Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Суворова, Ирина Игоревна

• Суворова, Ирина Игоревна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Суворова, Ирина Игоревна

Оглавление

Список используемых сокращений

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эмбриональные стволовые клетки

1.1 Происхождение и основные свойства ЭСК

1.2 Сигнальные пути, участвующие в регуляции самообновления и

плюрипотентности ЭСК

1.3 Транскрипционные маркеры плюрипотентности

1.4 Структура клеточного цикла ЭСК

2. Активация ATM/ATR-сигнального пути в клетках после повреждения ДНК

2.1. Общая схема активации ATM/ATR-сигнального каскада

2.2. Распознавание повреждений ДНК и формирование репаративных фокусов

2.3. Активация контрольных точек клеточного цикла в фазах G]/S, S и G2/M после

повреждения ДНК

2.4. Регуляция белка р53 и его роль в клеточном ответе на повреждение ДНК

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток

МТТ-тест

Проточная цитофлуориметрия на содержание ДНК

Анализ активности каспаз in vitro

Иммунофлуоресценция

Электрофорез и иммуноблоттинг

Выделение РНК и ОТ-ПЦР

РЕЗУЛЬТАТЫ

Активация киназ ATM и ATR в ЭСК после повреждения ДНК

Колокализация фокусов уН2АХ с белками RAD51, DNA-PK и 53ВР1 после облучения в

ЭСК

Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение мЭСК по фазам

клеточного цикла и выживаемость клеток

Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение чЭСК по фазам

клеточного цикла

Активация сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения ДНК

Функциональные последствия активации белка р53, вызванной облучением, на

плюрипотентные свойства мЭСК

Последствия нутлин-зависимой активации белка р53 на плюрипотентные свойства

мЭСК

ОБСУЖДЕНИЕ

Активация киназ ATM и ATR и последующее формирование репаративных фокусов в

ЭСК после повреждения ДНК

Роль киназ ATM, ATR, Chkl и Chk2 в распределении ЭСК человека и мыши по фазам

клеточного цикла

Функциональный статус сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения

ДНК

Функциональные последствия активации р53 на плюрипотентные свойства мЭСК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Список цитированной литературы

Список используемых сокращений

ATM ataxia telangiectasia mutated

ATR ataxia telangiectasia and Rad3-related protein

ASK1 apoptosis signal-regulating kinase

ВМР4 bone morphogenetic protein

BRCA breast cancer

53ВР1 p53-Binding Protein

BRCT BRCA-1 C-terminus

CDK cyclin-dependent kinase

Chkl checkpoint kinase

Chk2 checkpoint kinase

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMSO dimethylsulfoxide

DNA-PK DNA-dependent protein kinase

ERK extracellular signal-regulated kinase

FGF fibroblast growth factor

GAPDH rjiHLi,epajibAerH/i,-3-(J)Oc4)aTflerHflporeHa3a

GDF growth differentiation factor

HDAC hystone deacetylase

Hdm2 human double minute

HR homologous recombination

IL6 interleukin

JAK Janus-associated kinase

Klf Kriippel like factor

LIF leukemia inhibitory factor

LIFR LIF receptor

МАРК mitogen-activated protein kinase

MDC1 mediator of Damage Checkpoint protein

Mdm2 mouse double minute

МЕК mitogen activated protein kinase kinase

Mrell meiotic recombination

Mytl myelin transcription factor

NBS1 nijmegen Breakage Syndrome

NHEJ non-homologous end joining

p-TEFb positive transcription elongation factor b

PBS phosphate buffer solution

PIKK phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases

PCNA proliferating cell nuclear antigen

PI3K phosphoinositide 3-kinase

Rb retinoblastoma protein

RPA replication protein A

Sox2 SRY-related high-mobility group (HMG)-box-2

STAT signal transducer and activator of transcription

Tbx3 T-box transcription factor3

Tcf T cell-factor

Tell T-cell leukemia oncogene

TGFP transforming growth factor (3

Trim28 Tripartite motif-containing

XRCC4 X-ray repair cross-complementing protein

BKM внутренняя клеточная масса

MTT метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромид

ЭКК эмбриональные карциномные клетки

мЭСК эмбриональные стволовые клетки мыши

чЭСК эмбриональные стволовые клетки человека

ОТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей полимеразной

цепной реакцией

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют большой научно-практический интерес, так как они могут быть использованы для получения дифференцированных производных - клеток и тканей, необходимых для целей регенеративной медицины и клеточной терапии. Дополнительной мощной поддержкой для исследования ЭСК явилась разработка принципиально новых методов, направленных на получение индуцированных плюрипотентных клеток (iPSCs) из обычных соматических клеток, которые имеют много общих свойств с ЭСК. Использование ЭСК в развитии биомедицинских технологиях возможно благодаря их уникальным свойствам - плюрипотентности и самообновлению. Однако главной проблемой терапевтического применения ЭСК остается проблема генетической стабильности популяции этих клеток. На фоне неограниченной пролиферативной активности ЭСК, когда большая часть (60-70%) популяции находится в фазе синтеза, возникающие, в том числе и при репликации ДНК, повреждения ДНК могут накапливаться в виде мутаций. Поскольку возникающие мутации несут серьезную угрозу для всех дифференцированных клеточных потомков, в ЭСК должны

функционировать механизмы, которые минимизировали бы последствия различных генотоксических воздействий.

В соматических клетках поддержание стабильности и целостности

генома происходит через активацию ATM/ATR-сигнального каскада,

который координирует общий клеточный ответ на повреждение ДНК,

вовлекая сигнальные пути, ответственные за остановку клеточного цикла

(чекпойнт-контроль), репарацию, индукцию апоптоза и старения. Клеточный

ответ на повреждение ДНК начинается с активации сенсорных киназ ATM и

ATR, которые распознают повреждения ДНК и в свою очередь активируют

5

нижележащие сигнальные пути. Киназы ATM и ATR участвуют в фосфорилировании гистона ШАХ по Serl39 в области разрывов ДНК с образованием фокусов уШАХ - обязательный этап для формирования репаративных фокусов. К местам фокусов уН2АХ привлекается множество белков, среди которых комплекс Mrel 1/Nbsl/Rad50, MDC1, BRCA-1, адапторный белок 53ВР1, репаративные белки Rad51, киназы DNA-PK и Ки70/80 и другие (Pauli et al., 2000; Fernandez-Capetillo et al., 2003). Параллельно ATM и ATR фосфорилируют нижележащие киназы Chk2 и Chkl и совместно с ними участвуют в активации (фосфорилироваии) и стабилизации опухолевого супрессора р53. Белок р53 является транскрипционным фактором и транс-активирует множество генов-мишеней, в частности ген p21/Wafl, белковый продукт которого ингибирует циклин-зависимые киназные комплексы и опосредует остановку клеточного цикла на границе фаз Gt/S при действии генотоксического стресса.

ЭСК не останавливаются в контрольной точке Gi/S клеточного цикла, в которой клетки с поврежденной ДНК не допускаются до процесса репликации, и подвергаются только временному блоку G2/M (Малашичева и др., 2002; Becker et al., 2006; Chuykin et al., 2008). Поэтому можно предположить, что в ЭСК реализуются особые механизмы клеточного ответа на повреждение ДНК, которые строго скоординированы с их главными свойствами — плюрипотентностью и самообновлением - и (в значительной степени) могут отличаться от ответа соматических клеток. Исследование активации ATM/ATR-сигнального пути в ЭСК при действии генотоксических факторов расширит наше понимание фундаментальных механизмов, лежащих в основе поддержания стабильности и целостности генома этих клеток.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование особенностей активации ATM/ATR-сигнального пути в ЭСК мыши и человека (мЭСК, чЭСК) после повреждения ДНК. Были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать способность ЭСК к активации сенсорных киназ ATM, ATR и последующему формированию репаративных фокусов в местах повреждений ДНК после облучения.

2. Выявить вклад киназ ATM, ATR, Chkl и Chk2 в распределение ЭСК по клеточному циклу, в частности в реализацию временного блока G2/M, и выживаемость после облучения.

3. Проанализировать функциональный статус сигнального пути р53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения ДНК.

4. Провести сравнительное изучение последствий активации сигнального пути p53-p21/Wafl в клетках при действии облучения и при действии нутлина - специфического блокатора протеасомной деградации белка р53, на структуру клеточного цикла и плюрипотентные свойства мЭСК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эмбриональные стволовые клетки

1.1 Происхождение и основные свойства ЭСК

Эмбрион млекопитающих на стадии преимплантационной бластоцисты (3.5-4-й день эмбриональной стадии у мышей, и 8-й день у человека) состоит из двух различных клеточных популяций, различающихся по морфологии и на молекулярной уровне: наружного слоя клеток - трофоэктодермы и клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) (схема 1). В то время как клетки трофобласта дают начало зародышевой части плаценты, ВКМ являются источником образования всех типов тканей взрослого организма, а также внезародышевых тканей. В постимплантационной стадии эмбриогенеза ВКМ разделяются на эпибласт (первичную эктодерму) и гипобласт (первичную эндодерму). Впоследствии из гипобласта образуется внезародышевая эндодерма (выстилке желточного мешка), а из клеток эпибласта образуются все производные трех зародышевых листков (эктодерма, мезодерма, эндодерма) и внезародышевые структуры (амнион, аллантоис, мезодерма желточного мешка) (Niwa et al., 2007).

Клетки на пре- и постимплантационных стадиях эмбриона представляют собой источник различных линий стволовых клеток, среди которых особый интерес представляют эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые наряду с клетками эпибласта обладают свойством плюрипотентности - способностью образовывать все типы клеток взрослого организма. Их широкий дифференцировочный потенциал выявляется в опытах in vivo, когда ЭСК, пересаженные в ткани взрослых мышей, способны формировать тератомы. Кроме того, клеточные потомки инъецированной бластоцисты обнаруживаются во всех взрослых тканях

Морула

sO

Рапная бпасто циста

Внутренняя

-► ошга

(ВКМ)

Поздняя бпастоциста

Полос» бвспцкш

Постимплантационный зародыш

Нфычние

половые кжстен

Соштачсяис

ПрофоЭЕГОДфШ

ЭшраэнЁршх

ЗЕГОДфШ

Эдвдфм Мезодфша Эцдэдфм

Проишхоппнха полость

Схема 1. Схематическое изображение эмбрионального развития мыши на ранней стадии. Рисунок взят из обзора Nrwa et al., 2007, Development. Подробное описание в тексте.

химерного животного, а также в клетках зародышевой линии (Bradley et al., 1984).

В 1998 году из избыточных бластоцист, которые были не использованы

в процессе экстракорпорального оплодотворения, была выделена линия

плюрипотентных стволовых клеток человека (Thompson et al., 1995).

Основываясь на источнике их происхождения и способности формировать

тератомы, эти клетки были определены как чЭСК. Однако при более

подробном их исследовании выяснилось, что чЭСК по своим особенностям в

значительной степени отличаются от мЭСК (Chia et al., 2010). Например, для

поддержания недифференцированного состояния чЭСК не требуется фактор.

LIF, в то время как факторы FGF и Activin необходимы для самообновления

и плюрипотентности. Конечно, эти различия в первую очередь могут быть

объяснены видоспецифическими особенностями. Однако с другой стороны,

выделение эпибластных стволовых клеток из постимплантационного

зародыша мыши позволило предположить, что чЭСК могут соответствовать

более поздней стадии эмбриогенеза, чем мЭСК (Smith et al., 2001; Tesar et al.,

2007). Интересно, что выделение мЭСК происходит из эмбрионов в

состоянии диапаузы (Evans and Kaufman, 1981). Диапауза - состояние, так

называемого, эмбрионального «ареста» в преимплантационной стадии

бластоцисты. Такой «арест» возникает при нехватке эстрогенов и длится до

тех пор, пока не восстановятся условия, необходимые для имплантации

бластоцисты в стенку матки. Таким образом, наличие такого феномена у

мышей способствует получению ЭСК из эмбрионального зародыша (Smith et

al., 2001). В настоящее время отсутствуют прямые свидетельства наличия

диапаузы в ходе эмбрионального развития человека, что дает возможность

некоторым исследователям предполагать, что процесс выделения чЭСК

сопровождается их одновременной прогрессией в более позднюю стадию

эмбриогенеза (De los Angeles et al., 2012; Smith et al., 2001). Можно отметить,

что если культивировать бластоцисты мыши в присутствии факторов FGF и

Activin, то преимущественно будут формироваться эпибластные стволовые

10

клетки, а не обычные ЭСК (Najm et al., 2011). Таким образом, у чЭСК намного больше общих особенностей с мЭпиСК, чем с мЭСК, хотя с другой стороны имеются и некоторые различия, что также делает сложным их сравнение.

Состояние плюрипотентности in vivo является преходящим, но при соблюдении строго определенных условий культивирования возможно поддержание полученных из бластоцисты ЭСК в этом состоянии in vitro достаточно долго, что характеризует их еще одно их важное свойство -самообновление. Самообновление можно определить как состояние, при котором ЭСК активно пролиферируют, претерпевая симметричные деления с сохранением исходных свойств (Smith, 2001). Поддержание плюрипотентности достигается через самообновление, и в связи с этим ЭСК характеризуются целым рядом особенностей. Во-первых, ЭСК имеют уникальную структуру клеточного цикла: укороченную фазу G] и отсутствие контрольной точки Gi/S, и соответственно большая часть клеточной популяции (около 60% мЭСК и 40% чЭСК) находятся в фазе синтеза ДНК (Becker et al., 2006; Chuykin et al., 2008). Известно, что в начале фазы Gi клетка коммитирована на восприятие сигналов извне - митогенные стимулы или ростовые факторы, от которых зависит дальнейшая прогрессия или остановка клеточного цикла. Вероятно, функциональное значение отсутствия митоген-чувствительного периода фазы Gi в ЭСК заключается в том, чтобы избежать стимулирующего действия сигналов, запускающих дифференцировку.

Кроме того, ЭСК имеют определенные эпигенетические особенности.

Так, структура хроматина ЭСК находится в «открытой конформации», что

способствует быстрой регуляции генов, и характеризуется повсеместным

присутствием маркера транскрипционно-активного хроматина НЗК4теЗ

(Azuara et al., 2006). Этот гистоновый маркер ко-локализуется в особых

участках, которые были обозначены как «бивалентные домены» (Bernstein et

al., 2006). Эти домены состоят из коротких маркированных НЗК4теЗ

11

хроматиновых элементов, которые фланкированы участками хроматина, содержащих транскрипционно-репрессирующий НЗК27шеЗ. Такая «бивалентная» организация хроматина позволяет быстро регулировать гены в процессе эмбрионального развития. Таким способом регулируется большинство ткане-специфичных генов, которые находятся в подавленном состоянии в плюрипотентных ЭСК и быстро активируются при дифференцировке.

Одним из хорошо изученных эпигенетических феноменов в контексте плюрипотентности является активация и инактивация Х-хромосомы, статус которой часто используется как маркер состояния плюрипотентных ЭСК. Получение стабильных линий мЭСК из женских бластоцист бывает иногда проблематично из-за потери (инактивации) одной из двух X хромосом, что обычно происходит при дифференцировке, однако такие линии получены (Nichols and Smith, 2009; Zvetkova et al., 2005). В отличие от мЭСК, недифференцированные линии чЭСК могут содержать как две активированные X хромосомы, так и одну (Shen et al., 2008; Silva et al., 2008).

Стоит также отметить еще одну характерную особенность ЭСК -особый метаболический статус этих клеток. Так, гликолиз -преимущественный путь получения энергии для ЭСК, для которых характерна низкая активность митохондрий по сравнению с соматическими клетками (Prigione and Adjaye, 2010; Varum et al., 2011). В процессе дифференцировки происходит переключение с гликолитического пути на путь окислительного фосфорилирования. В связи с этим предполагается, что гипоксия способствует поддержанию плюрипотентного состояния ЭСК (Ezashi and Roberts, 2005; Forristal et al., 2010).

1.2 Сигнальные пути, участвующие в регуляции самообновления и плюрипотентности ЭСК

Для получения и сохранения исходных свойств любых постоянных клеточных линий, в частности ЭСК, необходимо строгое соблюдение определенных условий культивирования. Культивирование ЭСК в отличие от большинства других клеток имеет свою специфику. Для успешной пролиферации ЭСК необходимо культивирование на слое фидерных клеток, в качестве которых часто используют митотически инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты (MEFs). Фидерные клетки экспрессируют факторы, необходимые для самообновления и поддержания ЭСК в недифференцированном виде.

мЭСК можно культивировать как на фидерном слое фибробластов, так и на желатинизированных чашках Петри в среде, содержащей необходимые ростовые факторы. Одним из необходимых факторов является LIF (Leukaemia Inhibitory Factor). Установлено, что сигнальный путь, активируемый LIF, необходим для сохранения недифференцированного состояния мЭСК (Chambers and Smith 2004). LIF является цитокином из семейства интерлейкинов IL-6, и его влияние на клетки обусловлено взаимодействием с рецепторным гетеродимерным комплексом GP130 и LIFR. В первую очередь LIF взаимодействует со своим рецептором LIFR, затем этот комплекс привлекает GP130 и формируется тримерный комплекс (Zhang et al., 1997). В мЭСК LIFR и GP130 активируют несколько сигнальных путей, среди которых определяющим сохранение плюрипотентности мЭСК считается путь активации транскрипционного фактора STAT3, который вовлечен в активацию таких генов как klf4, sox2, oct3/4. Интересно, что LIF-зависимый механизм поддержания плюрипотентности не функционирует в крысиных ЭСК, а также в ЭСК приматов, в частности в чЭСК (Daheron et al., 2004; Humphrey et al., 2004; Buehr et al., 2008). Несмотря на то, что рецептор LIFR экспрессируется во всех этих клетках и фактор LIF может взаимодействовать с ним, активируя STAT3, который затем транслоцируется в ядро, этот путь не является значимым для поддержания плюрипотентного состояния (Li et al., 2008).

Удивительно, но LIFR(3 и gpl30 могут активировать сигнальный путь MAPK-ERK1/2, направляя ЭСК на выход из программы самообновления и вход в дифференцировку. Активированная киназа МЕК1 фосфорилирует киназы ERK1/2, которые затем транслоцируются в ядро и фосфорилируют транскрипционные факторы, ответственные за дифференцировку мЭСК (Burdon et al., 1999). Следовательно, путь через МАРК ингибирует самообновление мЭСК в отличие от каскада LIF-STAT3. Кстати, использование ингибиторов киназы МЕК1 PD98059 и U0126 повышают эффективность выделение мЭСК из бластоцисты (Nichols et al., 2009; Ying et al., 2008). Неожиданно, но ингибирование этой киназы в чЭСК приводит к быстрой потере свойства самообновления, что демонстрирует противоположную функциональную значимость пути MAPK-ERK1/2 в этих клетках (Li et al., 2007).

Кроме того, фактор LIF способен активировать путь через киназу PI3K в мЭСК, поддерживая недифференцированное состояние этих клеток с помощью негативной регуляцией активности ERK (Paling et al., 2004). Ингибирование этого пути в мЭСК усиливает LIF-зависимое фосфорилирование ERK и индуцирует дифференцировку, в то время как в чЭСК сигнальные каскады, идущие через PI3K и ERK, совместно поддерживают плюрипотентность (Li et al., 2007).

LIF не единственный фактор, необходимый для поддержания

недифференцированного состояния мЭСК. Как было сказано выше, для

культивирования мЭСК требуется добавление в среду эмбриональной бычьей

сыворотки, которая является богатым источником как митогенных факторов,

так и факторов, поддерживающих самообновление и плюрипотентность. В

числе последних, можно выделить факторы ВМР4 и GDF6, которые могут

эффективно заменять сыворотку и в присутствии фактора LIF поддерживать

плюрипотентность мЭСК с сохранением потенциала к дифференцировке

(Ying et al., 2003). ВМР4 действует на мЭСК через рецепторный комплекс,

состоящий из белков BMPRIa и BMPRII, что ведет к фосфорилированию

14

транскрипционных факторов Smad 1/5/8 и их взаимодействие с Smad4. BMP, а также GDF6, действуя через транскрипционные факторы Smad, влияют на гены Id (от англ. Inhibitors of differentiation), и таким образом супрессируют дифференцировку мЭСК (Ying et al., 2003). Соответственно, повышенная экспрессия Id в мЭСК позволяет сохранять недифференцированное состояние клеток в отсутствие сыворотки, но при наличии фактора LIF.

В отличие от мЭСК для чЭСК, как было сказано выше, фактора LIF недостаточно для поддержания недифференцированного состояния при культивировании без фидерного слоя. Некоторые исследователи объясняют этот факт слабой активацией STAT3-ny™ в этих клетках, в то время как другие - отсутствием или относительно слабой экспрессией компонентов сигнального пути, активируемого фактором LIF (Sato et al., 2004; Ginis et al., 2004). В качестве фидерной культуры для культивирования чЭСК используются фибробласты разного происхождения. В настоящее время многие исследователи чаще всего используют эмбриональные фибробласты человека (hEFs от англ. human embryonic fibroblasts), как альтернативный вариант мышиным эмбриональным фибробластам, во избежание заражения чЭСК ретровирусами грызунов. Имеются данные, предлагающие применение взрослых паренхимных клеток молочной железы человека (hBPCs, от англ. human adult breast parenchymal cells) и взрослых эндометриальных клеток матки человека (hUECs от англ. human adult uterine endometrial cells) в качестве фидера для культивирования чЭСК, причем последние демонстрируют схожие свойства с hEFs (Biswas and Hutchins, 2007). Bongso и коллеги сравнили целый ряд претендентов на роль фидера для культивирования чЭСК из числа взрослых, эмбриональных и неонатальных клеток человека. В итоге, наиболее подходящими кандидатами оказались эмбриональные мышечные клетки, взрослые клетки кожи и D551/CC1-10 (коммерчески полученные эмбриональные клетки кожи), которые лучше всего поддерживали популяцию чЭСК в недифференцированном состоянии

по сравнению с MEFs (70-90% против 65-75%) (Tan and Bongso 2003).

15

Однако все больше исследователей переходят на бесфидерную систему культивирования, используя в качестве подложки разные бесфидерные субстраты, включающие в себя белки внеклеточного матрикса, при этом в ростовую среду добавляют факторы роста и другие агенты, стимулирующие клеточный рост. Успешно используется кондиционированная среда MEFs для поддержания недифференцированного состояния чЭСК в культуре. Учитывая, что большинству клеток для выживаемости и роста требуется межклеточные контакты (адгезия), чЭСК синтезируют интегрин аб и pi (специфический рецептор к ламинину), экспрессия которых может зависеть от некоторых растворимых факторов, продуцируемых MEFs (Biswas and Hutchins 2007). Комбинация подходящих белков матрикса, таких как матригель или ламинин, и кондиционированная среда MEFs хорошо поддерживают рост недифференцированных чЭСК. Кроме того, растворимым фактором, отвечающий за «стволовость» чЭСК, является активин А, продуцируемый MEFs. Как было показано, в среде, обогащенной активином А, плюрипотентность чЭСК сохраняется даже при отсутствии фидерного слоя (Beattie et al., 2005). Кроме того, фактор FGF2 (или bFGF) также играет существенную роль в поддержании самообновления и плюрипотентности чЭСК, a TGF(3 усиливает эффект bFGF, поддерживая недифференцированное состояние чЭСК в отсутствии фидера (Vallier et al., 2005; Greber et al., 2007). Известно также, что Wnt сигнальный путь вовлечен в кратковременное сохранение плюрипотентности не только мышиных, но и человеческих ЭСК. Показан еще один интересный факт, что BMP путь, поддерживающий совместно с LIF самообновление мЭСК, обеспечивает дифференцировку чЭСК в клетки трофобласта (Xiao et al., 2006).

Таким образом, существует возможность ведения ЭСК без фидерного слоя, на чашках, покрытых желатином (для мЭСК), либо набором экстраклеточных белков - матригелем (для чЭСК). При этом для мышиных клеток важно наличие в среде фактора LIF, а для клеток человека - фактора

роста фибробластов bFGF, трансформирующего фактора роста TGFpi и активина A (Beattie et al., 2005).

1.3 Транскрипционные маркеры плюрипотентности

Недифференцированное состояние ЭСК поддерживается коровыми транскрипционными факторами Oct3/4, Nanog и Sox2 (Young, 2011). Предполагается, что среди них Oct3/4 играет критичную роль в установлении и поддержании фундаментального свойства плюрипотентности, так как эмбрионы, у которых отсуствует Oct3/4, не способны к формированию ВКМ и дифференцируются в трофоэктодермальные ткани (Nichols et al., 1998). Белок Oct3/4, кодируемый геном Pou5fl, экспрессируется в ВКМ и эпибласте, первичных половых клетках и недифференцированных ЭСК (Scholer et al., 1990). В чЭСК Oct3/4, кодируемый геном OTF3, представлен в трех изоформах ОСТ4А, ОСТ4В и ОСТ4В1, среди которых только ОСТ4А является ответственным за поддержание плюрипотентных свойств (Wanq and Dai, 2010). Белок Oct3/4 принадлежит к семейству транскрипционных факторов POU, члены которого контролируют экспрессию своих генов-мишеней через связывание с октамерной последовательностью ATGCAAAT (Herr and Cleary, 1995). Чтобы оставаться плюрипотентнтыми, ЭСК необходимо поддерживать уровень белка Oct3/4 на строго определенном уровне, так как его сверхэкспресия будет приводить мезодермальной и эндодермальной дифференцировке, а низкая экспрессия к дифференцировке в клетки трофоэктодермы (Niwa et al., 2000). Также критичная роль Oct3/4 в поддержании плюрипотентности и самообновления выявляется в процессе получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) (Takahashi and Yamanaka, 2006; Maherali and Hochedlinger, 2008). Технология создания таких клеток требует введения различных комбинаций транскрипционных факторов, среди которых всегда присутствует Oct3/4. Так,

например, большинство протоколов получения iPSCs не требует введения фактора Nanog, который находиться под регуляцией Oct3/4 и других транскрипционных факторов (Schwarz et al., 2014). Введение фактора Sox2 в некоторых случаях также не требуется, как, например, при работе с нейрональными стволовыми клетками, которые его уже экспрессируют (Kim et al., 2009).

Хорошо охарактеризованным партнером Oct3/4 является транскрипционный фактор Sox2. Взаимодействие между Oct3/4 и Sox2 впервые было описано при выявлении их функционального связывания с энхансерным элементом гена fgf4 (Ambrosetti et al., 1997). Далее ДНК-связывающие последовательности для Oct3/4 и Sox2 были обнаружены в энхансерных областях многих генов, включая nanog (Chambers and Tomlinson, 2009). Как и в случае ЭСК, нокаутных по гену oct3/4, ЭСК с делецией гена sox2 дифференцируются в клетки трофобласта (Masui et al., 2007). Несмотря на то, что Sox2 является ко-активатором для Oct3/4, Sox2 сам по себе не является обязательным для активации Sox-Oct энхансерных областей, что может предполагать наличие других белков, замещающих его активность. Однако показано, что Sox2 необходим для регуляции транскрипционных факторов, влияющих на экспресиию Oct3/4 (Masui et al., 2007).

Транскрипционный фактор Nanog впервые был открыт в процессе скрининга плюрипотентных факторов, которые могли бы поддерживать самообновление мЭСК в отсутствии фактора LIF (Chambers et al., 2003). Было показано, что мЭСК с генетической делецией nanog имеют тенденцию к дифференцировке, но при этом сохраняют плюрипотентное состояние (Chambers et al., 2007). Предполагается, что Nanog необходим для формирования ВКМ и первичных половых клеток, а также стабилизирует ЭСК в культуре, предотвращая сигналы, вызывающие дифференцировку (Chambers et al., 2007).

Геномный анализ показал, что Oct3/4 взаимодействует приблизительно с 623 (3%) промоторными районами известных белок-кодирующих генов в чЭСК, в то время как Sox2 и Nanog связываются с 1271 (7%) и 1687 (9%) генами, соответственно (Boyer et al., 2005). Кроме того, обнаружено 353 гена, с которыми ассоциированы все три перечисленных транскрипционных фактора, что свидетельствует о тесном взаимодействии всех этих факторов в регуляции плюрипотентности и самообновления (Wang and Guda, 2014). Таким образом, общая схема функционирования, описанных выше транскрипционных факторов, может заключаться в активации экспрессии других белков, ассоциированных с поддержанием плюрипотентного состояния и с одновременной репрессией генов дифференцировки, а также в активации собственной экспрессии или экспрессии друг друга (Young, 2011). По крайней мере, такая модель отвечает на вопрос, как ЭСК поддерживают самообновление и плюрипотентность, оставаясь на пороге дифференцировки.

Для идентификации других транскрипционных факторов, необходимых для поддержания самообновления мЭСК, Иванова (Ivanova) и коллеги, используя принцип РНК-интерференции, протестировали больше 100 транскрипционных факторов (Ivanova et al., 2006). Согласно полученным результатам, только 6 генов были вовлечены в поддержание самообновления мЭСК и включали oct3/4, sox2, nanog (как ожидалось), а также esrrb, tbx3 и tell. Далее в мЭСК были выявлены дополнительные важные участники, поддерживающие плюрипотентность, как например регуляторы хроматина Tip60-p400 и SetDBl, а также Cnot3, Trim28, PaflC как главные транскрипционные ко-факторы (Fazzio et al., 2008; Bilodeau et al., 2009; Hu et al., 2009; Ding et al., 2009). Кроме того, был идентифицирован транскрипционный фактор PRDM14 как один из ключевых участников, поддерживающих главные свойства чЭСК, но не мЭСК, что свидетельствует о важных видо-специфичных отличиях между этими клетками (Chia et al., 2010).

с-Мус - другой важный регулятор самообновления и плюрипотентности ЭСК, который также вовлечен в процесс репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные и в канцерогенез (Takahashi and Yamanaka, 2006; Kim et al., 2010). В настоящее время полагают, что транскрипционный модуль Мус, куда входит с-Мус, функционирует независимо от транскрипционного модуля плюрипотентных факторов (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008). Модуль myc включает в себя n-Myc, Rexl, Zfx, E2F и др. и вовлечен в процессы самообновления и метаболизма (Chen et al., 2008; Kim et al., 2008; Kidder et al., 2008). Так, полагают, что появление раковых клеток с фенотипом ЭСК есть следствие активации транскрипционного модуля Мус (Kim et al., 2010). Огромное количество активно транскрибируемых генов в ЭСК совместно регулируется транскрипционными факторами и белком с-тус. Причем, факторы Oct3/4, Nanog и Sox2 определяют выбор генов, которые будут транскрибироваться с привлечением РНК-полимеразы II, которая синтезирует небольшой фрагмент, останавливаясь в так называемой «паузе». Затем привлекается транскрипционный фактор Cdk9/CyclinT (p-TEFb), который фосфорилирует энзим и освобождают его из состояния «паузы», позволяя полностью транскрибировать ген. Было показано, что с-тус регулирует эффективность, с которой эти гены будут транскрибироваться, привлекая фактор p-TEFb (Rahl et al., 2010; Smith et al., 2011). Таким образом, можно объяснить, почему усиленная экспрессия с-тус повышает эффективность репрограммирования соматических клеток и играет важную роль в пролиферации раковых клеток (Jaenisch and Young, 2008; Rahl et al., 2010).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Суворова, Ирина Игоревна, 2014 год

Список цитированной литературы

1. Кожухарова И.В., Фридлянская И.И., Ковалева З.В., Пуговкина Н.А., Алексеенко JI.JL, Зенин В.В., Иванцов К.М., Леонтьева O.K., Гринчук Т.М., Никольский Н.Н. 2009. Новые линии эмбриональных стволовых клеток человека С612 и С910. Цитология. Т. 51. № 7. С. 551-557.

2. Малашичева А.Б., Кислякова Т.В., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А. Отсутствие блока G1/S в клетках тератокарциномы F9 обусловлено деградацией ингибитора циклин-зависимых киназ р21™аШс1р1//Цитология. 2000. Т. 42. №5. С. 433-440.

3. Малашичева А. Б., Кислякова Т. В., Саватьер П., Поспелов В.А. Эмбриональные стволовые клетки не останавливаются в клеточном цикле при действии повреждающих факторов //Цитология. 2002. Т. 44. № 7. С. 643-648.

4. Abraham R.T. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases//Genes Dev. 2001. V. 15. № 17. P. 2177-2196.

5. Adams B.R., Golding S.E., Rao R.R., Valerie K. Dynamic dependence on ATR and ATM for double-strand break repair in human embryonic stem cells and neural descendants//PLoS One. 2010. V.5. №4. P.e 10001.

6. Adams K.E., Medhurst A.L., Dart D.A., Lakin N.D. Recruitment of ATR to sites of ionising radiation-induced DNA damage requires ATM and components of the MRN protein complex //Oncogene. 2006. V. 25. № 28. P. 3894-3904.

7. Agarwal S., Tafel A.A., Kanaar R. DNA double-strand break repair and chromosome translocations //DNA Repair. 2006. V .5. № 9-10. P. 10751081.

8. Akdemir K.C., Jain A.K., Allton K., Aronow В., Xu X., Cooney A.J., Li W., Barton M.C. Genome-wide profiling reveals stimulus-specific functions of p53 during differentiation and DNA damage of human embryonic stem cells //Nucleic Acids Res. 2014. V. 42. № 1. P. 205-23.

9. Ambrosetti D.C., Basilico C., Dailey L. Synergistic activation of the fibroblast growth factor 4 enhancer by Sox2 and Oct-3 depends on proteinprotein interactions facilitated by a specific spatial arrangement of factor binding sites //Mol Cell Biol. 1997. V. 17. № 11. P. 6321-6329.

10. Azuara V., Perry P., Sauer S., Spivakov M., Jorgensen H.F., John R.M., Gouti M., Casanova M., Warnes G., Merkenschlager M., Fisher A.G. Chromatin signatures of pluripotent cell lines//Nat Cell Biol. 2006. V.8. №5. P.532-538.

11. Bakkenist C.J., Kastan M.B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation // Nature. 2003. V. 421. №6922. P. 499-506.

12. Bartek J., Falck J., Lukas J. Chk2 kinase - a busy messenger //Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. V. 2. № 12. P. 877-886.

13. Beattie G.M., Lopez A.D., Hayek A. Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers //Stem Cells. 2005. V. 23. №4. P. 489-495.

14. Becker K.A., Ghule P.N., Therrien J.A., Lian J.B., Stein J.L., van Wijnen

A.J., Stein G.S. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase //J Cell Physiol. 2006. V. 209. № 3. P. 883893.

15. Bernstein B.E., Mikkelsen T.S., Xie X., Kamal M., Huebert D.J., Cuff J., Fry

B., Meissner A., Wernig M., Plath K., Jaenisch R., Wagschal A., Feil R., Schreiber S.L., Lander E.S. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells //Cell. 2006. V. 125. № 2. P. 315-326.

16. Bilodeau S., Kagey M.H., Frampton G.M., Rahl P.B., Young RA. SetDBl contributes to repression of genes encoding developmental regulators and maintenance of ES cell state//Genes Dev. 2009. V.23. №21. P.2484-2489.

17. Biswas A., Hutchins R. Embryonic stem cells //Stem cells and development. 2007. V. 16. №2. P. 213-221.

18. Bo S, Hui H, Li W., Hui L., Hong X., Lin D., Dai W.X., Wu Y.H., Ai X.H., Hao J., Qi S. Chkl, but not Chk2, is responsible for G2/M phase arrest induced by diallyl disulfide in human gastric cancer BGC823 cells //Food Chem Toxicol. 2014 V. 68.P. 61-70.

19. Booher R.N., Holman P.S., Fattaey A. Human Mytl is a cell cycle-regulated kinase that inhibits Cdc2 but not Cdk2 activity //J Biol Chem. 1997. V. 272. №35. P. 22300-22306.

20. Bradley A., Evans M., Kaufman M.H., Robertson E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines //Nature. 1984. V. 309. № 5965. P. 255-256.

21. Brugarolas J., Chandrasekaran C., Gordon J.I., Beach D., Jacks T., Hannon G.J. Radiation-induced cell cycle arrest compromised by p21 deficiency // Nature. 1995 V. 377. № 6549. P. 552-557.

22. Bode A.M., Dong Z. Post-translational modification of p53 in tumorigenesis. Nat. Rev // Cancer. 2004. V. 4. № 16. P. 793-805.

23. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F., Johnstone S.E., Levine S.S., Zucker J.P., Guenther M.G., Kumar R.M., Murray H.L., Jenner R.G., Gifford D.K., Melton D.A., Jaenisch R., Young R.A. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells //Cell. 2005. V. 122. №6. P. 947956.

24. BuehrM., Meek S., Blair K., Yang J., Ure J., Silva J., McLay R., Hall J., Ying Q.L., Smith A. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts //Cell. 2008. V. 135. № 7. P. 1287-1298.

25. Burdon T., Chambers I., Stracey C., Niwa H., Smith A. Signaling mechanisms regulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells //Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 4. P. 131-143.

26. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells //Cell. 2003.V.113. № 5. P. 643-655.

27. Chambers I., Silva J., Colby D., Nichols J., Nijmeijer B., Robertson M., Vrana J., Jones K., Grotewold L., Smith A. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development//Nature. 2007. V. 450. № 7173. P. 1230-1234.

28. Chambers I. and Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells //Oncogene. 2004. V. 23. № 43. P. 7150-7160.

29. Chambers I., Tomlinson S.R. The transcriptional foundation of pluripotency //Development. 2009. V. 136. № 14. P. 2311-2322.

30. Chang H.M., Martinez N.J., Thornton J.E., Hagan J.P., Nguyen K.D., Gregory R.I. Trim71 cooperates with microRNAs to repress Cdknla expression and promote embryonic stem cell proliferation //Nat Commun. 2012. V.3. P.923.

31. Chapman J.R., Sossick A.J., Boulton S.J., Jackson S.P. BRCA1-associated exclu-sion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNArepair //J. Cell Sci. 2012. V. 125. № 15. P. 3529-3534.

32. Charvet C., Wissler M., Brauns-Schubert P., Wang S.J., Tang Y., Sigloch F.C., Mellert H., Brandenburg M., Lindner S.E., Breit B., Green D.R., McMahon S.B., Borner C., Gu W., Maurer U. Phosphorylation of Tip60 by GSK-3 determines the induction of PUMA and apoptosis by p53 // Mol Cell. 2011. V. 42. №5. P. 584-596.

33. Chen X., Xu H., Yuan P., Fang F., Huss M., Vega V.B., Wong E., Orlov Y.L., Zhang W., Jiang J., Loh Y.H., Yeo H.C, Yeo Z.X, Narang V., Govindarajan K.R., Leong B., Shahab A., Ruan Y., Bourque G., Sung W.K., Clarke N.D., Wei C.L., Ng H.H. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells // Cell. 2008.V. 133. № 6. P. 1106-1117.

34. Chene P., Fuchs J., Bohn J., Garcia-Echeverria C., Furet P., Fabbro D. A small synthetic peptide, which inhibits the p53-hdm2 interaction, stimulates the p53 pathway in tumour cell lines// J. Mol. Biol. 2000. V. 299. № l.P. 245-253.

35. ChiaN.Y., Chan Y.S., Feng B., Lu X., Orlov Y.L., Moreau D., Kumar P., Yang L., Jiang J., Lau M.S., Huss M., Soh B.S., Kraus P., Li P., Lufkin T., Lim B., Clarke N.D., Bard F., Ng H.H. A genome-wide RNAi screen reveals determinants of human embryonic stem cell identity //Nature. 2010. V. 468. №7321. P. 316-320.

36. Chuykin I.A., Lianguzova M.S., Pospelova T.V., Pospelov V.A. 2008. Activation of DNA damage response signaling in mouse embryonic stem cells //Cell Cycle. V. 7. № 18. P. 2922-2928.

37. Conklin J.F., Sage J. Keeping an eye on retinoblastoma control of human embryonic stem cells // J Cell Biochem. 2009. V. 108. № 5. P. 1023-1030.

38. Corbet S.W., Clarke A.R., Gledhill S., Wyllie A.H. P53-dependent and -independent links between DNA-damage, apoptosis and mutation frequency in ES cells // Oncogene. 1999. V. 18. № 8. P. 1537-1544.

39. Crescenzi E., Palumbo G., de Boer J., Brady H.J..Ataxia telangiectasia mutated and p21CIPl modulate cell survival of drug-induced senescent tumor cells: implications for chemotherapy // Clin Cancer Res. 2008. V. 14. № 6. P .1877-1887.

40. Cuadrado M., Martinez-Pastor B., Murga M., Toledo L.I, Gutierrez-Martinez P., Lopez E., Fernandez-Capetillo O. ATM regulates ATR chromatin loading in response to DNA double-strand breaks //J Exp Med. 2006. V. 203. № 2. P. 297-303.

41. Daheron L., Opitz S.L., Zaehres H., Lensch M.W., Andrews P.W., Itskovitz-Eldor J., Daley G.Q. LIF/STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells //Stem Cells. 2004. V. 22. № 5. P. 770-778.

42. Dai C., Gu W. Review p53 post-translational modification: deregulated in tumorigenesis // Trends Mol Med. 2010. V. 16. № 11. P. 528-536.

43. Dannenberg J.H., van Rossum A., Schuijff L., te Riele H. Ablation of the retinoblastoma gene family deregulates G(l) control causing immortalization and increased cell turnover under growth-restricting conditions //Genes Dev. 2000. V. 14. № 23. P. 3051-3064.

44. De Los Angeles A., Loh Y.H., Tesar P.J., Daley G.Q. Accessing naive human pluripotency // Curr Opin Genet Dev. 2012. V. 22. №3. P. 272-282.

45. Ding L., Paszkowski-Rogacz M., Nitzsche A., Slabicki M.M., Heninger A.K., de Vries I., Kittler R., Junqueira M., Shevchenko A., Schulz H., Hubner N., Doss M.X.,Sachinidis A., Hescheler J., Iacone R., Anastassiadis K., Stewart A.F., Pisabarro M.T., Caldarelli A., Poser I., Theis M., Buchholz F. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Pafl complex for embryonic stem cell identity //Cell Stem Cell. 2009. V. 4. №5. P. 403-415.

46. Dolezalova D., Mraz M., Barta T., Plevova K., Vinarsky V., Holubcova Z., Jaros J., Dvorak P., Pospisilova S., Hampl A. MicroRNAs regulate p21(Wafl/Cipl) protein expression and the DNA damage response in human embryonic stem cells //Stem Cells. 2012. V. 30. №. 7. P. 1362-1372.

47. Dotto G.P. p21(WAFl/Cipl): more than a break to the cell cycle? //Biochim Biophys Acta. 2000.V. 1471. № 1. P. 43-56.

48. Downs J.A., Nussenzweig M.C., Nussenzweig A. Chromatin dynamics and the preservation of genetic information // Nature. 2007. V. 447. № 7147. P. 951-958.

49. Evans M.J. and Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154-156.

50. Ezashi T., Das P., Roberts R.M. Low 02 tensions and the prevention of differentiation of hES cells //Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102. № 13. P. 4783-4788.

51. Faast R., White J., Cartwright P., Crocker L., Sarcevic B., Dalton S. Cdk6-cyclin D3 activity in murine ES cells is resistant to inhibition by pl6(INK4a) //Oncogene. 2004. V. 23. № 2. P. 491-502.

52. Fazzio T.G., Huff J.T., Panning B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity //Cell. 2008. V. 134. №1. P. 162-174.

53. Fernandez-Capetillo О., Celeste A., Nussenzweig A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors //Cell Cycle. 2003. V. 2. № 5. P. 2426-2427.

54. Filion T.M., Qiao M., Ghule P.N., Mandeville M., van Wijnen A.J., Stein J.L., Lian J.B., Altieri D.C., Stein G.S. Survival responses of human embryonic stem cells to DNA damage //J Cell Physiol. 2009. V. 220. № 3. P. 586-592.

55. Filipczyk A.A., Laslett A.L., Mummery C., Pera M.F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells //Stem Cell Res. 2007. V. 1. № 1. P. 45-60.

56. Forristal C.E., Wright K.L., Hanley N.A., Oreffo R.O., Houghton F.D. Hypoxia inducible factors regulate pluripotency and proliferation in human embryonic stem cells cultured at reduced oxygen tensions // Reproduction. 2010. V. 139. № 1. P. 85-97.

57. Gartel A.L., Goufman E.,Najmabadi F., Tyner A.L. Spl and Sp3 activate p21 (WAF1/CIP1) gene transcription in the Caco-2 colon adenocarcinoma cell line // Oncogene. 2000.V. 19. № 45. P. 5182-5188.

58. Ginis I., Luo Y., Miura Т., Thies S., Brandenberger R., Gerecht-Nir S., Amit M., Hoke A., Carpenter M.K., Itskovitz-Eldor J., Rao M.S. Differences between human and mouse embryonic stem cells // Dev Biol. 2004. V. 69. № 2. P. 360-380.

59. Grandela C., Pera M.F., Grimmond S.M., Kolle G., Wolvetang E.J. p53 is required for etoposide-induced apoptosis of human embryonic stem cells // Stem Cell Res. 2007. V. 1. № 2. P. 116-128.

60. Greber В., Lebrach H., Adjaye J. Fibroblasts growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESCs self-renewal //Stem Cells. 2007. V. 25. № 2. P. 455-464.

61. Gu W., Roeder R.G. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain //Cell. 1997. V. 90. № 4. P. 595606.

62. Hanna J., Cheng A.W., Saha K., Kim J., Lengner C.J., Soldner F., Cassady J.P., Muffat J., Carey B.W., Jaenisch R. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs // Proc Natl Acad Sei USA. 2010. V. 107. № 20. P. 9222-9227.

63. Haupt S., Berger M., Goldberg Z., Haupt Y. Apoptosis - the p53 network // J Cell Sei. 2003. V. 116. № 20. P. 4077-4085.

64. Herr W., Cleary M.A. The POU domain: versatility in transcriptional regulation by a flexible two-in-one DNA-binding domain //Genes Dev. 1995. V. 9. № 14. P. 1679-1693.

65. Hong Y., Stambrook P.J. Restoration of an absent Gl arrest and protection from apoptosis in embryonic stem cells after ionizing radiation //Proc Natl Acad Sei USA. 2004. V. 101. № 40. P. 14443-14448.

66. Hu G, Kim J, Xu Q, Leng Y, Orkin SH, Elledge SJ. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal //Genes Dev. 2009. V. 23. № 7. P. 837-848.

67. Huarte M., Guttman M., Feldser D., Garber M., Koziol M.J., Kenzelmann-Broz D., Khalil A.M., Zuk O., Amit I., Rabani M., Attardi L.D., Regev A., Lander E.S., Jacks T., Rinn J.L. A large intergenic noncoding RNA induced by p53 mediates global gene repression in the p53 response// Cell. 2010. V.142. №3. P.409-419.

68. Humphrey R.K., Beattie G.M., Lopez A.D., Bucay N., King C.C., Firpo M.T., Rose-John S., Hayek A. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells is STAT3 independent //Stem Cells. 2004. V. 22. № 4. P. 522-530.

69. Hurley P.J., Bunz F. ATM and ATR: components of an integrated circuit //Cell Cycle. 2007. V. 6. № 4. P. 414-417.

70. Ivanova N., Dobrin R., Lu R., Kotenko I., Levorse J., DeCoste C., Schäfer X., Lun Y., Lemischka I.R. Dissecting self-renewal in stem cells with RNA interference //Nature. 2006. V. 442. № 7102. P. 533-538.

71. Jaenisch R. and Young R. Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming //Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 567-582.

72. Jain A.K., Allton K., Iacovino M., Mähen E., Milczarek R.J., Zwaka T.P., Kyba M., Barton M.C. p53 regulates cell cycle and microRNAs to promote differentiation of human embryonic stem cells //PLoS Biol. 2012. V. 10. №2. P. el001268.

73. Jazayeri A., Falck J., Lukas C., Bartek J., Smith G.C., Lukas J., Jackson S.P. ATM-and cell cycle-dependent regulation of ATR in response to DNA double-strand breaks // Nat Cell Biol. 2006. V. 15. № 8. P. 37-45

74. Jones S.M., Kazlauskas A. Growth factor-dependent signaling and cell cycle progression //Chem Rev. 2001. V. 101. № 8. P. 2413-2423.

75. Kastan M.B., Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer//Nature. 2004. V.432. №7015. P.316-323.

76. Kidder B.L., Yang J., Palmer S. Stat3 and c-Myc genome-wide promoter occupancy in embryonic stem cells //PLoS One. 2008. V. 3. № 12. P. e3932.

77. Kim J., Chu J., Shen X., Wang J., Orkin S.H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells //Cell. 2008. V. 132. № 6. P. 1049-1061.

78. Kim N.R., Kang S.K, Ahn H.H., Kwon S.W., Park W.S., Kim K.S., Kim S.S., Jung H.J., Choi S.U., Ahn J.H, Kim K.R. Discovery of a new and efficient small molecule for neuronal differentiation from mesenchymal stem cell //J Med Chem. 2009. V. 52. № 24. P. 79317933.

79. Kim J., Woo A.J., Chu J., Snow J.W., Fujiwara Y., Kim C.G., Cantor

A.B., Orkin S.H. A Myc network accounts for similarities

between embryonic stem and cancer cell transcription programs

//Cell. 2010.V. 143. № 2. P. 313-324.

98

80. Koledova Z., Kafkova L.R., Calabkova L., Krystof V., Dolezel P., Divoky V. Cdk2 inhibition prolongs G1 phase progression in mouse embryonic stem cells //Stem Cells Dev. 2010. V. 19. № 2. P. 181-194.

81. Kuo L.J., Yang L.X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA doublestrand breaks //In Vivo. 2008. V. 22. № 3. P. 305-309.

82. Kuribayashi K., Krigsfeld G., Wang W, Xu J., Mayes P.A., Dicker D.T, Wu

G.S., El-Deiry W.S.TNFSF10 (TRAIL), a p53 target gene that mediates p53-dependent cell death //Cancer Biol Ther. 2008. V. 7. № 12. P. 2034-2038.

83. Lam M.H., Liu Q., Elledge S.J., Rosen J.M. Chkl is haploinsufficient for multiple functions critical to tumor suppression //Cancer Cell. 2004. V. 6. № l.P. 45-59.

84. Lavin M.F., Kozlov S. ATM activation and DNA damage response //Cell cycle. 2007. V. 6. № 8. P. 931-942.

85. Li M., He Y., Dubois W., Wu X., Shi J., Huang J. Distinct regulatory mechanisms and functions for p53-activated and p53-repressed DNA damage response genes in embryonic stem cells //Mol Cell. 2012. V. 46. № 1. P. 3042.

86. Li P., Tong C., Mehrian-Shai R., Jia L., Wu N., Yan Y., Maxson R.E., Schulze E.N., Song H., Hsieh C.L., Pera M.F., Ying Q.L. Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts //Cell. 2008. V. 135. №7. P. 1299-1310.

87. Li J., Wang G., Wang C., Zhao Y., Zhang H., Tan Z., Song Z., Ding M., Deng

H. MEK/ERK signaling contributes to the maintenance of human embryonic stem cell self-renewal //Differentiation. 2007. V. 75. № 4. P. 299-307.

88. Lieber M.R. The Mechanism of Double-Strand DNA Break Repair by the Nonhomologous DNA End-Joining Pathway //Annu Rev Biochem. 2010. V. 79. P. 181-211.

89. Lin T., Chao C., Saito S., Mazur S.J., Murphy M.E., Appella E., Xu Y. p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog

expression // Nat Cell Biol. 2005. V. 7. № 2. P. 165-171.

99

90. Liu Q., Guntuku S., Cui X.S., Matsuoka S., Cortex D., Tamai K., Luo G., Carattini-Rivera S., DeMayo F., Bradley A., Donehower L.A., Elledge S. Chkl is essential kinase that is regulated by ATR and required for the G2/M DNA damage checkpoint //Genes and Dev. 2000. V. 14. № 12. P. 1448-1459.

91. Lopez-Contreras A.J., Fernandez-Capetillo O. The ATR barrier to replication-born DNA damage //DNA Repair (Amst). 2010. V. 9. № 12. P. 1249-1255.

92. Lossaint G., Besnard E., Fisher D., Piette J., Dulic V. Chkl is dispensable for G2 arrest in response to sustained DNA damage when the ATM/p53/p21 pathway is functional //Oncogene. 2011 V. 30. № 41. P. 4261-4274.

93. Lou Z., Minter-Dykhouse K., Franco S., Gostissa M., Rivera M.A., Celeste A., Manis J.P., van Deursen J., Nussenzweig A., Paull T.T., Alt F.W., Chen J. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM dependent DNA damage signals // Mol. Cell. 2006. V. 21. № 2. P. 187200.

94. Lukas J., Lukas C., Bartek J. More than just a focus: the chromatin response to DNA damage and its role in genome integrity maintenance // Nat. Cell Biol. 2011. V. 13. № 10. P. 1161-1169.

95. Macleod K.F., Sherry N., Hannon G., Beach D., Tokino T., Kinzler K., Vogelstein B., Jacks T. p53-dependent and independent expression of p21 during cell growth, differentiation, and DNA damage //Genes Dev. 1995. V. 9. № 8. P. 935-944.

96. Maherali N., Hochedlinger K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells //Cell Stem Cell. 2008. V. 3.№ 6. P. 595-605.

97. Masui S., Nakatake Y., Toyooka Y., Shimosato D., Yagi R., Takahashi K., Okochi H., Okuda A., Matoba R., Sharov A.A., Ko M.S., Niwa H. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells // Nat Cell Biol. 2007. V. 9. №. 6. P. 625-35.

98. Matsuoka S., Ballif B.A., Smogorzewska A., McDonald E.R 3rd, Hurov

K.E., Luo J., Bakalarski C.E., Zhao Z., Solimini N., Lerenthal Y., Shiloh

Y., Gygi S.P., Elledge S.J. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive

100

protein networks responsive to DNA damage //Science. 2007. V. 316. № 5828. P. 1160-1166.

99. Momcilovic O., Knobloch L., Fornsaglio J., Varum S., Easley C., Schatten G. DNA Damage Responses in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Embryonic Stem Cells //PLoS ONE. 2010. V .5. № 10. P. el3410.

100. Murray-Zmijewski F., Slee E.A., Lu X. A complex barcode underlies the heterogeneous response of p53 to stress //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. V. 9. № 9. P. 702-712.

101. Myers J.S., Cortez D. Rapid activation of ATR by ionizing radiation requires ATM and Mrel 1 // J Biol Chem. 2006. V. 281. № 14. P. 9346-9350.

102. Najm F.J., Chenoweth J.G., Anderson P.D.,Nadeau J.H., Redline R.W., McKay R.D., Tesar P.J. Isolation of epiblast stem cells from preimplantation mouse embryos //Cell Stem Cell. 2011. V. 8. № 3. P. 318325.

103. Nakano K., Vousden K.H. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53 //Mol Cell. 2001. V.l. № 4. P. 683-694.

104. Neganova I., Zhang X., Atkinson S., Lako M. Expression and functional analysis of G1 to S regulatory components reveals an important role for CDK2 in cell cycle regulation in human embryonic stem cells //Oncogene. 2009. V. 28. № l.P. 20-30.

105. Nichols J., Silva J., Roode M. and Smith A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo //Development. 2009. V. 136. № 19. P. 3215-3222.

106. Nichols J. and Smith A. Naive and primed pluripotent states //Cell Stem Cell. 2009. V. 4. № 6. P. 487-492.

107. Niwa H. How is pluripotency determined and maintained? //Development. 2007. V. 134. № 4. P. 635-646.

108. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, de-differentiation or self-renewal of ES cells //Nature Genet. 2000. V. 24. № 4. P. 372-376.

109. Oda E., Ohki R., Murasawa H., Nemoto J., Shibue .T, Yamashita T., Tokino T., Taniguchi T., Tanaka N. Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis //Science. 2000. V. 288. № 5468. P. 1053-1058.

110. Ou Y.H., Chung P.H., Sun T.P., Shieh S.Y. p53 C-terminal phosphorylation by CHK1 and CHK2 participates in the regulation of DNA-damage-induced C-terminal acetylation //Mol Biol Cell. 2005. V. 16. № 4. P. 1684-1695.

111. Paling N.R., Wheadon H., Bone H.K. and Welham M.J. Regulation of embryonic stem cell self-renewal by phosphoinositide 3-kinase-dependent signaling //J Biol Chem. 2004. V. 279. № 46. P. 48063-48070.

112. Patil M., Pabla N., Dong Z. Checkpoint kinase 1 in DNA damage response and cell cycle regulation //Cell Mol Life Sei. 2013.V. 70. № 21. P. 40094021.

113. Prigione A., Adjaye J. Modulation of mitochondrial biogenesis and bioenergetic metabolism upon in vitro and in vivo differentiation of human ES and iPS cells //Int J Dev Biol. 2010. V. 54. № 11-12. P. 1729-1741.

114. Proctor C.J., Gray D.A. Explaining oscillations and variability in the p53-Mdm2 system //BMC Syst Biol. 2008. V. 2. № 75.

115. Puzio-Kuter A.M. The Role of p53 in Metabolic Regulation //Genes Cancer. 2011. V.2. №4. P. 385-391.

116. Qin H., Yu T., Qing T., Liu Y., Zhao Y., Cai J., Li J., Song Z., Qu X., Zhou P., Wu J., Ding M., Deng H. Regulation of apoptosis and differentiation by p53 in human embryonic stem cells // J Biol Chem. 2007. V. 282. № 8. P. 5842-5852.

117. Rahl P.B., Lin C.Y., Seila A.C., Flynn R.A., McCuine S., Bürge C.B., Sharp P.A. and Young R.A. c-Myc regulates transcriptional pause release //Cell. 2010. V. 141. №3. P. 432-445.

118. Reinhardt H.C., Yaffe M.B. Kinases that control the cell cycle in response to DNA damage: Chkl, Chk2, and MK2 //Curr Opin Cell Biol. 2009. V. 21. № 2. P. 245-255.

119. Riley T., Sontag E., Chen P., Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes //Nat Rev Mol Cell Biol. 2008. V. 9. № 5. P. 402412.

120. Ringshausen, I., O'Shea, C.C., Finch, A.J., Swigart, L.B., Evan, G.I. Mdm2 is critically and continuously required to suppress lethal p53 activity in vivo //Cancer Cell. 2006. V. 10. № 6. P. 501-514.

121. Roninson I.B. Oncogenic functions of tumour suppressor p21(Wafl/Cipl/Sdil): association with cell senescence and tumour-promoting activities of stromal fibroblasts //Cancer Lett. 2002.V. 179. № 1. P. 1-14.

122. Sabapathy K., Klemm M., Jaenisch R., Wagner E.F. Regulation of ES cell differentiation by functional and conformational modulation of p53 //EMBO J. 1997. V. 16. № 20. P. 6217-6229.

123. Saito S., Yamaguchi H., Higashimoto Y., Chao C., Xu Y., Fornace A.J., Appella E., Anderson C.W. Phosphorylation site interdependence of human p53 post-translational modifications in response to stress // J Biol Chem. 2003. V. 278. № 39. P. 37536-37544.

124. Sancar A., Lindsey-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K., Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints /Annu. Rev. Biochem. 2004. V. 73. № 15. P. 39-85.

125. Sato N., Meijer L., Skaltsounis L., Greengard P. and Brivanlou A.H. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor //Nat Med. 2004. V. 10. № 1. P. 55-63.

126. Schmitt CA, Fridman JS, Yang M, Baranov E, Hoffman RM, Lowe SW. Dissecting p53 tumor suppressor functions in vivo //Cancer Cell. 2002. V. 1. № 3. P. 289-398.

127. Scholer HR, Ruppert S, Suzuki N, Chowdhury K, Gruss P. New type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4 //Nature. 1990. V. 344. № 6265. P. 435-439.

128. Schratt G., Weinhold B., Lundberg A.S., Schuck S., Berger J., Schwarz H., Weinberg R.A., Ruther U., Nordheim A. Serum response factor is required for immediate-early gene activation yet is dispensable for proliferation of embryonic stem cells //Mol Cell Biol. 2001. V. 21. № 8. P. 2933-2943.

129. Schwarz B.A., Bar-Nur O., Silva J.C., Hochedlinger K. Nanog is dispensable for the generation of induced pluripotent stem cells //Curr Biol. 2014. V. 24. № 3. P.347-350.

130. Serrano L., Liang L., Chang Y., Deng L., Maulion C., Nguyen S., Tischfield J.A. Homologous recombination conserves DNA sequence integrity throughout the cell cycle in embryonic stem cells //Stem Cells Dev. 201 l.V. 20. № 2. P. 363-374.

131. Shangary S., Wang S. "Small-Molecule Inhibitors of the MDM2-p53 ProteinProtein Interaction to Reactivate p53 Function: A Novel Approach for Cancer Therapy" //Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2008. V. 49. № 35. P. 223-241.

132. Shen Y., Matsuno Y., Fouse S.D., Rao N., Root S., Xu R., Pellegrini M., Riggs A.D., Fan G. X-inactivation in female human embryonic stem cells is in a nonrandom pattern and prone to epigenetic alterations //Proc Natl Acad Sci USA. 2008. V. 105. № 12. P. 4709-4714.

133. Shigeta M., Ohtsuka S., Nishikawa-Torikai S., Yamane M., Fujii S., Murakami K., Niwa H. Maintenance of pluripotency in mouse ES cells without Trp53 //Sci Rep. 2013. V. 3. № 2944.

134. Shimura T., Toyoshima M., Adiga S.K., Kunoh T.,Nagai H., Shimizu N., Inoue M., Niwa O. Suppression of replication fork progression in low-dose-specific p53-dependent S-phase DNA damage checkpoint //Oncogene. 2006. V. 25. № 44. P. 5921-5932.

135. Silva S.S., Rowntree R.K., Mekhoubad S., Lee J.T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells //Proc Natl Acad Sci USA. 2008. V.105. № 12. P. 4820-4825.

136. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice amd man //Ann. Rev.

Develop. Biol. 2001. V. 17. № 12. P. 435-462.

104

137. Smith K.N., Lim J.M., Wells L., Dalton S. Myc orchestrates a regulatory network required for the establishment and maintenance of pluripotency // Cell Cycle. 2011. V. 10. № 4. P. 592-597.

138. Smith J., Tho L.M., Xu N., Gillespie D.A. The ATM-Chk2 andATR-Chkl pathways in DNA damage signaling and cancer //Adv Cancer Res. 2010. V. 108. №36. P. 73-112.

139. Sohn D., Essmann F., Schulze-Osthoff K., Janicke R.U. p21 blocks irradiation-induced apoptosis downstream of mitochondria by inhibition of cyclin-dependent kinase-mediated caspase-9 activation //Cancer Res. 2006. V. 66. №23. P. 11254-11262.

140. Song H., Chung S.K, Xu Y. Modeling disease in human ESCs using an efficient BAC-based homologous recombination system //Cell Stem Cell. 2010. V. 6. №1.P. 80-89.

141. Stead E., White J., Faast R., Conn S., Goldstone S., Rathjen J., Dhingra U., Rathjen P., Walker D., Dalton S. Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities //Oncogene. 2002. V. 21. № 54. P. 8320-8333.

142. Stiff T., Reis C., Alderton G.K, Woodbine L., O'Driscoll M., Jeggo P.A. Nbsl is required for ATR-dependent phosphorylation events //EMBO J. 2005. V. 24. № l.P. 199-208.

143. Sykes S.M., Mellert H.S., Holbert M.A., Li K., Marmorstein R., Lane W.S., McMahon S.B. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction //Mol Cell. 2006. V. 24. № 6. P. 841-851.

144. Takahashi K. and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors //Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

145. Tan S., Bongso A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells //Stem Cells. 2003. V. 21. № 5. P. 546-556.

146. Tang Y., Zhao W., Chen Y., Zhao Y., Gu W. Acetylation is indispensable for p53 activation //Cell. 2008. V. 133. № 4. P. 612-626.

147. Taylor W.R., Stark G.R. Regulation of the G2/M transition by p53 //Oncogene. 2001. V. 20. № 15. P. 1803-1815.

148. Tesar P.J., Chenoweth J.G., Brook F.A., Davies T.J., Evans E.P., Mack D.L., Gardner R.L., McKay R.D. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells //Nature. 2007. V. 448. № 7150. P.196-199.

149. Thompson L.H. Recognition, signaling, and repair of DNA double-strand breaks produced by ionizing radiation in mammalian cells: the molecular choreography //Mutat Res. 2012. V. 751. № 2. P. 158-246.

150. Thompson J.A., Itskovitz-Eldor F., Shapiro S.S. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V.282. № 5391. P. 11451147.

151. Thut C.J., Goodrich J.A., Tjian R. Repression of p53-mediated transcription by MDM2: A dual mechanism //Genes Dev. 1997. V. 11. № 15. P. 19741986.

152. Tichy E.D., Stambrook P.J. DNA repair in murine embryonic stem cells and differentiated cells //Exp. Cell Res. 2008. V. 314. № 9. P. 1929-1936.

153. Tomimatsu N., Tahimic C.G., Otsuki A., Burma S., Fukuhara A., Sato K., Shiota G., Oshimura M., Chen D.J., Kurimasa A. Ku70/80 modulates ATM and ATR signaling pathways in response to DNA double strand breaks // J Biol Chem. 2007. V. 282. № 14. P. 10138-10145.

154. Unger T., Juven-Gershon T., Moallem E., Berger M., Vogt Sionov R., Lozano G., Oren M., Haupt Y. Critical role for Ser20 of human p53 in the negative regulation ofp53 byMdm2//EMBO J. 1999. V. 18. №7. P. 1805-1814.

155. Vallier L., Alexander M., Pedersen R.A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripitency of human embryonic stem cells //J. Cell Sci. 2005. V. 118. № 76. P. 4495-4509.

156. Varum S., Rodrigues A.S., Moura M.B., Momcilovic O., Easley C.A. 4th, Ramalho-Santos J., Van Houten B., Schatten G. Energy metabolism in human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts //PLoS One. 2011. V. 6. № 6. P. e20914.

157. Vaseva A.V., Moll U.M. The mitochondrial p53 pathway //Biochim Biophys Acta. 2009. V. 1787. № 5. P. 414-420.

158. Wahl G.M. and Carr A.M. The evolution of diverse biological responses to DNA damage: insights from yeast and p53 //Nature Cell Biol. 2001. V. 3. № 12. P. E227-E286.

159. Wang X., Dai J. Concise review: isoforms of OCT4 contribute to the confusing diversity in stem cell biology //Stem Cells. 2010. V. 28. № 5. P. 885-893.

160. Wang X., Guda C. Computational analysis of transcriptional circuitries in human embryonic stem cells reveals multiple and independent networks//Biomed Res Int. 2014. V. 2014. № 725780.

161. Wani M.A., Wani G., Yao J., Zhu Q., Wani A.A. Human cells deficient in p53 regulated p21(wafl/cipl) expression exhibit normal nucleotide excision repair of UV-induced DNA damage //Carcinogenesis. 2002. V. 23. № 3. P. 403-410.

162. White J., Stead E., Faast R., Conn S., Cartwright P., Dalton S. Developmental activation of the Rb-E2F pathway and establishment of cell cycle-regulated cyclin-dependent kinase activity during embryonic stem cell differentiation //Mol Biol Cell. 2005. V. 16. № 4. P. 2018-2027.

163. Wolff S., Erster S., Palacios G., Moll U.M. p53^s mitochondrial translocation and MOMP action is independent of Puma and Bax and severely disrupts mitochondrial membrane integrity //Cell Res. 2008. V. 18. P. 733-744.

164. Wu X., Bayle J.H., Olson D., Levine A.J. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop //Genes Dev. 1993. V. 7. № 7A. P. 1126-1132.

165. Xiao L., Yuan X., Sharkis S.J. Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor, Wnt, and Bone Morphogenic Protein pathways in

human embryonic stem cells //Stem Cells. 2006. V. 24. № 6. P. 1476-1486.

107

166. Xirodimas D.P., Stephen С.W., Lane D.P. Cocompartmentalization of p53 and Mdm2 is a major determinant for Mdm2-mediated degradation of p53 //Exp Cell Res. 2001. V. 270. № 1. P. 66-77.

167. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I. and Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 //Cell. 2003. V. 115. № 3. P. 281-292.

168. Ying Q.L., Wray J., Nichols J., Batlle-Morera L., Doble В., Woodgett J., Cohen P. and Smith A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal //Nature. 2008. V. 453. № 7194. P. 519-523.

169. Young R.A. Control of the embryonic stem cell state //Cell. 2011. V. 144. № 6. P. 940-954.

170. Yu V.P., Koehler M., Steinlein C., Schmid M., Hanakahi L.A., van Gool A.J., West S.C., Venkitaraman A.R. Gross chromosomal rearrangements and genetic exchange between nonhomologous chromosomes following BRCA2 inactivation //Genes Dev. 2000. V. 14. № 11. P. 1400-1406.

171. Yuan J., Adamski R., Chen J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be //FEBS Lett. 2010. V. 584. № 17. P. 3717-3724.

172. Zhang X.P., Liu F., Wang W. Two-phase dynamics of p53 in the DNA damage response //Proc Natl Acad Sci USA. 201 l.V. 108. № 22. P. 89908995.

173. Zhang J.G., Owczarec C.M., Ward L.D., Howlett G.J., Fabri L.J., Roberts B.A., Nicola N.A. Evidence for the formation of a heterotrimeric complex of leukaemia inhibitory factor with its receptor subunits in solution //Biochem.J 1997. V. 325. № Pt3. P. 693-700.

174. Zhang X., Wan G., Berger F.G., He X., Lu X. The ATM kinase induces microRNA biogenesis in the DNA damage response //Mol Cell. 2011. V. 41. №4. P. 371-383.

175. Zhang Y., Xiong Y., Yarbrough W.G. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor

suppression pathways //Cell. 1998. V. 92. № 6. P. 725-734.

108

176. Zhang X., Zhang J , Wang T , Esteban M A , Pei D. Esrrb activates Oct4 transcription and sustains self-renewal and pluripotency in embryonic stem cells //Biol Chem. 2008. V. 283. № 51. P. 35825-35833.

177. Zhao H., Watkins J.L., Piwnica-Worms H. Disruption of the checkpoint kinase 1/cell division cycle 25A pathway abrogates ionizing radiation-induced S and G2 checkpoints //Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99. № 23. P. 14795-14800.

178. Zvetkova I, Apedaile A, Ramsahoye B, Mermoud JE, Crompton LA, John R, Feil R, Brockdorff N. Global hypomethylation of the genome in XX embryonic stem cells //Nat Genet. 2005. V. 37.№ 11. P. 1274-1279.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю Валерию Анатольевичу Поспелову за отличное и мудрое руководство и возможность осуществить данную работу. Хочу поблагодарить Синеву Галину, Католикову Наталью, Черепкову Марию, Григораша Богдана и других сотрудников лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток за неоценимую помощь на различных этапах моей работы и всестороннюю поддержку. Хочется выразить благодарность Кожухаровой Ирине Викторовне за культивирование и предоставление ЭСК человека, а также другим сотрудникам группы генетических механизмов дифференцировки и малигнизации клеток за всестороннюю помощь. Также благодарю Николая Дмитриевича Аксенова за проведение анализа проб на проточном цитофлуориметре и Андрея Владимироваича Кропотова за помощь в осуществлении количественной ОТ-ПЦР.

Искренне благодарю мою семью и друзей, которые поддерживали меня в любых ситуациях.