотидная последовательность Температура отжига, оС

Обратный CCTGGCAAACAGCCTTTGAT

SSADH1 Zea mays Прямой CACAGCCTGGGGATGTCATT 58

Обратный GGTGCCACCTGCGTTTGTAT

SSADH2 Zea mays Прямой GTGCTTAGAAGGGCGTGAGT 58

Обратный CAGGTTCGAAGGTGAAGCCA

Праймеры для метил-специфичной ПЦР к генам ООБН1 и ООБНЗ

Ген Положение исследуемого цитозина Название Нуклеотидная §оследовательность Температура отжига оС

1 2 3 4 5 6

прямой М ОТТТТАТАТТОТАААААТТОАТСОА 52

I -144 нукл. обратный М ААТТТТСССАТСТААТТАТСТССОТ

прямой и ОТТТТАТАТТОТАААААТТОАТТОА 52

обратный И ААТТТТСССАТСТААТТАТСТССАТ

прямой М ОТТТАОАТТООТТАТОСОТ 52

ООБН1 II -190 нукл. обратный М ААТТТТСССАТСТААТТАТСТССОТ

прямой И ОТТТАОАТТООТТАТОТОТ 52

обратный И ААТТТТСССАТСТААТТАТСТССАТ

прямой М ТТТТТТООАТОАТАОТТТТООСОТ 52

III -316 нукл. обратный М ААТТТТСССАТСТААТТАТСТССОТ

прямой И ТТТТТТООАТОАТАОТТТТООТОТ 52

обратный И ААТТТТСССАТСТААТТАТСТССАТ

прямой М ТОТТАТОООААОАААТСОС 51

I -197 нукл. обратный М СССТАСАСАААААСААААА

прямой И ТОТТАТОООААОАААТТОС 51

обратный И СССТОСАСАААААСААААА

ООБНЗ прямой М ТТТТАОТОТТТТОТАСОО 51

II -275 нукл. обратный М СССТАСАСАААААСААААА

прямой И ТТТТАОТОТТТТОТАТОО 51

обратный И СССТОСАСАААААСААААА

прямой М ОТОСОТААТТОТТСОА 49

III -297 нукл. обратный М СССТАСАСАААААСААААА

прямой И ОТОТОТААТТОТТТОА 49

обратный И СССТОСАСАААААСААААА

Праймеры для метил-специфичной ПЦР к генам ООИ1 и ООИ2

Ген Название Положение исследуемого цитозина Последовательность Температура отжига , С

ОБИ1 Прямой М 1 -779 АТТТОТАОАТТТААТСООТТОООТ 52-53

Обратный М лллллстллллтслстлттстсатт

Прямой и АтттатлалтттААттааттааат

Обратный И АААААсТААААТслсТАТТстсАТТ

Прямой М 2 -419 тсатлатААтттттаттттатаа 52-53

Обратный М АААААсТААААТслсТАТТстсаТТ

Прямой И ттатлатААтттттаттттатаа

Обратный И АААААсТААААТслсТАТТстсАТТ

Прямой М 3 -340 тллаАттатАТАттттсаатаатАт 52-53

Обратный М АААААсТААААТслсТАТТстсаТТ

Прямой И тллаАттатАТАтттттаатаатАт

Обратный И АААААсТААААТслсТАТТстсАТТ

ОБИ2 Прямой М 1 -304 АалтААаттАаттАтааалтааас 53

Обратный М ТАсатсТТсТТААТААссАААсаАА

Прямой И АалтААаттАаттАтааалтааата

Обратный И ТАсАТсТТсТТААТААссАААсААА

Прямой М 2 -263 аатААатаалсааААААааА 53

Обратный М ТАсатсТТсТТААТААссАААсаАА

Прямой И аатААатаалтааААААааА

Обратный И ТАсАТсТТсТТААТААссАААсААА

Прямой М 3 -185 ааттсаатттлатттталААТААт 53

Обратный М ТАсатсТТсТТААТААссАААсаАА

Прямой И ааттсаатттлатттталААТААт

Обратный И ТАсАТсТТсТТААТААссАААсААА

Праймеры к СрО-островкам в составе промоторов генов ВНАБ1 и 0НА02

Ген Название Последовательность Т отжига

ОЭНА1 А Прямой ОАТААТАТААООТТТОТТТТАТТТТТ 50

Обратный АСТААСТАТААССССТААТТССТАС

ВБНА1 В Прямой ТТТТОАТАТАТАООАТТТТОТТОАТОА АА 55

Обратный АААСАААААСАААТААААСТАТААСТ АТАА

ВБНА2 Прямой ТООААААТАТТТААААОТТТАОААА 49-50

Обратный АТАААТАААСААААААСААААААСА

Таблица 5.

Изменение уровня пролина (ммоль/ г с.м.) в зеленых листьях кукурузы

( п=4, р<0.03)

Время инкубации, часы

0 1 3 6 12 24

Контроль 0.60 0.70 0.75 0.60 0.50 0.50

Опыт 0.60 1.90 1.70 1.60 2.40 3.5

Таблица 6

Субклеточная локализация 2ОГДК активности в листьях кукурузы

( п=4, р<0.03)

Фракция органоидов Общая активность, Е/грамм сырой массы % активности фермента от общего содержания

Пероксисомы - -

Цитоплазма 2.1 1.5

Хлоропласты - -

Митохондрии 137.4 98.5

Таблица 7

Активность маркерных ферментов, используемых для определения чистоты

фракций ( п=4, р<0.03)

Фракция органоидов Активность СДГ Активность АДГ Активность каталазы Содержание хлорофилла

Е/мл % Е/мл % Е/мл % мг/мл %

Цитоплазма 0.05 3.4 3.20 86.9 н/о н/о 1.08 1.20

Хлоропласты 0.06 4.3 0.21 6.0 0.01 3.60 86.30 95.70

Митохондрии 1.36 92.3 0.22 6.0 0.02 5.70 2.79 3.10

Пероксисомы н/о н/о 0.04 1.1 0.25 90.70 н/о н/о

Рис.1 Изоферментный состав 2ОГДГ в листьях кукурузы Zea mays L.

2 70

и

и 60

и 50

д

н 40

и

о 30

к

и

к 20

« < 10

0

2 3 6

Время инкубации, часы

12

24

0

1

Рис.2 Общая активность 2-ОГДК в проростках сахарной свёклы при действии солевого стресса. Различия между значениями контрольной и опытной группы статистичски достоверны (р<0.05).

Рис. 3 Динамика метилирования (5тС) промотора гена ООВИ1 и его экспрессии в листьях кукурузы в контрольной группе.

Рис. 4 Относительный уровень транскриптов гена ООВИ1 2ОГДГ в проростках сахарной свёклы при действии солевого стресса. Различия между значениями контрольной и опытной группы статистичски достоверны

(р<0.05).

л X

о

РЭ

о

а _

^ 03

5К

х л ч

о н к

и О

х н о

о

о н с к а

и X

а н

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Н2О

■5тС

2 3 4 6 8 12 16 18 22 24 Время инкубации, часы

100

90 о4

80 оЯ к

X

70

РЭ