Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Веремейчик, Галина Николаевна

• Веремейчик, Галина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Веремейчик, Галина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика марены сердцелистной (Rubia cordifolia)

1.2. Агробактериальная индукция онкогенеза у растений

1.3. Агробактериальные гены rol — растительные онкогены

1.4. Активные формы кислорода, их роль в защитных реакциях растений

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования

2.2. Получение и культивирование клеточных культур марены

2.3. Выделение плазмидной ДНК

2.4. Выделение тотальной растительной ДНК

2.5. Выделение тотальной растительной РНК

2.6. Реакция обратной транскрипции и получение амплифицированиой кДНК

2.7. Доказательство трансгенности полученных культур

2.8. Доказательство экспрессии генов rol в трансгенных культурах

2.9. Анализ экспрессии гена изохоризматсинтазы (ICS)

2.10. Анализ экспрессии генов кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK)

2.11. Анализ экспрессии генов НАДФН-оксидаз (Rboh)

2.12. Методы оценки уровня экспрессии генов

2.13. Секвенирование и анализ последовательностей

2.14. Химический анализ антрахинонов

2.15. Измерение концентрации внутриклеточного кальция

2.16. Измерение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода

2.17. Флуориметрическое измерение активных форм кислорода

2.18. Масс-спектрометрический анализ содержания салициловой кислоты

2.19. Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1 Индивидуальное и совместное действие генов rol в трансгенных культурах марены сердцелистной

4.2. Влияние генов rol на содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках марены сердцелистной

4.3. Воздействие абиотических факторов на rol-экспрессирующие культуры марены сердцелистной

4.4. Воздействие гена ro/С на НАДФН-оксидазную сигнальную систему в ro/C-культурах марены сердцелистной

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L.»

Биотехнологическое производство биологически активных веществ связано с получением стабильных растительных штаммов-суперпродуцентов. В этой области биотехнология тесно связана с достижениями клеточной и генетической инженерии растений. Возможности генетической инженерии позволяют не только получать практически значимый результат, но и выявлять механизмы активации вторичного метаболизма в культуре клеток лекарственных растений для осознанного управления этими сложными процессами.

В последнее время усилия генетической инженерии растений направлены на изучение влияния регуляторных генов, активирующих вторичный метаболизм в клеточных культурах ценных лекарственных растений. Одним из перспективных направлений в этой области является исследование эффектов генов rol, участвующих в агробактериальной колонизации растений за счет горизонтального переноса генетического материала (Combard, Baucher, 1988; Hasen et al1991; Levesque et al., 1988). Экспрессия генов rol из Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes в трансгенных растениях или клеточных культурах вызывает активацию вторичного метаболизма (Moyano et al., 1999). Расшифровка механизма этого процесса позволит использовать этот метод как поливалентный для получения штаммов-суперпродуцентов.

Поскольку вторичный метаболизм сопряжен со сложным механизмом защитных реакций растений, мы предполагаем, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC способна в ряде случаев повысить устойчивость трансгенных клеток к негативным абиотическим факторам. Механизм го/-индуцируемой активации биосинтеза вторичных метаболитов в настоящее время активно изучается. Известно, что индивидуальная экспрессия генов rolB и rolC активирует биосинтез антрахинонов в культуре клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) (Bulgakov et al., 2002), ценного лекарственного растения, экстракт которого используют для лечения почечнокаменной болезни и в качестве антиоксидантного и противомикробного препарата (Gilani et al., 1994, Pandey et al., 1994, Singh et al., 2004, Manojlovic et al.,

2005). При этом изучение влияния экспрессии этих генов на устойчивость трансгенных клеток растений к абиотическим стрессам осталось в тени.

В данной работе мы впервые исследовали совместное влияние генов rolA, rolB и rolC на биосинтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы (гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов) в трансгенных культурах марены. Кроме того, в рамках исследования совместного и индивидуального влияния генов rol на устойчивость трансгенных клеток марены к стрессам мы изучали содержание активных форм кислорода в этих клетках, поскольку известно, что устойчивость растений к стрессам напрямую связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Yahraus etal., 1995).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление взаимосвязи между содержанием активных форм кислорода в клетках го/-трансгенных культур марены сердцелистной, их устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам и активацией вторичного метаболизма при совместном и индивидуальном действии агробактериальных онкогенов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Получить трансгенную культуру марены экспрессирующую совместно гены rolA, rolB и rolC — RABC,

2. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на ростовые и биосинтетические характеристики трансгенных клеточных культур марены сердцелистной.

3. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на содержание активных форм кислорода в клеточных культурах марены сердцелистной.

4. Изучить реакцию трансгенных культур на воздействие негативными абиотическими факторами.

5. Исследовать влияние экспрессии гена rolC на механизм регуляции окислительного взрыва.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Повышение содержания антрахинонов и экспрессия гена изохоризматсинтазы в rolC- и ro/5-трансгенных линиях марены сердцелистной обнаруживают положительную корреляцию с уровнем экспрессии трансгенов.

2. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой.

3. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости к стрессам) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках снижается, а устойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам повышается. Возможно это связано с тем, что экспрессия гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же оказывает ингибирующий эффект на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

Научная новизна. Впервые получена клеточная культура марены сердцелистной, экспрессирующая совместно гены rolA, rolB и rolC и изучено влияние генов rol на рост и биосинтез антрахинонов при их совместной экспрессии.

Впервые установлена положительная корреляция между экспрессией генов rolC и rolB и экспрессией гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов — изохоризматсинтазой при индивидуальной и совместной экспрессии этих трансгенов.

Впервые показано, что в клетках, экспрессирующих ген rolC, снижено содержание активных форм кислорода, что, по-видимому, повышает устойчивость ro/C-культур к солевому и температурному стрессам. Показано, что в ro/C-клетках снижен уровень экспрессии патогениндуцируемой изоформы гена НАДФН-оксидазы марены и значительно ингибирован регуляторный механизм этого фермента.

Практическая значимость. Установлено, что в культурах марены сердцелистной с высоким уровнем экспрессии гена rolC повышена устойчивость к абиотическим стрессам по сравнению с контрольной культурой: в 4 раза при солевом стрессе и при повышении температуры и в 6,2 раза при понижении температуры. Изучен возможный механизм, обеспечивающий го/С-опосредованное повышение устойчивости клеток.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученных "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2006), на Международном симпозиуме по разнообразию и биологически-активным веществам растений (Taiwan-Russia Bilateral Symposium оп Plant Biodiversity and Bioactive Natural Products) (Тайвань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Анализ содержания АФК в культурах марены выполнен совместно с Т. Ю. Горпенченко и Д. JI. Ампниным, а анализ содержания СК в культурах марены выполнен совместно с П. С. Дмитренок в центре коллективного пользования ДВО РАН.

Благодарности. Автор выражает свою глубокую признательность научному руководителю академику Ю.Н. Журавлеву. Автор благодарит сотрудников группы биоинженерии В.П. Булгакова за ценные консультации по исследовательской работе, Ю.Н. Шкрыль за помощь в освоении методик молекулярной биологии. Автор искренне благодарит сотрудника группы биоинженерии Г.К. Чернодед за получение каллусных культур марены. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН Н.П. Мищенко, П. С. Дмитренок, Д. JI. Аминину и БПИ ДВО РАН Т. Ю. Горпенченко за помощь в проведении экспериментов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Веремейчик, Галина Николаевна

6. ВЫВОДЫ

1. Была получена трансгенная культура марены ЯАВС, экспрессирующая совместно агробактериальные гены го1А, го1В и го1С.

2. Для культур с разной интенсивностью экспрессии генов го1В и го1С — ЯВЬ, ЯВ-М, ЯВ-Н, ЯС-Ь, ЯС-М и ЯС-Н было показано наличие положительной корреляции между уровнем экспрессии трансгенов и гена изохоризматсинтазы марены: г=0.839; Р<0.001 и 1-0.953; Р<0.001, соответственно, где г — коэффициент корреляции.

3. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген го1С, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой. Повышение устойчивости го/С-клеток к стрессовым воздействиям возможно связано с понижением их способности генерировать АФК в ответ на абиотический стресс

4. С повышением уровня экспрессии гена го1С содержание активных- форм кислорода в трансгенных клетках снижается по сравнению с контрольными клетками.

5. Экспрессия гена го1С вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же ингибирующе влияет на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

6. Эффекты экспрессии генов гоЮ (повышение устойчивости) и го1В (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах ЯАВС и ЯА4, но друг друга не усиливают.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспрессия агробактериальных генов rol оказывает различные эффекты на трансгенные культуры. В основном исследователи уделяли внимание такому эффекту как активация вторичного метаболизма. В этом аспекте изучалось действие генов rolB и rolC и дикого штамма A rhizogenes А4 (Moyano et al., 1999).

Известно, что вторичный метаболизм растений напрямую связан с системой патоген-индуцируемого защитного механизма (Тарчевский, 2002). Поэтому мы предположили, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в культуре растительных клеток способна повлиять не только на вторичный метаболизм, но и на устойчивость культур к неблагоприятным абиотическим воздействиям.

Нами было исследовано индивидуальное действие генов rol A, rolB и rolC с разным уровнем экспрессии трансгена в культуре клеток марены сердцелистной. Для выявления эффектов генов rol при их совместной экспрессии мы исследовали клеточные культуры марены, трансформированные диким штаммом A. rhizogenes А4 и конструкцией rolABC.

Нами было показано, что во всех /*о/-экспрессирующих культурах марены активирован биосинтез антрахинонов и повышен уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы — ключевого фермента биосинтеза антрахинонов. В rolB- и ro/С-культур ах с разным уровнем экспрессии трансгена мы показали наличие положительной корреляции между интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC и биосинтетическими показателями культур.

Из полученных данных мы сделали вывод, что максимальная активация биосинтеза антрахинонов наблюдается при экспрессии гена rolB. Этот эффект был описан как для культур, экспрессирующих только ген rolB, так и для культур, экспрессирующих все три гена rol. Блокирование тирозинфосфотазной активности белка RolB снимает этот эффект.

Исследовав влияние неблагоприятных абиотических воздействий на клеточные культуры марены, экспрессирующие гены rol A, rolB и rolC, мы показали, что все го/-экспрессирующие культуры обладают повышенной устойчивостью к этим воздействиям. При этом наибольшую устойчивость к солевому и температурным стрессам показали культуры, экспрессирующие ген rolC, как индивидуально, так и совместно с генами rol А и rolB.

Таким образом, мы показали, что вышеописанные эффекты генов rolB (активация биосинтеза антрахинонов) и rolC (повышение устойчивости к негативным абиотическим воздействиям) сохраняются и при совместной их экспрессии в клетках RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

Поскольку экспрессия генов rol в клеточных культурах марены приводит к активации биосинтеза антрахинонов, можно было ожидать, что при этом происходит значительное повышение содержания активных форм кислорода в трансгенных клетках. Однако, мы показали, что только индивидуальная экспрессия гена rolC оказывает влияние на содержание АФК. При этом экспрессия гена rolC не повышала, а напротив значительно понижала содержание АФК в клетках, в то время как индивидуальная экспрессия генов rolA и rolB на содержание АФК не влияла. Кроме того, была значительно снижена способность ro/C-клеток генерировать окислительный взрыв в ответ на стрессовые воздействия. Такой эффект гена rolC был нейтрализован в культурах, экспрессирующих все три гена rol.

Мы предполагаем, что ингибирующее действие гена rolC на систему генерации АФК обеспечивает го/С-клеткам повышенную устойчивость к абиотическим стрессам. При этом можно предположить, что го/-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов не связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой, как этого можно было ожидать.

Экспериментальные данные показали, что в го/С-культурах значительно снижена экспрессия генов НАДФН-оксидаз — основных источников АФК в клетке. Кроме того, мы показали, что экспрессия гена rolC оказывает влияние и на систему регуляции этого фермента: кальциевые каналы и RcCDPK3. Принимая во внимание данные о действии Н202 на токи кальция в клетках культур R и RC-L (Шкрыль, 2006), мы предположили, что активность Н202-индуцируемых кальциевых каналов в ro/C-культуре марены значительно ингибирована относительно нетрансгенной культуры. Экспрессия гена RcCDPK3 в культурах RC-L и RC-H так же значительно снижена относительно контрольной культуры, что, возможно, приводит к понижению активности патоген-индуцируемой изоформы НАДФН-оксидазы марены, как это было описано для 81£ЮРК5 и НАДФН-оксидазы картофеля фКВОНВ) (КоЬауаэЫ е/ а1, 2007).

В нашем исследовании мы обнаружили новый способ повышения устойчивости клеток растений к абиотическим стрессам за счет влияния трансгена го1С на метаболизм АФК. Было частично изучен предполагаемый механизм этого явления. Дальнейшее более детальное изучение /^/-опосредованных эффектов на сигнальные системы клеток растений может иметь значение для управления защитным аппаратом растительного организма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Веремейчик, Галина Николаевна, 2008 год

1. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992.

2. Булгаков В.П., Лауве Л.С., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев Ю.Н. Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированных растительным окогеном rolCII Генетика. 2000. Т. 2. С. 209-216.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: Наука, 1999.

4. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986.

5. Дрейпер Д., Скот С., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джэкоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Д. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991.

6. Лукьянов К., Гурская Н., Богданова Е., Лукьянов С. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции // Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. С. 163-170.

7. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. Т. 34, №2. С. 165-182.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

9. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды бактерий и генетическая инженерия растений. М.: Наука, 1985. ,

10. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислородаю М.: КДУ, 2007.

11. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.

12. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002.

13. Тинланл Б.А. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 354-359.

14. Федореев С.А. Химическое исследование хиноидных пигментов дальневосточных представителей семейства Boraginaceae (бурачниковые): Автореф. дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1980.

15. Шкрыль Ю.Н. Влияние генов rol агробактерий на процессы роста и вторичного метаболизма в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 2006.

16. Хилтон М.Д. Перенос новых генов в клетки растений // В мире науки. 1983. № 8. С.17.

17. Allan A., Fluhr R. Two distinct sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells // Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 1559-1572.

18. Altamura M., Archilletti Т., Capone I., Costantino P. Histological analysis of the expression of Agrobacterium rhizogenes rolB-GUS gene fusions in transgenic tobacco // New Phytol. 1991. Vol. 118. P. 69-78.

19. Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215. P. 403-410.

20. Amicucci E., Gaschler K., Ward J.M. NADPH oxidase genes from tomato (.Lycopersicon esculentum) and curly-leaf pondweed (Potamogeton crispus) // Plant Biol. 1999. Vol. 1. P. 524-528.

21. Apel K, Hirt H Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal ' transduction //Annu. Rev. Plant Biol. 2004. Vol. 55. P. 373-399.

22. Baquar S. Medicinal and poisonous plants of Pakistan. Karachi.: Printas, 1989.

23. Barlow J., Mathias A., Williamson R., Gammack D. A simple method for the quantitative isolation of undegraded high molecular weight ribonucleic acid // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1963. Vol. 13. P. 61-66.

24. Barros L.,. Curtis R., Vianna A., Campos L., Cameiro M. Fused RolA protein enhances beta-glucoronidase activity 50-fold: implication for RolA action // Protein Peptide Letters. 2003. Vol. 10. P. 303-311.

25. Bekesiova I., Nap J.-P., Mlynarova L. Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia II Plant Mol. Biol. Rep. 1999. Vol. 17. P. 269277.

26. Biswas T.K., Mukherjee B. Plant medicines of India origin for wound healing activities: a review // Lower Extremity Wounds. 2003. Vol. 2, № 3. P. 25-39.

27. Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants // Free Radical Res. 1995. Vol. 23. P. 517-532.

28. Blomeke B., Poginsky B., Schmutte C., Marquardt H., Westendorf J. Formation of genotoxic metabolites from anthraquinone glycosides, present in Rubia tinctorum L. // Mutat. Res. 1992. Vol. 265, № 2. P. 263-272.

29. Broothaerts W., Mitchell H., Weir B., Kaines S., Smith L., Yang W., Mayer J., Roa-Rodriguez C., Jefferson R. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria // Nature. 2005. Vol. 433. P. 629-633.

30. Browse J., Xin Z. Temperature sensing and cold acclimation // Curr. Opin. Plant Biol. 2001. Vol. 4. P. 241-246.

31. Bulgakov V.P., Kiselev K.V., Yakovlev K.V., Zhuravlev Y.N., Gontcharov A.A., Odintsova N.A. Agrobacterium-mediated transformation of sea urchin embryos // Biotechnol. J. 2006. Vol. 4. P. 454-461.

32. Bulgakov V.P. Functions of rol genes in plant secondary metabolism // Biotechnol. Adv. 2008. Vol. 26. P. 318-24.

33. Busto V., Rodriguez-Talou J., Giulietti A., Merchuk J. Effect of shear stress on anthraquinones production by Rubia tinctorum suspension cultures // Biotechnol. Prog. 2008. Vol. 24. P. 175-181.

34. Cai Y., Sun M., Xing J., Corke H. Antioxidant phenolic constituents in roots of Rheum officinale and Rubia cordifolia: structure radical scavenging activity relationships // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, № 26. P. 7884-7890.

35. Capone I., Spano L., Cardarelli M., Bellincampi D., Petit A., Costantino P. Induction and growth properties of carrot roots with different complements of Agrobacterium rhizogenes T-DNA // Plant. Mol. Biol. 1989. Vol. 13. P. 43-52.

36. Chang C.J., Kao C.H. 1997. Paraquat toxicity is reduced by poliamines in rice leaves // Plant Growth Regul. 1997. Vol. 22. P. 163-168.

37. Cheng S., Willmann M., Chen H., Sheen J. Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family // Plant Physiol. 2002. Vol. 129. P. 469-485.

38. Chung M.I., Jou S.J., Cheng T.H., Lin C.N., Ko F.N., Teng C.M. Antiplatlet constituents of formosan Rubia akane // J. Nat. Prod. 1994. Vol. 57, № 2. P. 313-316.

39. Citovsky V., Kozlovsky S., Lacroix B., Zaltsman A., Dafny-Yelin M., Vyas S., Tovkach A., Tzfira T. Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium infection // Cell Microbiol. 2007. Vol. 9. P. 9-20.

40. Coelho S.M., Taylor A.R., Ryan K.P., Sousa-Pinto I., Brown M.T., Brownlee C.0 4

41. Spatiotemporal patterning of reactive oxygen production and Ca wave propagation in fiicus rhizoid cells // Plant Cell. 2002. Vol. 14. P. 2369-2381.

42. Combard A., Baucher M.-F. A common organization of the T-DNA genes expressed in plant hairy roots induced by different plasmids of Agrobacterium rhizogenes II Plant Mol. Biol. 1988. Vol. 10. P. 499-509.

43. Dehio C., Grossmann K., Schell J., Schmulling T. Phenotype and hormonal status of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes T-DNA //Plant Mol. Biol. 1993. Vol. 23, Iss 6. P. 1199-1210.

44. Estruch J.J., Chriqui D., Grossman K., Schell J., Spena A. The plant oncogene rolC is responsible for the release of cytokinins from glucoside conjugates // EMBO J. 1991a. Vol. 10, № 10. P. 2889-2895.

45. Estruch J.J., Schell J., Spena A. The protein encoded by the rolB plant oncogene hydrolyses indole glucosides//EMBO J. 1991b. Vol. 10, № 11. P. 3125-3128.

46. Feng D., Doolittle R. Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees // J. Mol. Evol. 1987. Vol. 60. P. 351-360.

47. Fillipini F., Rossi R., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P. M., Lo Schiavo F., Terzi M. A plant oncogene as a phosphatase // Nature. 1996. Vol. 379. P. 499-500.

48. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back! // Biotechnology. 1994. Vol. 12. P. 883-888.

49. Fredenhagen A., Mett H., Meyer T., Buchdunger E., Regenass U., Roggo B.E., Petersen F. Protein tyrosine kinase and protein kinase C inhibition by fungal anthraquinones related to emodin// J. of Antibiot. 1995. Vol. 48. P. 1355-1358.

50. Furusawa I., Tanaka K., Thanutong P., Mizuguchi A., Yazaki M., Asada K. 1984. Paraquat resistant tobacco calluses with enhanced superoxide dismutase activity // Plant Cell Physiol. 1984. Vol. 25. P. 1247-1254.

51. Gelvin S.B. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 51. P. 223-256.

52. Gilani A.H., Janbaz K.H., Zaman M.5 Lateef A., Suria A., Ahmed H.R. Possible presence of calcium channel blockers in Rubia cordifolia: an indigenous medicinal plant // J. Pak. Med. Assoc. 1994. Vol. 44. P. 82-85.

53. Gilani A.H., Janbaz K.H. Effect of Rubia cordifolia extract on acetaminophen and CCI4-induced hepatotoxicity // Phytotherapy Res. 1995. Vol. 9. P. 372-375.

54. Gottwald E., Muller O., Polten A. 2001. Semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction with the Agilent 2100 Bioanalyzer // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 40164022.

55. Groom Q.J., Torres M.A., Fordham-Skelton A.P., Hammond-Kosack K.E., Robinson N.J., Jones J.D.G. RbohA, a rice homologue of the mammalian gp91phox respiratory burst oxidase gene // Plant J. 1996. Vol. 10. P. 515-522.

56. Guivarc'h A., Carneiro M., Vilaine F., Pautot V., Chriqui D. Tissue-specific expression of the rolA gene mediates morphological changes in transgenic tobacco // Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 30. P. 125-134.

57. Halliwell B. Free radicals in biology and medicine. NY.: Oxford University Press, 1999.

58. Han Y.S., Heijden R., Lefeber A.W., Erkelens C., Verpoorte R. Biosynthesis of anthraquinones in cell cultures of Cinchona 'Robusta' proceeds via the methylerythritol 4-phosphate pathway // Phytochemistry. 2002. Vol. 59, № 1. P. 45-55.

59. Hanks S.K., Hunter T. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification // FASEB J. 1995. Vol. 9. P. 546-596.

60. Harmon A.C., Gribskov M., Gubrium E., Harper J.F. The CDPK superfamily of protein kinases//New Phytol. 2001. Vol. 151. P. 175-183.

61. Hassanean H.A., Ibraheim Z.Z., Takeya K., Itorawa H. Further quinoidal derivatives from Rubia cordifolia L. // Pharmazie. 2000. Vol. 55, № 4. P. 317-319.

62. Hellens R., Millineaux P., Klee H. Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends Plant Sci. 2000. Vol. 5. P. 446-451.

63. Hernandez J.A., Campillo A., Jimenez A., Alarcon J.J., Sevilla F. Response of antioxidant systems and leaf water relations to NaCl stress in pea // New Phytol. 1999. Vol. 141. P. 241251.

64. Hill C., Rimmer J., Grenn B., Finch J., Thomas J. Histone-DNA interaction and their modulation by phosphorylation of -Ser-Pro-X-Lys/Arg-motifes // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 1939-1948.

65. Hippeli S., Heiser I., Elstner E. F. Activated oxygen and free oxygen radicals in pathology: New insights and analogies between animals and plants // Plant Physiol. 1999. Vol. 37. P. 167-178.

66. Hong Y., Takano M., Liu C.M., Gasch A., Chye M.L., Chua N.H. Expression of three members of the calcium dependent protein kinase gene family in Arabidopsis thaliana II Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 30. P 1259-1275.

67. Itokawa H., Ibraheim Z.Z., Qiao Y.F., Takeya K. Anthraquinones, naphtohydroquinones and naphtohydroquinone dimers from Rubia cordifolia and their cytotoxic activity // Chem. Pharm. Bull. 1993. Vol. 41, № 10. P. 1869-1872.

68. Jain A., Basal E. Inhibition of Propionibacterium induced mediators of inflammation by Indian herbs // Phytomedicine. 2003. Vol. 10, № 1. P. 34-38.

69. Jiang Y., Deyholos M. Comprehensive transcriptional profiling of NaCl-stressed Arabidopsis roots reveals novel classes of responsive genes // BMC Plant Biol. 2006. Vol. 12. P. 6-25.

70. Kawasaki Y., Goda Y., Yoshihira K. The mutagenic constituents of Rubia tinctorum II Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 49, № 6. P. 1504-1509.

71. Keller T., Damude H.G., Werner D., Doerner P., Dixon R.A., Lamb C. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs // Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 255-266.

72. Kiraly L., Hafez Y., Fodor J., Kiraly Z. Induction of hypersensitive necrosis at high temperatures by generation of reactive oxygen forms in virus resistant tobacco // Acta Biol. Szegediensis. 2005. Vol. 49. P. 85-87.

73. Kiselev K.V., Kusaykin M.I., Dubrovina A.S., Bezverbny D.A., Zvyagintseva T.N., Bulgakov V.P. The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related (3-1,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 2225-2231.

74. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. 2007. Vol. 128. P. 681-692.

75. Knight H., Trewavas A.J., Knight M.R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 489-503.

76. Kobayashi M., Ohura I., Kawakita K., Yokota N., Fujiwara M., Shimamoto K., Doke N., Yoshioka H. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase // Plant Cell. 2007. Vol. 19. P. 1065-1080.

77. Koncz C., Schell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector // Mol. Gen. Genet. 1986. Vol. 204. P. 383-396.

78. Kovtun Y., Chiu W.-L., Tena G., Sheen J. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 2940-2945.

79. Kratsch H.A., Wise R.R. The infrastructure of chilling stress // Plant Cell Environ. 2000. Vol. 23. P. 337-350.

80. Kulinsky V., Kolesnichenko L.S. Extrinsic regulation of metabolic and energetic mitochondrial functions. Focus on Signal Transduction Research. NY.: Nova Science Publishers Inc. 2007.

81. Kunik T., Tzfira T., Kapalnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 1871-1876.

82. Lambeth J.D. Nox enzymes and the biology of reactive oxygen // Nature Rev. Immunol. 2004. Vol. 4. P. 181-189.

83. Lander H.M. An essential role for free radicals and derived species in signal transduction // FASEB J. 1997. Vol. 11. P. 118-124.

84. Leach F., Aoyagi K. Promoter analysis of the highly expressed rolC and rolD root-inducing genes of Agrobacterium rhizogenes: enhancer and tissue-specific DNA determinants are dissociated // Plant Science. 1991. Vol. 79. P. 69-76.

85. Leipner J., Fracheboud Y., Stamp P. Acclimation by suboptimal growth temperature diminishes photooxidative damage in maize leaves // Plant Cell Environ. 1997. Vol. 20. P. 366-372.

86. Levesque H., Delepelaire P., Rous P., Slightom J., Tepfer D. Common evolutionary origin of the central portions of the Ri TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes and Ti T-DNAs of Agrobacterium tumefaciens II Plant Mol. Biol. 1988. Vol. 11. P. 731-744.

87. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response // Cell. 1994. Vol. 79. P. 583-593.

88. Liou M.J., Wu T.S. Triterpenoids from Rubia yunnanensis II J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65, №9. P. 1283-1287.

89. Low P.S., Merida J.R. The oxidative burst in plant defense:function and signal transduction. Physiol. Plant. 1996. Vol. 96. P. 533-542.

90. Manojlovic N.T., Solujic S., Sukdolak S., Milosev M. Antifungal activity of Rubia tinctorum, Rhamnus frangnla and Caloplaca cerina II Fitoterapia. 2005. Vol. 76, № 2. P. 244246.

91. Marczylo T., Arimoto-Kobayashi S., Hayatsu H. Protection against Trp-P-2 mutagenicity by purpurin: mechanism of in vitro antimutagenesis // Mutagenesis. 2000. Vol. 15, №3. P. 223-228.

92. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR//Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27. P. 1558-1560.

93. Maurel C., Brevet J., Barbier-Brygoo H., Guern J., Tempe J. Auxin regulates the promoter of the root-inducing rolB gene of Agrobacterium rhizogenes in transgenic tobacco // Mol. Gen. Genet. 1990. Vol. 1. P. 58-64.

94. Mehler A.H. Studies on the reactions of illuminated chloroplasts. I Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents // Arch. Biochem. Biophys. 1951. Vol. 33. P. 6577.

95. Merzlyak M.N., Hendry G.A.F. Free Radical Metabolism, pigment degradation and lipid peroxidation in leaves during senescence // Proc. Royal Soc. Edinbrough. 1994. Vol. 102B. P. 459-471.

96. Mikosch T., Lavrijssen B., Sonnenberg A., van Griensven L. Transformation of the cultivated mushroom Agaricus bisporm (Lange) using T-DNA from Agrobacterium tumefaciens II Curr. Genet. 2001. Vol. 39. P. 35-39.

97. Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Glazunov V.P., Chemoded G.K., Bulgakov V.P., Zhuravlev Y.N. Anthraquinone production by callus cultures of Rubia cordifolia // Fitoterapia. 1999. Vol. 70. N 6. P. 552-557.

98. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen gene network of plants // Trends Plant Sci. 2004. Vol. 9. P. 490-498.

99. Morimoto M., Tanimoto K., Sakatani A., Komai K. Antifeedant activity of an anthraqunones aldehyde in Galium aparine L. against Spodoptera litura F. // Phytochemistry. 2002. Vol. 60, № 2. P. 163-166.

100. Morita H., Yamamiya T., Takeya K., Itokawa H. New antitumor bicyclic hexapeptides, RA-XI, XII, - XIII and - XIV from Rubia cordifolia II Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 40, № 5. P. 1352-1354.

101. Moshe S., Robert F. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases // Plant Physiol. 2006. Vol. 141. P. 336-340.

102. Moyano E., Fornale S., Palazon J., Cusido R., Bonfill M., Morales C., Pinol M. Effect of Agrobacterium rhizogenes T-DNA on alkaloid production in Solanaceae plants // Phytochemistry. 1999. Vol. 52. P. 1287-1292.

103. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures II Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

104. Nilsson O, Moritz T, Sundberg B, Sandberg G, Olsson O. Expression of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene in a deciduous forest tree alters growth and development and leads to stem fasciation // Plant Physiol. 1996. Vol. 2. P. 493-502.

105. Noctor G., Foyer C. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annu. Rev. Plant Physiol. 1998. Vol. 49. P. 249-279.

106. Olivari C., Albumi C., Pugliarello C.M., Michelis M.I.D. Olivari C., Albumi C., Pugliarello C.M., Michelis M.I.D. Phenylarsine oxide inhibits the fusicoccin-induced activation of plasma membrane H^-ATPase // Plant Physiol. 2000. Vol. 122. P. 463-470.

107. Ozgen U., Houghton P.J., Ogundipe Y., Coskun M. Antioxidant and antimicrobial activities of Onosoma argentatum and Rubia peregrine II Fitoterapia. 2003. Vol. 74. P. 682685.

108. Pan X., Welti R., Wang X. Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry // Phytochemistry. 2008. Vol. 69. P. 1773-1781.

109. Pandey S., Sharma M., Chaturvedi P., Tripathi Y.B. Protective effect of Rubia cordifolia on lipid peroxide formation in isolated rat liver homogenate // Indian J. Exp. Biol. 1994. Vol. 32, №3. P. 180-183.

110. Piedras P., Hammond-Kosack K., Harrison K., Jones J. Rapid, Cf-9- and Avr9-dependent production of active oxygen species in tobacco suspension cultures // Mol. Plant Microbe Interact. 1998. Vol. 11. P. 1155-1166.

111. Piers K., Heath J., Liang X., Stephens K., Nester E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 1613-1618.

112. Poginsky B., Westendorf J., Blomeke B., Marquardt H., Hewer A., Grover P.L., Philips D.H. Evaluation of DNA binding activity of hydroxyanthraquinones occurring in Rubia tinctorum L. // Carcinogenesis. 1991. Vol. 12, № 7. P. 1265-1271.

113. Prasad T.K. Mechanism of chilling-induced oxidative stress injury and tolerance in developing maize seedlings: changes in antioxidant system, oxidation of proteins and lipids, and protease activities//Plant J. 1996. Vol. 10. P. 1017-1026.

114. Rhodes M.J.C., Robins R.J., Hamill J.D., Parr A.J., Hilton M.G., Walton N.J. Properties of transformed root cultures. NY.: Clarendon Press, 1990.

115. Roberts D.M., Harmon A.C. Calcium-modulated proteins: targets of intracellular calcium signals in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. 1992. Vol. 43. P. 375-414.

116. Rudd J.J., Franklin-Tong V.E. Unravelling responsespecificity in Ca2+ signalling pathways in plant cells // New Phytol. 2001. Vol. 151. P. 7-33.

117. Sagi M., Davydov O., Orazova S., Yesbergenova Z., Ophir R., Stratmann J.W., Fluhr R. Plant respiratory burst oxidase homologs impinge on wound responsiveness and development m Ly coper si con esculentum II Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 616-28.

118. Sagi M., Fluhr R. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases // Plant Physiol. 2006. Vol. 141. P. 336-340.

119. Sanders D., Brownlee C., Harper J.F. Communicating with calcium // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 691-706.

120. Schmulling T, Schell J, Spena A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development // EMBO J. 1988. Vol. 9. P. 2621-2629.

121. Schulman H., Lou L.L. Multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase: domain structureand regulation // Trends Biochem. Sci. 1989. Vol. 14. P. 62-66.

122. Segarra G., Jauregui O., Casanova E., Trillas I. Simultaneous quantitative LC-ESI-MS/MS analyses of salicylic acid and jasmonic acid in crude extracts of Cucumis sativus under biotic stress 11 Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 395-401.

123. Singh R., Geetanjali, Chauhan S.M.S. 9,10-anthraquinones and other active compounds from the genus Rubia II Chemistry and Biodiversity. 2004. Vol. 1. P. 1241-1264.

124. Sinkar V.P., Pythoud F., White F.F., Nester E.W., Gordon M.P. Rol A locus of the Ri plasmid directs developmental abnormalities in transgenic tobacco plants // Genes Development. 1988. Vol. 2. P. 688-697.

125. Sheng J., Citovsky V. Agrobacterium-pXant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1699-1710.

126. Slightom J.L., Durand-Tardif M., Joanin L., Tepfer d. Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, №> l.P. 108-121.

127. Spena A., Schmulling T., Koncz C., Schell J. Independent and synergetic activity of rol A, B and C loci in stimulating abnormal growth in plants // EMBO J. 1987. Vol. 6, № 13. P. 3891-3899.

128. Suzuki Y.J., Forman IT.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction // Free Radical Biol. Med. 1996. Vol. 22. P. 269-285.

129. Takahashi E., Marczylo T.H., Watanabe T., Nagai S., Hayatsu H., Negishi T. Preventive effect of anthraquinone food pigments on the DNA damage induced by carcinogens in Drosophila I I Mutat. Res. 2001. Vol. 1. P. 139-145.

130. Tinland B., Hohn B. Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome // Genet. Eng. (NY). 1995. Vol. 17. P. 209-229.

131. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends Plant Sci. 1996. Vol. l.P. 178-184.

132. Tjus S.E., Moller B.L., Schelle H.V. Photosystem I is an early target of photoinhibition in barley illuminated at chilling temperatures // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 755-764.

133. Torres M.A., Onouchi H., Hamada S., Machida C., Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox) // Plant J. 1998. Vol. 14. P. 365-370.

134. Tripathi Y.B., Pandey S., Shukla S.D. Anti-platelet activating factor of Rubia cordifolia Linn. // Indian J. Exp. Biol. 1993. Vol. 31, №> 6. P. 533-555.

135. Tripathi Y.B., Sharma M., Manickam M. Rubiadin, a new antioxidant from Rubia cordifolia II Indian J. Biochem. Biophys. 1997. Vol. 34, № 3. P. 302-306.

136. Tripathi Y.B., Sharma M. Comparison of the antioxidant action of the alcoholic extract of Rubia cordifolia with rubiadin // Indian J. Biochem. Biophys. 1998. Vol. 35, № 5. P. 313316.

137. Trovato M., Maras B., Linhares F., Costantino P. The plant oncogene rolD encodes a functional ornithine cyclodeaminase // PNAS. 2001. Vol. 98, № 23. P. 13449-13453.

138. Trypsteen M., van Lijsebettens M., van Severan R., van Montagu M. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Echinacea purpurea II Plant Cell Rep. 1991. Vol. 10. P. 85-89.

139. Valentine L. Agrobacterium tumefaciens and the plant: the David and Goliath of modern genetics // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 948-955.

140. Westendorf J., Pfau W., Schulte A. Carcinogenicity and DNA adduct formation observed in ACI rats after long term treatment with madder root, Rubia tinctorum L. // Carcinogenesis. 1998. Vol. 19, № 12. P. 2163-2168.

141. White P. The cultivation of animal and plant cells. NY.: Ronald Press. 1963.

142. Wildermuth M.C., Dewdney J., Wu G., Ausubel F.M. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence // Nature. 2001. Vol. 29. P. 562-565.

143. Wiseman H., Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer // Biochem. J. 1996. Vol. 313. P. 17-29.

144. Wu T.S., Lin D.M., Shi L.S., Damu A.G., Kuo P.C., Kuo Y.H. Cytotoxic anthraquinones from the stems of Rubia wallichiana Decne // Chem. Pharm. Bull. 2003. Vol. 51, №8. P. 948-950.

145. Yahraus T., Chandra S., Legendre L., Low P. Evidence for a mechanically induced oxidative burst // Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 1259-1266.

146. Yamamoto Y., Kobayashi Y., Devi S., Rikiishi S., Matsumoto H. Aluminum toxicity is associated with mitochondrial dysfunction and the production of reactive oxygen species in plant cells //Plant Physiol. 2002. Vol. 128. P. 63-72.

147. Yoshie Y., Goto K., Takai R., Iwano M., Takayama S., Isogai A., Che F.-S. Function of the rice gp91phox homologs OsrbohA and OsrbohE genes in ROS-dependent plant immune responses // Plant Biotechnol. 2005. Vol. 22. P. 127-135.

148. Yoshikawa T., Furuy a T. Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes // Plant Cell Rep. 1987. Vol. 6. P. 449-453.

149. Yoshioka H., Sugie K., Park H.-J., Maeda H., Tsuda N., Kawakita K., Doke N. Induction of plant gp91 phox homolog by fungal cell wall, arachidonic acid, and salicylic acid in potato // Mol. Plant Microbe Interact. 2001. Vol. 14. P. 725-736.