Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Инюшкина, Юлия Витальевна

• Инюшкина, Юлия Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Инюшкина, Юлия Витальевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

X. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ботаническая характеристика семейства Во^тасеае бурачниковые).

1.2. Фотохимическая характеристика семейства Вог

§тасеае.

1.3. Фармакологические свойства метаболитов кофейной кислоты.

1.4. Биосинтез розмариновой кислоты и ее производных.

1.5. Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы растений.

1.6. Влияние гена го1С на трансформированные клетки растений.

1.7. Влияние элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в клетках растений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Бактерии и плазмиды.

2.3. Культивирование бактериальных штаммов.

2.4. Питательные среды.

2.5. Получение клеточных культур Е. яепсеит.

2.5.1. Получение контрольных и го/С-трансгенных культур

Е. йепсеит.

2.5.2. Получение культуры трансгенных корней Е. зепсеит.

2.5.3. Получение клеточной линии Е-4.

2.5.4. Динамика роста каллусных культур Е. хепсеит и накопления ими полифенолов.

2.6. Эксперименты с активаторами биосинтеза полифенолов.

2.7. Выделение плазмидной ДНК.

2.8. Доказательство трансгенности и экспрессия генов.

2.8.1. Выделение растительной ДНК.

2.8.2. Полимеразная цепная реакция на препаратах ДНК.

2.8.3. Выделение тотальной растительной РНК.

2.8.4. Реакция обратной транскрипции.

2.8.5. Полимеразная цепная реакция на препаратах кДНК.

2.8.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-time PCR).

2.9. Секвенирование ДИК и кДНК.

2.10. Определение содержания полифенолов в культурах клеток

Е. sericeum.

2.11. Исследование фармакологической активности метаболитов кофейной кислоты из каллусной культуры Е. sericeum.

2.11.1. Влияние препаратов из клеточной культуры

Е. sericeum на функцию почек у крыс.

2.11.2. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления.

2.11.3. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления.

2.12 Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика клеточных культур Е. sericeum.

3.1.1. Клеточные культуры Е. sericeum.

3.1.2. Доказательство трансгенности культур Е. sericeum.

3.1.3. Доказательство экспрессии гена rolC в го/С-трансгенных культурах Е. sericeum.

3.2. Накопление полифенолов в культуре клетокЕ. sericeum.

3.2.1. Содержание метаболитов кофейной кислоты в культурах корней и каллусов Е. sericeum.

3.2.2. Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е. sericeum методом селекции.

3.2.3. Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток sericeum.

3.3. Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов.

3.4. Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена rolC.

3.4.1. Экспрессия генов PAL.

3.4.2. Экспрессия генов CYP.

3.5. Фармакологические свойства препарата из клеточной культуры

Е. sericeum и возможность ее применения в медицине.

3.5.1. Стабильность рабдозина и розмариновой кислоты в процессе сушки каллусов.

3.5.2. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на функцию почек у крыс.

3.5.3. Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления.

3.5.4. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)»

Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности. Это подход получает распространение в нашей стране и мире, поскольку создает воспроизводимый источник сырья для получения биологически активных веществ. Биотехнологическое получение вторичных метаболитов основано на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать эти вещества. Клетки растений можно выращивать неопределенно долго (каллусы женьшеня растут в культуре in vitro уже более 50 лет), состав сред для них относительно прост, путем различных манипуляций часто удается повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки in vitro - это удобная модель для изучения вторичного метаболизма клетки, поскольку исследователь может управлять ее функционированием через изменение условий культивирования или экспрессии генов.

В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения (Dixon and Sumner, 2003). Экстракты лекарственных растений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности (Ullah and Khan., 2008). Активно изучаются антиоксидантные и противовоспалительные свойства растительных полифенолов, в том числе метаболитов кофейной кислоты (Ivanauskas et al., 2008; Ueda et al., 2002). Известно, что полифенолы растений перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты: розмариновая кислота и литоспермовая кислота Б (Makino et al., 2002), содержащиеся в растениях семейства Boraginaceae.

На Дальнем Востоке это семейство представлено несколькими видами, в том числе незабудочником шелковистым (Eritrichium sericeum Lehm. DC.) и воробейником краснокорневым (.Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc.). Эти виды растений являются редкими и их промышленное использование невозможно. Поэтому разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур этих растений является перспективной задачей для биотехнологии.

Современная биотехнология растений широко использует методы генетической инженерии. Так, например, в последние годы выявлены гены, оказывающие существенное влияние на продукцию вторичных метаболитов в культурах клеток растений, в том числе гены rol Agrobacterium rhizogenes. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур, однако также известны случаи ингибирования (Bulgakov, 2008). К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов фенилпропаноидного пути ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и го/С-трансгенной культурах клеток Е. sericeum.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Получить контрольную и экспрессирующую ген rolC культуры клеток Е. sericeum.

2. Увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum посредством селекции и воздействия элиситоров.

3. Исследовать связь между экспрессией гена rolC и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты.

4. Исследовать фармакологическое действие полифенолов из культуры клеток Е. sericeum.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4) накапливает метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухой массы ткани.

2. Экспрессия гена rolC в клетках Е. sericeum приводит к активации биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в длительно-пассируемых культурах и увеличению продуктивности культуры.

3. Ген rolC вызывает активацию экспрессии специфической формы гена CYP98 (CYP98A3), ответственной за биосинтез розмариновой кислоты.

4. Полифенолы культуры клеток Е. sericeum обладают выраженным антиоксидантным и противовоспалительным действием.

Научная новизна. Показано, что клеточные культуры незабудочника шелковистого синтезируют метаболиты кофейной кислоты в больших количествах, многократно превышающих содержание этих веществ в природных растениях. Установлена зависимость действия гена rolC на продукцию метаболитов кофейной кислоты от времени культивирования каллусов - с возрастанием числа пассажей ген проявляет активирующее действие на вторичный метаболизм. В культурах клеток незабудочника шелковистого обнаружен ген CYP98A3, кодирующий специфическую форму цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, вовлеченную в биосинтез розмариновой кислоты. Установлена взаимосвязь экспрессии CYP98A3 с экспрессией гена rolC и повышением содержания метаболитов кофейной кислоты в rolC-трансгенной культуре клеток.

Практическая значимость. Получена клеточная культура незабудочника шелковистого, которая является воспроизводимым источником метаболитов кофейной кислоты. Максимальное содержание рабдозина в ней составляет 4.11% от сухого веса ткани, что является самым высоким содержанием этого вещества в природных и биотехнологических источниках. Показано, что полифенолы из культуры клеток незабудочника шелковистого обладают выраженным антиоксидантным действием, снижают симптомы при остром воспалении, что делает их перспективными для углубленного фармакологического изучения с целью создания в дальнейшем медицинских препаратов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2006), II Международном конгрессе по молекулярному размножению растений (2nd International Conference on Plant Molecular Breeding) (КНР, Санья, 2007), 21-м Тихоокеанском научном конгрессе (21st Pacific Science Congress) (Япония, Окинава,

2007), Международной конференции по биоинформатике (International Multiconference of Engineers and Computer Scientists) (Гонконг, 2008), 13-м Международном симпозиуме по биотехнологии "13th International Biotechnology Symposium (IBS

2008)" (КНР, Далянь, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы содержит 90 наименований.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Инюшкина, Юлия Витальевна

ВЫВОДЫ

1. Получена высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4), накапливающая метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухого веса ткани, что в 16 раз превысило содержание этих веществ в корнях и в 635 раз — в надземных частях природного растения.

2. В результате селекции и действия индукторов вторичного метаболизма (метилжасмонат и глицерат меди) на 38% повышено содержание полифенолов в культуре клеток Е. sericeum и изменено соотношение метаболитов кофейной кислоты за счет увеличения пропорции рабдозина. Содержание рабдозина достигло 4.1%.

3. Экспрессия агробактериального гена rolC вызывает активацию продукции метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum.

4. В трансформированной геном rolC культуре клеток Е. sericeum отмечено увеличение экспрессии гена CYP98A3, ключевого в биосинтезе метаболитов кофейной кислоты.

5. Повышение экспрессии гена CYP98A3 в го/С-трансгенной культуре клеток Е. sericeum коррелирует с активацией продукции полифенолов

6. Показано отсутствие в каллусах Е. sericeum ограничения потока метаболитов со стороны реакции, катализируемой PAL.

7. Возможное использование каллусной культуры Е. sericeum в медицине — это разработка препаратов для лечения заболеваний почек и препаратов, нормализующих окислительно-восстановительные реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее в нашей лаборатории были получены клеточные культуры таких растений, как Lithospermum erythrorhizon, Rubia cordifolia, Panax ginseng, Vitis amurensis (Rupr.), Maackia amurensis (Rupr. et Maxim.), стабильно синтезирующие вторичные метаболиты. Особенностью работы с культурами Е. sericeum явилось то, что при кажущейся простоте получения высокопродуктивной гомогенной культуры, эта задача выполнялась с трудом и на протяжении ряда лет. Действительно, первичные каллусы были чрезвычайно гетерогенны, мы наблюдали расщепление ткани на агрегаты различные по морфологии, скорости роста и содержанию вторичных метаболитов в течение не отдельных пассажей (как происходит обычно), а многих лет. Этот факт заставлял задумываться о том, можно ли вообще использовать в биотехнологии этот вид растения.

Другое обстоятельство и необычность объекта исследования заключались в том, что клетки незабудочника шелковистого ответили парадоксальным образом на введение гена rolC - признанного активатора вторичного метаболизма. Долговременное подавление продуктивности в пэ/С-трансгенных культурах незабудочника шелковистого заставило задуматься о том, что ген rolC не является классическим активатором вторичного метаболизма (как другие гены, используемые в настоящее время в биотехнологии), а скорее это модулятор, реализующий свой потенциал в зависимости от регуляторного и биохимического контекста клетки каждого отдельно взятого вида растений. Представлялось, что исследование механизма действия гена в разных модельных системах - в случае явного стимулирования и в случае явного ингибирования процессов вторичного метаболизма, может пролить свет на механизм его действия.

Подытожим, как эти задачи решались в процессе настоящего исследования. Решению первой - созданию высокопродуктивного штамма клеток, помогло то обстоятельство, что метаболиты кофейной кислоты — это группа постоянно экспрессируемых вторичных метаболитов (так называемых "preformed secondary metabolites"), которые находятся под жестким регуляторным контролем растительной клетки. Это означает практически гарантированную стабильность биосинтеза вторичных метаболитов в том случае, если бы удалось отобрать стабильные активно-растущие агрегаты. Эта задача была выполнена путем долговременной селекции. Но это же свойство биосинтетического аппарата незабудочника шелковистого означало и то, что будет очень трудно влиять на синтез вторичных метаболитов путем стандартных воздействий элиситорами. что и оказалось в действительности. Только два элиситора — метилжасмонат и ионы меди, могли каким-то образом повлиять на увеличение продуктивности культуры. В итоге получена линия Е-4, которая показала обнадеживающие фармакологические результаты.

В плане исследования регуляторной функции гена го1С получено два принципиальных результата. Первый заключается в том, что ген оказывает влияние на экспрессию отдельных форм ключевых генов биосинтеза вторичных метаболитов. В этом плане обстоятельства складывались удачно — уже был известен ключевой ген в цепочке биосинтеза розмариновой кислоты, СУР98А6. Идентификация аналога этого гена у незабудочника шелковистого (СУР98АЗ) и изучение его экспрессии показали действительно уникальную картину увеличения экспрессии в го/С-культуре, сопровождаемую увеличенным накоплением полифенолов. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными на других объектах. Так, в культурах клеток марены, уровень экспрессии го1С определял уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы, ключевого в биосинтезе антрахинонов (8Ькгу1 е1 а1., 2008). На модели трансгенных клеток марены не удалось выявить какую-либо специфичность действия гена, так как гены изохоризматсинтазы были представлены лишь двумя высоко гомологичными формами. Аналогичная ситуация отмечена в культурах го1В-трансгенных клеток винограда, где трансформация привела к увеличению продукции резвератрола (КлБе1еу а1., 2007). В этой культуре выявлены транскрипты новых изоформ гена стильбенсинтазы, которых не было в контрольной культуре (Киселев, неопубликованные данные).

Второй результат - это выявление медленнотекущих процессов в го1С-трансгенных культурах. Первоначально экспрессия гена го1С в культуре трансгенных клеток растений семейства бурачниковые (Е. Бегюеит, Ь. егуШгогЫгоп) привела к супрессии вторичного метаболизма. Далее, при продолжительном культивировании, го/С-трансгенные каллусы Е. яепсеит стали аккумулировать значительные количества метаболитов кофейной кислоты. Следует отметить, что сходный эффект наблюдался также для культур клеток женьшеня, трансформированных геном го1С (Булгаков и др., 1993), однако в то время его посчитали случайностью. Для женьшеня период уменьшенной (по сравнению с контролем) продукционной способности трансгенных каллусов составлял 6 мес., затем наблюдали быстрое увеличение содержания гинзенозидов в го/С-культурах женьшеня и превышение их уровня над контрольной культурой стабилизировалось. Аналогичная ситуация наблюдалась и для других эффектов гена го1С, например, образования трансгенных корней и апикальных меристем го1С-каллусами женьшеня (вогрепсЬепко е1 а1., 2006).

Результаты настоящего исследования показывают, что в будущих исследованиях будет необходимо привлечь методы глобальной протеомики и геномики и построить интерактому белковых взаимодействий в нормальных и го1С-трансгенных клеточных культурах растений для более глубокого изучения специфичности взаимодействия Яо1С с ростовым и биосинтетическим аппаратом клетки.

89

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Инюшкина, Юлия Витальевна, 2008 год

1. Барабой В. А. Растительные фенолы и здоровье человека. М.: Наука, 1984.

2. Беленький M.J1. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Изд-во АН ЛатвССР, Рига. 1971.

3. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М. и др.: тез. докл. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология», Алма-Ата, 1993 г. С. 170.

4. Воробьев Д.П., Ворошилов В.Н., Гурзенков H.H., Дорониеа Ю.А., Егорова Е.М., Нечаева Т.И., Пробатова Н.С., Толмачев А.И., Черняева A.M. Определитель высших растений Сахалина и Курильских островов. JL: Изд-во АН СССР, 1974.

5. Дрейпер Д., Скот С., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джэкоб JL, Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Д. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991.

6. Ибрагимов Ф.Н., Ибрагимова B.C. Основные лекарственные средства китайской медицины. М., 1960.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

8. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 2. С. 321-331.

9. Федореев С. А. Химическое исследование хиноидных пигментов дальневосточных представителей семейства Boraginaceae (бурачниковые). Владивосток, 1980. 151с.

10. Шварц Г. Я., Сюбаев Р. Д. Фармакол. и токсикол. 1982. Т. 45. Вып. 1. С .46-49.

11. Щербановский J1.P., Нилов Г.И., Рабинович В.Д., Горина B.J1. Растительные нафтохиноны ингибиторы дрожжей, молочнокислых и уксуснокислых бактерий // Растит, ресурсы. 1972. Т. VIII. С. 112 - 115.

12. Щербановский JI.P., Шубина Л.С., Бензо-, нафто- и антрахиноны цветковых растений как антимикробные вещества // Растит, ресурсы. 1975. Вып. 3.

13. Agata I., Hatano Т., Nishibe S., Okuda Т. Rabdosiin, a new rosmarinic acid dimerwith a lignan skeleton, from Rabdosia japónica II Chem Pharm Bull. 1988. Vol. 36. P. 3223-3225.

14. Aquino R., Morelli S., Lauro R., Abdo S., Saija A., Tomaino A. Phenolic constituents and antioxidant activity of an extract of Anthurium versicolor leaves // J. Nat. Prod. 2001. Vol. 64. P. 1019-1023.

15. Basnet D., Park J.,Yoon Y. Combinatorial biosynthesis of 5-O-desosaminyl erythronolide A as a potent precursor of ketolide antibiotics // J. Biotechnol. 2008. Vol. 347. P. 321-337.

16. Bekesiova I., Nap J.P., Mlynarova L. Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia II Plant Mol Biol Reprt. 1999. Vol. 17. P. 269-277.

17. Benveniste I., Tijet N., Adas F., Philipps G., Salaün J.P, Durst F. CYP86A1 from Arabidopsis thaliana encodes a cytochrome P450-dependent fatty acid omega-hydroxylase // Biochem Biophys Res Commun. 1998. Vol. 243, No. 3. P. 688-693.

18. Bonhomme V., Laurain Mattar D., Fliniaux MA. Effect of rolC gene on hairy root: Induction development and tropane alkaloid production by Atropa belladonna II J. Nat. Prod. 2000. Vol. 63. P. 1249-1252.

19. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.T., Tchernoded G.K., Zhuravlev Y.N. The impact of plant rolC oncogene on ginsenoside production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. P. 1929-1934.

20. Bulgakov, V.P. Functions of rol genes in plant secondary metabolism // Biotechnol. Adv. 2008. Vol. 26. P. 318-3245.

21. Cochrane FC, Davin LB, Lewis NG. The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family:kinetic characterization of the four PAL isoforms // Phytochemistry. 2004. Vol. 65. P.1557-1564.

22. Dixon R.A., and Sumner L.W. Legume natural products: understanding and manipulating complex pathways for human and animal health // Plant Physiol. 2003. Vol. 131. P. 878-885.

23. Driscoll J., Hasard G., Wood H., Goldin A. Structure antitumor activity relationships among quinone derivatives // Cancer Chemother. Repts. 1974. Vol.4. P. 1-362.

24. Englberger W., Hadding U., Etschenberg E., Graf E., Leyck S., Winkelmann J., Parnham M. Rosmarinic acid: a new inhibitor of complement C3-convertase with antiinflammatory activity // Int J Immunopharmacol. 1988. Vol. 10, No. 6. P. 729-737.

25. Estabrook R. A passion for P450s (remembrances of the early history of research on cytohrome P450) // Drug Metab. Dispos. 2003. Vol. 31, No. 12. P. 1461-1473.

26. Filippini F., Rossi R., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P.M., et al. A plant oncogene as a phosphatase // Nature. 1996. Vol. 379. P. 499-500.

27. Fukasawa-Akada T., Kung S., Watson J.C. Phenylalanine ammonia-lyase gene structure, expression, and evolution in Nicotiana II Plant Molecular Biology. 1996. Vol. 30. P.711-722.

28. Fujita Y., Hara Y., Suga C., Morimoto T. Production of shikonin derivatives by cell suspension cultures of Lithospermum erythrorhizon II Plant Cell Rep. 1981. Vol. 1. P. 6163.

29. Fung KP., Wu J., Zeng LH., Wong HN., Lee CM., Hon PM., Chang HM., Wu TW. Lithospermic acid B as an antioxidant-baset protector of cultured ventricular myocytes and aortic endothelial cells of rabbits // Life Sci. 1993. Vol. 53, No. 12. P. 189-93.

30. Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu,C. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression // Methods. 2001. Vol. 25. P. 386-401.

31. Greenman C., Stephens P., Smith R., Dalgliesh GL., Hunter C., Bignell G., et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes // Nature. 2007. Vol. 446. P. 153158.

32. Grzegorczyk I., Krolicka A., Wysokinska H. Establishment of Salvia officinalis L.hairy root cultures for the production of rosmarinic acid // Z Naturforcsh C. 2006. Vol. 61. P. 351 -356.

33. Honkakoshi P., Negishi M. Regulation of P450 (CYP) genes by nuclear receptors // Biochem. J. 2000. Vol. 347. P. 321-337.

34. Inyushkina Y.V., Bulgakov V.P., Veselova M.V. et al. High rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum callus cultures and effect of the calli on Masugi-nephritis in rats // Biosci. Biotecnol. Biochem. 2007. Vol. 71. P. 1286-1293.

35. Ito H., Miyazaki T., Ono M., Sakurai H. Antiallergic activities of rabdosiin and its related compounds: chemical and biochemical evaluations // Chem. 1998. Vol. 6, No. 7. P. 1051-1056.

36. Ivanauskas L., Jakstas V., Radusiene J., Lukosius A., Baranauskas A. Evaluation of phenolic acids and phenylpropanoids in the crude drugs // 2008 Medicina (Kaunas). 2008. Vol. 44, No.l.P. 48-55.

37. Kamata K., Iizuka T., Nagai M., Kasuya Y. Endothelium-dependent vasodilator effect of the extract from Salvia miltiorrhiza radix. A study on the identification of lithospermic acid B in the extracts // Gen Pharmacol. 1993. Vol. 24, No. 4. P. 977-981.

38. Kamata K., Noguchi M., Nagai M. Hypotensive effect of lithospermic acid B isolated from the extract of Salvia miltiorrhiza radix in the rat // Gen Pharmacol. 1994. Vol. 25, No. l.P. 69-73.

39. Kiselev K.V, Kusaykin M.I, Dubrovina A.S, Bezverbny D.A, Zvyagintseva T.N,

40. Bulgakov V.P. The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related P-l,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 2225-2231

41. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. 2007. Vol. 128. P. 681-692.

42. Li L., Cheng H., Gai J., Yu D. Genome-wide identffcation and characterization of putative cytochrome P450 genes in the model legume Medicago truncatula II Planta. 2007. Vol. 226. P. 109-123.

43. Li H., Lee H., Jung M., Shah S., U.S. Patent 6267992 (Jul. 31, 2001).

44. Makino T., Ono T., Muso E., Yoshida H., Honda G., Sasayama S. Inhibitory effects of rosmarinic acid on the proliferation of cultured murine mesangial cells // Nephrol. Dialysis Transplant. 2000. Vol. 15. P. 1140-1145.

45. Makino T., Ito M., Kiuchiu F. et al. Inhibitory effect of decoction of Perilla frutescens on cultured murine mesangial cell proliferation and quantative analysis of its active constituents // Planta Med. 2001. Vol. 67. P. 24-28.

46. Makino T., Ono T., Liu N., Nakamura T., Muso E., Honda G. Suppressive effects of rosmarinic acid on mesangioproliferative glomerulonephritis in rats // Nephron. 2002. Vol. 92. P. 898-904.

47. Matsuno M., Nagatsu A., Ogihara Y., Mizukami H. Synthesis of 2-0-(4-Coumaroyl)-3-(4-hydroxyphenyl)lactic acid, an important intermediate of rosmarinic acid biosynthesis // Chem. Pharm. Bull. 2001. Vol. 49, No. 12. P. 1644-1646.

48. Matsuno M., Nagatsu A., Ogihara Y., Ellis BE., Mizukami H. CYP98A6 from Lithospermum erythrorizon encodes 4-coumaroy-4'-hydroxyphenyllactic acid 3-hydroxylase involved in rosmarinic acid biosynthesis // FEBS Lett. 2002. Vol. 13, No. 514. P. 219-224.

49. Mizukami H., Ogawa T., Ohashi H., Ellis B. E. Induction of rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures by yeast extract // Plant Cell Reports. 1992. Vol. 11. P. 480.

50. Mizukami H., Tabira Y., Ellis B. E. Methyl jasmonate-induction of rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures // Plant Cell Reports. 1993. Vol. 12. P. 706.

51. Morant M., Hehn A., Werck-Reichhart D. Conservation and diversity of genefamilies explored using the CODEHOP strategy in higher plants // BMC Plant Biology. 2002.Vol. 2, No. 7.

52. Morant M., Schoch G., Ullmann P., Ertunc T., Little D., Olsen C., Petersen M., Negrel J., Werck-Reichhar D. Catalytic activity, duplication and evolution of the CYP98 cytochrome P450 family in wheat // Plant Mol. Biol. 2007. Vol. 63. P. 1-19.

53. Nishizava M., Tsuda M., Hayashi K. Two caffeic acid tetramers having enantiomeric phenyldihydronaphthalene moieties from Macrotomia euchroma II Phytochemistry. 1990. Vol. 29. P. 2645.

54. Palazon J., Cusido RM., Gonzalo J., Bonfill M., Morales S., Pinol MT. Relation between the amount the rolC gene product and indole alkaloid accumulation in Catharantus roseus transformed root cultures // J. Plant Physiol. 1998. Vol. 153. P. 712.

55. Petersen M. Cytochrome P450-dependent hydroxylation in the biosynthesis of rosmarinic acid in Coleus II Ptytochemistry. 1997. Vol. 45, No. 6. P. 1165-1172.

56. Petersen M., Simmonds MS. Rosmarinic acid II Ptytochemistry. 2003. Vol. 62, No. 2. P. 121-125.

57. Sevon N., Drager B., Hiltunen R., Caldentey KM. Characterization of transgenicplants drived from hairy roots of Hyoscyamus muticus II Plant Cell Rep. 1997. Vol. 16. P. 605-611.

58. Siminszky B., Corbin F.T., Ward E.R., Fleischma T.J., Dewey R.E. Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 17501755.

59. Sumaryono W., Proksch P., Hartmann T., Nimtz M., Wray V. Induction of rosmarinic acid accumulation in cell suspension cultures of Orthosiphon aristatus after treatment with yeast extract // Phytochemistry. 1991. Vol. 30. P. 3267-3271.

60. Szabo E., Thelen A., Petersen M. Fungal elicitor preparations and methyl jasmonate enhance rosmarinic acid accumulation in suspension cultures of Coleus blumei II Plant Cell Reports. 1999. Vol. 18. P. 485-489.

61. Ueda H., Yamazaki C., Yamazaki M. Luteolin as an anti-inflammatory and antiallergic constituent of Perilla frutescens II Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol. 25, No. 9. P. 1197—1202.

62. Ullah M., Khan M. Food as medicine: potential therapeutic tendencies of plant derived polyphenolic compounds // Asian Pac J Cancer Prev. 2008. Vol. 9, No. 2. P. 187196.

63. Werch-Reichhard D. and Feyereisen R. Cytochromes P450: a success story // Genome Biology. 2000. Vol. 1, No. 6.

64. Winterhoff H., Gumbinger H., Sourgens H. On the antigonadotropic activity of Lithospermum and Lycopus species and some of their phenolic constituents // Planta Med. 1988. Vol. 54, No. 2. P. 101-106.

65. Yamamoto H., Kenichiro I., Kazufumi Y. Caffeic acid oligomers in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures // Phytochemistry. 2000a. Vol. 53. P.651-675.

66. Yamamoto H., Yazaki K., Inoue K. Simultaneous analysis of shikimate-derived secondary metabolites in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures by highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 2000b. Vol. 738. P. 3-15.

67. Yamamoto H., Zhao P., Yazaki K., Inoue K. Regulation of lithospermic acid B and shikonin production in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures // Chem. Pharm. Bull. 2002. Vol. 50, No. 8. P. 1086-1090.

68. Yazaki K., Inushima K., Kataoka M., Tabata M. Intracellular localization of UDPG:p-hydroxybenzoate glucosyltransferase and its reaction product in Lithospermum cell cultures // Phytochemistry. 1995. Vol. 38. P. 1127.

69. Zhao J., Davis L.C., Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites // Biotechnology Advances. 2005. Vol. 23. P. 283-333.