Стабилизация олигомерных ферментов без применения носителей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Трубецкой, Владимир Сергеевич

• Трубецкой, Владимир Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Трубецкой, Владимир Сергеевич

Список сокращений, встречающихся в диссертации.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ СТАБИЛЬНОСТИ И ИНАКТИВАЦИИ

ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ.

1. Особенности проявления функциональной активности олигомерных ферментов.

2. Механизм инактивации олигомерных ферментов.

3. Молекулярные основы стабильности олигомерных ферментов из термофильных микроорганизмов.

Глава П. СТАБИЛИЗАЦИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ БЕЗ ПРИМЕНЕНИЯ НОСИТЕЛЕЙ.

1. Стабилизация ферментов путем одноточечной модификации поверхностных функциональных групп.

2. Стабилизация олигомерных ферментов эффекторами.

3. Стабилизация олигомерных ферментов с помощью солевых мостиков.

4. Стабилизация олигомерных ферментов с помощью внутримолекулярного сшивания бифункциональными реагентами.

Глава III. ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ.

МЕТОДЫ. 4Ь

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Термостабильность препаратов ГАФД с ковалентно сшитыми субъединицами.

2. Стабилизация ГАФД обработкой бифункциональными реагентами по отношению к различным денатурирующим воздействиям.

3. Механизм стабилизации олигомерных ферментов би~ функционф1ьными реагентами.

4. Термостабильность препаратов ГАФД, измеренная с помощью регистрации ферментативной активности при повышенной температуре.

5. Сравнение стабильности ГАШД с поперечносшитыми субъединицами и ферментов из термофильных микроорганизмов.

6. Стабилизация L-аспарагиназы с помощью ковалентного сшивания субъединиц.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стабилизация олигомерных ферментов без применения носителей»

Биологическая наука на современном этапе своего развития немыслима без биотехнологии - широкомасштабного внедрения элементов живой природы в промышленное производство, медицину и другие области. Неотъемлемой частью биотехнологии является инженерная энзимология - наука, занимающаяся разработкой путей практического применения ферментных препаратов.

Ферменты, будучи уникальными биологическими катализаторами различных биохимических процессов, обладают набором свойств, делающими их чрезвычайно привлекательными для внедрения в практику. Речь идет о исключительно высокой каталитической эффективности /скорость некоторых реакций увеличивается на 10-12 порядков [i ]/ и о чрезвычайно высокой избирательности действия ферментов. К сожалению, на пути широкого внедрения биокатализа в практику стоят серьезные препятствия, связанные с малой стабильностью на-тивных ферментов, чувствительностью к изменениям рН и температуры, а также быстрым выведением из организма, если речь идет о применении фермента в клинике в качестве терапевтического агента

2,з] . Именно поэтому получение искуственно стабилизированных производных ферментов является одной из важнейших задач инженерной энзимологии.

В основе процессов инактивации ферментов могут лежать явления различной природы; для ряда причин /например, ингибирования ионами тяжелых металлов, окисления существенных функциональных групп белка и т.д./ разработаны эффективные методы их подавления

4,5] . Наибольшие осложнения вызывает инактивация фермента, обусловленная денатурирующим воздействием внешней среды, в процессе которого глобула фермента претерпевает ряд изменений, включая существеннейшее - разворачивание полипептидной цепи [ б ] . Этот же фактор инактивации играет важную роль при использовании ферментов в качестве лекарственных средств.

Наиболее популярным и исторически первым методом преодоления названных препятствий является иммобилизация ферментов на нерастворимых и растворимых носителях различной природы. Ряд исследований последнего времени показал, что ферменты, иммобилизованные на различных полимерах, частично освобождены от нежелательных свойств, присущих нативным ферментам [7 ] . Однако, в ряде случаев это не является полным решением проблемы. Дело в том, что при практическом применении иммобилизованных ферментов, особенно в медицине, наличие объемной полимерной матрицы может серьезно сказаться на взаимодействии ферментов с высокомолекулярными субстратами и компонентами клеточных мембран, что ставит задачу стабилизации ферментов без применения носителей.

Ранее в нашей лаборатории были разработаны подходы к стабилизации ферментов без использования полимерных носителей на примере простейшего модельного фермента - химотрипсина [8,9] . Они заключались в одноточечной модификации определенных функциональных групп на поверхности белковой глобулы, а также в применении бифункциональных реагентов в качестве "скобок", скрепляющих отдельные части полипептидной цепи и фиксирующих таким образом активную конформацию глобулы. Но наряду с подобными химо-трипсину одноцепочечными ферментами в природе существует множество более сложных по структурной организации белков, а именно субъединичных ферментов, состоящих из нескольких полипептидных цепей, соединенных в каталитически активный агрегат нековалент-ными связями [ю] . Как показали исследования последних лет, помимо обычных механизмов инактивации, этим ферментам присущ специфический способ потери активности - диссоциация на каталитически неактивные субъединицы. Очевидно, можно ожидать существенного повышения стабильности подобных систем, если попытаться каким-либо искусственным способом скрепить субъединицы олигомер-ного фермента между собой и таким образом предотвратить диссоциацию. Осуществить подобную идею можно было бы химической модификацией олигомерного фермента с помощью бифункциональных реагентов, отлично зарекомендовавших себя в случае стабилизации одно-цепочечных ферментов [8,9] при условии связывания между собой двух соседних субъединиц одной молекулой подобного реагента.

Хотелось бы отметить, что, помимо практического значения, проблема стабилизации сложных олигомерных ферментов важна еще и в теоретическом плане как особый подход к изучению структуры и функции биокатализаторов и, что особенно важно, механизмов их денатурации.

Для детального изучения процесса стабилизации олигомерных ферментов с помощью обработки бифункциональными реагентами была выбрана следующая общая схема работы. На первом этапе работы общие подходы и методики отрабатываются на модельном объекте /обычно выбирается хорошо изученный фермент/, для которого получаемые результаты можно было бы легко интерпретировать. Второй этап работы заключается в перенесении отработанных на модельном объекте подходах на другие объекты, имеющие непосредственное практическое применение.

В предлагаемой работе мы попытались выяснить, в какой степени результаты, полученные в процессе изучения стабилизации простых одноцепочечных ферментов можно перенести на более сложно организованные олигомерные белки. Более конкретно, задачами данного исследования являются: а/ всестороннее изучение явления стабилизации олигомерных ферментов межсубъединичным сшиванием, включая выявление корректных способов измерения стабильности фермента и изучение влияния длины сшивающего реагента на эффект стабилизации, б/ исследование механизма стабилизации с применением различных методов /как прямых, так и косвенных/, и, наконец,-в/ перенос разработанных методов на конкретные олигомерные ферменты, применяющиеся в качестве терапевтических средств.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Прежде чем обсудить имеющиеся в литературе данные касающиеся особенностей инактивации и стабилизации олигомерных ферментов, необходимо отметить следующее. По вопросам, затронутым в настоящем обзоре, выполнено огромное количество работ, в которых исследователи имели дело с различными объектами. Нас, однако, в первую очередь, интересовали работы, выполненные с глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназой и ь-аспарагиназой - т.е.;именно с теми ферментами, с которыми мы проводили наши эксперименты. Поэтому им и уделено первостепенное внимание в "Обзоре литературы" .

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Трубецкой, Владимир Сергеевич

ВЫВОДЫ.

1. Субъединичные ферменты, первой стадией конформационной инактивации которых является обратимая диссоциация на составляющие их субъединицы, могут быть стабилизированы против инактивации под действием температуры, денатурирующих агентов и ряда других факторов путем внутримолекулярного сшивания между собой их субъединиц различными бифункциональными реагентами.

2. Величина эффекта стабилизации коррелирует с содержанием в ферменте сшитой фракции, регистрируемой по данным гель-электрофореза в полиакриламидном геле в диссоциирующих условиях, причем, содержание этой фракции, а значит, и эффект стабилизации могут быть повышены, благодаря выбору оптимального сшивающего реагента, образующего максимальное количество внутримолекулярных межсубъединичных связей. Для выбора оптимального реагента целесообразно изучать действие на фермент гомологических рядов однотипных бифункциональных реагентов, различающихся по длине цепи.

3. Кинетический смысл наблюдаемых эффектов стабилизации состоит в повышении энергии активации первой стадии инактивации - диссоциации на отдельные субъединицы и, как следствие, в замедлении процесса инактивации в целом.

4. Прямо показано, что в случае глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы наблюдаемые эффекты стабилизации коррелируют с понижением внутримолекулярной подвижности глобулы. В то же время каталитические параметры фермента меняются незначительно. Это указывает на большие резервы стабилизации ферментов путем ограничения их внутримолекулярной подвижности.

5. Метод регистрации активности фермента при повышенных температурах дает возможность оценить истинную термостабильность фермента с учетом возможного вклада процессов реассоциации и реактивации.

6. Использование в качестве бифункциональных сшивающих реагентов дикарбоновых кислот и диимидоэфиров позволило по разным химическим механизмам получить стабилизированные производные таких ферментов, как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и широко применяемая в клинической практике ь-аспарагиназа. Тот факт, что стабильные ферментные производные получены без использования полимерных носителей, может облегчить их практическое использование.

7. Упрочение межсубъединичных контактов с помощью бифункциональных сшивающих реагентов в определенной степени моделирует природный процесс молекулярной эволюции ферментов, создавший функционирующие в термофильных микроорганизмах ферментативные системы, стабилизированные за счет образования дополнительных мостиковых ионных межсубъединичных связей. ч

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Трубецкой, Владимир Сергеевич, 1984 год

1. Березин И.В., Клибанов АЖ., Мартинек К. Кинетико-термодинамичес-кие аспекты катализа иммобилизованными ферментами.- Успехи химии, , 1975, т. 44, с. 17-47.

2. Жоли м. Физическая химия денатурации белков.- М.: Мир, 1968, 364 с.

3. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Современное состояние и перспективы использования в медицине иммобилизованных физиологически-активных соединений белковой природы.- Хим.-фарм. журнал, 1980, №4,с. 21-36.

4. Мартинек К. Стабилизация ферментов один из ключевых факторов при внедрении биокатализа в практику.- В кн.: Успехи биоорганического катализа, Изд-во МГУ, 1979, с. 105-157.

5. Klibanov A.M. Enzyme stabilization by immobilization.- Anal. Biochem. 1979, v. 93, №1, p. 1-23.

6. Tanford C. Protein denaturation, part 2.- Adv. Protein Chem., 1969, v. 24, p. 1-35.

7. Zaborsky 0. Immobilized enzymes.- Cleveland, Ohio: CRC Press 1973.

8. Torchilin V.P., Maksimenko A.V., Smirnov V.N., Klibanov A.M., Berezin I.V., Martinek K. Prinsiples of enzyme stabilization. Part III. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 522, p. 277-283.

9. Torchilin V.P., Maksimenko A.V., Smirnov V.N., Berezin I.V., Martinek K. Prinsiplrs of enzyme stabilization. Part V. -Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.568, p. 1-10.

10. Klotz I.M., Darnall D.W., Langerman N.R. Quaternary structure of proteins.- The Proteins, New-York London, Academic Press, 1975, p. 293-405.

11. Шульц Г., Ширмер P. Принципы структурной организации белков.-М.: Мир, 1982, с. 64.

12. Jaenicke R. Folding and association of oligomeric enzymes.-Biophys. Struct, and Mech, 1981, v.7, p. 228-229.

13. Chan W.W.-C. Matrix-bound protein subunits.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, v. 41, № 5, p. 1198-1204.

14. Ashmarina L.I., Muronetz V.I., Nagradova N.K. A monomer of gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is catalytically active.-Biochem. Int., 1980, v. 1, p. 47-54.

15. Chan W.W.-C. The relationship between quaternary structure and enzyme activity.- Trends Biochem. Sci., 1976, v. 1, № 11, p. 258-260.

16. Gavilanes F.G., Gavilanes J.G., Municio A.M. Conformational stability of fructose-1,6-biphosphate aldolase from Ceratis ca-pitata.- Int. J. Peptide Protein Res., 1981, v. 17, № 2, p. 539545.

17. Shore J.D., Chakrabarti S.K. Subunit dissociation of mitochondrial malate dehydrogenase.- Biochemistry, 1976, v. 15, № 11,p. 875-879.

18. Wood D.C., Hodges C.T., Harrison J.H. The relation of the pH and concentration-dependent dissociation of porcine heart mitochondrial malate dehydrogenase.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 82, № 3, p. 943-950.

19. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Филипова Н.Ю., Бере-зин И.В. Димеры каталитически активные частицы люциферазы светляков.- Докл. акад. наук СССР, 1980, т. 260, № 2, с. 358-360.

20. Бровко Л.Ю., Беляева У.И., Угарова Н.Н. Субъединичные взаимодействия В люциферазе светляков Luciola mingrelica. Их роль и проявлении активности фермента и процессе термоинактивации.-Биохимия, 1982, т. 47, № 5, с. 760-766.

21. Dobeli Н., Schoenenberger G.A. A factor isolated from liverinhibits reassociation/reactivation of dissociated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- FEBS Lett., 1981, v. 133, №1, p. 123126.

22. Hoagland V.D., Teller D.C. Influence of substrate on the dissociation of rabbit muscle D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.-Biochemistry, 1969, v. 8, № 2,p. 594-602.

23. Muronetz V.I., Golovina Т.О., Nagradova N.K. Rat skeletal muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: adenine nucleotide-induced inactivation.- Arch. Biochem. Biophys., 1976, v. 177, № 1, p. 16-23.

24. Shifrin s., Grochowski B.J. L-Asparaginase from Escherichia coli. Succinilation and subunit interactions.- J. Biol. Chem., 1972,v. 247, № 4, p. 1048-1054.

25. Marshall J.J. Manipulation of the properties of enzyme by covalent attachment of carbohydrate.- Trends Biochem. Sci., 1978, v.3, № 4, p. 79-83.

26. Torchilin V.P., Galka M., Ostrowski W. Comparative studies on immobilization of human prostatic acid phosphatase.- Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 483, № 2, p. 331-336.

27. Muller J., Klin C. Stability of dehydrogenases. III. Malate dehydrogenases." Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 707, № 1, p. 133141 .

28. Jaenicke R. Subunit refolding and reassociation of oligomeric enzymes.- In Proteins: structure, function and industrial application, 12-th FEBS meeting, Oxford, Pergamon Press, 1978, p. 187198.

29. Jaenicke R., Schmid D., Knof S. Monodispersity and quaternary structure of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- Biochemistry, 1968, v. 7, W 3, p. 919-926.

30. Jaenicke R., Rudolph R., Hieder I. Quaternary structure, subunitactivity and in vitro association of porcine mitochondrial malate dehydrogenase.- Biochemistry, 1979, v. 18, №7, p. 1217-1223.

31. Gerschitz J., Rudolph R., Jaenicke R. Refolding and reactivation of liver alcihol dehydrogenase after dissociation and denaturation in б M guanidine hydrochloride.- Eur. J. Biochem., 1978, v. 87,3, p. 591-597.

32. Forasteri H., Ingham K.C. Thermal stability of human chorionic gonadotropin (hCG) reversible dissociation of subunits at neutral pH.- J. Biol. Chem., 1982, v. 257, № 14, p. 7976-7981.

33. Levi A.S. Properties of water-insiluble matrix bound lactate dehydrogenase. Arch. Biochem. Biophys., 1975, v. 168, № 1, p. 115121 .

34. Goldman R., Kedem 0., Katchalski E. Kinetic behavior of alkaline phosphatase-collodion membrane.- Biochemistry, 1971, v. 10, № 1, p. 165-172.

35. Полторак O.M., Чухрай E.C. Кинетика и механизм каталитической инактивации ферментов с четвертичной структурой.- Вест. Моск. унта. Сер. 2. Химия, 1979, т. 20, № 3, с. I95-2II.

36. Чухрай Е.С. Проблемы межбелковых взаимодействий в явлениях адсорбции, катализа и термоинактивации ферментов. Автореф. Дисс. . докт. хим. наук.- М, 1982, 36 с.

37. Полторак О.М., Сванидзе Р.С., Чухрай Е.С. К теории термоинактивации фермент-белковых комплексов. Вест. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия, 1980, т. 21, № 6, с. 545-549.

38. Tomimatsu Y. Macromolecular properties and subunit interactions of ribulose-1,5-biphosphate carboxylase from alfalfa.- Biochem. Biophys. Acta, 1980, v. 622, № 1, p. 85-93.

39. Незлин P.С. Строение и биосинтез антител.- М.: Наука,1972, с. 112.

40. Walker J.E., Wonacott A.J., Harris J.I. Heat stability of a tet-rameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.-Eur. J. Biochem., 1980, v. 108, № 2, p. 581-586.

41. Walker J.I., Carne A.F., Runswick M.J., Bridgen J., Harris J.I. D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Complete amino acid sequence of the enzyme from Bacillus stearothermophilus.- Eur. J. Biochem., 1980, v. 108, №2, p. 549-565.

42. Biescher G., Harris J.I., Thierry J.C., Walcker J.E., Wonacott A. Sequence and structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus.- Nature, 1977, v. 266,5600, p. 328.333.

43. Hocking J.D., Harris J.I. D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Amino-acid sequence of the enzyme from extreme thermophyle Thermus aquaticus.- Eur. J. Biochem., 1980, v. 108, № 2, p. 567579.

44. Argos P., Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frauk G., Trats-chin J.D. Thermal stability and protein structure.- Biochemistry, 1979, v. 18, № 25, p. 5698-5703.

45. Perutz M.F. Electrostatic effects in proteins.- Science, 1978, v. 201, № 4362, p. 1187-1192.

46. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н., Березин И.В. Взаимосвязь между структурой и стабильностью белков и ферментов из мезофильных и термофильных источников.- Биоорг. хим., 1982, т. 8, № II, с. 1445-146I.

47. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н. Стабилизация пероксидазы хрена при ацетилировании фермента и в присутствии ионов кальция.- Биоорг. хим., 1981, т. 7, № I, с. 75-85.

48. Угарова Н.Н., Рожкова Г.Д., Березин К.В. Химическая модификация6.nh2 групп лизина в пероксидазе хрена. Влияние ее на каталитические свойства и пространственную структуру фермента.- Биохимия, 1978, т. 43, № 7, с. 1242-1250.

49. Foucault G., Nakano М., Pudles J. Role of lysine-183 in D-glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- Eur. J. Biochem., 1978,v. 83, № 1, p. 113-123.

50. Akazawa Т., Sugiyama Т., Nakayama N., Oda T. Structure and function of chloroplast proteins VI.- Arch. Biochem. Biophys., 1968, v. 128, № 3, p. 646-653.

51. Subramani S., Schachman H.K. Linkage beetwen reactivity of sulf-hydryl groups and subunit interactions in aspartate transcarbamoy-lase.- J. Biol. Chem., 1982, v. 257, № 20, p. 11219- 11223.

52. Smith G.D., Schachman H.K. A disproportional mechanism for the

53. All or Non dissociation of mercurial-treated glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase.- Biochemistry, 1971, v. 10, № 24, p. 45764588.

54. Gibbons I., Perham R.N. The reaction of aldolase with 2-methyl maleic anhydride.- Biochem. J., 1970, v. 116, № 5, p. 843-849.

55. Meighen E.A.,Schachman H.K. Hybridization of native and chemically modified enzymes I.- Biochemistry, 1970, v. 9, № 5, p. 1163-1176.

56. Meighen E.A., Schachman H.K. Hybridization of native and chemically modified enzymes. II.- Biochemistry, 1970, v. 9, № 5. p.1 177-1 184 .

57. Muller J. Stability of lactate dehydrogenase. I. Chemical modification of lysines.- Biocim. Biophys. Acta, 1981, v. 669, № 2,p. 210- 215.

58. Cupo P., El-Deiry W., Witney P.L., Awad Jr., W.H. Stabilizationof proteins by guanidination.- J. Biol. Chem., 1980, v. 255, № 22, p. 10823-10833.

59. Minotani N., Sekiguchi Т., Bautista J.G., Nosoh Y. Basis of thermostability in pig heart lactate dehydrogenase treated with o-methylisourea.- Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 581, № 2, p. 334341 .

60. Shibuya H., Abe M., Sekiguchi Т., Nosoh Y. Effect of guanidination on subunit interaction in hybrid isozymes from pig lactate dehydrogenase.- Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 708, № 3, p. 300-304.

61. Torchilin V.P., Maksimenko A.V., Smirnov V.N., Klibanov A.M., Berezin I.V., Martinek K. Principles of enzyme stabilization. Part IV.- Biocim. Biophys. Acta, 1979, v. 567, № 1, p. 1-11.

62. Marangos P.J., Constantinides S.M. Factors affecting the folding and association of flounder muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in vitro.- Biochemistry, 1974, v. 13, № 5, p. 904910.

63. Rudolph R., Hieder H., Jaenicke R. Mechanism of reactivation and refolding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from yeast after denaturation and dissociation.- Eur. J. Biochem., 1977,v. 81. № 3, p. 563-570.

64. Teipel J.W., Koshland Jr. D.E. Kinetic aspects of conformational changes in proteins.I.- Biochemistry, 1971, v. 10, № 5, p. 792798.

65. Курганов Б.И. Индуцируемая специфическим лигандом димеризация аллостерического фермента.- Мол. биол., 1982, т. 16, № 2, с. 424

66. Irwin M.J., Nyborg J., Reid B.R., Blow D.M. The crystal structure of tyrosyl-transfer RNA syntetase at 2.7 A resolution.- J. Mol. Biol., 1976, v. 105, № 4, p. 577-586.

67. Evans P.R., Hudson P.J. Structure and control of phosphofructo-kinase from Bacillus stearothermophilus.- Nature, 1979, v. 279, № 5713, p. 500-504.

68. Shaw P.J., Murihead H. Crystallographic structure analysis of glucose-6-phosphate isomerase at 3.5 A resolution.- J. Mol. Biol., v. 109, W 3, p. 475-485.

69. Harris J.I., Waters M. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. In: The Enzymes. New-York San Francisco - London: Academic Press. 1976, v. 13, p. 1-47.

70. Payne R.C., Traut T.W. Regulation of uridine kinase quaternary structure dissociation by the inhibitor СТР.- J. Biol. Chem., 1982, v. 257, № 21, p. 12485-12488.72. диксон!:,M., Уэбб Э. Ферменты,- M.: Мир, 1982, с. 589.

71. Чередникова Т.В., Муронец В.И., Наградова Н.К. Влияние специфических антител на ассоциацию субъединиц глицеральдегид-3-фосфатдегид-рогеназы.- Биохимия, 1982, т. 47, № 3, с. 361-372.

72. De Renobales М., Welch Jr. W. Chemical cross-linking stabilizes the enzymic activity and quaternary structure of formyltetrahydro-folate syntetase.- J. Biol. Chem., 1980, V. 255, № 21, p. 1046010463.

73. Lowell S.J., Winzor D.J. Effects of phosphate on the dissociation and enzyme stability of rabbit muscle lactate dehydrogenase.-Biochmistry, 1974, v. 13, № 17, p. 5327-5331.

74. Rippa M., Signorini M., Bellini T. The effect of inorganic phosphate on the stability of some enzymes.- Biochem. J., 1981, v. 197,1. W 3, p. 747-749.

75. Haschke R.H., Friedhoff J.M. Calcium related properties of horseradish proxidase.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 80,1. W 4, p. 1039-1042.

76. Ayala J.A., Nieto M. Thermal denaturation of Micrococcus lyso-deikticus adenosine triphosphatase.- Biochem. J., 1978, v. 169, № 2, p. 371-380.

77. Harmon F.R., Gross N.H., Wood H.G. Stabilization of the quaternary structure of transcarboxylase by cobalt (II) ions.- Biochemistry, 1982, v. 21, № 12, p. 2847-2852.

78. Шульц Г., Ширмер P. Принципы структурной организации белков.- М.: Мир, 1982, с.

79. Wold F. Bifunctional reagents.- In: Methods in enzymology, New-York-London: Academic Press, 1972, v. 25, p. 623-651.

80. Bloxham D.P. Synthesis and use of bifunctional chloromethyl-alkane-dione derivatives of variable chain lenght for cross-linking thiol groups in oligomeric proteins.- Biochem. J., 1977, v. 167, № 1,p. 201-210.

81. Davies G.E., Stark G.R. Use of dimethyl suberimidate, a cross-linking reagent in studying the subunit structure of oligomeric proteins.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, v. 66, № 3, p. 651656.

82. Packman L.C., Perham R.N. Quaternary structure of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex of Bacillus stearothermophilus studied by a new reversible cross-linking procedure with bis (imidoesters).- Biochemistry, 1982, v. 21, № 21, p. 5171-5175.

83. Hucho F., Mullner H., Sund H. Investigation of the symmetry of oligomeric enzymes with bifunctional reagents.- Eur. J. Biochem.,1975, v. 59, № 1, p. 79-87.

84. Mackenzie R.E., Aldridge M., Paquin J. The bifunctional enzyme formiminotransferase-cyclodeaminase is a tetramer of dimers.-J. Biol. Chem., 1980, v. 255, № 19, p. 9474-9478.

85. Freedman R.B. Cross-linking reagents and membrane organisation.-Trends Biochem. Sci., 19 79, v. 4, № 9, p. 193-197.

86. Hajdu J., Wyss S.R., Aebi H. Properties of human erythrocyte ca-talases after crosslinking with bifunctional reagents.- Eur. J. Biochem., 1977, v. 80, № 2, p. 199-207.

87. Torchilin V.P. Chemical aspects of enzyme stabilization for use in therapy.- In: Future directions for enzyme ingeneering, New-York: Plenum Press, 1980, p. 219-241.

88. Reinolds G.D., Baker H.J., Reinolds R.H. Enzyme replacement using liposome carriers in feline G^-gangliosidosis fibroblasts.-Nature, 1978, v. 275, № 5682, p. 754-755.

89. Петров P.В. Иммунология.- M.: Медицина, 1983, с. 28.

90. Braidman I.P., Gregoriadis G. Rapid partial purification of placental glucocerebroside- -glucosidase and its entrapment in liposomes.- Biochem. J., 1977, v. 164, № 2, p.439-445.

91. Gregoriades G., Neerunjun D.E. Control of the rate of hepatic uptake and catabolism of liposome-entrapped proteins injected into rats. Possible therapeutic applications.- Eur. J. Biochem., 19 74, v. 47, № 1, p. 179-185.

92. Whitecar J.P., Bodey G.P., Harris J.E., Freireich E.J. Current consepts: L-asparaginase.- New Engl. J. Med., 1970, v. 282, № 13, p. 732-734.

93. Blasek R., Benbough J.E. Improvement in the persistence of microbial asparaginase and glutaminase in the circulation of the rat by chemical modifications.- Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 677,2, p. 220-224.

94. Nickle E.C., Solomon R.D., Torchia Т.Е., Wriston Jr, J.C. Chemical modifications of E. coli L-asparaginase and their effect plasma clearance rate and other properties.- Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 704, № 2, p. 345-352.

95. Holcenberg J.S., Schmer G., Teller D.S., Roberts J. Biologic and physical properties of succinilated and glycosylated Aci-netobacter glutaminase-asparaginase.- J. Biol. Chem., 1975, v. 250, № 11, p. 4165-4170.

96. Sherwood R.F., Barid J.K., Atkinson T. Enhanced plasma persistence of therapeutic enzymes by coupling to soluble dextran.-Biochem. J., 1977, v. 164, № 2, p. 461-464.

97. Coony D.A., Rosenbluth R.J. Enzymes as therapeutic agents.- In: Advances in pharmacology and chemotherapy, New-York: Academic Press, 1975, v. 12, p. 78.

98. Вольф M., Рансбергер К. Лечение ферментами.- М.: Мир, 1967, с. 142-157.

99. Spadaro А.С.С., Draghetta W., del Lama S.N. A convenient manual trinitrobenzene sulfonic acid method for monitoring amino acids and peptides in chromatography column effluent.- Anal. Biochem., 1979, v. 96, № 2, p. 317-321.

100. Ferdinand W. The isolation and specific activity of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- Biochem. J., 1964,v. 92, № 3, p. 578-585.0

101. Howard J.В., Carpenter F.H. L-Asparaginase from Erwinia caroto-vora. Substrate specificity and enzymatic properties.- J. Biol. Chem., 1972, v. 247, № 4, p. 1020-1030.

102. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.- Nature, 1970, v. 227, № 5259,p. 680-685.

103. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.- М.: Наука, 1981, с. 64.

104. Braatz J.A., Mclntire K.R. A High yield method for isolating proteins from polyacrylamide gels by electrophoretic elution.-In: Electrophoresis-78, Amsterdam: Elsevier-North Holland, 1978, p. 145-154.

105. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.- М.: Наука, 1981, с. 91.

106. Constantinides S.M., Deal Jr. W.C. Reversible dissociation of tetrameric rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase into dimers or monomers by adenosine triphosphate.- J. Biol. Chem., 1969, v. 244, № 20, p. 5695-5702.

107. Price N.C., Radda G.K. The binding of NAD+ to rabbit muscle gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase studied by protein fluorescence quenching.- Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 235, № 1, p. 2731 .

108. Seydoux F., Bernard S., Pfenninger O., Payne M., Malhotra O.P. Preparation and active-site specific properties of sturgeon muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- Biochemistry, 1973,v. 12, № 21, p. 4290-4293.

109. Толкачев В.А., Михайлов А.И. Номограмма для двойного интегрирования сигнала Э.П.Р.- Приб. тех. эксп., 1964, № 6, с. 95-96.

110. Bell J.Е., Dalziel К. Studies of coenzyme binding to rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 391, № 2, p. 249-258.

111. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.- Anal. Biochem., 1978, v. 72, № 1, p. 248

112. Ы4. Fry D.W., White J.С., Goldman I.D. Rapid separation of low-molecular weight solutes from liposomes without dilution.- Anal. Biochem., 1978, v. 90, № 3, p. 809-815.

113. Torchilin V.P., Martinek K. Enzyme stabilization without carriers.' Enzyme microb. technol., 1979, v. 1, № 2, p. 74-81.

114. Merkil J.R., Lee C.C., Freund T.S. A dimeric extracellular heat-stable aminopeptidase produced by a marine Pseudomonad.- Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 661, № 1, p. 32-38.

115. Herman R., Rudolph R., Jaenicke R. Kinetics of in vitro reconsti-tution of olygomeric enzymes by cross-linking.- Nature, 1979,v. 277, № 5693, p. 243-245.

116. Doster W., Hess B. ; Reversible solvent denaturation of rabbit muscle pyruvate kinase.- Biochemistry, 1981, v. 20. № 4, p. 772-780.

117. Жоли M. Физическая химия денатурации белков,- М.: Мир, 1968, с. 56.

118. Lakatos S., Zavodszky P., Elodi P. Dissociation of mammalian D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase into monomers.- FEBS Lett., 1972, v. 20, № 3, p. 324-326.

119. Kalman M., Nuridsany M., Ovady J. Substrate-induced dissociation of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase detected by affinity chromatigraphy. Study of subunit interactions by affinity sorption.- Biochim. Biophys. Acta, 1980, № 2, p. 285-293.

120. Amenlunxen R.E. Some chemical and physical properties of thermostable glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from B. stearo-thermophilus.- Biochem. Biophys. Acta, 1967, v. 139, N- 1, p. 2432.

121. Вейнберга И.Г., Чухрай Е.С., Полторак О.М., Арен А.К., Розиня И.П. Кинетика термоинактивации химически модифицированной почечнойс. 455-15.- из ацилазы I.- Вест. Моск. ун-та. Сер. 2. химия, 1981, т. 22. № 5, с. 455-457.

122. Чухрай Е.С. Критерии диссоциативного механизма термоинактивации ферментов с четвертичной структурой.- Вест. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия, 1981, т. 22, Р 4, с. 331-340.

123. Михайлов А.И., Большаков А.И., Лебедев Ю. С., Гольданский В.И. Процессы диффузии в облученных молекулярных кристаллах.- Физ. тверд, тела, 1972, т. 14, № 4, с. II72-II78.

124. Foucault G., Bodo J.-M., Nakano M. Structure and reactivity relationship in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.- Eur. j. Biochem., 1981, v. 119, № 3, p. 625-632.

125. Chan W.W.-C., Enns C.A. Hybrid aspartate transcarbamoylase containing cross-linked subunits.- Can. J. Biochem., 1981, v. 59, № 6, p. 461-468.

126. Chan W.W.—C. Conformation of cross—linked transcarbamoylase.— Can. J. Biochem., 1981, v. 59, № 5, p. 371-378.

127. Pennathur-Das R., Health R.L., Mentzer W.C., Lubin B.H. Modification of hemoglobin-S with dimethyl adipimidate. Contributionof inter-tetrameric cross-linking to changes in properties.- Bio-chim. Biophys. Acta, 1982, v. 706, W 1, p. 80-85.

128. Mozhaev V.V., Siksnis V.A., Torchilin V.P., Martinek K. Operational stability of copolymerized enzymes at elevated temperatures.- Biotechnol. Bioeng., 1983, v. 25, W 7, p. 1937-1945.