Функционирование малатдегидрогеназной системы в листьях кукурузы в стрессовых условиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Гатауллина Марина Олеговна

• Гатауллина Марина Олеговна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Гатауллина Марина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики ферментов малатдегидрогеназной системы

1.1.1. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики НАД+-МДГ

1.1.1.1. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики микротельцовой НАД+-МДГ

1.1.1.2. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики митохондриальной НАД+-МДГ

1.1.1.3. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики цитоплазматической НАД+-МДГ

1.1.2. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики НАДФ+-МДГ

1.1.3. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики НАД+- и НАДФ+-МЭ

1.2. Экспрессионная регуляция ферментов

1.3. Эпигенетические механизмы регулирования ферментов окислительного метаболизма

1.3.1. Виды эпигенетических механизмов

1.3.2. Методы анализа эпигенетических исследований

1.3.3. Роль эпигенетики в адаптации растений к стрессам

1.4. Роль малатдегидрогеназной системы в нормальных и стрессовых условиях

1.4.1. Роль НАД+- малатдегидрогеназной системы в адаптации

растений в нормальных и стрессовых условиях

1.4.2. Роль НАДФ+- малатдегидрогеназы в регуляции клеточного метаболизма

1.4.3. Функционирование НАД+-малик-энзима в норме и в условиях стресса

1.4.4. Функционирование НАДФ+-МЭ в норме и в условиях стресса

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИИССЛЕДОВАНИЯ

2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1 Объекты исследования

2.2.2 Определение активности малатдегидрогеназы

2.2.3 Определение количества белка

2.2.4 Выделение и очистка малатдегидрогеназы

2.2.5 Получение пероксисомальной фракции

2.2.6 Электрофоретические исследования

2.2.6.1 Аналитический электрофорез

2.2.6.2 Определение гомогенности ферментных препаратов

2.2.6.3 Специфическое проявление ферментов

2.2.6.4 Определение молекулярной массы субъединиц

2.2.7 Определение молекулярной массы нативного фермента

2.2.8 Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов

2.2.9 Выделение РНК и ДНК. Определение концентрации суммарной клеточной РНК

2.2.10 Получение кДНК методом обратной транскрипции

2.2.11 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в

агарозном геле

2.2.12. Проведение ПЦР в реальном времени

2.2.13. Модификация ДНК бисульфитом натрия

2.2.14. Анализ промоторов генов и подбор праймеров для метил-специфичной ПЦР

2.2.15. Проведение метил-специфичной полимеразной цепной реакции

2.2.16. Бисульфитное секвенирование

2.2.17. Постановка эксперимента по созданию светового режима

2.2.18. Постановка эксперимента по созданию гипоксического стресса

2.2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХОБСУЖДЕНИЕ

2.3.1. Биохимические аспекты функционирования малатдегидрогеназной ферментной системы в мезофилле листьев

кукурузы

2.3.1.1. Субклеточная локализация и изоферментный состав МДГ

2.3.1.2. Получение в гомогенном состоянии различных малатдегидрогеназиз мезофилла листьев кукурузы

2.3.1.3. Определение молекулярной массы нативных молекул МДГ

и малик-энзимов

2.3.1.4. Измерение молекулярной массы субъединиц препаратов энзимов

2.3.1.5. Субъединичное строение

2.3.1.6 Определение величиныконстанты Михаэлиса

2.3.1.6.1. Сродство ферментов к малату

2.3.1.6.2. Величины Км исследуемых ферментовпри использовании оксалоацетата

2.3.1.6.3. Сродство малатдегидрогеназ к пирувату

2.3.1.6.4. Сродство различных малатдегидрогеназк коферментам

2.3.1.7. Определение оптимальных значений рН

малатдегидрогеназных реакций

2.3.1.7.1. Определение рН-оптимумов оксидоредуцирующих малатдегидрогеназ

2.3.1.7.2. Определение величин рН- оптимумов

декарбоксилирующих малатдегидрогеназ

2.3.1.8.Изучение влияния металлов на активность

малатдегидрогеназных реакций

2.3.2.Молекулярные аспекты функционирования

малатдегидрогеназной системы в мезофилле листьев кукурузы

2.3.3. Влияние светового режима на функционирование малатдегидрогеназной системы в листьях кукурузы

2.3.4. Функционирование малатдегидрогеназной ферментативной

95

системы в листьях кукурузы в гипоксических условиях

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЯБ - рестрикционная эндонуклеаза ЯГ - электрофоретическая подвижность белка АМФ - аденозинмонофосфат АТФ - аденозинтрифосфат АФК - активные формы кислорода гМДГ - глиоксисомальная малатдегидрогеназа ДДС - додецилсульфат натрия ДКС - дальний красный свет ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КС - красный свет МДГ - малатдегидрогеназа мМДГ - митохондриальная малатдегидрогеназа мРНК - матричная РНК

МС-ПЦР - метилспецифичная полимеразная цепная реакция МЭ - малик-энзим

НАД(Н) - никотинамидадениндинуклеотид НАДФ(Н) - никотинамидадениндинуклеотидфосфат ОА - оксалоацетат

пре-гМДГ - предшественник глиоксисомальной малатдегидрогеназы

ПЦР - полимеразнаяцепнаяреакция

РНК - рибонуклеиноваякислота

тРНК - транспортнаяРНК

ФМС - феназинметасульфат

цМДГ - цитоплазматическаямалатдегидрогеназа

цРНК - циклическаяРНК

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функционирование малатдегидрогеназной системы в листьях кукурузы в стрессовых условиях»

Актуальность проблемы.

Одним из главных направлений развития биохимии является выявление механизмов регуляции метаболизма в живых организмах. Среди множества проблем данной области науки важное место занимает изучение ферментативных систем, и их роли в регуляции поддержания жизнедеятельности в нормальных условиях и адаптации к различным неблагоприятным факторам.

Малатдегидрогеназная система представлена четырьмя ферментами: НАД+-малатдегидрогеназа (1.1.1.37), НАДФ+-малатдегидрогеназа (1.1.1.82), НАД+- малик-энзим (1.1.1.39) и НАДФ+-малик-энзим (1.1.1.40).

Данная ферментативная система играет важную роль в регуляции протекания метаболизма живых организмов. Двойной путь утилизации малата (оксидоредуцирующий и декарбоксилирующий) уменьшает зависимость организма от гликолиза в процессах анаболизма и катаболизма. Растительная МДГ является необходимым регулирующим компонентом клеточного метаболизма, обеспечивающим его изменения при адаптации к стрессовым условиям.

Особый интерес представляет изоферментный состав и субклеточная локализация изоформ различных малатдегидрогеназ. Кроме того, важными, но малоизученными аспектами исследований энзимов являются функции и механизмы регуляции их активности на генетическом и эпигенетическом уровнях. Одним из наиболее интересных и перспективных направлений исследования эпигенетических механизмов является метилирование промоторов генов.

В настоящее время, все статьи, посвященные малатдегидрогеназам, не рассматривают эти ферменты как целостную взаимосвязанную систему. В данной работе предпринимается попытка обобщить биохимические,

молекулярные и эпигенетические аспекты регуляции активности всех четырех ферментов малатдегидрогеназной системы.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось изучение физико-химических и каталитических характеристик изоформ ферментов малатдегидрогеназной системы растений и молекулярно-эпигенетических механизмов их функционирования в нормальных и стрессовых условиях.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать изоферментный состав НАД(Ф)+-зависимых малатдегидрогеназ и их субклеточную локализациюв листьях кукурузы;

2. Получить электрофоретически гомогенные препараты исследуемых ферментов малатдегидрогеназной системы;

3. Изучить физико-химические и регуляторные свойства некоторых изоферментов оксидоредуцирующих и декарбоксилирующих МДГ;

4. Определить локализацию, структуру и регуляцию генов, кодирующих различные малатдегидрогеназы;

5. Изучить особенности биохимических и молекулярных механизмов регуляции функционирования малатдегидрогеназной системы в листьях кукурузы при различном световом режиме;

6. Исследовать особенности регуляции работы малатдегидрогеназной системы в ходе адаптации клеточного метаболизма к стрессовым условиям,вызванным гипоксией;

7. Выявить роль статуса метилирования промоторов генов исследуемых изоформв регуляции работы малатдегидрогеназных ферментов.

Научная новизна и значимость работы.

Были получены гомогенные препараты трех НАД+-зависимых и одной НАДФ+-зависимой оксидоредуцирующих малатдегидрогеназ, локализованных в различных компартментах клетки, а также трех малик-энзимов. Свойства полученных ферментов, изученные в одной лаборатории, позволили провести достоверное сравнение их между собой.

Исследование уровня метилирования промоторов генов, кодирующих малатдегидрогеназы кукурузы при различных световых режимах, показало, что эпигенетические механизмы играют важную роль в регуляции экспрессии данных генов. Так, для nadf-me установлена четкая зависимость между уровнем транскриптов и статусом метилирования отдельных CG -динуклеотидов. Высокий метильный уровень промоторов данных генов приводит к снижению содержания транскриптов генов НАД+-зависимых малик-энзимов. Зависимость экспрессии гена от метильного статуса промотора показана также для одного из цитоплазматических изоферментов НАД+-МДГ. Следовательно, обнаружен эпигенетический механизм регуляции функционирования некоторых изоформ малатдегидрогеназной ферментной системы.

Практическая значимость.

Впервые проведенный в работе анализ нуклеотидных последовательностей промоторов малатдегидрогеназных генов позволил подобрать метил-специфичные праймеры, которые можно использовать в научно-исследовательских лабораториях при изучении эпигенетического контроля за функциональным состоянием ферментных систем.

Модифицированная методика очистки пероксисомальной малатдегидрогеназы может быть использована для исследования других микротельцовых ферментов. Полученные препараты изоформ МДГ могут применяться в других научных исследованиях.

Результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по биохимии, физиологии растений, спецкурсов, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых, бакалаврских и магистерских работ.

Практическая значимость данной работы состоит не только в проведении фундаментальных исследований. Изучение механизмов работы малатдегидрогеназной системы необходимо при создании модифицированных сортов растений с повышенной экспрессией генов,позволяющих адаптировать растение к неблагоприятным условиям.

Полученные результаты по влиянию светового режима на метаболизм растений открывают возможности для создания светильников, обладающих оптимальными спектральными характеристиками для выращивания растений.

Положения, выносимые на защиту.

1. В мезофилле листьев кукурузы обнаружены 11 различных изоформ оксидоредуцирующих и декарбоксилирующих малатдегидрогеназ, для которых выявлена субклеточная локализация в митохондриях, хлоропластах, пероксисомах и цитоплазме. Для различно локализованных изоферментов МДГ обнаружены отличия в физико-химических, каталитических и регуляторных свойствах. Для них характерна специфическая физиологическая роль в регуляции клеточного метаболизма в стрессовых условиях.

2. Все изученные изоформы энзимов МДГ являются изоферментами, то есть генетически детерминированными формами. Обнаружены 10 генов НАД+-зависимой малатдегидрогеназы, из них 4 цитоплазматических, 1 глиоксисомальная и 2 митохондриальных, а также псевдогены и гены с неизвестной локализацией. Кроме того, выявлены гены для декарбоксилирующих малатдегидрогеназ и НАДФ+-МДГ. Был проанализирован нуклеотидный состав их промоторов и подобраны специфические праймеры для исследуемых генов.

3. Исследование генетической детерминации генов МДГ и МЭ показало, что их большое количество позволяет экспрессировать отдельные формы фермента, что дает возможность растениям адаптироваться к различным условиям. Наличие CpG-островков в промоторах генов позволяет сделать заключение о важной роли эпигенетических механизмов в регулировании экспрессии ферментов в экстремальных условиях.

4. Исследовано действие светового режима на функционирование малатдегидрогеназ. Установлено, что НАД+-зависимые малатдегидрогеназы листьев кукурузы обладают более высокой активностью в темноте, что обуславливает усиление функционирования цикла Кребса и процессов, связанных с ним. Однако одна из цитоплазматических НАД+-МДГ и одна

изоформа НАД+-МЭ демонстрировали высокую активность на свету, характерную для НАДФ+-зависимых форм.

5. Установлено, что пероксисомальная МДГ и НАДФ+-МЭ участвуют в адаптационном ответе растительной клетки на стрессовые условия, вызванные гипоксией. Так, в условиях гипоксии протекание ЦТК ингибируется, что сопряжено со снижением экспрессии митохондриальных ферментов. В то же время запускается интенсификацияэкспрессии пероксисомальной формы МДГ.

6. Выявлен эпигенетический механизм в регулировании отдельных изоформ малатдегидрогеназной системы. Установлено влияние метилирования CG-динуклеотидов промоторов генов nadf-me и cyt-mdh2 в листьях растений при смене светового режима. Однако при гипоксии такой зависимости не обнаружено.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 19-ой, 20-ой, 21-ой, 22-ой и 23-ей международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019), 8, 9, 10, 11 съездах общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (2016, 2017, 2018, 2019); межрегиональных конференциях, посвященных памяти профессора А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019).

Публикации.

Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 18 публикациях - статьях и тезисах, среди которых 7 статей, опубликованных в журналах, включенных в список ВАК .

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и

обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (168 источников). Иллюстрационный материал включает 44 рисунка и 7 таблиц.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики ферментов малатдегидрогеназной системы

1.1.1. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики НАД+-МДГ

В настоящее время, наиболее изученным ферментом семейства малатдегидрогеназ является НАД+-зависимая малатдегидрогеназа (1.1.1.37), катализирующая реакцию превращения малата в оксалоацетат и их синтез в организме [50]. Данный фермент находится в растениях, животных и микроорганизмах, кодируется, как правило несколькими генами и имеет множество изоформ [106].

Из кинетических исследований известно, что в реакции фермент первоначально связывается с НАД+/НАДН, а затем с субстратом. Активный центр малатдегидрогеназы состоит в основном из гидрофобных аминокислот, содержащих сайты связывания для субстрата и никотинамидного кольца кофермента. При образовании комплекса фермент-коэнзим-субстрат белок претерпевает конформационные изменения.

ДДС-форез препаратов из мембран корней кукурузы (Zea mays) показал, что молекулярная масса связанных с мембраной мономеров равна 41 кДа, в то время как мономеры (35 кДа) и димеры (70 кДа) были обнаружены для свободных изоферментов. Мембранно связанная МДГ из соцветий цветной капусты (Brassica oleracea) и листьев шпината (Spinacia Oleracea L.) показали молекулярные массы, схожие с мембрано связанной МДГ кукурузы. При этом, МДГ, как правило, является димером с массой 65-85 кДа или тетрамером [4]. Однако встречаются и октомерные формы, преимущественно, в бактериальных организмах [9].

Ионы металлов могут оказывать большое влияние на ферменты. В частности, четвертичные структуры ферментов стабилизируются двух- и

одновалентными металлами, такими как Ca2+, Mg2+, №+, K+ и ингибируются Fe2+. При этом, активация и ингибирование фермента различными ионами для разных организмов видоспецифично [20].

Растительная ткань содержит несколько молекулярных форм малатдегидрогеназы. Физиологическое значение множественных форм МДГ заключается в их участии в разных метаболических путях [164]. Отличия в функциях соответствуют различиям в субклеточных местоположениях: НАД+-МДГ обнаружен в микротельцах, таких как глиоксисомы и пероксисомы, в митохондриях и в цитозоле.

Малат или оксалоацетат образуются в клетке в зависимости от физиологических параметров, таких как окислительно -восстановительное состояние НАД+ и функций ткани [7].

1.1.1.1. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики

микротельцовой НАД+-МДГ

Глиоксисомы, как и пероксисомы листьев, относятся к семейству микротелец. Они лишены ДНК, окружены единственной мембраной и обладают по крайней мередвумя биохимическими возможностями: обработкой O2 и окислением жирных кислот [24].

Установлено, что в жировых семядолях ткани эндосперма присутствует глиоксисомальная малатдегидрогеназа (гМДГ), которая по своему электрофоретическому поведению отличается от митохондриальной и цитозольной форм. Она представляет собой гомодимер с Мг 67 кДа и молекулярной массой субъединицы 33 кДа, хотя имеет тенденцию образовывать агрегаты при более высоких концентрациях. Изоэлектрическая точка гМДГ равна 8,92, что значительно выше, чем изоэлектрическая точка митохондриальной МДГ (рН 5,39).

Форма МДГ из микротелец значительно менее термостабильна, чем другие изоферменты. Антитела, вырабатываемые против гМДГ, отличают МДГ микротелец от других изоферментов по их способности к селективному ингибированию и преципитации [76].

По кинетическим свойствам микротельцовая МДГ сходна с митохондриальной формой. Например, для семян арбуза Км (ОА) = 0,18 мкМ; Км (НАДН) = 0,13 мкМ; Км (малат) = 7,18 мкМ; Км (НАД+) = 0,46 мМ [27] .

Глиоксилатный цикл является субстрат-индуцируемым процессом, как и биосинтез глиоксисом. Как следствие, время появления и снижения гМДГ во время развития растения сильно отличается от мМДГ. Глиоксисомная МДГ отсутствует в сухих семенах. После лаг-фазы в течение 1,5 дней наблюдается значительное увеличение количества и активности фермента, которое достигает пика на 4-й день, а затем снижается. В это же время, мМДГ уже присутствует в сухих семенах в значительных количествах. Во время развития семядолей оба изофермента синтезируются в цитоплазматических рибосомах [17].

Транспортировка глиоксисомальной МДГ от сайта синтеза в цитоплазме к сайту функции в органелле включает в себя перемещение белка через единственную мембрану органеллы. Глиоксисомная МДГ из арбуза с субъединицей Мг=33000 Да является исключительной, поскольку она синтезируется в качестве более крупного предшественника. В зародышевых клетках пшеницы синтезируется белок с Mr = 38000 Да, а в системе ретикулоцитов молекулярная масса еще более высокая - 41000 Да [27].

Эксперименты in vivo показали, что более крупный белок (пре-гМДГ) является предшественником нативного фермента, совместимого с посттрансляционным транспортом гМДГ. Продукт бесклеточной трансляции импортируется посттрансляционно в глиоксисомы. Однако глиоксисомы из семядолей арбуза и эндосперма клещевины вели себя по-разному. Когда продукты трансляции из мРНК арбуза инкубировали с глиоксисомами арбуза, предшественник гМДГ (пре-гМДГ) обрабатывался неэффективно, что было выявлено иммунопреципитацией с наноспецифичными антителами.

Добавление к смеси протеиназы, расщепляющей по специфическим пептидным связям (трипсин, химотрипсин) или неспецифично (протеиназа К, проназа Е, папаин), приводило к количественному превращению субъединицы -предшественника в субъединицу 33000 Да, что указывает на протеиназную чувствительность вещества. Инкубация продуктов трансляции генов МДГ арбуза с глиоксисомами из фасоли касторовой привела к эффективной обработке и превращению пре-гМДГ в устойчивую к протеиназе форму субъединицы [76].

Пероксисомы, также как и глиоксисомы содержат большое количество фермента НАД+-МДГ. Предполагается, что окисленный компонент листового пероксисомального малатного челнока может являться аспартатом, а не оксалоацетатом, поскольку аспартат является субстратом для аспартатных аминотрансфераз, функционирующих в трех различных путях пероксисом листьев. Глиоксисомы в жировой ткани и пероксисомы листьев являются близкородственными структурами у высших растений. При озеленении семядолей арбуза или огурца микротела претерпевают функциональный переход от глиоксисомального метаболизма к пероксисомному. Эти результаты подтверждают гипотезу об одной популяции, впервые предложенную Trelease et а1. Это означает, что микротела сохраняются во время перехода и что изменяется только их энзиматическое содержание. Альтернативная гипотеза ранее предполагала, что глиоксисомы деградируют и создаются новые пероксисомы при озеленении семядолей. Поэтому ферменты, присутствующие как в глиоксисомах, так и в пероксисомах, одинаковы: серологически неразличимы, имеют те же изоэлектрические точки и сходны по субъединичному строению (обе формы являются димерами) [76].

1.1.1.2. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики

митохондриальной НАД+-МДГ Митохондриальная малатдегидрогеназа была выделена из семядолей прорастающих проростков арбуза и отделена от цитозольных и глиоксисомальных изоферментов с помощью аффинной хроматографии на 5'-АМФ-сефарозе. Данный изофермент представляет собой гомодимер с Mr 74000 Да. Субъединицы разделяются в электрофорезе в ДДС-полиакриламидном геле на субъединицы с молекулярной массой 38 кДа.

Развитие митохондриальной и глиоксисомальной МДГ во время прорастания семян определяли с помощью радиального иммунодиффузионного анализа, а также флуоресцентной иммуногистохимической локализации двух изоферментов со специфическими антителами. Было обнаружено, что в семядолях незаряженных семян содержится мМДГ. В течение первых четырех дней прорастания активность фермента увеличилась в 3 раза, что в итоге составляет 16% от общей активности МДГ, извлеченной из ткани семядолей.

Митохондриальная МДГ синтезируется de novo в течение первых 4 дней прорастания. Синтез происходит на цитоплазматических рибосомах. Кинетические параметры мМДГ очень похожи на параметры гМДГ: Км (оксалоацетат) = 0,15 мМ; Км (НАДН 2) = 0,11 мМ; Км (малат) = 3,69 мМ; Км (НАД+) = 0,46 мМ [76].

Митохондриальная МДГ, как и большинство митохондриальных ферментов, также синтезируется в качестве предшественника с более высокой молекулярной массой у растений и млекопитающих [76].

1.1.1.3. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики

цитоплазматической НАД+-МДГ

Цитоплазматические МДГ являются энзимами, которые кодируются одним (персик, пшеница, сосна), либо несколькими (кукуруза, фасоль, эхиноцерус)

генами. Их работа дифференцирована по локализации в ткани и времени онтогенеза. Так например, после отделения неочищенных экстрактов из семядолей арбуза с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и специфического для МДГ окрашивания, в течение первого периода прорастания распознаются три цитоплазматических изоэнзима МДГ. При этом, цМДГ-1 встречаются в значительном количестве уже в семядолях сухих семян, в то время как цМДГ-2 и 3 присутствуют в очень малом количестве. Во время прорастания в темноте активность ферментов увеличивается с разной скоростью, но все они достигают максимума на третий день, а затем наблюдается постепенно снижение скорости ферментативной реакции.

Принимая по внимание отсутствие определяемого количества гМДГ в корнях и листьях, очевидно, что мМДГ и цМДГ являются двумя изоферментами для основного клеточного метаболизма [76].

Биосинтез цитоплазматических изоферментов отличается от глиоксисомальной и митохондриальной форм. В то время как гМДГ и мМДГ синтезируются как предшественники с более высокой молекулярной массой, трансляция цитозольного МДГ in vitro дает продукт, который имеет ту же молекулярную массу, что и субъединица нативного изофермента (39,5 кДа) [83].

1.1.2. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики

НАДФ+-МДГ

НАДФ+-МДГ (1.1.1.82) - фермент, катализирующий обратимое превращение оксалоацетата в малат с использованием НАДФН в качестве кофактора. НАДФН-МДГ был выделен и охарактеризован из листьев C4 -растений: кукурузы, шпината, гороха и сорго. Малат, образующийся в ходе реакции НАДФН-МДГ в клетках мезофилла C4 - растений, транспортируется в хлоропласты клеток обкладки и участвует в ее обеспечении углекислым газом

для механизма концентрации углерода. Известно, что активность НАДФ+-МДГ в клетках регулируется концентрацией субстрата и интенсивностью света и в несколько раз ниже у С3 - растений по сравнению с С4 - видами [76].

Анализ препаратов из листьев твердой пшеницы показал, что данный фермент находится в двух фракциях: хлоропластах и цитоплазме. При этом,процентное содержание общей активности соотносится как 70-75 к 2530% [25].

У кукурузы НАДФ+-МДГ локализуется исключительно в хлоропластах мезофилла.

Нативная неактивная форма фермента из листьев кукурузы представляет собой димерный белок с молекулярной массой 87,4 кДа с коэффициентом седиментации 5,5 с и радиусом Стокса 3,62 нм. Молекулярная масса субъединицы препарата НАДФ+-МДГ из листьев гороха составляет 38 500. Как активные, так и неактивированные препараты нативного фермента, элюированные из колонки гель-фильтрации, указывают на молекулярную массу 40000 Да, 87000 Да и 163000 Да. Таким образом, предполагается, что фермент присутствует в мономерной, димерной и тетрамерной формах [27].

В листьях твердой пшеницы были обнаружены три изоформы 42, 66 и 74 кДа в цитозоле и три изоформы 66, 74 и 86 кДа во фракциях хлоропластов. А молекулярная масса субъединицы фермента из листьев шпината была равна 28,5 кДа, при нативной массе 56 кДа [35,39,61,91].

В листе гороха НАДФ+-МДГ может являться мономером, димером или тетрамером с разными значениях рН и ионной силы. При этом, тетрамер является неактивным [44].

Анализ изофокуса показал, что нативный ферментный препарат содержит два белка р/ 4,88 и 4,90. Ультрафиолетовый спектр поглощения не обнаруживает хромофоров на белке. Неактивная форма фермента содержит три тиола и три дисульфида на субъединицу. 2-меркаптоэтанол может восстанавливать два из трех субъединиц дисульфидов без сопутствующей активации фермента. Обработка фермента дитиотреитолом восстанавливает все

три дисульфида и полностью активирует фермент. Эти результаты показывают, что активация НАДФ+-МДГ зависит от восстановления критической дисульфидной связи. Фермент может использовать как НАДФН, так и НФДН для восстановления оксалоацетата [70].

Данная малатдегидрогеназа демонстрирует аллостерическую кинетику для НАДФ+ с числом Хилла 1,56 [35].

Все последовательности НАДФ+-МДГ содержат восемь консервативных остатков цистеина, некоторые из которых отвечают за окислительно -восстановительную регуляцию фермента. Оба N- и C-концевых участка в последовательностях НАДФ+-МДГ содержат два остатка цистеина, а каталитическое ядро содержит другие четыре цистеина [147].

Было определено, что изоэлектрическая точка имеет рН 4,35. Как и для НАД+- зависимого фермента, для НАДФ+-МДГ характерно большее сродство к субстрату и коферменту обратной реакции. Так, например, значения Км для препаратов из листьев гороха составляли 39 мкМ для НАДН, 48 мкМ для оксалоацетата, 14,5 мМ для малата и 63 мкМ для НАДФ+ [44, 168].

1.1.3. Физико-химические свойства и регуляторные характеристики НАД+-

и НАДФ+-МЭ

Декарбоксилирующая малатдегидрогеназа (малик-энзим) является широко распространенным ферментом [157], катализирующим окислительное декарбоксилирование малата, генерирующего пируват, CO2 и восстанавливающего энергию в виде НАДН или НАДФН [126]. Стандартное изменение свободной энергии (ок. - 8 кДжмоль-1) классифицирует данную реакцию как потенциально обратимую в естественных условиях [17]. Хотя участие МЭ в фотосинтезе C4- или CAM растений было широко изучено [64], все виды растений, как правило, имеют несколько изоформ, индивидуальные биологические роли которых до сих пор неизвестны [107]. Предлагаемые

физиологические роли различных изоформ малик-энзимов связаны с ее способностью контролировать наличие субстратов и продуктов для других метаболических путей, хотя наиболее характерными считаются реакции, идущие в направлении декарбоксилирования. Известно также о некоторых карбоксилиующих функциях малик-энзимов [102].

Первая характеристика полного растительного семейства МЭ была проведена для С3-растения Arabidopsis thaliana. Это семейство состоит из трех цитозольных белков (НАДФ-МЭ1-3), пластидной изоформы (НАДФ+-МЭ4) и двух ферментов с митохондриальной локализацией (НАД+-МЭ1 и НАД+-МЭ2). Эти белки отличаются не только субклеточной локализацией и кофакторами, но и количеством, экспрессией в ткани и в развитии, биохимическими свойствами, такими как масса, рН-оптимум, значение Км [156].

Из растения Arabidopsis thaliana был выделен НАД+ -зависимый малик-энзим. Субклеточная локализация - митохондрии. Тканевая локализация: листья, стебли, цветки, корни, пыльца. В цветках в основном в пыльниках, рыльце пестика, гинецее (апикальная часть) и чашелистиках. В стручке содержится в верхней его части. В семенах обнаруживается в семядолях, зародышевом стебельке и зародышевом корешке. Медленно накапливается во время развития в мезофилле листьев и клетках, окружающих сосудистые пучки. Кофакторами фермента являются ионы Mg2+ и Мп2+. Оптимальный рН составляет 6,6 для гомодимера и 6,5 для гетеродимера НАД+-МЭ. В присутствии КоА оптимальный рН составляет 6,8 как для гомодимера, так и для гетеродимера НАД+-МЭ. Секвенирование взрослого растения показало, что длина кодируемого участка 607 пар нуклеотидов, а масса 66,641 Да.

Было показано, что НАД+-МЭ функционирует как гетеродимерный фермент как НАД+-МЭ1 (а-субъединица), так и НАД+-МЭ2 (в-субъединица) в С4 двудольном Amaranthus hypochondriacum, но октамеры только одной субъединицы НАД+-МЭ, как было показано, образуются в нескольких С4-растениях. В A. thaliana НАД+-МЭ2 может функционировать как гомодимер, но предполагается, что могут образовываться октамеры одной субъединицы НАД-

МЭ. Этот факт позволяет предсказать, что одним из них является наиболее вероятная функциональная форма фотосинтезирующегорастительного НАД+-МЭ2 [152].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гатауллина Марина Олеговна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Астафурова Т. П., Войцековская С. А., Верхотурова Г. С. Исследование путей адаптации растений к гипобарической гипоксии //Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2007. - №1.

2. Болдырев А.А. Биомембранология: учеб. пособие/ А.А. Болдырев, Е.И. Кяйвяряйнен, В.А. Илюха. - Петрозаводск: Изд-во Кар НЦ РАН, 2006. - 226с.

3. Волощук О. Н., Копыльчук Г. П. Активность КДО+-зависимых дегидрогеназ цикла Кребса митохондрий печени в условиях индуцированного ацетаминофеном гепатита на фоне алиментарной белковой недостаточности //Биомедицинская химия. - 2016. - Т. 62. - №. 2. - С. 16.

4. Воронин А. В., Редкокашин Д. Е., Шаталаев И. Ф. Исследование малатдегидрогеназы лекарственных растений семейства гречишные //Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2015. - Т. 17. - №. 53.

5. Воронин А. В., Редкокашин Д. Е.Фенольные соединения и активность оксидоредуктаз лекарственных растений (обзор). 5-6, 2015 г., Аспирантский вестник Поволжья, стр. 330-334.

6. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. — М. : Мир, 1982. — 446 с.

7. Гармаш Е. В. Митохондриальное дыхание фотосинтезирующей клетки //Физиология растений. - 2016. - Т. 63. - №. 1. - С. 17-17.

8. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. — М.: Мир, 1970. - 173 с.

9. Епринцев А. Т. и др. Изоформы малатдегидрогеназы бактерий Rhodovulum steppense А-20s, культивируемых хемотрофно в аэробных

условиях// Прикладная биохимия и микробиология. - 2016. - Т. 52. - №. 2. - С. 168-173.

10. Епринцев А. Т. и др. Молекулярно-биохимические аспекты световой регуляции 2-оксоглутаратдегидрогеназы в растениях //Физиология растений. - 2020. - Т. 67. - №. 2. - С. 206-213.

11. Епринцев А. Т. и др. Роль метилирования промоторов в регуляции генов сукцинатдегидрогеназы в проростках кукурузы //Физиология растений. -2012. - Т. 59. - №. 3. - С. 332-332.

12. Епринцев А. Т. Идентификация и исследование экспрессии генов / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, Д. Н. Федорин. - Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 2008. - 63с

13. Епринцев А. Т. Роль дифференциальной экспрессии генов sdh1-1 и sdh1-2 в изменении изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в прорастающих семенах кукурузы / А. Т.Епринцев, Д. Н.Федорин, Н. В.Селиванова, Дж. А.Ахмад, В. Н. Попов // Известия РАН. Серия биологическая. - 2010. - № 3. - с. 324-332.

14. Зайчикова М.В. Регуляторные и кинетические характеристики цитоплазматической аконитатгидратазы из растительных и животных тканей / М.В.Зайчикова, А.Альнассер, А.О.Королькова, А.Т.Епринцев // Вестн. ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. 2010. Вып. 2. С.81-84.

15. Климова М. А. Епринцев А. Т., Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств / А. Т. Епринцев, М. А. Климова // Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 2008. 26 с.

16. Кузнецов Е. Д. Роль фитохрома в растениях / Е. Д. Кузнецов, Л.К. Сечняк, Н.А. Киндрук, О.К. Слюсаренко. - М.: Агропромиздат, 1986. - 288с.

17. Пинейру де Карвалью М.А.А., Землянухин А.Т. Малатдегидрогеназа высших растений. — Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1991. — 216 с.

18. Плакунов В., Николаев Ю. Основы динамической биохимии. -Litres, 2017.

19. Попов В. Н. Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот / В. Н. Попов, А. Т. Епринцев, Д.Н.Федорин.-Воронеж:Изд-воВоронеж.ун-та,2006.-47с.

20. Римарева Л. В. и др. Влияние ферментных комплексов на метаболизм спиртовых дрожжей и накопление ионов неорганической природы в концентрированном зерновом сусле //Вестник Российской сельскохозяйственной науки. - 2016. - №. 3. - С. 28-30.

21. Скрябин Н. А. и др. Методы исследования метилирования ДНК: возможности и перспективы использования в онкологии //Сибирский онкологический журнал. - 2013. - №. 6 (60).

22. Федорин Д. Н. и др. Влияние светового режима на функционирование НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы в листьях гороха //Auditorium. - 2018. - №. 1 (17).

23. Филина Ю. В., Габдулхакова А. Г., Арлеевская М. И. Методы анализа метилирования ДНК //Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №. 8.

24. Храмченкова О. М. Клеточные структуры и их функции. - 2017.

25. Чумикина Л. В. и др. Активность малатдегидрогеназы в прорастающем зерне тритикале //Физиология растений и генетик. - 2013.

26. Юдина Р. С., Ибрагимова С. С., Железнова Н. Б. Изучение структуры популяций амаранта (AMARANTHUS L.) по изоферментным локусам //Информационный вестник ВОГиС. - 2008. - Т. 12. - №. 3. - С. 385391.

27. Юдина Р.С. Генетика и феногенетика малатдегидрогеназы растний

— М:Наука,2010.

28. Abd El-Moneim D. et al. On the consequences of aluminium stress in rye: repression of two mitochondrial malate dehydrogenase mRNA s //Plant Biology.

- 2015. - Т. 17. - №. 1. - С. 123-133.

29. Abogadallah G. M. Insights into the significance of antioxidative defense under salt stress //Plant signaling & behavior. - 2010. - Т. 5. - №. 4. - С. 369-374.

30. AdamsK.L.et al. Intracellular gene transfer in action: dual transcription and multiple silencing of nuclear and mitochondrial cox2 genes in legume // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96.- P. 13863-13868.

31. Alfonso S. U., Brüggemann W. Photosynthetic responses of a C 3 and three C 4 species of the genus Panicum (sl) with different metabolic subtypes to drought stress //Photosynthesis research. - 2012. - Т. 112. - №. 3. - С. 175-191.

32. Alvarez C. E. et al. Kinetics and functional diversity among the five members of the NADP-malic enzyme family from Zea mays, a C 4 species //Photosynthesis research. - 2013. - Т. 115. - №. 1. - С. 65-80.

33. An J., Rao A., Ko M. TET family dioxygenases and DNA demethylation in stem cells and cancers //Experimental & molecular medicine. - 2017. - Т. 49. - №. 4. - С. e323-e323.

34. Antequera F. Number of CpG islands and genes in human and mouse / F. Antequera, A. Bird // Proc Natl Acad Sci USA. - 1993. - V.90. -Р.11995-11999.

35. Babayev H. G. et al. NADP-malate dehydrogenase isoforms of wheat leaves under drought: their localization, and some physicochemical and kinetic properties //Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2015. - Т. 11. - №. 3.

36. Badia M. B. et al. Enhanced cytosolic NADP-ME2 activity in A. thaliana affects plant development, stress tolerance and specific diurnal and nocturnal cellular processes //Plant Science. - 2015. - T. 240. - C. 193-203.

37. Bagard M. et al. Ozone-induced changes in photosynthesis and photorespiration of hybrid poplar in relation to the developmental stage of the leaves //Physiologia Plantarum. - 2008. - T. 134. - №. 4. - C. 559-574.

38. Bauwe H., Hagemann M., Fernie A. R. Photorespiration: players, partners and origin //Trends in plant science. - 2010. - T. 15. - №. 6. - C. 330-336.

39. Biehler K., Migge A., Fock H. P. The role of malate dehydrogenase in dissipating excess energy under water stress in two wheat species //Photosynthetica (Czech Republic). - 1996.

40. Bohler S. et al. A DIGE analysis of developing poplar leaves subjected to ozone reveals major changes in carbon metabolism //Proteomics. - 2007. - T. 7. -№. 10. - C. 1584-1599.

41. Bolwell G. P. et al. The apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three-component system //Journal of experimental botany. - 2002. -T. 53. - №. 372. - C. 1367-1376.

42. Bouthour D. et al. Differential response of NADP-dehydrogenases and carbon metabolism in leaves and roots of two durum wheat (Triticum durum Desf.) cultivars (Karim and Azizi) with different sensitivities to salt stress //Journal of plant physiology. - 20.

43. Bowman S. M. et al. Toxicity and reductions in intracellular calcium levels following uptake of a tetracycline antibiotic in Arabidopsis //Environmental science & technology. - 2011. - T. 45. - №. 20. - C. 8958-8964.

44. Carr P. D. et al. Chloroplast NADP-malate dehydrogenase: structural basis of light-dependent regulation of activity by thiol oxidation and reduction //Structure. - 1999. - T. 7. - №. 4. - C. 461-475.

45. Casati P., Spampinato C. P., Andreo C. S. Characteristics and physiological function of NADP-malic enzyme from wheat //Plant and cell physiology. - 1997. - T. 38. - №. 8. - C. 928-934.

46. Chen L. et al. Research on the reliability model of the underwater vehicle launch under the simulation environment of numerical wave tank //2015 First International Conference on Reliability Systems Engineering (ICRSE). - IEEE, 2015. - C. 1-7.

47. Chen Q. et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder //Science. - 2016. - T. 351. - №. 6271. - C. 397400.

48. Chen Q. et al. The role of NADP-malic enzyme in plants under stress //Plant science. - 2019. - T. 281. - C. 206-212.

49. Chen Q., Yan W., Duan E. Epigenetic inheritance of acquired traits through sperm RNAs and sperm RNA modifications //Nature Reviews Genetics. -2016. - T. 17. - №. 12. - C. 733.

50. Chen Y. et al. Cytosolic Malate Dehydrogenase 4 Modulates Cellular Energetics and Storage Reserve Accumulation in Maize Endosperm //Plant Biotechnology Journal. - 2020

51. Cheng Y., Long M. A cytosolic NADP-malic enzyme gene from rice (Oryza sativa L.) confers salt tolerance in transgenic Arabidopsis //Biotechnology letters. - 2007. - T. 29. - №. 7. - C. 1129-1134.

52. Chinnusamy V., Zhu J. K. Epigenetic regulation of stress responses in plants //Current opinion in plant biology. - 2009. - T. 12. - №. 2. - C. 133-139.

53. Choi C. S., Sano H. Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of a gene encoding a glycerophosphodiesterase-like protein in tobacco plants //Molecular Genetics and Genomics. - 2007. - T. 277. - №. 5. - C. 589-600.

54. Corpas F. J. et al. Activation of NADPH-recycling systems in leaves and roots of Arabidopsis thaliana under arsenic-induced stress conditions is accelerated

by knock-out of Nudix hydrolase 19 (AtNUDX19) gene //Journal of plant physiology. - 2016. - T. 192.

55. Cousins A. B. et al. Peroxisomal malate dehydrogenase is not essential for photorespiration in Arabidopsis but its absence causes an increase in the stoichiometry of photorespiratory CO2 release //Plant physiology. - 2008. - T. 148. -№. 2. - C. 786-795.

56. Cushman J. C. Molecular cloning and expression of chloroplast NADP-malate dehydrogenase during Crassulacean acid metabolism induction by salt stress //Photosynthesis Research. - 1993. - T. 35. - №. 1. - C. 15-27.

57. Davis B.J. A new high resolution electrophoresis method / B.J. Davis, L. Ornstein // Society for the study at the New York Academy of medicine. — 1959. — P. 112-118.

58. Deinlein U. et al. Plant salt-tolerance mechanisms //Trends in plant science. - 2014. - T. 19. - №. 6. - C. 371-379.

59. Delhaize E., Gruber B. D., Ryan P. R. The roles of organic anion permeases in aluminium resistance and mineral nutrition //Febs Letters. - 2007. - T. 581. - №. 12. - C. 2255-2262.

60. Dikow N. et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA //Molecular and cellular probes. - 2007. - T. 21. - №. 3. - C. 208-215.

61. Ding Y., Ma Q. H. Characterization of a cytosolic malate dehydrogenase cDNA which encodes an isozyme toward oxaloacetate reduction in wheat //Biochimie. - 2004. - T. 86. - №. 8. - C. 509-518.

62. Dizengremel P. et al. Metabolic-dependent changes in plant cell redox power after ozone exposure //Plant Biology. - 2009. - T. 11. - C. 35-42.

63. Doebley J., Morden C. W., Schertz K. F. A gene modifying mitochondrial malate dehydrogenase isozymes inSorghum (Gramineae) //Biochemical genetics. - 1986. - T. 24. - №. 11-12. - C. 813-819.

64. Drincovich M. F. et al. C 4 decarboxylases: Different solutions for the same biochemical problem, the provision of CO 2 to RuBisCO in the bundle sheath cells //C4 photosynthesis and related CO2 concentrating mechanisms. - Springer, Dordrecht, 2010. - C. 277-300.

65. Eads C. A. et al. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation //Nucleic acids research. - 2000. - T. 28. - №. 8. - C. e32-00.

66. Eprintsev A. T. et al. Oligomeric forms of bacterial malate dehydrogenase: a study of the enzyme from the phototrophic non-sulfur bacterium Rhodovulum steppense A-20s //Bioscience, biotechnology, and biochemistry. - 2018.

- T. 82. - №. 1. - C. 81-89.

67. Fang H. et al. An emphasis of hydrogen sulfide-cysteine cycle on enhancing the tolerance to chromium stress in Arabidopsis //Environmental Pollution.

- 2016. - T. 213. - C. 870-877.

68. Fang J., Zhang X. M., Jiang C. S. Hybrid Projective Synchronization of a New Hyperchaotic System. - Trans Tech Publications Ltd, 2011. - T. 42. - C. 6367.

69. Faske M. et al. Transgenic tobacco plants expressing pea chloroplast Nmdh cDNA in sense and antisense orientation (effects on NADP-malate dehydrogenase level, stability of transformants, and plant growth) //Plant physiology.

- 1997. - T. 115. - №. 2. - C.

70. Fickenscher K., Scheibe R. Purification and properties of NADP-dependent malate dehydrogenase from pea leaves //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology. - 1983. - T. 749. - №. 3. - C. 249-254.

71. Finkemeier I. et al. Transcriptomic analysis of the role of carboxylic acids in metabolite signaling in Arabidopsis leaves //Plant physiology. - 2013. - T. 162. - №. 1. - C. 239-253.

72. Finnegan E. J., Peacock W. J., Dennis E. S. DNA methylation, a key regulator of plant development and other processes //Current opinion in genetics & development. - 2000. - T. 10. - №. 2. - C. 217-223.

73. Foyer C. H., Noctor G. Ascorbate and glutathione: the heart of the redox hub //Plant physiology. - 2011. - T. 155. - №. 1. - C. 2-18.

74. Gauthier P. P. G. et al. In folio isotopic tracing demonstrates that nitrogen assimilation into glutamate is mostly independent from current CO2 assimilation in illuminated leaves of Brassica napus //New Phytologist. - 2010. - T. 185. - №. 4. - C. 988-999.

75. Gehring M., Henikoff S. DNA methylation dynamics in plant genomes //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression. - 2007. - T. 1769. - №. 5-6. - C. 276-286.

76. Gietl C. Malate dehydrogenase isoenzymes: cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. .

77. González-Agüero M. et al. The unusual acid-accumulating behavior during ripening of cherimoya (Annona cherimola Mill.) is linked to changes in transcription and enzyme activity related to citric and malic acid metabolism //Molecules. - 2016. - T. 21. - №.

78. Gonzalgo M. L. et al. Identification and characterization of differentially methylated regions of genomic DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR //Cancer Research. - 1997. - T. 57. - №. 4. - C. 594-599.

79. Gullberg J. et al. Design of experiments: an efficient strategy to identify factors influencing extraction and derivatization of Arabidopsis thaliana samples in metabolomic studies with gas chromatography/mass spectrometry //Analytical biochemistry. - 200.

80. Guo Y. et al. NADP-malate dehydrogenase of sweet sorghum improves salt tolerance of Arabidopsis thaliana //Journal of agricultural and food chemistry. -2018. - T. 66. - №. 24. - C. 5992-6002.

81. Hebbelmann I. et al. Multiple strategies to prevent oxidative stress in Arabidopsis plants lacking the malate valve enzyme NADP-malate dehydrogenase //Journal of experimental botany. - 2012. - T. 63. - №. 3. - C. 1445-1459.

82. Holliday R., Pugh J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development //Science. - 1975. - T. 187. - №. 4173. - C. 226-232.

83. Huang J. et al. Self-protection of cytosolic malate dehydrogenase against oxidative stress in Arabidopsis //Journal of experimental botany. - 2018. - T. 69. -№. 14. - C. 3491-3505.

84. Hysková V. D. et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase, NADP-malic enzyme, and pyruvate, phosphate dikinase are involved in the acclimation of Nicotiana tabacum L. to drought stress //Journal of Plant Physiology. - 2014. - T. 171. - №. 5. - C. 19-25.

85. Joaquín-Ramos A. et al. Comparative proteomic analysis of amaranth mesophyll and bundle sheath chloroplasts and their adaptation to salt stress //Journal of plant physiology. - 2014. - T. 171. - №. 15. - C. 1423-1435.

86. Kim J. M. et al. Alterations of lysine modifications on the histone H3 N-tail under drought stress conditions in Arabidopsis thaliana //Plant and Cell Physiology. - 2008. - T. 49. - №. 10. - C. 1580-1588.

87. Kornfeld J. W., Brüning J. C. Regulation of metabolism by long, non-coding RNAs //Frontiers in genetics. - 2014. - T. 5. - C. 57.

88. Kriaucionis S., Tahiliani M. Expanding the epigenetic landscape: novel modifications of cytosine in genomic DNA //Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2014. - T. 6. - №. 10. - C. a018630.

89. Kurita O. Overexpression of peroxisomal malate dehydrogenase MDH3 gene enhances cell death on H 2 O 2 stress in the ald5 mutant of Saccharomyces cerevisiae //Current microbiology. - 2003. - T. 47. - №. 3. - C. 0192-0197.

90. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmly // Nature. — 1970. — Vol. 77, No. 4. — P.680-683.

91. Legris A. J., Tsai C. S. Characterization of malate dehydrogenase isozymes in wheat germ //Canadian journal of biochemistry. - 1975. - T. 53. - №. 5.

- C. 527-535.

92. León A. M. et al. Antioxidative enzymes in cultivars of pepper plants with different sensitivity to cadmium //Plant Physiology and Biochemistry. - 2002. -T. 40. - №. 10. - C. 813-820.

93. Li S. et al. Analysis of knockout mutants suggests that Arabidopsis NADP-MALIC ENZYME2 does not play an essential role in responses to oxidative stress of intracellular or extracellular origin //Journal of experimental botany. - 2013.

- T. 64. - №. 12. - .

94. Lin G. et al. Exploring cloud computing for large-scale scientific applications //2013 IEEE Ninth World Congress on Services. - IEEE, 2013. - C. 3743.

95. Lindén P. et al. Reduced mitochondrial malate dehydrogenase activity has a strong effect on photorespiratory metabolism as revealed by 13C labelling //Journal of experimental botany. - 2016. - T. 67. - №. 10. - C. 3123-3135.

96. Liu S. et al. Expression of an NADP-malic enzyme gene in rice (Oryza sativa. L) is induced by environmental stresses; over-expression of the gene in Arabidopsis confers salt and osmotic stress tolerance //Plant Molecular Biology. -2007. - T. 64. - №. 1-2.

97. Liu T. et al. Cold acclimation alters DNA methylation patterns and confers tolerance to heat and increases growth rate in Brassica rapa //Journal of experimental botany. - 2017. - T. 68. - №. 5. - C. 1213-1224.

98. Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.H. Papp et al.// J. Biologi. — 1951. — Vol. 193. — P. 265-275.

99. Lukens L. N., Zhan S. The plant genome's methylation status and response to stress: implications for plant improvement //Current opinion in plant biology. - 2007. - T. 10. - №. 3. - C. 317-322.

100. Lyons S. M. et al. RNA biology of angiogenin: Current state and perspectives //RNA biology. - 2017. - T. 14. - №. 2. - C. 171-178.

101. Mattiello L. et al. Transcriptome analysis highlights changes in the leaves of maize plants cultivated in acidic soil containing toxic levels of Al 3+ //Molecular biology reports. - 2014. - T. 41. - №. 12. - C. 8107-8116.

102. Maurino V. G. et al. Redundancy is sometimes seen only by the uncritical: Does Arabidopsis need six malic enzyme isoforms? //Plant Science. -2009. - T. 176. - №. 6. - C. 715-721.

103. Mayer B. F. et al. Cold acclimation induces distinctive changes in the chromatin state and transcript levels of COR genes in Cannabis sativa varieties with contrasting cold acclimation capacities //Physiologia plantarum. - 2015. - T. 155. -№. 3. - C. 281.

104. Mellen M., Ayata P., Heintz N. 5-hydroxymethylcytosine accumulation in postmitotic neurons results in functional demethylation of expressed genes //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2017. - T. 114. - №. 37. - C. E7812-E7821.

105. Mhamdi A., Noctor G. High CO2 primes plant biotic stress defences through redox-linked pathways //Plant physiology. - 2016. - T. 172. - №. 2. - C. 929-942.

106. Moriyama S., Nishio K., Mizushima T. Structure of glyoxysomal malate dehydrogenase (MDH3) from Saccharomyces cerevisiae //Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. - 2018. - T. 74. - №. 10. - C. 617624.

107. Muhaidat R., Sage R. F., Dengler N. G. Diversity of Kranz anatomy and biochemistry in C4 eudicots //American Journal of Botany. - 2007. - T. 94. - №. 3. -C. 362-381..

108. Müller G. L. et al. Improved water use efficiency and shorter life cycle of Nicotiana tabacum due to modification of guard and vascular companion cells //Scientific reports. - 2018. - T. 8. - №. 1. - C. 1-14.

109. Müller G. L. et al. Nicotiana tabacum NADP-malic enzyme: cloning, characterization and analysis of biological role //Plant and cell physiology. - 2008. -T. 49. - №. 3. - C. 469-480.

110. Munns R. Tester M., 2008 //Mechanisms of salinity tolerance. annual Review of Plant biology. - T. 59. - C. 651-681.

111. Nan N. et al. Rice plastidial NAD-dependent malate dehydrogenase 1 negatively regulates salt stress response by reducing the vitamin B6 content //Plant Biotechnology Journal. - 2020. - T. 18. - №. 1. - C. 172-184..

112. Nesterenko M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S.J. Upton // J. Biochem. Biol. — 1994. — Vol. 28. — P. 239-242.

113. Neus J. D., Fehr W. R., Schnebly S. R. Agronomic and seed characteristics of soybean with reduced raffinose and stachyose //Crop Science. -2005. - T. 45. - №. 2. - C. 589-592.

114. Nguyen H. T. et al. Low temperature stress in maize (Zea mays L.) induces genes involved in photosynthesis and signal transduction as studied by suppression subtractive hybridization //Plant Physiology and Biochemistry. - 2009. -T. 47. - №. 2. - C. 116-1.

115. Nilsson E. E., Skinner M. K. Environmentally induced epigenetic transgenerational inheritance of disease susceptibility //Translational Research. -2015. - T. 165. - №. 1. - C. 12-17.

116. Noctor G. et al. Glutathione in plants: an integrated overview //Plant, cell & environment. - 2012. - T. 35. - №. 2. - C. 454-484.

117. Noctor G., Mhamdi A., Foyer C. H. The roles of reactive oxygen metabolism in drought: not so cut and dried //Plant physiology. - 2014. - T. 164. -№. 4. - C. 1636-1648.

118. Pinto M. E. et al. Effects of UV-B radiation on growth, photosynthesis, UV-B-absorbing compounds and NADP-malic enzyme in bean (Phaseolus vulgaris L.) grown under different nitrogen conditions //Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. - 199.

119. Qi J. et al. Apoplastic ROS signaling in plant immunity //Current opinion in plant biology. - 2017. - T. 38. - C. 92-100.

120. Ramamurthy M. S. et al. Lignin biosynthesis during wound healing of potato tubers in response to gamma irradiation //Postharvest biology and technology. - 2000. - T. 18. - №. 3. - C. 267-272.

121. Rothbart S. B., Strahl B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. - 2014. - T. 1839. - №. 8. - C. 627-643.

122. Ruiz-Torres C. et al. Arsenic-induced stress activates sulfur metabolism in different organs of garlic (Allium sativum L.) plants accompanied by a general decline of the NADPH-generating systems in roots //Journal of plant physiology. -2017. - T. 211. - .

123. Saikia M., Hatzoglou M. The many virtues of tRNA-derived stress-induced RNAs (tiRNAs): discovering novel mechanisms of stress response and effect on human health //Journal of Biological Chemistry. - 2015. - T. 290. - №. 50. - C. 29761-29768.

124. Scheibe R. et al. Strategies to maintain redox homeostasis during photosynthesis under changing conditions //Journal of experimental botany. - 2005. -T. 56. - №. 416. - C. 1481-1489.

125. Schreier T. B. et al. Plastidial NAD-dependent malate dehydrogenase: a moonlighting protein involved in early chloroplast development through its interaction with an FtsH12-FtsHi protease complex //The Plant Cell. - 2018. - T. 30. - №. 8. - C. 1745-1769.

126. Scrutton,N.S., Berry,A., Perham,R.N. Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering // Nature, 1990, vol. 343, № 6253, pg. 38-43.

127. Selinski J., Scheibe R. Malate valves: old shuttles with new perspectives //Plant Biology. - 2019. - T. 21. - C. 21-30.

128. Seth C. S., Misra V. Changes in C-N metabolism under elevated CO 2 and temperature in Indian mustard (Brassica juncea L.): an adaptation strategy under climate change scenario //Journal of plant research. - 2014. - T. 127. - №. 6. - C. 793-802.

129. Sew Y. S. et al. Loss of mitochondrial malate dehydrogenase activity alters seed metabolism impairing seed maturation and post-germination growth in Arabidopsis //Plant physiology. - 2016. - T. 171. - №. 2. - C. 849-863.

130. Shendure J., Ji H. Next-generation DNA sequencing //Nature biotechnology. - 2008. - T. 26. - №. 10. - C. 1135.

131. Shevchenko A. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels / A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann // Anal. Chem. — 1996. — Vol. 68. — P. 850-858

132. Sibbritt T., Patel H. R., Preiss T. Mapping and significance of the mRNA methylome //Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. - 2013. - T. 4. - №. 4. -C. 397-422.

133. Singer J., Roberts-Ems J., Riggs A. D. Methylation of mouse liver DNA studied by means of the restriction enzymes msp I and hpa II //Science. - 1979. - T. 203. - №. 4384. - C. 1019-1021.

134. Singh R. et al. Magnaporthe oryzae effector AVR-Pii helps to establish compatibility by inhibition of the rice NADP-malic enzyme resulting in disruption of oxidative burst and host innate immunity //Molecules and cells. - 2016. - T. 39. - №. 5. - C. 426.

135. Smiri M., Chaoui A., El Ferjani E. Respiratory metabolism in the embryonic axis of germinating pea seed exposed to cadmium //Journal of plant physiology. - 2009. - T. 166. - №. 3. - C. 259-269.

136. Stitt M, Hurry V Curr . A plant for all seasons: alterations in photosynthetic carbon metabolism during cold acclimation in Arabidopsis. Opin Plant Biol. 2002 Jun; 5(3):199-206.

137. Stryer L., Latchman D. S. Biochemistry (4th edn) //Trends in biochemical sciences. - 1995. - T. 20. - №. 11. - C. 488.

138. Sun L. et al. Superior aluminium (Al) tolerance of Stylosanthes is achieved mainly by malate synthesis through an Al-enhance

139. Susan J. C. I. et al. High sensitivity mapping of methylated cytosines //Nucleic acids research. - 1994. - T. 22. - №. 15. - C. 2990-2997.

140. Sytar O. et al. Heavy metal-induced oxidative damage, defense reactions, and detoxification mechanisms in plants //Acta physiologiae plantarum. -2013. - T. 35. - №. 4. - C. 985-999.

141. Tang W. W. C. et al. A unique gene regulatory network resets the human germline epigenome for development //Cell. - 2015. - T. 161. - №. 6. - C. 14531467.

142. Tao X., Yang Z., Tong L. Crystal structures of substrate complexes of malic enzyme and insights into the catalytic mechanism //Structure. - 2003. - T. 11. - №. 9. - C. 1141-1150..

143. Teng X. et al. FLOURY ENDOSPERM16 encoding a NAD-dependent cytosolic malate dehydrogenase plays an important role in starch synthesis and seed development in rice //Plant biotechnology journal. - 2019. - T. 17. - №. 10. - C. 1914-1927.

144. Tomaz T. et al. Mitochondrial malate dehydrogenase lowers leaf respiration and alters photorespiration and plant growth in Arabidopsis //Plant physiology. - 2010. - T. 154. - №. 3. - C. 1143-1157.

145. Torres M. A. ROS in biotic interactions //Physiologia Plantarum. - 2010. - T. 138. - №. 4. - C. 414-429.

146. Tronconi M. A. et al. Arabidopsis NAD-malic enzyme functions as a homodimer and heterodimer and has a major impact on nocturnal metabolism //Plant Physiology. - 2008. - T. 146. - №. 4. - C. 1540-1552.

147. Tuteja N., Gill S. S. Targeting the Redox Regulatory Mechanisms for Abiotic Stress Tolerance in Crops //Biochemical, Physiological and Molecular Avenues for Combating Abiotic Stress in Plants. - 2018. - C. 151.

148. Umer M., Herceg Z. Deciphering the epigenetic code: an overview of DNA methylation analysis methods //Antioxidants & redox signaling. - 2013. - T. 18. - №. 15. - C. 1972-1986.

149. Umezawa T. et al. Engineering drought tolerance in plants: discovering and tailoring genes to unlock the future //Current opinion in biotechnology. - 2006. -T. 17. - №. 2. - C. 113-122.

150. Valderrama R. et al. The dehydrogenase-mediated recycling of NADPH is a key antioxidant system against salt-induced oxidative stress in olive plants //Plant, Cell & Environment. - 2006. - T. 29. - №. 7. - C. 1449-1459.

151. Van Assche F., Cardinaels C., Clijsters H. Induction of enzyme capacity in plants as a result of heavy metal toxicity: Dose-response relations in Phaseolus vulgaris L., treated with zinc and cadmium //Environmental pollution. - 1988. - T. 52. - №. 2. - C.

152. Watson-Lazowski A. et al. Investigating the NAD-ME biochemical pathway within C 4 grasses using transcript and amino acid variation in C 4 photosynthetic genes //Photosynthesis research. - 2018. - T. 138. - №. 2. - C. 233248.

153. Wei J. W. et al. Non-coding RNAs as regulators in epigenetics //Oncology reports. - 2017. - T. 37. - №. 1. - C. 3-9.

154. Wheeler M. C. G. et al. A comprehensive analysis of the NADP-malic enzyme gene family of Arabidopsis //Plant Physiology. - 2005. - T. 139. - №. 1. - C. 39-51.

155. Wheeler M. C. G. et al. Differential contribution of malic enzymes during soybean and castor seeds maturation //PLoS One. - 2016. - T. 11. - №. 6.

156. Wheeler M. C. G. et al. Structure-Function Relationship Studies of the Four Arabidopsis thaliana NADP-Malic Enzyme Isoforms //Photosynthesis. Energy from the Sun. - Springer, Dordrecht, 2008. - C. 965-969.

157. Winning B. M., Bourguignon J., Leaver C. J. Plant mitochondrial NAD+-dependent malic enzyme. cDNA cloning, deduced primary structure of the 59-and 62-kDa subunits, import, gene complexity and expression analysis //Journal of Biological Chemistry. - 1994. - T. 269. - №. 7. - C. 4780-4786..

158. Wu T. P. et al. DNA methylation on N 6-adenine in mammalian embryonic stem cells //Nature. - 2016. - T. 532. - №. 7599. - C. 329-333.

159. Wu X. et al. Negative regulation of cadmium tolerance in Arabidopsis by MMDH2 //Plant Molecular Biology. - 2019. - T. 101. - №. 4-5. - C. 507-516.

160. Xu L. et al. Three distinct 3-methylcytidine (m3C) methyltransferases modify tRNA and mRNA in mice and humans //Journal of Biological Chemistry. -2017. - T. 292. - №. 35. - C. 14695-14703.

161. Yaniv M. Chromatin remodeling: from transcription to cancer //Cancer genetics. - 2014. - T. 207. - №. 9. - C. 352-357.

162. Yao Y. X. et al. The functions of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene in growth and tolerance to cold and salt stresses //Plant physiology and biochemistry. - 2011. - T. 49. - №. 3. - C. 257-264.

163. Yin G. et al. Comprehensive mitochondrial metabolic shift during the critical node of seed ageing in rice //PloS one. - 2016. - T. 11. - №. 4.

164. Yoshida K., Hisabori T. Adenine nucleotide-dependent and redox-independent control of mitochondrial malate dehydrogenase activity in Arabidopsis thaliana //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. - 2016. - T. 1857. -№. 6. - C. 810-818.

165. You J. et al. Transcriptomic responses to aluminum stress in soybean roots //Genome. - 2011. - T. 54. - №. 11. - C. 923-933.

166. Yue Y., Liu J., He C. RNA N6-methyladenosine methylation in post-transcriptional gene expression regulation //Genes & development. - 2015. - T. 29. -№. 13. - C. 1343-1355.

167. Zhang Y., Adams I. P., Ratledge C. Malic enzyme: the controlling activity for lipid production? Overexpression of malic enzyme in Mucor circinelloides leads to a 2.5-fold increase in lipid accumulation //Microbiology. -2007. - T. 153. - №. 7. - C. 2013-2.

168. Ziegler P., Beck E. Exoamylase activity in vacuoles isolated from pea and wheat leaf protoplasts //Plant Physiology. - 1986. - T. 82. - №. 4. - C. 11191121.

Приложение

Таблица 1.

+

Таблица очистки НАДФ -зависимой малатдегидрогеназы из мезофилла

кукурузы.

(п=3; р<0,05)

Стадия V, мл. Белок, мг Общая активность, Е. Удельная активность Е/мг белка Выход, % Степень очистки

1) Гомогенат 10 73,4 118 1,6 100 1

2) Фракционирование солями 1 10,3 23,6 2,2 20 1,3

3) Гель-фильтрация через сефадексО-25 6 9,6 21,8 2,3 18,4 1,3

4) Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-8ЕРЫЛСЕЬ 3 0,08 7,3 91 6 57

Таблица 2.

Таблица очистки НАД+-зависимых малик-энзимов из мезофилла кукурузы.

(п=3; р<0,05)

Стадия V, мл. Белок, мг Общая активность, Е. Удельная активность Е/мг белка Выход, % Степень очистки

1) Гомогенат 10 65 43 0,6 100 1

2) Фракционирование солями 1 5,8 12,5 2,2 29 3,6

3) Гель-фильтрация через сефадексО-25 5 5,1 10,9 2,2 26 3,6

4) Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-8ЕРЫЛСЕЬ 2 0,03 2,3 76 5 126

2 0,02 1,3 65 3 108

Таблица 3.

Таблица очистки НАДФ+-зависимых малик-энзимов из мезофилла кукурузы.

(п=3; р<0,05)

Стадия V, мл. Белок, мг Общая активность, Е. Удельная активность Е/мг белка Выход, % Степень очистки

1) Гомогенат 17 46,5 39,1 0,8 100 1

2) Фракционирование солями 2 5,5 17,6 3,2 44 3,8

3) Гель-фильтрация через сефадексО-25 6 5,3 14,5 2,7 37 3,2

4) Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-8ЕРЫЛСЕЬ 4 0,063 5,8 92 15 109

а

б

Рис. 1. Электрофореграмма цитоплазматической изоформы НАД+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а - окрашивание нитратом серебра;

б -специфическое окрашивание;

Б - фронт красителя бромфенолового синего.

Рис. 2. Электрофореграмма митохондриальной изоформы НАД+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а - окрашивание нитратом серебра;

б -специфическое окрашивание;

Б - фронт красителя бромфенолового синего.

Рис. 3. Электрофореграмма пероксисомальной изоформы НАД+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а - окрашивание нитратом серебра;

б -специфическое окрашивание;

Б - фронт красителя бромфенолового синего.

Рис. 4. Электрофореграмма изоформы НАДФ+-МДГ из мезофилла кукурузы: а - окрашивание нитратом серебра; б -специфическое окрашивание; Б - фронт красителя бромфенолового синего.

Рис. 5. Определение значения Кт для цитоплазматической формы НАД+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАД+

в) Определение сродства к оксалоацетату

г) Определение сродства к НАДН

Рис. 6. Определение значения Кт для митохондриальной формы НАД+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАД+

в) Определение сродства к оксалоацетату

г) Определение сродства к НАДН

Рис. 7. Определение значения Кт для пероксисомальной формы НАД+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАД+

в) Определение сродства к оксалоацетату

г) Определение сродства к НАДН

Рис. 8. Определение значения Кт для НАДФ+-МДГ из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАДФ+

в) Определение сродства к оксалоацетату

г) Определение сродства к НАДФН

1/Ь гпН

б

Рис. 9. Определение значения Кт для НАД+-МЭ 1 из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАД+

в) Определение сродства к пирувату

г) Определение сродства к НАДН

Рис. 10. Определение значения Кт для НАД+-МЭ 2 из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАД+

в) Определение сродства к пирувату

г) Определение сродства к НАДН

Рис. 11. Определение значения Кт для НАДФ+-МЭ из мезофилла кукурузы:

а) Определение сродства к малату

б) Определение сродства к НАДФ+

в) Определение сродства к пирувату

г) Определение сродства к НАДФН

Рис. 12. Зависимость активности цитоплазматической изоформы НАД+-МДГ от рН для прямой реакции (окисление малата).

Рис. 13. Зависимость активности цитоплазматической изоформы НАД+-МДГ от pH для обратной реакции (восстановление оксалоацетата).

Активность, Е

о н-1-1-1-1-1-1

7,5 а 8,5 9 9,5 10 10,5 Р'"'

Рис. 14. Зависимость активности митохондриальной изоформы НАД+-МДГ от рН для прямой реакции (окисление малата).

Рис. 15. Зависимость активности митохондриальной изоформы НАД+-МДГ от рН для обратной реакции (восстановление оксалоацетата).

Рис. 16. Зависимость активности пероксисомальной изоформы НАД+-МДГ от рН для прямой реакции (окисление малата).

Рис. 17. Зависимость активность пероксисомальной изоформы НАД+-МДГ от рН для обратной реакции (восстановление оксалоацетата).

Рис. 18. Зависимость активности препарата НАДФ+-МДГ от рН для прямой реакции (окисление малата).

Рис. 19. Зависимость активность препарата НАДФ+-МДГ от рН для обратной реакции (восстановление оксалоацетата).

Рис. 20. Зависимость активности препарата НАД+-МЭ 1 от рН для прямой реакции (окисление малата).

Рис. 21. Зависимость активность препарата НАД+-МЭ 1 от рН для обратной реакции (восстановление пирувата).

Рис. 22. Зависимость активности препарата НАД+-МЭ2 от рН для прямой реакции (окисление малата).

Рис. 23. Зависимость активность препарата НАД+-МЭ 2 от рН для обратной реакции (восстановление пирувата).

Рис. 24. Зависимость активности препарата НАДФ+-МЭ от рН для прямой реакции (окисление малата).

Активность, Е

6 6,5 1 7,5 а 8,5 9 9,5

Рис. 25. Зависимость активность препарата НАДФ+-МЭ от рН для обратной реакции (восстановление пирувата).

■20 -10 0 10 20 30 40 50

Рис. 26. Влияние ионов магния на активность препарата цитоплазматической НАД+-МДГ в концентрации а) 0,02-10мМ; б) более 10 мМ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

Рис. 27. Влияние ионов кальция на активность препарата цитоплазматической НАД+-МДГ в концентрации а) 0,02-1мМ; б) 1-40мМ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

-2О -10 0 10 20 30 40 50 60 [i], MM

Рис. 28. Влияние ионов бария на активность препарата цитоплазматической НАД+-МДГ в концентрации а) 0,02-0,08 мМ; б) 0,02-0,08 мМ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

-И- -т- -1-

■20 -10 0 10 20 30 40 50

Рис. 29. Влияние ионов марганца на активность препарата цитоплазматической НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

Рис. 30. Влияние ионов магния на активность препарата митохондриальной НАД+-МДГ в концентрации а) 0,02-10мМ; б) более 10 мМ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

0.09 1 /V

0.0! 0.0Г 1 ♦

0.06

0.03

0.04 2

0.03 * ♦ 0.02 t 0.01

1-1-

■20 10 О 10 20 30 40 30

Рис. 31. Влияние ионов кальция на активность препарата митохондриальной НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

ал а: 1Л' ♦ 1

ли

Л1 • * • % ■

й0! ■ /

<г, л

А* 4' 4! О Л2 0,4 м <и I и

Рис. 32. Влияние ионов бария на активность препарата митохондриальной НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

I-1-0--

■20 -10 0 10 20 30 40 50

Рис. 33. Влияние ионов марганца на активность препарата митохондриальной НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

Рис. 34. Влияние ионов магния на активность препарата пероксисомальной НАД+-МДГ в концентрации а) 0,02-2 мМ; б) более 2 мМ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

-0,4 flJ.j (f 0rï M D.6 Q.a ] 1,3

!/[fl].mM

Рис. 35. Влияние ионов кальция на активность препарата пероксисомальной НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

M

0,4

Рис. 36. Влияние ионов бария на активность препарата пероксисомальной НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

/

Рис. 37. Влияние ионов марганца на активность препарата пероксисомальной НАД+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

Рис. 38. Влияние ионов магния на активность препарата НАДФ+-МДГ в концентрации а) 0,05-5 мМ; б) более 5 мМ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

[i],mM

Рис. 39. Влияние ионов бария на активность препарата НАДФ+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

Рис. 40. Влияние ионов марганца на активность препарата НАДФ+-МДГ:

1 - 0,1 мМ оксалоацетат;

2 - 0,2 мМ оксалоацетат

Рис. 41. Влияние ионов магния на активность препарата НАД+-МЭ 1 в концентрациях а) 0,05 - 5 мМ; б) 5-40 мМ:

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат

Рис. 42. Влияние ионов бария активность препарата НАД+-МЭ 1:

1- 0,1 мМ малат; 2 - 0,2 мМ малат

Рис. 43. Влияние ионов кальция активность препарата НАД+-МЭ 1: 1 - 0,1 мМ малат; 2- 0,2 мМ малат

Рис. 44. Влияние ионов марганца активность препарата НАД+-МЭ 1 в концентрациях а) 0,05 - 3 мМ; б) 3-40 мМ:

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат

Рис. 45. Влияние ионов магния на активность препарата НАД+-МЭ 2 в концентрациях а) 0,05 - 3 мМ; б) 3 - 40 мМ:

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат

Рис. 46. Влияние ионов бария активность препарата НАД+-МЭ 2: 1- 0,1 мМ малат; 2 - 0,2 мМ малат

[I], мМ

Рис. 47. Влияние ионов кальция активность препарата НАД+-МЭ 2: 1 - 0,1 мМ малат; 2- 0,2 мМ малат

Рис. 48. Влияние ионов марганца активность препарата НАД+-МЭ 2 в концентрациях а) 0,05 - 3 мМ; б) 3 - 40 мМ:

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат

Рис. 49. Влияние ионов магния на активность препарата НАДФ+-МЭ в концентрациях а) 0,05 - 7,5 мМ; б) 7,5 - 40 мМ:

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат.

Рис. 50. Влияние ионов бария активность препарата НАДФ+-МЭ :

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат.

Рис. 51. Влияние ионов кальция активность препарата НАДФ+-МЭ: 1 - 0,1 мМ малат; 2- 0,2 мМ малат.

Рис. 52. Влияние ионов марганца активность препарата НАДФ+-МЭ в концентрациях а) 0,05 - 7,5 мМ; б) 7,5 - 40 мМ:

1 - 0,1 мМ малат;

2 - 0,2 мМ малат

Таблица 4 .

Праймеры к генам оксидоредуцируюих малатдегидрогеназ для

метилспецифичной ПЦР

Ген Название Последовательность

1 2 4 5

прямой М CCGCTAAAAAAATAATAGCA

I обратный М GATTATTGGTTGAGTAGGAGG

прямой U CCGCTAAAAAAATAATAACA

обратный U ATTATTGGTTGAGTAGGAGG

прямой М AAATCTAAATAAACAATCGCC

II обратный М GATTATTGGTTGAGTAGGAGG

прямой U CATAAATCTAAATAAACAACA

обратный U ATTATTGGTTGAGTAGGAGG

прямой М CTCCTATAACTATTATCAATATAAAGCA

III обратный М GATTATTGGTTGAGTAGGAGG

прямой U CTCCTATAACTATTATCAATATAAAACA

обратный U ATTATTGGTTGAGTAGGAGG

прямой М GTTTGTTTGTTTGTTGGTTATTGTC

I обратный М TTCCTAACTCCCCTAAAACTCGT

прямой U TTGTTTGTTTGTTGGTTATTGTTGT

обратный U TTTTCCTAACTCCCCTAAAACTCAT

II прямой М TGTTTTGTATTTTTTTATTATCGA