Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР-диагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.11.17, доктор технических наук Чернышев, Андрей Владимирович

• Чернышев, Андрей Владимирович
• доктор технических наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор технических наук Чернышев, Андрей Владимирович

Перечень условных обозначений.

Введение.

Глава 1. Обзор современного состояния разработки оборудования для

ПЦР-диагностики - амплификаторов ДНК.

1.1. Конструктивные схемы оборудования для ПЦР-диагностики.

1.2. Проблемы разработки оборудования для ПЦР-диагностики.

1.2.1. Обеспечение однородности температурного поля рабочего тела.

1.2.2. Повышение скорости нагрева/охлаждения рабочего тела.

1.2.3. Снижение динамического разброса температуры рабочего тела в процессе стабилизации температуры.

1.2.4. Повышение надежности блока нагрева/охлаждения в циклическом режиме.

1.3. Обзор методов расчета оборудования для ПЦР-диагностики.

1.3.1. Обзор методов расчета термостатирующих устройств.

1.3.2. Обзор методов расчета тепловых источников.

1.3.3. Обзор и выбор метода решения теплового состояния.

1.4. Выводы к главе 1. Постановка цели и задач исследования.

Глава 2. Биотехнические аспекты создания оборудования для ПЦРдиагностики.

2.1. Молекулярно-биологические основы процесса ПЦР.

2.2. Коэффициент «качества» процесса ПЦР.

2.3. Биотехнический подход к анализу процесса ПЦР.

2.4. Моделирование теплового состояния реакционной смеси в ходе ПЦР.

2.4.1. Математическая модель теплового состояния реакционной смеси.

2.4.2. Результаты численного эксперимента.

2.5. Энергетическая оценка влияния химических и физико-химических реакций в ходе ПЦР на тепловое состояние реакционной смеси.

2.6. Выводы к главе 2.

Глава 3. Разработка общей классификации и концептуальной модели расчета оборудования для ПЦР-диагностики.

3.1 Классификация оборудования для ПЦР-диагностики.

3.1.1. Классификация по принципу действия.

3.] .2. Классификация по техническим и эксплуатационным характеристикам.

3.1.3. Анализ классификационных признаков.

3.2. Концептуальная модель расчета оборудования для ПЦРдиагностики.

3.2.1. Обобщенная структурная схема.

3.2.1.1. Структурная схема теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

3.2.1.2. Структурная схема пневматического устройства.

3.2.1.3. Структурная схема комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

3.2.2. Концептуальная модель расчета.

3.3. Выводы к главе 3.

Глава 4. Теория рабочих процессов и разработка методики расчета твердотельных амплификаторов ДНК.

4.1. Математическая модель расчета теплового блока твердотельного амплификатора ДНК.

4.1.1. Основные допущения.

4.1.2. Расчетная область.

4.1.3. Система уравнений.

4.1.4. Граничные и начальные условия.

4.2. Разработка методики расчета твердотельного устройства.

4.2.1. Дискретный аналог уравнения теплопроводности для теплового блока.

4.2.2. Дискретный аналог уравнения Навье-Стокса в каналах радиатора.

4.2.3. Дискретный аналог уравнения энергии в каналах радиатора.

4.2.4. Дискретный аналог уравнения Навье-Стокса в воздушной камере.

4.2.5. Дискретный аналог уравнения неразрывности в воздушной камере.

4.2.6. Дискретный аналог уравнения энергии в воздушной камере.

4.3. Математическая модель расчета преобразователей энергии твердотельных амплификаторов.

4.3.1. Вывод уравнения сохранения энергии для неравновесных процессов в термоэлектрических элементах Пельтье.

4.3.2. Вывод закона сохранения энергии для нестационарных условий.

4.3.3. Обобщенные законы теплопроводности и электропроводности в анизотропной среде.

4.3.4. Вывод закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически анизотропной среды для нестационарных условий.

4.3.5. Вывод закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически изотропной среды.

4.3.6. Вывод дискретного аналога закона сохранения энергии для однородной термоэлектрически изотропной среды.

4.4. Алгоритм расчета.

4.5. Еыводы к главе 4.

Глава 5. Численные исследования твердотельных амплификаторов ДНК.

5.1. Исследование физических факторов, влияющих на воспроизводимость результатов амплификации ДНК.

5.1.1. Факторы, влияющие на однородность теплового поля рабочего тела

5.1.1.1. Взаимодействие рабочего тела с окружающей средой и элементами конструкции.

5.1.1.2. Неоднородность теплофизических свойств рабочего тела.

5.1.1.3. Неоднородность теплового потока от преобразователя энергии.

5.1.2. Численные исследования однородности теплового поля рабочего тела.

5.1.2.1. Математическая модель.

5.1.2.2. Неоднородность теплофизических свойств рабочего тела.

5.1.2.3. Исследование влияния теплового потока от преобразователя энергии и взаимодействия с окружающей средой на однородность теплового поля рабочего тела.

5.2. Численные исследования процессов в тепловых блоках твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов

Пельтье.

5.2.1. Математическая модель твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.2.1.1. Расчетная область.

5.2.1.2. Система уравнений.

5.2.1.3. Начальные и граничные условия.

5.2.2. Численное исследование 96- луночного теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.2.3. Численное исследование 16- луночного теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.2.4. Численное исследование 32-луночного теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

5.3. Численные исследования твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.3.1. Математическая модель твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.3.1.1. Расчетная область.

5.3.1.2. Система уравнений математической модели.

5.3.1.3. Начальные и граничные условия.

5.3.2. Численное исследование твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.3.3. Экспериментальные исследование твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК.

5.4. Выводы к главе 5.

Глава 6. Разработка методики расчета. Численные и экспериментальные исследования характеристик пневматического амплификатора ДНК.

6.1. Математическая модель пневматического амплификатора ДНК.

6.1.1. Расчетная схема пневматического амплификатора ДНК.

6.1.2. Расчетные зависимости.

6.1.3. Принятые допущения.

6.1.4. Математическая модель расчета переходных процессов.

6.1.5. Метод решения.

6.1.6. Расчетно-теоретические исследования конструктивных и функциональных параметров пневматического амплификатора ДНК.

6.1.6.1. Исходные параметры.

6.1.6.2. Результаты расчета.

6.2. Экспериментальные исследования.

6.2.1. Экспериментальный стенд.

6.2.2. Результаты экспериментальных исследований.

6.3. Выводы к главе 6.

Глава 7. Повышение эффективности и надежности твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

7.1. Повышение ресурса работы амплификатора ДНК в циклическом режиме за счет применения эффективных ТЭМО.

7.2. Повышение ресурса работы амплификатора ДНК в циклическом режиме за счет применения эффективных законов управления и регулирования.

7.2.1. Синтез системы автоматического регулирования амплификатора ДНК.

7.2.2. Экспериментальные исследования системы автоматического регулирования амплификатора ДНК на основе ТЭМО.

7.2.3. Разработка блока нагрева/охлаждения амплификатора ДНК с управляемым усилителем тока.

7.3. Разработка и исследование комбинированной электротермоэлектрической схемы блока нагрева/охлаждения с целью повышения ресурса амплификатора ДНК.

7.3.1. Математическая модель расчета процессов в тепловом блоке комбинированного электро-термоэлектрического амплификатора ДНК.

7.3.2. Численные исследования комбинированного электротермоэлектрического амплификатора ДНК.

7.4. Выводы к главе 7.

Глава 8. Разработка, создание и клинические испытания оборудования для ПЦР-диагностики.

8.1. Разработка и создание твердотельных амплификаторов ДНК.

8.1.1. Разработка и создание твердотельных амплификаторов ДНК на базе термоэлектрических преобразователей энергии.

8.1.2. Разработка и создание тепловых блоков анализаторов нуклеиновых кислот для проведения ПЦР в реальном времени. 327 v

8.1.3. Разработка и создание комбинированного электропневмомеханического амплификатора ДНК для проведения ПЦР в биологических микрочипах.

8.2. Разработка и создание малогабаритного мобильного пневмомеханического амплификатора ДНК. 337 ^

8.3. Клинические испытания.

8.4. Выводы к главе 8.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР-диагностики»

Актуальность. В настоящее время объектами научных и диагностических исследований медико-биологических лабораторий всего мира все чаще становятся нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК. В ходе исследований ставятся задачи, не только требующие определить наличие исследуемой нуклеиновой кислоты в образце, но и определить ее исходное количество и нуклеотидную последовательность (сиквенс). Наиболее доступным, достоверным и высокочувствительным методом, позволяющим обнаружить ДНК в пробе и оценить ее количество, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Разработка в 1983 году сотрудником фирмы «Cetus», США, Кэри Мюллисом, метода полимеразной цепной реакции является одним из крупнейших методологических открытий в современной молекулярной биологии. За это он в дальнейшем был удостоен Нобелевской премии.

Принцип метода полимеразной цепной реакции широко используется как в научных исследованиях, так и для диагностики в практическом здравоохранении, в системе Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор).

Полимеразная цепная реакция - это циклическая температурозависимая ферментативная реакция, в ходе которой происходит квазиэкспоненциальный рост количества специфического фрагмента исходной двухцепочечной ДНК. В процессе ПЦР накапливается достаточное количество молекул ДНК для достоверной визуальной детекции этого фрагмента. В настоящее время в России основным методом анализа продуктов ПЦР является гель-электрофоретическое разделение ДНК с последующей визуализацией продуктов разделения путем облучения геля на дпине волны 254 нм. Свечение фрагментов ДНК происходит благодаря интеркалирующему агенту - бромистому этидию, добавленному в гель. Флуоресценция молекулы бромистого этидия многократно возрастает в результате его связывания с продуктами ПЦР. Наличие продуктов амплификации (полосы в геле) дает исследователю информацию о присутствии в исходном образце ДНК-мишени, а отсутствие продуктов амплификации говорит об отсутствии в исходном образце ДНК-мишени. На практике, необходимо получить такое количество продукта ПЦР (копий ДНК), которое возможно обнаружить тем или иным доступным методом. Очевидно, чем чувствительнее способ обнаружения, тем раньше в ходе реакции образуется пороговое количество ДНК - то есть количество ДНК, которое можно достоверно обнаружить с использованием какого-либо метода детекции. Цикл, при котором образуется пороговое количество ДНК, называется пороговым. В тоже время, количество циклов реакции, при которых образуется пороговое число ДНК, зависит от исходного количества ДНК в пробе. Следовательно, каждому начальному количеству ДНК соответствует определенное значение порогового цикла реакции, определив которое и используя калибровочную прямую, можно определить исходное количество копий ДНК. Основным условием для реализации данного подхода является необходимость оценки динамики изменения количества продукта непосредственно в ходе реакции. На практике это может быть осуществлено путем измерения сигнала флуоресценции. По динамике изменения сигнала флуоресценции оценивается динамика изменения количества ДНК. Такой процесс называют ПЦР с детекцией сигнала в реальном масштабе времени (real-time PCR), или кинетической ПЦР.

Полимеразная цепная реакция, используемая при анализе ДНК, позволяет сегодня решать такие научно-исследовательские и диагностические задачи, как:

- анализ фрагментов ДНК для диагностики социально значимых заболеваний, таких как гепатиты В и С, туберкулез, СПИД и многих других инфекционных заболеваний, а также онкологических и генетических заболеваний;

- генотипирование (в медицине используется для определения антибиотико-резистентных штаммов (туберкулез), в криминалистике -для идентификации личности, в сельском хозяйстве - при селекции ценных пород животных и сортов растений);

- идентификация генетических мутаций;

- мониторинг экспрессии генов при разработке новых лекарственных средств;

- поиск и изучение новых генов;

- мониторинг экологической безопасности (экологический профиль микроорганизмов);

- определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК;

- молекулярно-биологические исследования;

Важнейшее значение метод получил в свете событий, произошедших 11 сентября 2001 года в США. Теоретическая возможность биологического терроризма перешла в область реальных фактов. По своим губительным для человечества свойствам биологический терроризм сопоставим с ядерным оружием. Однако выявить носителя биологического воздействия практически невозможно. Наиболее эффективным способом снижения поражающего фактора является как можно более скорое обнаружение факта воздействия и принятие дальнейших мер по его локализации и нейтрализации. Применение ПЦР для этих целей является одним из наиболее эффективных и оперативных методов определения факта воздействия. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, воздух, почва и т.д.). В США разрабатываются и выпускаются комплекты мобильного оборудования для проведения ПЦР в полевых условиях.

Наиболее широкое практическое применение метод имеет в медицине, так как выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. Данное свойство метода делает его незаменимым в современных диагностических исследованиях. Метод обладает серией таких преимуществ, как:

- возможность прямого определения наличия возбудителя;

- высокая чувствительность;

- высокая специфичность;

- универсальность процедуры выявления различных возбудителей;

- высокая скорость получения результата анализа;

- возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Суть данных преимуществ заключается в следующем.

Прямое определение наличия возбудителей: многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфичного участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции [1].

Высокая специфичность метода ПНР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя, фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров. Последовательность более 15 нуклеотидов уникальна, и поэтому праймер способен образовывать полностью комплементарную связь только с единственным участком ДНК. Следовательно, если такой участок в исследуемой ДНК есть, то дальнейший ход реакции возможен. Если нет, накопление продукта не происходит. Это практически исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПНРЛ анализа составляет 10. 10 клеток в пробе (чувствительность л г иммунологических и микроскопических тестов-10 .10 клеток).

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

Высокая скорость получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированные методы обработки биоматериала, детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4,0 . 4,5 часа.

Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике.

Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции.

Масштаб практического использования ПЦР определяется очень большим количеством факторов, таких как разработка и сертификация новых методик; разработка, производство, испытание и сертификация диагностических наборов; создание и производство соответствующего оборудования.

К разработке оборудования для реализации ПЦР приступили практически одновременно с открытием самой реакции. Для успешного протекания полимеразной цепной реакции необходимо устройство, в котором можно обеспечить изменение температуры реакционной смеси по' заданному закону и с определенной степенью точности. Одним из первых серийно выпускаемых приборов данного назначения стал прибор фирмы CETUS - «Perkin Elmer 9600» (USA).

Наиболее распространенное название устройств данного класса -амплификаторы ДНК. За прошедшие годы к разработке и производству амплификаторов ДНК приступили десятки фирм в промышленно развитых странах. Созданы и серийно выпускаются амплификаторы ДНК, обладающие различными техническими характеристиками, отличающиеся принципом действия и предназначенные для работы в различных условиях. Лидерами в производстве данного оборудования являются такие зарубежные фирмы, как Perkin Elmer, Bio Rad, MJ Research (США), Techne (Великобритания),

Eppendorf, Biometra (Германия). Среди отечественных производителей - ЗАО «ДНК Технология, ЗАО «Компания Биоком», ЗАО «Ресурс Прибор», ЗАО «СТМ-Ц», ОАО «Приборостроительный завод Сигнал», Институт аналитического приборостроения РАН. Необходимость создания оборудования для ПЦР-диагностики, отвечающего современным и постоянно меняющимся требованиям, определяется:

- постоянным развитием естественных наук в направлении исследований в области молекулярной биологии и генетических исследований;

- созданием новых методов диагностических исследований в практической медицине;

- проведение молекулярно-генетических исследований при идентификации личности при проведении судебно-медицинских экспертиз;

- проведением следственных действий правоохранительными органами в процессе противодействия биологическому терроризму.

Создание оборудования данного класса способствует развитию отечественного высокотехнологичного производства и направлено на выпуск продукции конкурентоспособной на мировом рынке медицинского и научного оборудования.

По принципу действия амплификаторы ДНК относятся к классу электропневмомеханических устройств, а по назначению - к изделиям медицинского назначения для молекулярно-генетических исследований. Современная практика сложилась таким образом, что допуск к лабораторному применению подобных устройств осуществляется органами контроля Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Практически все типы амплификаторов ДНК, выпускаемых в настоящее время, имеют или существенное ограничение по производительности и ресурсу работы, или низкую точность подержания заданной температуры рабочего поля и низкую скорость изменения температуры. Предложено несколько вариантов конструктивных решений, направленных на повышение эффективности работы устройств. Некоторые фирмы, в том числе «Biometra» (Германия), выпустили устройства, в которых тепловые блоки изготовлены из серебра с позолотой контактных поверхностей. Данное решение позволило несколько повысить эффективность устройства, но привело к значительному удорожанию изделия, и без того недешевого. Средняя стоимость подобных устройств составляет 3,5 . 4,0 тысяч долларов США.

Центральной проблемой при создании оборудования для ПЦР-диагностики является проблема повышения его эффективности. Решить данную задачу возможно на основе математического моделирования и исследования рабочих процессов. На сегодняшний день вопросы теории рабочих процессов и разработки методов расчета оборудования для ПЦР-диагностики мало изучены. Некоторые принципы обобщения определены в работе Н.А. Ярышева и Л.Б. Андреевой [2], в которой проведены анализ и систематизация вариантов исполнения и методов расчета термостатирующих устройств различных типов. Математическая модель разработана на основе закона сохранения энергии при значительном наборе допущений. В работе получено дифференциальное уравнение объекта термостатирования, находящегося во внутреннем объеме термостатирующего устройства. Предложенный метод дает достаточно хорошие результаты, но обладает следующими недостатками: не позволяет рассчитывать тепловые процессы в динамическом режиме; нельзя рассчитать тепловые поля по объему рабочего тела; расчет конкретной задачи требует значительных преобразований и выкладок; количество решаемых на его основе задач ограничено.

Известны попытки решения подобных задач и аналитическими методами. Предложенный B.C. Зарубиным [3] подход имеет те же ограничения. Максимально в направлении создания методики расчета прецизионных устройств нагрева и охлаждения, работающих в динамическом режиме, продвинулась О.В. Белова [4]. Автором разработан метод расчета, сочетающий в себе конечно-элементную и конечноразностную дискретизацию и использующий численные методы решения на несогласованных сетках. Однако в работе предложена модель только одного варианта исполнения устройства нагрева/охлаждения - на термоэлектрических элементах Пельтье. Кроме того, при построении пространственной модели теплового блока автор заменяет расчетные области, в которые входят полупроводниковые материалы и медные спаи, на некий эффективный объем, теплофизические свойства которого представлены в виде эффективных плотности и коэффициента теплопроводности. Предложенный подход был оригинальным шагом на пути построения практически первой пространственной модели расчета тепловых процессов в динамическом режиме. Однако при решении задачи исследования однородности теплового поля метод не позволяет учитывать неоднородность теплового поля самого источника (в данном случае -элемента Пельтье), а мощность источника в общем случае зависит от пространственных координат и времени.

Темпы развития современных методов исследований порождают очень важное требование - значительное сокращение сроков и стоимости разработки устройств. При этом еще на этапе проектирования необходимо обеспечить максимально высокий уровень конструктивного решения и технических характеристик создаваемых устройств. Для решения данной задачи необходимо снабдить разработчика общей концептуальной моделью и методами расчета, которые позволили бы провести расчетно-теоретические исследования вариантов исполнения конструкций, основанных на различных принципах действия. Требуется обобщить накопленный на сегодняшний день опыт создания подобного оборудования и разработать общую классификацию, которая помогла бы обосновано выбрать и оценить вариант конструкции.

Решение задачи усложняется также тем, что амплификаторы ДНК в сочетании с образцами, содержащими биологический материал, а более точно - реакционной смесью, представляют собой биотехническую систему (БТС). Успешная разработка или эффективное совершенствование характеристик данной системы возможны лишь при взаимном учете и согласовании параметров всех ее составляющих. Широко распространенной ошибкой является создание новых и совершенствование имеющихся технических средств без учета особенностей биохимических процессов.

Таким образом, объектом исследований в данной работе является оборудование медицинского назначения для ПЦР-диагностики -амплификаторы ДНК. Предметом исследований, соответственно, являются рабочие процессы, протекающие в данных устройствах, определяющие их технические и эксплуатационные характеристики.

Актуальность темы диссертации, направленной на создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработку оборудования для ПЦР-диагностики, подтверждается тем, что она связана с выполнением работ по Федеральной целевой научно-технической программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002 - 2006 годы.

Научной новизной обладают следующие результаты, полученные в диссертации:

1. Впервые выделены классификационные признаки и предложена общая классификация амплификаторов ДНК: по типу рабочего тела, способу подвода и отвода теплоты, способу преобразования энергии, типу используемых рабочих емкостей для реакционных ПЦР смесей и пр.

2. В результате впервые проведенных исследований теплового взаимодействия реакционной смеси и теплового блока амплификатора ДНК в ходе ПЦР установлено, что одной из основных причин низкой воспрозводимости результатов проведения ПЦР является неоднородность теплового поля рабочего тела в переходных режимах работы амплификаторов ДНК, которая может достигать ± (7.8) К при скорости изменения температуры рабочего тела теплового блока (1. .1,5) К/с. Впервые разработана математическая модель и произведен расчет энергетического воздействия химических и физико-химических реакций при матричном синтезе цепей и плавлении ДНК на тепловое состояние реакционной смеси. Установлено, что теплота, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций (2,0-10'5. 1,0-10"4 Дж), не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

3. Впервые разработана научная основа для описания рабочих процессов в тепловых блоках амплификаторов ДНК. Создана обобщенная структурная схема, определяющая характер взаимодействия компонентов теплового блока.

4. На основе обобщенной структурной схемы построена концептуальная модель расчета процессов тепломассопереноса, которая позволяет формировать единый подход к созданию частных математических моделей амплификаторов ДНК, базирующихся на различных принципах действия. Концептуальная модель состоит из системы нестационарных дифференциальных уравнений энергии, движения и неразрывности вязкой среды в трехмерной постановке, начальных и граничных условий.

5. Впервые разработана модель расчета термоэлектрических преобразователей энергии на основе законов неравновесной термодинамики.

6. На основе концептуальной модели созданы математические модели расчета различных типов твердотельных амплификаторов ДНК. На основе метода контрольного объема созданы методы и алгоритмы расчета, проведены численные исследования тепловых блоков амплификаторов ДНК и определены конструктивные и функциональные параметры, позволившие обеспечить однородность теплового поля рабочего тела на уровне ±(0,08.0,15) К при скорости изменения температуры от 1,5 К/с до 4,6 К/с.

7. На базе обобщенной структурной схемы и основных законов классической равновесной термодинамики для открытых систем впервые созданы математическая модель и алгоритм расчета пневматического амплификатора ДНК.

Практическая ценность и внедрение результатов работы.

1. Разработаны не имеющие аналогов концептуальная модель расчета, обобщенная расчетная схема и методы расчета, которые могут быть использовании при создании новых типов амплификаторов ДНК, основанных на различных принципах действия. Концептуальная модель и методы расчета позволяют существенно (в 5-10 раз) сократить сроки создания данного типа оборудования.

2. Выявлены направления и разработаны способы повышения надежности работы твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов. Предложена новая комбинированная твердотельная электро-термоэлектрическая схема амплификатора ДНК, позволяющая качественно изменить условия работы термоэлектрических элементов. Достигнуто значительное (до 100 раз) увеличение количества рабочих циклов функционирования твердотельных устройств на основе термоэлектрических элементов.

3. Математические модели и методики расчета внедрены в практику проектирования в ЗАО «СТМ-Ц», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург. С использованием созданных методик и программ расчета разработаны и серийно производятся ЗАО «СТМ-С», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург, следующие типы амплификаторов ДНК: «Циклотемп-2», «Циклотемп-4», «Циклотемп-106», «Циклотемп-107», амплификаторы ДНК для количественного анализа ДНК в реальном времени - анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32.

4. С применением созданных методик и программ расчета впервые разработана и изготовлена партия специализированных амплификаторов ДНК, предназначенных для работы с биологическим микрочипами. Устройство запатентовано в Российской Федерации (Пат. 43871 РФ, МПК7 С12М 1/34) и внедрено в Институте молекулярной биологии РАН, г. Москва, и Институте аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург.

5. С использованием разработанных методик и программ расчета разработан опытный образец малогабаритного мобильного пневмомеханического амплификатора ДНК для работы в полевых условиях. Устройство предназначено для проведения оперативной биологической разведки с целью индикации и идентификации агентов биологического воздействия непосредственно в зоне их обнаружения

6. Амплификатор ДНК «Циклотемп-107» и анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АНК 32 прошли приемочно-технические испытания во ВНИИМТ МЗ РФ и клинические испытания в исследовательских центрах и научно-исследовательских институтах МЗ РФ, МО РФ и РАМН, рекомендованы к применению в медицинской практике, внесены в Государственный Реестр изделий медицинского назначения и серийно производятся.

7. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр «Биомедицинские технические системы и устройства» и «Вакуумная и компрессорная техника» МГТУ им. Н.Э. Баумана.

Работа содержит восемь глав.

В первой главе представлен обзор современного состояния разработки оборудования для ПЦР-диагностики - амплификаторов ДНК. Рассмотрены конструктивные схемы оборудования, проведен анализ существующих проблем разработки оборудования и методов расчета. Сформулированы цель и задачи исследования.

Во второй главе исследованы биотехнические аспекты создания оборудования для ПЦР-диагностики, введено понятие коэффициента «качества» ПЦР, предложено уточненное описание процесса наработки выбранных фрагментов исходной ДНК при проведении ПЦР, дано обоснование необходимости повышения скорости нагрева/охлаждения реакционной смеси в переходных этапах реализации температурного протокола и точности поддержания температуры на этапах стабилизации. Проведено исследование теплового состояния реакционной смеси в ходе ПЦР. Впервые дана оценка влияния тепловых эффектов, обусловленных ходом ПЦР на исполнение заданного температурного протокола. Установлено, что теплота (2,0-10"5 .1,0-10"4 )Дж, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций при матричном синтезе цепей и плавлении ДНК не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

В третьей главе проведен подробный анализ конструктивных схем оборудования для ПЦР-диагностики, выявлены классификационные признаки и синтезирована обобщенная структурная схема. Разработана концептуальная модель расчета оборудования для ПЦР-диагностики.

Четвертая глава посвящена разработке теории рабочих процессов и созданию на базе концептуальной модели методики расчета твердотельных амплификаторов ДНК. Разработаны расчетная схема, математическая модель и методика расчета твердотельных амплификаторов ДНК. Получено нестационарное уравнение тепловых источников в термоэлектрических элементах.

В пятой главе проведены численные исследования твердотельных тепловых амплификаторов ДНК. Исследованы физические факторы, влияющие на воспроизводимость результатов амплификации ДНК. Проведены численные исследования однородности теплового поля рабочего тела. Проведены численные исследования твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье и твердотельного комбинированного электро-пневматического амлификатора ДНК для проведения ПНР в биочипах.

Шестая глава посвящена созданию теории рабочих процессов и разработке методики расчета пневматических амплификаторов ДНК. Разработаны расчетная схема, математическая модель и методика расчета. Проведены численные и экспериментальные исследования.

Седьмая глава посвящена повышению эффективности и надежности твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье. Выявлены основные направления и разработаны методы повышением эффективности и надежности амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье.

Восьмая глава посвящена разработке, созданию и клиническим испытаниям амплификаторов ДНК. На основе предложенной в работе общей классификации и обобщенной структурной схемы синтезированы частные структурные схемы семейства твердотельных и пневматических устройств. На их базе и с учетом результатов численных исследований разработаны конструкции и созданы новые амплификаторы ДНК различного назначения. Амплификаторы ДНК «Циклотемп 107», АНК16 и АНК 32 прошли приемочно-технические и клинические испытания, рекомендованы для применения в медицинской практике и внесены в государственный Реестр изделий медицинского назначения.

Заключение диссертации по теме «Приборы, системы и изделия медицинского назначения», Чернышев, Андрей Владимирович

Основные результаты и выводы

1. Выделены основные классификационные признаки, на которых предложена общая классификация, позволяющая синтезировать новые структурные и конструктивные схемы амплификаторов ДНК.

2. Проведено исследование взаимодействия реакционной смеси и теплового блока амплификаторов ДНК. Показано, что с теплофизической точки зрения для получения максимального выхода ПЦР-продукта следует снижать объем реакционной смеси, интенсифицировать процесс отдачи тепла от рабочей среды к реакционной смеси и адаптировать температурный протокол процесса ПЦР для каждого типа амплификатора ДНК. Установлено, что одной из основных причин пониженной воспроизводимости результатов проведения ПЦР является неоднородность теплового поля рабочего тела в переходных режимах работы амплификаторов ДНК. Впервые произведен расчет энергетического воздействия химических и физико-химических реакций в ходе ПЦР на тепловое состояние реакционной смеси. Установлено, что теплота, выделяемая или поглощаемая в процессе химических и физико-химических реакций (2,0-1 О*5 .1,0Т0*4 )Дж не вызывает существенного изменения теплового состояния реакционной смеси.

3. Разработана теория рабочих процессов, предложена методология расчета и создания оборудования для ПЦР-диагностики, основу которых составил системный подход к исследованию параметров амплификаторов ДНК.

4. Создана обобщенная структурная схема, определяющая характер взаимодействия компонентов теплового блока. На основе обобщенной структурной схемы построена концептуальная модель расчета процессов тепло-массопереноса, которая позволяет формировать единый подход к созданию математических моделей амплификаторов ДНК, базирующихся на различных принципах действия.

5. На базе концептуальной модели расчета создана математическая модель расчета твердотельных амплификаторов ДНК, включающая общую расчетную схему, математическую модель твердотельных амплификаторов ДНК, математическую модель расчета термоэлектрических преобразователей энергии на основе законов неравновесной термодинамики. Разработаны методики и алгоритмы расчета твердотельных амплификаторов ДНК.

6. Проведены комплексные численные исследования влияния конструктивных и функциональных параметров на основные характеристики тепловых блоков амплификаторов ДНК. Проведены численные исследования различных вариантов тепловых блоков твердотельных амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов Пельтье и твердотельного комбинированного электромеханического амплификатора ДНК, в результате которых получены общие рекомендации по проектированию тепловых блоков твердотельных амплификаторов ДНК, направленные на повышение скорости нагрева/охлаждения и снижения разброса температуры рабочего тела.

7. На основе обобщенной структурной схемы создана математическая модель пневматического амплификатора ДНК. В основу модели заложены законы классической равновесной термодинамики для открытых систем. Созданы метод и алгоритм численного расчета пневматического амплификатора ДНК. Сопоставление результатов теоретических и экспериментальных исследований температур реакционной смеси и рабочего тела показали, что отклонение результатов расчета относительно данных, полученных опытным путем, не превышает (5. 10) %. Подтверждено, что в пневматических амплификаторах ДНК реально достичь скорости изменения температуры рабочего тела (5. 10) К/с в диапазоне от 298 К до 363 К.

8. Проведены исследования работы амплификаторов ДНК на основе термоэлектрических элементов, позволяющая в 30 . 40 раз повысить ресурс их работы. Предложена комбинированная электро-термоэлектрическая схема блока нагрева/охлаждения, позволяющая отказаться от циклического режима работы термоэлектрических элементов. Численные исследования на базе созданной математической модели подтвердили работоспособность данной схемы. Амплификаторы ДНК, созданные на основе предложенных решений, находятся более пяти лет в реальной эксплуатации без замены термоэлектрических элементов, что на практике подтверждает решение проблемы повышения надежности и ресурса данных изделий.

9. Основные положения данной диссертации внедрены в практику создания и проектирования оборудования для ПЦР - диагностики в ООО «НПФ СТМ-Ц», г. Москва, ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск, ОАО «Приборный завод «Сигнал», г. Обнинск, Институте аналитического приборостроения (ИАнП) РАН, г. Санкт-Петербург.

10. На базе основных положений данной диссертации проведены исследования, разработаны и производятся следующие виды оборудования:

- амплификаторы ДНК: «Циклотемп-4», «Циклотемп-106» и «Циклотемп-107». Амплификатор ДНК «Циклотем-107» рекомендован Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ к серийному производству и применению в медицинской практике и внесен в Реестр изделий медицинского назначения. Совместное серийное производство амплификаторов ДЖ «Циклотемп-107» организовано ОАО «Приборный завод Сигнал» и ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск;

- анализаторы нуклеиновых кислот АНК 16, АЖ32 - амплификаторы ДНК для количественного анализа (разработаны в ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург совместно с МГТУ им. Н.Э. Баумана), рекомендованы к серийному производству и применению в медицинской практике и внесены в Реестр изделий медицинского назначения. Серийное производство анализаторов нуклеиновых кислот АЖ организовано ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург совместно с ОАО «Приборный завод «Сигнал» и ЗАО «Ресурс-Прибор», г. Обнинск;

- амплификаторы ДНК для проведения ПЦР в биологических микрочипах. Данный тип устройств, впервые создан в России и является одним из первых в мировой практике;

- тепловой блок пневматического малогабаритного мобильного амплификатора ДНК. На базе данного устройства в ИАнП РАН, г. Санкт-Петербург проводится разработка малогабаритного экспресс-анализатора на присутствие биологических агентов непосредственно в зоне предполагаемого воздействия.

Список литературы диссертационного исследования доктор технических наук Чернышев, Андрей Владимирович, 2006 год

1. Molecular Diagnostics / Edited by George P. Patrinos, Wilhelm Ansorge. -Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo: Elsevier Academic Press, 2005. -461 p.

2. Ярышев H.A., Андреева Л.Б. Тепловой расчет термостатов. JL: Энерго-атомиздат, 1984. - 176 с.

3. Зарубин B.C. Температурные поля в конструкции летательных аппаратов. М.: Машиностроение, 1978. - 155 с.

4. Белова О.В. Разработка метода расчета и исследование прецизионных устройств нагрева и охлаждения. Дисс. . канд. техн. наук (05.04.06). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2000. -104 с.

5. Пат. 5656493 (США), МКИ5 С12М 3/02. System for automated performance of the polymerase chain reaction / Kary B. Mullis, Larry Johnson, Richard A. Leath etc. (США); The Perkin-Elmer Corporation (США). № 199505. Заявлено 18.03.94. Опубл. 12.08.97.

6. Пат. 5795547 (США). МКИ6 B01L 9/00. Thermal Cycler / Rolf Mozer, Lukas Birrer (Швейцария); Roche Diagnostic Systems. Inc. (США). № 735943. Заявлено 23.10.96. Опубл. 18.09.98.

7. Пат. 5229580 (США), МКИ5 Н01В 3/02. Block for holding multiple sample tubes for automatic temperature control / Michael J. Chioniere (США); Automated Biosystems, Inc. (США). № 895943. Заявлено 09.06.92. Опубл. 20.07.93.

8. Patent 5616301 (США), МКИ6 ВО 1L 9/00. Thermal Cycler / Rolf Mozer, Lukas Birrer (Швейцария); Hoffman La Roche Inc. (США). № 301932. Заявлено0709.94. Опубл. 01.04.97.

9. Пат. 6015534 (США), МКИ7 B01L 3/00. PCR Sample Tube / John Girdner Afwood (США); The Perkin-Elmer Corporation (США). № 08/422740. Заявлено1404.95. Опубл. 18.01.2000.

10. Пат. 5942432 (США), МКИ5 С12М 3/00. Apparatus for fluid impingement thermal cycler / Douglas H. Smith, John Shigeura, Timothy M. Woudenberg (США); The Perkin-Elmer Corporation (США). № 08/946512. Заявлено 07.10.97. Опубл. 24.09.99.

11. Пат. 5187084 (США), МКИ5 С12Р 19/34. Automatic air temperature cycler and method of use in polymerase chain reaction / G. Anders Hallsby (США); The Dow Chemical Company (США). № 542384. Заявлено 22.06.90. Опубл. 16.02.93.

12. Пат. 5455175 (США), МКИ5 С12М 1/34. Rapid thermal cycling device / Carl T. Wittwer, David R. Hillyrd, Kirk M. Ririe (США); University of Utah Research Foundation (США). № 179969. Заявлено 10.01.94. Опубл. 03.10.95.

13. Пат. 5123477 (США), МКИ5 F25D 29/00. Thermal reactor for biotechno-logical processes / Jonathan M. Tyler (Канада); Unisys Corporation (Канада). № 346412. Заявлено 02.05.89. Опубл. 23.08.92.

14. Пат. 4028891 (Германия), МКИ5 В 01 L 7/00. Vorrichtung zur Behandlung von Proben mit vorgegebenen Temperatur-Zeit-Profilen /Gebr. Leibisch, 4800 Bielefeld (Германия). №4028891.9-52; Заявлено 12.09.90; Опубл. 03.09.92.

15. Пат. 6054263 (США), МКИ7 С12М 3/00. Thermal cycler including a temperature gradient block / John Lewis Danssaert, Robert James Shopes, Daniel Davis Shoemaker (США); Stratagene (США). № 09/115175; Заявлено 14.07.98; Опубл. 25.08.2000.

16. Пат. 6197572 (США), МКИ7 С12М 1/40. Thermal Cycler Having Automatically Positionable Lid /Rolf Schnecheli (Швейцария); Roche Diagnostic Corporation (Швейцария). № 09/302713; Заявлено 30.04.99; Опубл. 06.03.2001.

17. Пат. 347478 (США), МКПО D24/216. Laboratory instrument for handling biomolecular samples / Arthur J. Pinkney (Великобритания); Hybaid Ltd. (Великобритания). № 874576; Заявлено 27.04.92; Опубл. 31.05.94.

18. Пат. 5601141 (США), МКИ 6 F24D 29/00. High Throughput Thermal Cycler / Steven J. Gordon, Anthony J. Christopher (США); Intelligent Automation Systems, Inc. (США). № 959775; Заявлено 13.10.92; Опубл. 11.02.97.

19. Беляев H.M., Рядно A.A. Методы нестационарной теплопроводности: Учебное пособие для ВУЗОВ. М.: Высшая школа, 1978. - 328 с.

20. Тепло- и массообмен. Технический эксперимент: Справочник /Е.В. Аметистов, В.А. Григорьев, Б.Т. Емцов и др.; Под общ. ред. В.А. Григорьева, В.М. Зорина. М.: Энергоиздат, 1982. - 512 с.

21. Физические величины: Справочник / А.П. Бичев, Н.А. Бабушкина, A.M. Братковский и др.; Под ред. И.С. Григорьева, Е.З. Михайлова. М.; Энергоатомиздат, 1991. - 1232 с.

22. Принципы анализа и синтеза биотехнических систем: Учеб. Пособие / В.И. Лощилов, С.И.Щукин, В.И.Иванов; Под ред. В.И. Лощилова. М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1988. - 64 с.

23. А.с. 166933 (СССР). Способ термостатирования и устройство для его осуществления / Зорин И.В. // Кл.17с, 3/08. Б.И.- 1964.- №24.

24. А.с. 219258 (СССР). Устройство для термостатирования холодных спаев пермопар / Зорин И.В. //Кл.42с, 12/01. «Изобретения. Промышленные образцы. Товарные знаки».- 1968.- №18.

25. Muller Н. Der Einfluss pulsierenden Ggleichstroms auf das Betreib-sverhalten thermoelektrisher Kuhlgerate. 1967. - B. 41. - №3. - S. 236-240 (РЖЭЭ, 1967, 7nl3).

26. Stoesker W.F., Chaddock I.B. Trancient performance of a thermoelectric refrigerator under step-currant control // ASHRAE Journal. 1963. - V. 5. - № 9. H. 61-67. (РЖЭЭ, 1964,4п24; РЖХ. 1964. 4.47.317).

27. Мартыновский B.C., Наер В.А. Исследование полупроводниковых вариантов тепловых потоков // Теплоэнергетика. 1962. -№ 6. - С. 68-71.

28. Мартыновский B.C., Семенюк В.А., Томашевич М.Н. Оптимизация конструкции термоэлектрических охлаждающих батарей // Холодильная техника. 1970.-№ 2. - С. 31-35.

29. Иорданишвили Е.К., Малкович Б.Е.-Ш. О возможности управления температурой холодного спая термоэлемента // Вопр. радиоэлектрон. Сер. ТРТО.- 1971.-№2.-С. 74-81.

30. Никитин Ю.Ф., Рыков Н.А., Чернышев А.В. Основы расчета нестационарных процессов в теплоэлектрических приводах исполнительных устройств пневматических и вакуумных систем // Труды МВТУ им. Н.Э. Баумана. 1978. - № 269, Вып.4. - С. 22-23.

31. Никитин Ю.Ф., Рыков Н.А., Чернышев А.В. Исполнительные устройства одноразового действия: Учебное пособие М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1978.-31 с.

32. Теплотехнический справочник / Под общ. ред. В.Н. Юренева, П.Д. Лебедева. Т.1. - М.: Энергия, 1975. - 744 е., Т.2. - М.: Энергия, 1976. — 896 с.

33. Исаченко В.П., Осипова В.А., Сукомел А.С. Теплопередача. М.: Энергия, 1981.-416 с.

34. Теплотехника / Под общ. ред. А.П. Баскакова. М.: Энергоиздат, 1982. -261 с.

35. Зорин И.В., Зорина З.Я. Термоэлектрические холодильники и генераторы. Л.: Энергия, 1973. - 136 с.

36. Тайц Д.А., Карпов В.Г. Расчет термоэлектрических охлаждающих термостатов со статическим регулятором температуры // Холодильная техника. 1967.-№6. -С. 31-33.

37. Тайц Д.А. Разработка и исследование тепловых схем термоэлектрических охлаждающих термостатов: Дисс. . канд. техн. наук. Одесса, Одесский технологический институт пищевой и холодильной промышленности, 1968.- 143 с.

38. Иоффе А.Ф. Полупроводниковые термоэлементы. М., JL: Изд-во АН СССР, 1956.- 188 с.

39. Термоэлектрическое охлаждение / А.Ф. Иоффе, JT.C. Стильбанс, Е.К. Иорданишвили и др. М., Л.: Изд-во АН СССР, 1956. - 108 с.

40. Анатычук Л.И., Семенюк В.А. Оптимальное управление свойствами термоэлектрических материалов и приборов. Черновцы: Изд-во «ПРУТ», 1992.-264 с.

41. Котырло Г.К., Лобунец Ю.Н. Расчет и конструирование термоэлектрических генераторов и тепловых насосов: Справочник. Киев: Наукова думка, 1980.-327 с.

42. Анатычук Л.И. Термоэлементы и термоэлектрические устройства: Справочник. Киев: Наукова думка, 1979. - 740 с.

43. Бурштейн А.И. Физические основы расчета полупроводниковых термоэлектрических устройств. М.: Физматгиз, 1962. - 135 с.

44. Каганов М.А., Привин М.Р. Термоэлектрические тепловые насосы. Л.: Энергия, 1970.- 150 с.

45. Термоэлектрические охладители / Э.М. Лукишер, А.Л. Вайнер, М.Н. Сомкин и др. М.: Радио и связь, 1983. - 176 с.

46. Иорданишвили Е.К., Бабин В.П. Нестационарные процессы в термоэлектрических и термомагнитных системах преобразования энергии. М.: Наука, 1983.-320 с.

47. Ингберман М.И., Фромберг Э.М., Грабой Л.П. Термостатирование в технике связи. М.: Связь, 1979. - 144 с.

48. Каганов М.А., Ривкин А.С. Воспроизведение заданного временного хода температуры с помощью полупроводниковых элементов //ИФЖ. 1973. -Вып. 24, №5. - С. 902-907.

49. Гроот С. де, Мазур П. Неравновесная термодинамика. М.: Мир, 1964.- 456 с.

50. Осипов Э.В. Твердотельная криогеника. Киев: Наукова думка, 1977. -236 с.

51. Кошляков Н.С., Глинер Э.Б., Смирнов М.М. Основные дифференциальные уравнения математической физики. М.: Физматгиз, 1962. - 767 с.

52. Лыков А.В. Некоторые аналитические методы решения задач нестационарной теплопроводности / Изв. АН СССР, Энергетика и транспорт. -1969.-№2.

53. Тихонов А.Н. Об остывании тел при лучеиспускании, следующем закону Стефана-Больцмана / Изв. АН СССР. География и геофизика. 1937. -№3.-С. 461-479.

54. Видин Ю.В., Иванов В.В. Температурное поле в неограниченной пластине, нагреваемой радиацией и конвекцией одновременно / Изв. МВО СССР. Авиационная техника. 1965. - №4. - С. 56-64.

55. Иванов В.В. Исследование нестационарной теплопроводности в условиях аэродинамического нагрева //Вопросы теории тепло- и массообмена: Сб. научных трудов / Минск, 1970. С. 231 -244.

56. Коздоба Л.А., Чумаков В.Л. Решение нелинейных задач нестационарной теплопроводности / Теплофизика высоких температур. 1970. - Т. VII, №5.-С. 276-287.

57. Федоткин И.М., Айзен A.M. Асимтотические методы в задачах тепло-массопереноса. Киев: Виша школа, 1975. - 198 с.

58. Pafalski P., Zyszkowski W. Lagrangian approach to the поп-linear boundary heat transfer problem // AIAA Journal. 1968. -V. 6. - № 8. - P. 1143-1162.

59. Vujanovic В., Djukic Dj. On one variational principle of Hamilton's type for non-linear heat transfer problem // International J. Heat and Mass transfer. 1972.- V.15.-№5.-C. 1111-1123.

60. Патанкар С. В. Численные методы решения задач теплообмена и динамики жидкости. М.: Энергоатомиздат, 1984. - 152 с.

61. Годунов С.К., Рябенький B.C. Разностные схемы (введение в теорию): Учебное пособие. М.: Наука, Главная редакция физико-математической литературы, 1977. - 439 с.

62. Скибин А.П. Вариант конечно-элементного метода контрольного объема для решения задач тепломассообмена. Дисс. . канд. техн. наук (05.14.05). - М.: Моск. гос. техн. ун-т им. Н.Э. Баумана, 1993. - 222 с.

63. Калиткин Н.Н. Численные методы. М.: Наука, Главная редакция физико-математической литературы, 1978. - 512 с.

64. Ши Д. Численные методы в задачах теплообмена: Пер. с англ. / Под ред. В.И. Полежаева. М.: Мир, 1988. - 250 с.

65. Скибин А.П., Червяков В.В., Югов В.П. Метод конечных элементов, основанный на интегрировании по контрольному объему, для двумерных нестационарных эллиптических задач //Известия АН. Энергетика. -1995. №1. -С. 142-151.

66. Зенкевич О. К. Метод конечных элементов в технике: Пер. с англ. / Под ред. Б.Е. Победри. М.: Мир, 1975. - 541 с.

67. Норри Д., де Фриз Ж. Введение в метод конечных элементов: Пер. с англ. / Под ред. Г.И. Марчука М.: Мир, 1981. - 304 с.

68. Самарский А.А. Введение в численные методы. М.: Наука, 1987. -459 с.

69. Чернышев А.В., Белова О.В. Разработка, расчет и проектирование пневмоэлектромеханического и электровакуумного оборудования. Термоста-тирующие устройства: Мет. ук. М.: Изд-во МГТУ, 1997. - 16 с.

70. Чернышев А.В., Белова О.В. Метод решения сопряженной задачи конвективного теплообмена на примере термостатирующего устройства //Вестник МГТУ им. Н.Э. Баумана. Серия Машиностроение. 1998. - №4. -С. 77-87.

71. Чернышев А.В. Основы теории расчета электропневмомеханического оборудования для анализа ДНК // Научное приборостроение. 2002. - Том 12, № 1.-С. 53-65.

72. Baliga B.R., Patankar S.V. A new finite element formulation for convection-diffusion problems // Numerical Heat Transfer. 1980. - V.3. - P. 393-409.

73. Червяков B.B. Исследование теплофизических свойств углерод-углеродных композиционных материалов в условиях высоких температур; Дисс. . канд. техн. наук (01.04.14). М.: МГТУ им. Н.Э.Баумана, 1993. -102 с.

74. Кавтарадзе Р.З. Локальный теплообмен в камерах сгорания дизелей; Дисс. . докт. техн. наук (05.04.02). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1991. — 361 с.

75. Элементы систем автоматизированного проектирования ДВС. Алгоритмы прикладных программ / Под общ. ред. P.M. Петриченко. Л.: Машиностроение, 1990. - 328 с.

76. Флетчер К. Численные методы на основе метода Галеркина: Пер. с англ. Л.В. Соколовский / Под ред. В.П. Шидловского. М.: Мир, 1988. -352 с.

77. Сегерлинд Л. Применение метода конечных элементов: Пер. с англ. А.А. Шестакова / Под ред. Б.Е. Победри. М.: Мир, 1979. - 392 с.

78. Prakash С., Patankar S.V. A Control-Volume Finite-Element Method for Predicting Flow and Heat Transfer in Ducts of Arbitrary Cross Sections. Part I: Discription of the Method //Numerical Heat Transfer. 1987. - Vol. 12. -P. 389-412.

79. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain-reaction / K. Mullis, F. Faloona, S. Schart etc. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986.-V. 51.-P. 263.

80. Mullis K., Faloona F. Specific syntesis of DNA in vitro by polymerase catalysed chain-reaction // Meth. Enzymol. 1987. - № 155. - P. 335-350.

81. Кэри Б. Мюллис. Необычная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция // В мире науки. 1990. - №6. - С. 26-34.

82. Fitch J. Patrick. An engineering introduction to biotechnology / by J. Patrick Fitch p. cm. // Published by SPIE The International Society for Optical Engineering. Tutorial texts in optical engineering. - 2002. - V. 5 -№ 5.-127 p.

83. PCR technology // by Ehrlich H.A., ed. N.Y.: Stokton Press, 1989. -240 p.

84. ДНК-типирование в судебной медицине / Ю.В. Кухарьков, Г.Ф. Пучков, С.Р. Боровко, Н.А. Миклевич //Мн.: 00 «БелАКК», 2003. -93 с.

85. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология. 1991. - Том 25. - Вып. 4. - С. 926-936.

86. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Пособие для студентов биологических факультетов. М.: МЦНМО, 2002. -248 с.

87. Чернышев А.В., Друца B.JI. Проблемы создания оборудования для медицинской ПЦР-диагностики // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.-2004.-№12. С. 18.

88. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. -М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

89. Чернышев А.В., Бакай Д.А. К вопросу исследования однородности теплового поля пластины-держателя твердотельного амплификатора ДНК / Научное приборостроение. 2004. - Том. 14, №4 - С. 10-19.

90. Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа: Учеб. для вузов. М.: Дрофа, 2003.-840 с.

91. Кюрджиев Ю.В. Моделирование рабочих процессов, разработка и модернизация пневматических систем и агрегатов с учетом образования конденсата рабочего тела; Дисс. . канд. техн. наук (05.04.06). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2004. - 163 с.

92. Моделирование теплового состояния микропробирок с образцами в ходе полимеразной цепной реакции / А.В. Чернышев, Д.А. Бакай, В.Е. Курочкин, В.Н. Соколов, Е.Ю. Скоблилов // Научное приборостроение. 2005. -Том 15, №3. - С. 54-62.

93. Патанкар С. В. Численное решение задач теплопроводности и конвективного теплообмена при течении в каналах: Пер. с англ. Е.В. Калабина. -М.: Издательство МЭИ, 2003. 312 с.

94. Nucleic acids in chemistry and biology / Edited by G. Michael Blackburg, Michael J. Gait. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press, 1996. -378 p.

95. Rosing J., Slater E.C. The value of for hydrolysis of ATP / Biohim. Biofis. Acta. 1972. -V. 267. - P. 275-290.

96. Справочник биохимика / P. Досон, Д. Элиот, У.Элиот, К. Джонс: Пер. с англ. B.J1. Друца, О.Н. Королева-М.: Мир, 1991.-544 с.110. http://www.biochem.roche.com/lightcycler/.111. http://www.corbetresearch.com/.

97. Зысина-Моложен Jl. М., Зысин J1.B., Поляк М.П. Теплообмен в турбо-машинах. Л.: Машиностроение, 1974. - 336 с.

98. Абрамович Г.Н. Прикладная газовая динамика. М.: Наука, 1976. -888 с.

99. Хейвуд Р.У. Термодинамика равновесных процессов. Руководство для инженеров и научных работников: Пер. с англ. М.: Мир, 1983. - 304 с.

100. Петухов Б.С., Генин Л.Г., Ковалев С.А. Теплообмен в ядерных энергетических установках. М.: Энергоатомиздат, 1986. - 472 с.

101. Кочубей А.А., Рядно А.А. Численное моделирование процессов конвективного переноса на основе метода конечных элементов. Днепропетровск: Издательство ДГУ, 1991. - 223 с.

102. Макаров Д.В. Численное моделирование течения и теплообмена в системе компланарных каналов; Дисс. . канд. техн. наук (05.07.05). М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1995. - 115 с.

103. Белова О.В., Чернышев А.В. Метод решения сопряженной задачи конвективного теплообмена на примере термостатирующего устройства // Вестник МГТУ. Сер. Машиностроение. 1998. - № 4. - С. 77-87.

104. Коленко Е.А. Термоэлектрические охлаждающие приборы. M.-JL: Изд-во АН СССР, 1963.- 190 с.

105. Пехович А.И., Жидких В.М. Расчеты теплового режима твердых тел. -Л.: Энергия, 1976.-352 с.

106. Кит Г.С., Побережный О.В. Нестационарные процессы в телах с дефектами типа трещин. Киев: Наукова думка, 1992.-216 с.

107. Дульнев Г.Н., Заричняк Ю.П. Теплопроводность смесей и композиционных материалов: Справочная книга. Л.: Энергия, 1974. - 264 с.126. http://polikor/net/podi/htm/.127. http://www.kyocera.coM.jp/.

108. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод / Ю.П. Лысов, В. Флорентьев, А. Хорлин,

109. К. Храпко, В. Шик, А.Д. Мирзабеков //Докл. Акад. Наук СССР. 1988. -303.-С. 1508-1511.

110. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by co-polymerization / V. Vasiliskov, E. Timofeev, S. Surzhikov, A. Drobyshev, V. Shick, A. Mirzabekov // BioTechnique. 1999. - V. 27. - P. 592-606.

111. MAGlChip: Properties and applications in genomic studies / A. Mirzabekov, A. Kolchinsky // Genomic Technologies: Present and Future / Eds. D. J. Galas & S. J. McCormack. Norfolk: Horizon Scientific Press. - 2002. - Vol. 1, Ch 6. -P. 163-196.

112. Automated Polymerase Chain Reaction In Capillary Tubes With Hot Air /С.Т. Wittwer et al. //Nucleic Acids research. 1989. - V. 17. - №11 -P. 804-809.

113. Hoeskstra M.F. Use of a gas chromatograph oven for DNA amplification by the polymerase chain reaction //Biotechniques. 1988. - №6. - V. 10. -P. 932-936.

114. Heat Transfer Characteristics for Jet Array Impingement with initial Cross-flow / Florschuetz. L.W. et al. //Journal of Heat Transfer. 1984. - 106. -P. 34-41.

115. Hamadah T.T. Air jet impingement cooling of an array of simulated electronics packages / Heat Transfer in electronics. 1989. -№ 111. - P. 97-105.

116. Никитин Ю.Ф., Терентьев О.Д., Чернышев A.B. Моделирование исполнительных устройств систем управления //Известия Вузов. 1985. -№11. -С. 48-50.

117. Кокорев М.Н. Вопросы теории и расчета пневмопривода / М.Н. Кокорев, А.А. Рязанов, А.В. Чернышев; МВТУ им. Н.Э. Баумана. М., 1984. - 48 с. - Деп. в ЦИНТИхимнефтемаш 06.06.84, № 1120.

118. Мамонтов, М.А. Тепломеханика тела переменной массы основа теории пневмогазоприводов / М.А. Мамонтов // Пневматические приводы и системы управления: Сб. науч. тр. - М.: Наука, 1971. - С. 8-18.

119. МанькоП.С. Исследование, создание и оптимизация быстродействующего электропневматического клапана; Дисс. . канд. техн. наук (05.04.06). -М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1987. 145 с.

120. Попов Д.Н. Механика гидро- и пневмоприводов: Учебн. для вузов. -М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2002. 320 с.

121. Роуч П. Вычислительная гидродинамика: Пер. с англ. В.А. Гущина, В.Я. Митницкого / Под ред. П.И. Чушкина. М.: Мир, 1980. - 612 с.

122. Беляев Н.М. Расчет пневмогидравлических систем ракет. М.: Машиностроение, 1983.-219 с.

123. Бэр Г.Д. Техническая термодинамика. Теоретические основы и технические приложения: Пер. с англ. М.: Мир, 1977. - 518 с.

124. Техническая термодинамика: Учебник для вузов /Под ред. В.И. Крутова.-М.: Высшая школа, 1981.-439 с.

125. Техническая термодинамика: Учебник для вузов /В.А.Кирилин,

126. B.В. Сычев, А.Е. Шейндлин. М.: Энергоатомиздат, 1983. -416 с.

127. Глаголев К.В., Морозов А.Н. Физическая термодинамика: Учеб. пособие. М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2004. - 272 с.

128. Разработка математической модели пневматической системы термостабилизации / А.В. Чернышев, К.Е. Демихов, А.В. Полынков и др. //Научное приборостроение.-2006. Том 16. -№ 1. - С. 53-65.

129. Пневмогидравлические системы. Расчет и проектирование: Учебн. пос. для технических вузов / Н.М. Беляев, Е.И. Уваров, Ю.М. Степанчук; Под ред. Н.М. Беляева. М.: Высш. шк., 1988. - 271 с.

130. Вукалович М.П., Новиков И.И. Термодинамика. М.: Машиностроение, 1972.-670 с.

131. Герц Е.В., Крейнин Г.В. Расчет пневмоприводов: Справочное пособие. М.: Машиностроение, 1975. - 272 с.

132. Лыков А.В. Тепломассообмен: Справочник. М.: Энергия, 1978. -480 с.

133. Романенко Н.Т. Агрегаты пневматических систем летательных аппаратов. М.: Машиностроение, 1976. - 98 с.158. http://www.ferrotec-america.com/.

134. Пат. 2234765 (Россия), МКИ7 H01L 35/32. Термоэлектрический модуль /В.А. Желязняков (Россия). №2234765. Заявлено 22.10.2003; Опубл. 08.08.2006. Бюл. №4.-2 с.

135. Пат. 2117362 (Россия), МКИ6 H01L 35/28. Термоэлектрический охлаждающий модуль /В.Т. Каменский (Россия) -№2117362. Заявлено 12.03.1998; Опубл. 08.10.1998. Бюл. №4.-2 с.

136. Пат. 10289 (Россия), МКИ6 H01L 35/28. Термоэлектрический охлаждающий модуль / В.Т.Каменский (Россия) № 10289. Заявлено 16.12.1998; Опубл. 08.10.1998. Бюл. №4.-2 с.162. http://www.sctbnord.com/

137. Чернышев А.В, Повышение эффективности программируемых термостатирующих устройств на основе термоэлектрических микроохладителей // Конверсия в машиностроении. 2002. - № 6. - С. 134-139.

138. Чернышев А.В. Разработка и исследование электропневмовакуумного лабораторного и диагностического оборудования // Научно-техническая конференция «165 лет МГТУ им. Н.Э. Баумана»: Тезисы докладов. М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 1995. - С. 108.

139. Чернышев А.В., Прокофьев А.В. Комплекс лабораторного оборудования для ПЦР анализа // Биотехнология: Каталог Международной выставки; раздел Российские технологии (Ганновер: 18-21 октября) -М.: Министерство науки РФ, 1997.- 132 с.

140. Приборы для секвенирования и анализа ДНК. Отчет о НИОКР (за-ключ.) / МГТУ; Руководитель Чернышев А.В. Гос. контракт 6/1; № ГР 01.200.117184; Инв. № 02200108561.- М., 2000. - 271 с.

141. Пат. 3616264 (США), МКИ6 С12К 1/10. Temperature-controlled discrete sample analyzer / Robert A. Ray, Jams C. Sternberg (США); Beckman instruments, Inc. (США). № 837697. Заявлено 30.06.69.

142. Пат. 43871 (Россия), МКИ С12М 1/34. Программируемый термостат. /А.В.Чернышев, А.В. Полынков (Россия) №43871. Заявлено 24.08.2004; Опубл. 10.02.2005. Бюл. №4.-2 с.

143. Reducing the Threat of Biological Weapons //Science and technology review. http://www.llnl.gov/str/.

144. Uncovering Bioterrorism //Science and technology review http://www.llnl.gov/str/.

145. Rapid field detection of biological agents // Science and technology review -http ://w w w. llnl .gov/str/.

146. Пат. 6699713 (США), МКИ7 C12M 1/34. Polymerase chain reaction system / William L Benett, James B. Richards, Paul L. Stratton et. al. (США); The Regents of the University of California (США). № 09/752794. Заявлено 29.12.2000. Опубл. 02.03.2004.

147. Чернышев А.В. Общая концепция создания электропнемо-механического оборудования для проведения полимеразной цепной реакции

148. Производство амплификаторов ДНК «Циклотемп-107» передано на приборный завод «Сигнал» г. Обнинск, Калужской области и в ЗАО «Ресурс Прибор». :

149. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

150. РЕГИСТРАЦИОННОЕ УДОСТОВЕРЕНИЕ29/07030601/2868-02 от16 января 20Чода

151. Действительно до26 июня 20У года1. Класс: 2а1. ШШВДВШСКОЕ ИЗДЕЛИЕ

152. Термостат-амплификатор высокоскоростной прецизионный программируемый "Циклотемп-107"нормативный документ ТУ 9452-006-05969415-2001 "Термостат-амплификатор высокоскоростной прецизионный программируемый "Циклотемп-107"организация-разработчик

153. ООО "НПФ СТМ-Ц", Москва ОКПО 05969415предприятие-производитель

154. ООО "НПФ СТМ-Ц", Москва ОКПО 05969415

155. ЗАРЕГИСТРИРОВАНО В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ РЕЕСТР МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

156. Государственная регистрация^дредусматривает периодический контроль производства в целях обеспечения кач^^^Г-эЭ^^^ности, безопасности медицинских изделий,

157. Заместитель Министра VWBlAJf А. В. Катлинскийподпись, печать) (И.О. Фамилия)1. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

158. Акадёши наук, ^ашсг-Пет^б^г^ ОКЙО 04699534дй техники

159. Руководитель Федеральной служб по надзору в сфере адравоохранещ и социального развития 5шш

160. ОКПО 10856015 ОКЮД 33 204, ОКОГУ 49001 ОКАТО 24915000000, ОКФС 42, ОКОПФ 47

161. УТВЕРЖДАЮ: Главный инженер ПЗ«СИГН1. На№1. АКТо внедрении результатов докторской диссертации Чернышева А.В. « Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦР- диагностики»

162. Все перечисленное оборудование рекомендовано Министерством здравоохранения и социального развития РФ к применению в медицинскойщРшяАш щшт efirasBb, г Шдаж ШШ1

163. УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор1. АКТо внедрении результатов докторской диссертации Чернышева А.В.

164. ЗАО «Ресурс Прибор» в своей производственной деятельности использует ряд результатов, полученных А.В. Чернышевым в докторской диссертации «Создание теории рабочих процессов, методов расчета и разработка оборудования для ПЦРдиагностики :

165. Организовано производство тепловых блоков анализатора нуклеиновых кислот АНК-16 и АНК32. Данная продукция выпускается по заказу Института аналитического приборостроения РАН;