Разработка и применение ДНК зонда для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Афонюшкин, Василий Николаевич

• Афонюшкин, Василий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Афонюшкин, Василий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткая характеристика возбудителя.

1.2 Молекулярная биология пестивирусов.

1.3 Ущерб наносимый животноводству, патологии вызываемые вирусом.

1.3.1 Эпизоотология.

1.3.2 Пневмопатогенность.

1.3.3 Патология репродукции.

1.3.4 Иммунные и иммунопатологические изменения вызываемые вирусом.

1.4 Диагностика.

1.4.1 Основные методы диагностики.

1.4.2 Выделение вируса на культуре клеток.

1.4.3 Антигенная вариабельность вируса, проблемы серологической диагностики.

1.4.4 Методы генодиагностики.

1.4.4.1 Реакции ОТ-ПЦР.

1.3.4.2 Молекулярная гибридизация.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и применение ДНК зонда для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота»

Актуальность проблемы. Вирусная диарея крупного рогатого скота (ВД КРС, BVDV), вирусное заболевание, встречающееся среди всех парнокопытных животных (Dufell S.J., Harkness J.W. 1985). Заболевание протекает с развитием респираторного или диарейного синдрома. В патогенезе этой болезни характерным моментом является блокирование иммунореактивности организма в следствии поражения иммунокомпетентных клеток. Под действием такого влияния этот вирус может быть потенциальной причиной или усиливать пато-генность коинфицирующих микроорганизмов: вируса парагриппа-3, вируса инфекционного ринотрахеита КРС, коронаротавирусов, Pasteurella spp, Salmonella spp, Coccidia (Roth J.A.,Kaeberie M.L. 1983).

Заболевание широко распространено во всем мире (McCluckin A.W., et al., 1984; Gilmour J.S., Herring J.A., 1992), а также в России и странах СНГ (С.АЖидков с соавт., 1990; К.П. Юров и соавт., 1999, О.Г. Петрова и соавт., 2002; А.Г. Глотов с соавт., 2002).

Серопозитивность животных, выявляемая в различных иммунологических реакциях, колеблется в пределах 20 - 100%. Это, по-ввдимому зависит от концентрации поголовья, а также от наличия у обследованных животных феномена толерантности.

По данным А.Г.Глотова с соват. (2002) выделение цитопатогенных штаммов в чувствительной культуре клеток составляет не более 8% от числа исследованных проб, при этом вирус выделяется в основном от серонегативных животных при массовых вспышках респираторных и гинекологических заболеваний. Выявляемая сероконверсия, при этом, варьирует от 0 до 20% и может выявляться в сроки, превышающие 3-4 недели. Телята, выделяющие вирус, более подвержены развитию смешанных бронхопневмоний (Roth J.A. et al., 1983).

Вирусологические методики длительны по времени, трудоемки, и, учитывая существование нецитопатогенных штаммов вируса, требуют тщательного подбора всех компонентов реакции, а серологическая диагностика не всегда эффективна в связи с иммунодепрессивным действием вируса и наличием иммунотолерантных животных, все эти факторы значительно затрудняют диагностику заболевания.

По-видимому, оценка иммунного статуса может являться критерием достоверности серологических исследований (Wolfmeier A, Wolf G., et al., 1997). Однако установление факта иммунотолерантности требует выявления вируса у серонегативных животных с помощью вирусовыделения, или методов генодиагностики.

Учитывая, что в патогенезе заболевания играют роль как цитопатогенные, так и нецигопатогенные штаммы вируса, выявление и тех и других, приобретает большое значение.

В настоящее время, наиболее чувствительными и специфичными, для диагностики инфекционных заболеваний, признаны методы, основанные на выявлении в материале нуклеиновых кислот, позволяющие значительно сократить время на постановку диагноза (Phatt В., McGee J.D.,1990)

Разрабатываемые новые методы диагностики (блот РНК-ДНК гибридизация, РНК-ДНК гибридизация in situ и др.) вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота основаны на выявлении геномной РНК ВД КРС с помощью плазмидных ДНК-зондов (Hames B.D., Higgins S.J. 1985; Innis M.A., et al. 1982 ) Однако плазмидные и фаговые ДНК зонды обладают недостаточной специфичностью, в связи с наличием гетерогенной векторной последовательности (Hawhey P.M., Lewys D.A., 1989).

Учитывая этот факт, наиболее перспективными являются ПЦР-зонды не содержащие векторной последовательности (Brounlie J., et al., 1997).

ПЦР система рассчитанная для синтеза зонда должна быть адаптирована для работы только с цигопатогенными штаммами, что исключает риск наработки зонда с матрицы контаминирующего нецитпатогенного штамма.

Цель работы: Сконструировать биотинилированный ПЦР-ДНК-зонд для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и изучить возможности его использования в сочетании с серологическими и иммунологическими методами.

Задачи исследований:

1. Осуществить выбор мишени РНК-ДНК гибридизации путем выравнивания нуклеотидных последовательностей разных штаммов и биотипов вируса вирусной диареи

2. Провести подбор праймеров, анализировав последовательности генома возбудителя вирусной диареи разных штаммов для создания ОТ-ПЦР и на ее основе сконструировать ДНК-зонд для выявления геномной РНК различных биотипов вируса. В лабораторных условиях определить его чувствительность и специфичность.

3. Изучить эффективность использования ПЦР-ДНК-зонда, для индикации вируса вирусной диареи и выявления иммунотолерантных животных, в сочетании с серологическими и иммуноморфологическими методами исследований.

Научная новизна:

1. Разработаны и синтезированы праймеры, позволяющие в отработанном режиме проведения ОТ-ПЦР, осуществить синтез и биотинилирование ДНК зонда. Отработаны основные параметры постановки, изучена специфичность и чувствительность Нозерн-блот гибридизации.

2. Проанализирована возможность использования ДНК-зонда в сочетании с серологическими и иммунологическими методами исследования, для выявления иммунотолерантного к вирусу вирусной диареи крупного рогатого скота.

Теоретическая и практическая значимость работы.

На основе высокотемпературной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) разработана технология изготовления биотинилированного ДНК-зонда, позволяющего выявлять геномную РНК вируса вирусной диареи в биологических объектах.

Разработан комплекс диагностических исследований, включающих серологический, иммуноморфологический и гибридизационный методы, позволяющий повысить эффективность выявления инфицированного вирусом ВД-БС крупного рогатого скота за счет обнаружения иммунотолернатных животных.

Определены перспективы использования молекулярных зондов в выявлении иммунотолерантных к вирусу ВД-БС животных, которые предоставляют новые возможности изучения патогенеза инфекции.

Внедрение. Методические рекомендации "Выделение РНК вируса вирусной диареи и индикация с помощью Нозерн-блот гибридизации.", (утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН, прот. №6, 2002 г. и подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии прот. №2 2002 г.).

Результаты исследований используются в учебном процессе.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на 3-й международной научно-практической конференции: Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии (Алматы, 2000), на 5-й международной научно-практической конференции (Абакан, 2002), на ученых советах ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (2000-2002 гг).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки ПЦР ДНК-зонда для выявления РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 10В страницах, содержит 20 таблиц, 5 фотографий. Состоит из введения, обзора литературы,

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Афонюшкин, Василий Николаевич

4. ВЫВОДЫ

1. Разработанный ПЦР-ДНК-зонд обладает чувствительностью 0,01 ТЦД50/МЛ и позволяет выявлять животных инфицированных вирусом вирусной диареи.

2. Полученный ДНК-зонд специфичен к РНК вируса вирусной диареи и не гибридизировался с нуклеиновыми кислотами, которые могут встречаться в пробах биоматериала от крупного рогатого скота: геномная ДНК и РНК крупного рогатого скота, герпес- и аденовирусы, микроорганизмы рода Mycoplasma, Esherihia, Proteus, Staphylococcus и др.

3. Высокая чувствительность и специфичность зонда достигнута благодаря использованию, специально разработанной для синтеза зонда, ОТ-ПЦР, характеризующейся уникальными праймерами, а также - повышению температурного режима реакции обратной транскрипции до 54 °С, позволяющим добиться специфичного отжига ревертазного праймера.

4. Иммуноморфологическое исследование селезенки, позволило выявить достоверные различия в размерах маргинальной и мантийной зон лимфоидных фолликулов у серонегативных и серопозитивных животных (Р<0.05). Меньшие их размеры у основной массы серонегативных животных обусловлены наличием иммунодепрессивного и толерогенного действия вируса.

5. Методом молекулярной гибридизации подтверждено наличие РНК вируса в пробах селезенок с незначительными размерами мантийной зоны лимфоидных фолликулов у серонегативных животных, что свидетельствует о наличии у них иммунотолерантного состояния.

6. ДНК-зонд в комплексе с серологическими и иммуноморфологическими методами исследованиями, эффективен при выявлении феномена толерантности и оценке функционирования иммунной системы у животных с различной степенью

89 проявления инфекционного процесса ВД-БС КРС, что позволяет использовать его для углубленного изучения патогенеза болезни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Методические рекомендации "Выделение РНК вируса вирусной диареи и индикация с помощью Нозерн-блот гибридизации.", (утвержденные Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН прот. №6, 2002 г. и подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии прот. №2, 2002 г.).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Афонюшкин, Василий Николаевич, 2002 год

1. Альтитейн А.Д. Вирусные инфекции и генетическая инженерия . / Альтитейн А.Д. //.Биотехнология -1987 №3-с. 276-283

2. Амитина Н.Н., Обнаружение и количественное определение кишечных вирусов с помощью детекции вирусных антигенов в зараженных клетках иммунопероксидазным методом, / Амитина Н.Н., Гиневская В.А., Ширман Г .А. // Вопр.Вирусол. 1988. с. 1493-323

3. Беклемишев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция (при инфекциях, инвазиях и аллергиях) / Беклемишев Н.Д.// М.Медицина, 1986. 256Сс.

4. Бадашкеева А.Г., Олиго и полинуклеотидные зонды: метод молекулярной гибридизации. / А.Г.Бадашкеева, Д.Г.Кнорре, // Моллек. Биол. Вып.2,т25 1991 с. 320-326

5. Бочков Н.П., Медицинская генетика / Бочков Н.П., Захаров А.Ф., Иванов В.И. М.:Мир 1984. -368 с.

6. Власов В.В. Эффективность диагностических исследований. / Власов В.В. // М.: Медицина. 1988. -204 с.

7. Гаврилова Е.М. Гомогенный иммуноферментный анализ новое направление иммунохимии / Гаврилова Е.М. //Журн. Всесоюзн. хим. о-ва им Менд.-1982. Т.27.-С. 12-19.

8. Глотов А.Г., Распространение вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота / Глотов А.Г., Петрова О.Г. Глотова Т.Н., Нефедченко А.Ф., Татарчук А.Т.// Ветеринария №3, 2002г., с 17-21.

9. Глотов А.Г. Автореф. дисс. доктора вет. наук.-Новосибирск. 1999. С 2.

10. Ю.Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы: / Под ред. Д.Гловера.1. М.:Мир, 1989.11 .Дейвис К. Анализ генома: методы. Под ред. К.Дейвиса. Пер. с англ. М.: Мир, 1990. -247 с.

11. Ким Т.Г., Изучение условий поддерживания и хранения вируса диареи КРС/ Ким Т.Г., Борисов А.В., Борисов В.В. // Материалы научнопрактической конференции по вопросам ветеринарной вирусологии и биотехнологии г.Владимир. 1987 г. С 23.

12. Куриннов В.В., Современные эпизоотологические, патогенетические и диагностические особенности классической чумы свиней //Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии . / Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Хухоров И.Ю. .-Покров, 1993.

13. Лященко В.А., Механизмы активации иммунокомпетентных клеток. / Лященко В.А., Дроженников В.А., Молотковская И.М. // -М.:Медицина, 1988. 238с.

14. Манько В.М., Иммунокомпетентные клетки (поверхностные структуры и субпопуляционная организация) / Манько В.М., Хаитов Р.М. /Итоги науки и техники. Сер. Иммунология.-М.:ВИНИТИ, 1987.-T.18.C.3-239.

15. Маянский А.Н., Очерки о нейтрофиле и макрофаге. / Маянский А.Н., Маянский Д.Н. -М.: Наука., 1983-254с.

16. Медуницин Н.В. Медиаторы межклеточного иммунитета и клеточного взаимодействия. / Медуницин Н.В., Литвинов В.И., Мороз А.М. .1. М.Медицина. 1980. -263с.

17. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. / Никитин В.М. Кишинев: Штиице,1982. -304с.

18. Мазин А.В. Методы молекулярной и генетической инженерии. / Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. и др -Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990.

19. Кульберг А.Я. Регуляция имунного ответа. / Кульберг А.Я. -М.: Медицина 1986. -224с.

20. Красочно П.А. использование твердофазного ИФА для выявления ig М -антител к вирусу вирусной диареи у крупного рогатого скота. /Красочко П.А., Красочко И.А., Федоров Ю.Н. // Труды Виэв, т. 67. М.: 1989. С. 27-31

21. Петрова О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в Свердловской области./ Петрова О.Г., Татарчук А.Г., Сапожникова Н.Л., Шевченко Н.Н., Хаматов М.Ф., Глотов А.Г.// Ветеринария, -2000 г. -№2,-С. 11-15

22. Пузырев В.П. Патологическая анатомия генома человека. /Пузырев В.П., Степанов В.А. // Новосибирск: Наука.Сиб. предприятие РАН, 1997 с. 186187

23. Таршис М.Г. Математические методы в эпизоотологии. / Таршис М.Г., Константинов В.М. М.: Колос, 1975.175с.

24. Херрингтон С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ Под ред.С.Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир.

25. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие: 4.1. . / Щелкунов С.Н. Изд-во Новосиб. ун-та, 1994.

26. Юров Н.П. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи болезни слизистых крупного рогатого скота в различных регионах России. / Юров Н.П., Шуляк А.Ф., Петрова О.Г.// Труды ВИЭВ. -М.: - 1999 г. С. 25-34

27. Antonaracis S.E. Mapping by seqence homology / Antonaracis S.E. //. Fur. J. Hum. Genet. 1996; 4; 247-249.

28. Ausubel F.M. Current protocols in molecular biology/ Ausubel F.M., Brent R., Kingson R.E., Moore D.D., //. Join Wiley, NewYorK. 1987. p. 678

29. Antoniades, H. M., Simian sarcomaviruses one gene n-sis is derived from the gene (or genes) encoding a platelet-derived growth factor, / Antoniades, H. M., // Science, 221,275, 1982.

30. Arratia, R,., Gordon, L., and Waterman, M. S., An extreme value theory for sequ< matching, / Arratia, R,., Gordon, L., and Waterman, M. S., //Ann. Stat., 14,971, 1985.

31. Altschul, S. F. Trees, stars, and multiple biological sequence alignment, / Altschul, S. F. and Lipman, D., //SIAM J. Appl. Math., in press.

32. Arratia, R. An Erdos-Renyi law with shifts, in Advances in Mathematics, / Arratia, R. and Waterman, M. S., // Vol. 55, Academic Press, New York, 1985,13.

33. Baker J.C. Bovine viral diarhea virus, a rewiew. / Baker J.C. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1987.10; p.1449-1458

34. Berg L.P. Dissections and reconstructions genes and chromosomes (Nobel lecture). / Berg L.P. // Science, 1981;213; 296-303

35. Bishop D.T., The power of identity -by-descent methods for lineage analisis. / Bishop D.T., Williamson J.A. // Am. J. Hum. Genet. 1995; 55; 85-94.

36. Brown D.L., Efficient strategies for genomic searching using the affected-pedigree-memeber method of linkage analisis. / Brown D.L., Gorin M.b., Weeks D.E. // Am.J.Hum.Genet. 1994; 54; 544-552.

37. Bryndfort Т., Comparative genomic hybridisation in clinical cytogenetics. / BryndfortT., KirchoffM.,// Am.J.Hum.Genet. 1995; 57;1211-1220.

38. Backer J.A. Implications of never knowlege in the eradication of hog cholera. / Backer J.A. // Prot. US. Livenstooc sanytari associacion 25-28.1961

39. Backer J.A., A possybility of decreasing the cost of hog cholera eradication with use of heterotypyc BVDV vaccine./ Backer J.A., Coggins F. A // J. Am. Vet. Ass. 155. P.1866-1873.1968.

40. Bieleldt Ohmm H., Demonstration of BVDv in periferial blood mononuclear cells of persistentli infected clinicaly normal cattle./ Bieleldt Ohmm H., Ronsholt F., Bloch B. II J. Am.Vet. assoc. Vol.130, p 380-386. -1957.

41. S.R. Bolin,.Severe clinical disease induced in cattle persistently infected with ncp BVDV by superinfection with citopathic BVDV.

42. Bolin s.K., Effects of bovine viral DV on percentages and absolute numbers of cyrculating В and T-lymphocytes in cattle ./ S.R. Bolin,R.C.Cutlip.// am.J.Vet.Res. Vol.46, p.884-886. 1985

43. Bolin S.R., prevalence of bovine viral diarhea virus genotipes and antibody against those viral genotypes in fetal bovine serum. / Bolin S.R., Ridpath J.F. // J. Vet. Diagn. Invest. 1998; 10 p. 135-139.

44. Baroth,M., Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus / Baroth,M., OrlichJM., Thiel,H.J. and Becher,P. // Virology 278 (2), 456-466 (2000)

45. Browline J., Experimental production of fatal mucosal desease in cattle. / Browline J., Clarke M.C. Hovard C.I. // Vet. Rec. 114; p. 535-536; 1984

46. Chomczinski P., Single step method of RNA-isolation by acid guanidinum tiocianate-phenol-chloroform extraction. / Chomczinski P., Sacchi N. // Anal. Biochem. 162; p. 156-159; 1987.

47. Colett M.S. Molecular cloning and nucleotid seqence of the pestivirus bovine viral diarhea virus. / Colett M.S. Larson R., Gold. C., Strick D., Anderson D.K. // Virology 165; p. 191-199; 1988

48. Carman S., Severe acute bovine viral diarhea in Ontario, 1993-1995. 1998.; / Carman S., van Dreumel Т., Ridpath J. et al.// J. Vet. Diagn. Invest. 1998; 10 p. 27-35

49. Cortese V.S., Clinical and immunologic responses of vaccinated and unvaccinated calves to infection vith virulent tipe-II isolate of bovine viral diarhea virus/ Cortese V.S., WestK.N., HassardL.E. //. J. Am.Vet.Med. Assoc. 213; p. 1312-1319;1991

50. CanizzaroL.A., In situ gibridisation and translocation breakpoint mapping./ Canizzaro L.A., Aronson M.M., Emanuel B.S.// Cytogenet. Cell genet., 1985; 39; 173-178.

51. Collins F.S. Positional cloning moves from preditional to traditional. / Collins F.S. // Nature genet.1995,9; 347-350.

52. Curtis D, A procedure for combining two-point lod-scores into a summary multipoint map/Curtis D, Gurling H. A//. Hem. Hered, 1993; 43; 173-185.

53. Colett M.S., Recent advances in pestivirus research / Colett M.S., //J.Gen.Virology. 1989, Vol. 70. P.32-34.

54. Coria M.F. Specific immune tolerance in an apparent healthy bull persistetly infected with BVDV / Coria M.F. Mc Cluckin A.W Coria M.F. Mc Cluckin A.W. // J.Am.Vet.med. Vol72. P. 449-451. -1978.

55. Carrillo, H. and Lipman, D., The muliple sequence alignment problem in biology, / Carrillo, H. and Lipman, D., // SIAM J. Appl. Math., in press.

56. Dumas, J. P. Efficient algorithms for folding and comparing nucleic acid sequences, / Dumas, J. P. and Ninio, J., // Nucl. Acids Res., 80,197,1982.

57. J. Dahle, Neutralising antibody development following seqential inoculatyon of pigs with strains of bowine viral diarhea virus and hog cholera virus /.// J.Vet.Med. B34. P 729-739. 1987.

58. Erdos, P. On a new law of large numbers, / J. Dahle, B. Liess. // J. Anal. Math., 22, 103, 1970; reprinted in Selected Papers of Alfred Renyi, 1962-1970, Vol. 3, Akademiai Kiado, Budapest, 1976,43.

59. Erkrankugen A. Diarrhoe Fruchtbarkei rungen vercalungen und fruhsterbickneit virologi, serologishe untesuchung erebnisse. / Erkrankugen A. //Terartztl umsch. 1982 2: 100-109.

60. Fritzemier J. Experimental induced "late on set" mucosal disease characteriation of the cytopatogenic viruses isolated / Erkrankugen A. // Veter. Microbiol. 1995, Vol 46, № 1/3 p285-294.

61. Fredricen В. The effect of bovine virus diarrhea virus on reproduction in recentliy infected norwegian dairi herds/ Fredricen B.//Acta veter. Scand. B.8. Vol.45 N.l.p. 786-789.1998.

62. Francki R.I.B., Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international komitee on taxonomi of viruses. / Francki R.I.В., Fauget C.M., Knudsen D.L., // Arch Virol. Suppl. 2; p.28; 1994.

63. Fernelius A.L. Bovine viral diarhea virus in svine: Characteristics of virus recovered from naturaly and experymentally infected swine./ Fernelius A.L. Amtower G. et al. // Can. J. Сотр. Med. 37. P.13-20.

64. Feller, W., An Introduction to Probability Theory and Its Applications, / Feller, W., // Vol. 1, 3rd ed., John Willey & Sons, New York, 1968, 52.

65. Fitch, W. M. Optimal sequence alignment, / Fitch, W. M. and Smith, T. P., // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 1982,1983.

66. Fitch, W. M., Towards defining the course of evolution: minimum change for a specific tree topology, / Fitch, W. M., // Syst. Zool., 20,406,1971.

67. GillamI.C. Trend Biotechn. 1987. V.169 P.332-334

68. Giy A., Produktion and charakterization of monoklonal antibodi against HCV./ Giy A., Muylekermans G., De Smet A., et al. //Arch.virology,1993.Vol.l31

69. Griggs, J. R., Sequence alignments with matched sections, / Griggs, J. R., Hanlon, P. J. and Waterman, M. S., // SIAM J. Algorithm Disc. Mat., 7,604,1986.

70. Griggs, J. R., On the number of alignments of к sequences, / Griggs, J. R., Hanlon, P. J., Odiyzko, A., and Waterman, M. S., // Asian J. Comb., in press.

71. Gotoh, 0., An improved algorithm for matching biological sequences, / Gotoh, 0., // J. Mol. Biol., 162, 705,1982.

72. Hames B.D., Nucleic acids gibridization: Practical aproach. IRL press, / Hames B.D., HigginsSJ. //Oxford. 1985p.89-97

73. Hawley, D. K. Compilation and analysis of Echerichia coli promoter DNA sequences, / Hawley, D. K. and McClure, W. R., // Nucl. Acid Res., 11,2237, 1983

74. Holley, R. W., Structure of a ribonucleic acid, / Holley, R. W., Apgar, J., Everett, G. A., Madison, J. Т., Marquisee, M., Merrill, S. H., Penswich, J. R., and Zamer, A.,// Science, 147,1462,1965.

75. Jorde L.B., Lynkage diseqilibrium predicts phisical distance in the adenomatosis poliposic coli. / Jorde L.B., Waltcins W.S., Calson L. et al. // Am J. Hum. Genet., 1994; 54; 884-898

76. Jones,L.R.,. Heterogeneity within the 5' untranslated genomic region of bovine viral diarrea virus from a single individual. / Jones,L.R., Zandomeni,R. and Weber,E.L. // Virology 205: 66-74; 1994

77. Hammers С., Persistently infected cattle stabilise BVDV leading to herd specific strains / Hammers C., Lecomte C., Kulcsar G. et al. //Veter. Microbiol. Vol.61.N3-P.77-82

78. L. Hyndman, A novel nested transcription PCR detects bovine viral diarrhoea virus in fluids from abortet bovine fetuses./ L. Hyndman, S. Vilcec et al. // J. Virol, metods 71,69-76.

79. B.J.L. Hooft van Iddekinge, Application of the Polimerase Chain Reaction to the Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus Infections in Cattle. / B.J.L. Hooft van Iddekinge, P.A. van Rijn and R.J. Moorman. // Virologi 165: 200-208.

80. Howard C.J. Immunological responses to bovine virus diarrhea virus infections / Howard C.J. // Rev. Sci. Et tech./ off int. Episoot.-.-1990. N 1 . С 95-103.

81. Kobol D., Fetal and adult bovine interferon during viral diarhea virus infection / Kobol D., Jexon G.// Infect. Immun., 1976,14, 3: 660-666.

82. Kuemmerer B.M., "Bovine viral diarrhea virus strain Oregon: a novel mechanism for processing of NS2-3 based on point mutations";/ Kuemmerer B.M., Stoll D., Meyers G. //. J. Clin. Microbiol. 35; p.803-807; 1997

83. Karlin, S., New approaches computer analysis of nucleic acid sequences, / Karlin, S., Ghandour, G., Ost, F., Tavare, S., and Korn, L. J., // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 5 1983.

84. Kruskal J. B. Time Warps, String Edis, and Macromolecules: Theory and Practice of Sequence Comparison, Sankoff, D. and Kruskal, J. I Addison-Wesley, London, 1983.

85. Laquer H. Т., Asymptotic limits for a two-dimensional recursion, / Kruskal J. В // Stud. Appl. Math., 64,271,1981.

86. Karlin S., Comparative analysis of human and bovine papalloma viruses, / Karlin S., Ghandour, G., and Foulser, D. E., // Mol. Biol. Evol., 1,357, 1984.

87. Karlin S., Patterns in DNA and amino acid sequences and their statistical significance, in Mathematical Methods for DNA Sequences, Waterman, M. S., / Karlin S., Ost, F., and Blaisdell, В. E., // Ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1988.

88. Kim, S. EL, Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA, / Kim, S. H., Suddath, F. L., Quigley, G. J., McPherson, A., Sussman, J. L„ Wang, A. H. J., Seeman, N. C., and Rich, A., // Science, 185,435,1974.

89. Lin, A., The primary structure of rat liver ribosomal protein L37/ Lin, A., McNally, J., and Wool, I. G., //, J. Biol. Chem., 258,10664,1983.

90. Lipman, D. J. Rapid and sensitive protein similarity searches, / Lipman, D. J. and Pearson, W. R., //.Science, 227,1435,1985.

91. Levitt, M., Detailed molecular model for transfer ribonucleic acid, / Levitt, M., //Nature (London), 224,759,1969.

92. Fox, G. E. 5S RNA secondary structure, / Fox, G. E. and Woese, C. R., // Nature (London), 256, 505,1975.

93. Laamanen V.I., Comparison of RT-PCR assay and virus isolatyon in cell cultures for the detection of BVDv in field samples / Laamanen V.I., Neuven E.P. // Res. In veter. Sc.Vol.63. N 3. P. 1999-2003. -1997.

94. Lieber E.M., Experimental mucosal disease in cattle: changes of lymphocyte subpopulations in Peyer's patches and in limphoid nodules of large intestine / Lieber E.M., Kusters C., Pochlenz J.F. //Veter Immunol.Immunopatol.-1995 Vol.48 N 3/4 p233-248.

95. Liess В., Hog cholera viral antigens and some recent result on the relationship to envelope antigens of bovine viral diarhea mucosal desease virions./ Liess В., H.R. Frey U. //Comission of the European communities publication N 5904.

96. Luele L.,. Modulation of the cellular immune responses to T-cell dependent and T-cell independent antigens in lambs with induced bovine viral diarrhea virus infection./ Luele L., Pierre La Fortune, Marrielle Forret //Am.J.Vet.Res. vol.50. N 9. -1989

97. Liu S .Т., Rapid detection of hog chjlera virus in tissues py the polymerase chain reaction./ Liu S.T., Li S-N. //J.Virol.Methods. 1991. Vol.35 P. 1246-1247.

98. Lathrop G.M., Strategies for multilocus lineage analysis in humans. / Lathrop G.M., Laoouel J.M., Julier C. et al.// Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1984; 81; 3443-3446.

99. Le Beau M.M. One FISH, blue FISH./Le Beau M.M.// Nat. Genet., 1996; 12; 341-344.

100. Malmguist W.A. Bovine viral diarrhea mucosal disease:Ethiology, Pathogenesis and Applied immimiti. / Malmguist W.A. // J.Am.Vet.Med.As-soc. 152:763-768-1968

101. Moormann R., Molecular cloning and nucleotide sequence of HCV strain Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein Е1/ Moormann R., Warmerdam P., //Virologi, 1990,Vol.l77

102. Maniatis Т., Mollecular cloning: a laboratory manual. / Maniatis Т., // Gold spring Harbor press. NY. 1982 p.443

103. McCluckin A.W., Cutlip Franc G.H., Coria M.F. Production of cattle immunotolerant to bovine viral diarhea virus. / McCluckin A.W., Litteddaika E.T. Cutlip Franc G.H., Coria M.F. //CanJ. Сотр. Med. 48;p.l56-161; 1984

104. McCluckin A.W., Isolation ofcytopathyc and noncythopatic BVDV from the spleen of cattle acutely and chronically affected with bovine viral diarea. / McCluckin A.W., Bolin S.R., Coria M.F // J.Am.Vet.Med.Assoc. 186; p.558-569;1985

105. Miller, W. Sequence comparison with concave weighting functions, / Miller, W. and Myers, E. W., // Bull. Math. Biol., in press. 1988

106. Martinez H. M., An Efficient Method for Finding Repeats in Molecular Sequences.Nucleic / Martinez H. M., // Acids Res., 11,4629-4634,1983. 54

107. Nishikawa, K. Structure and function of 5S ribosomal ribonucleic acid from Torulopsis utiis, / Nishikawa, K. and Takemura, S., // J. Biochem., 76, 935,1974.

108. Nussinov, R., Algorithms for loop matchings, SIAM/ Nussinov, R. Pieczenik, G., Griggs, J. R., and Kleitman, D. J., // J. Appl. Math., 35, 68,1978.

109. Naharro, G. К., Gene product of v-frg one: hybrid protein containing a portion of actin and tyrosin-specific protein kinase, / Naharro, G. K., Robbins, C., and Reddy, E. P., // Scince, 223, 63,1984.

110. Noller, H. F. Secondary structure of 16S ribosomal RNA, Science, 212, 403, 1981.

111. Moazed, D., Rapid chemical probing of confirmation in 16S ribosomal RNA and 30S ribosomal subunits using primer extension, / Noller, H. F. and Woese, C. R., // J. Mol. Biol., 187,399,1986.

112. Naharro, G. K., Gene product of v-frg one: hybrid protein containing a portion of actin and tyrosin-specific protein kinase, / Naharro, G. K., Robbins, C., and Reddy, E. P., // Scince, 223, 63,1984.

113. Noller, H. F. Secondary structure of 16S ribosomal RNA/ Noller, H. F. and Woese, C. R., //, Science, 212,403,1981.

114. Needleman, S. B. A general method applicable to the search for similaritiesin the amino acid sequences of two proteins, / Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., // J. Mol. Biol., 48,444,1970.

115. Nagai,M., Genomic and serological diversity of bovine viral diarrhea virus in Japan. / Nagai,M., Ito,T., Sugita,S., Genno,A., Takeuchi,K., Ozawa,T., Sakoda,Y., Nishimori,T., Takamura,K. and Akashi,H. // Arch. Virol. 146 (4), 685-696 (2001)

116. Nettleton P.F., The production and survival lambs persistently infected with BDV. / Nettleton P.F., Gilmour J.S., Herring J.A. // Comp.Immun. Microbiol.Infect.Dis. 15;p.l79-188; 1992

117. Nora J. J., Medical Genetics: Principles and Practice. Lea and Febriger, / Nora J.J., FraserF.C. // AWawerly company, 1994 ,-467p.

118. Potgieter L.N.D.Current concepts on the role of viruses in respiratori tract of cattle. /Potgieter L.N.D.// Bovine.Pract.l0:45-81,1977.

119. Pearson, W. R., Improved tools for biological sequence comparisons, / Pearson, W. R. and Lipman, D. J., // Proc. Natl. Acad. Set. U.S.A., 85,2444,1988.

120. Pincel D., Cytogenetic analysis by in situ gibridisation mith fluorescently labeled nucleic acid probes./PincelD., GrayJ.M., Track B. et al.// Gold spring Harbor Simp. Quant. Biol. , 1986; LI; 151-157.

121. L.N.D.Potgieter, Comparison of the pneumopathogenity of two strains of BVDV. / L.N.D.Potgieter, M.D.McCracken // Am J.Vet.Res . N1 1985 Vol.46 151-153.

122. L.N.D.Potgieter, Current concepts on the role of viruses in respiratori tract disease of cattle. /L.N.D.Potgieter, //Bovine pract. Vol.10., p. 45-81. -1977.

123. Pellerin C, vanden Hurc J., Identification of a new group of bovine viral diarhoea virus stain s associated with severe outbreacs and high mortalities. / Pellerin C, vanden Hurc J., Lacomte J., Tijussen P . // Virology. 203; p. 260-268. 1994

124. Riond J.L., Bovine viral diarhea virus induced cerebellar disese in calf /.// J.Amer.Vet.Med. Assoc. Vol.197. N12. P.1631-1632.-1990.

125. Ruben O., Mollecular specifiti of the antibody responses of cattle naturally and experimentally infected with citopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea virus biotypes./Ruben 0.,Donis.,Edvard J. //Am.J.Vet.Res. Vol.48 N11 1987pi 549-1 .

126. Rumenapf Т., Processing of the Envelope Glycoproteins of pestivirus / Rumenapf Т., Under G. //J.Virology,1991, Vol.65.

127. Rumenampf Т., Stark H.J. Molecular characteristic of hog cholerae virus/ Rumenampf Т., Stark H.J. //Arch. Virol. 1991.Vol.67, p. 154-162.

128. Rumenampf T., Structural protein of hog cholerae virus expressed by vaccine virus: furser characterisation und induction ofprotective immunity./ Rumenampf Т., Stark H.J. //J.Virol. 1991. Vol. 65. P.184-195.

129. Ramsey F.K., Simposium on the mucosal desease complex / Ramsey F.K., Chivers W.N. //J.Gen.Virol. vol68. P. 1971-1982. -1987.

130. Ridpath J.F., Differetiation of types 1 a, lb, and 2 bvdv by PCR. / Ridpath J.F., Bolin S.R. // Mol.Cell.Prob. 12; p.101-106; 1998.

131. Ridpath J.F., Segregatyon of bovine viral diarhoea virus into genotipes. I Ridpath J.F., Bolin S.R., Dubovi E.J. // Virology 205: 66-74; 1994.

132. Ridpath,J.F. Detection and characterization of genetic ecombination in cytopathic type 2 bovine viral diarrhea viruses / Ridpath,J.F. and Neill,J.D. // J. Virol. 74 (18), 8771-8774 (2000)

133. Ridpath,J.F. Detection and Control of Ruminant Viruses, / Ridpath,J.F. and Neill,J.D.// Virology 205: 76-84; 2000

134. Saliki J.T.,. Microtiter vims isolation and enzime immunoassays for detection of BVDV in cattle serum. / Saliki J.T., Fulton R.W., Hull S.R. et al.// J. Clin. Microbiol. 35; p.803-807; 1997

135. Stanton, R. G Note on a "square functional" equation, / Stanton, R. G. and Cowan, D. D., // Rev., 2,277,1970.

136. Sellers, P., Theory and computation of evolutionare distances, / Sellers, P., // SIAM J. Appl. Math., 26,787,1974b

137. Smith, T. F. and Waterman, M. S., Comparison of biosequences, / Smith, T. F. and Waterman, M. S., // Adv. Appl. Math., 2,482,1981.

138. Smith, T. F., Comparative biosequence metrics/ Smith, T. F., Waterman, M. S., and Fitch, W. M., //, J. Mol. Evol., 18,38,1981.

139. Sellers, P., Pattern recognition in genetic sequences by mismatch density, / Sellers, P., // Bull. Math. Biol., 46,501,1984.

140. Smith, T. F. Identification of common molecular subsequences, / Smith, T. F. and Waterman, M. S., // J. Mol. Biol., 147,195,1981a.

141. Sellers, P., Pattern recognition in genetic sequences, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 76,3041,1979.

142. Sellers, P., The theory and computation of evolutionary distances: pattern recognition, / Sellers, P., // J. Algorithms, 1,359,1980.

143. Stiegler, P., Structural organization of the 16S ribosomal RNA from E. coli topography and secondary structure, / Stiegler, P., Carbon, P., Zuker, M., Ebel, J. P., and Ehresmann, C., //Nucl. Acid Res., 9,2153,1981.

144. Sprinzl, M., Compilation of tRNA sequences, / Sprinzl, M., Moll, J., Meissner, F., andHartmann, Т., //Nucl. Acids Res., 132, rl, 1985.

145. Stein, P. R., On some new sequences generalizing the Catalan and Motzkin numbers, / Stein, P. R., and Waterman, M. S., // Discrete Math., 26,261,1978,

146. Sankoff, D., Simultaneous solution to the RNA folding, alignment and protosequence problem, / Sankoff, D., // SIAM J. Appl. Math.,

147. Sankoff, D., Minimal mutation trees of sequences, / Sankoff, D., // SIAM J. Appl. Math., 78, 35,1975.

148. Sankoff, D. Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, /Sankoff, D. and Kruskal, J J I., Addison-Wesley, London, 1983,253.

149. Smith, T. F., The statistical distribution of nucleic acid similarities, / Smith, T. F., Waterman, M. S., and Burks, C., // Nucl. Acids Res., 13 (2), 645,1985.

150. Silvian D.G., A nested polimerase chain reaction assay to differentiate pestiviruses. / Silvian D.G., AkkulaRX. // Virus. Res. 38: p. 231-239; 1995

151. Skulmovska-krizkowska Danuta,. Isolation and characterisation of field strains of virus diarhea and mucosal disease in cattle. / Skulmovska-krizkowska Danuta, B. Zbignew. //Bull.vet.Inst.Pulawi.1976. Vol.20. N3-4. P. 72-75.

152. Sund C.,. Nucleosides Nucleotides, / Sund C., Ylikovski I. // 1988 V.7.P 655659

153. Showdon W.a.,. The bovine mucosal desease swine fever virus complex in pigs / Showdon W.a., E.L.French // Aust. Vet, сотр. Med. 37. P. 96-102.1973.

154. Stannon A.D., Detection of hog cholera virus atigens in experimentally infected pigs using an antigen capture ELISA / Stannon A.D., Morrisy C. // Vet. Microbiol. 1993. Vol.34.

155. Sobel E. A multiple sequence alignment program. / Sobel E. and Martinez H. M., //Nucleic AcidsRes., 14,1, 363-374,1986.

156. Trifinov, E. N. Open and closed 5S ribosomal RNA, the only two universal structures encoded in the nucleotide sequences, / Trifinov, E. N. and Bolshoi, G., // J.Mol. Biol., 169,1,1983.

157. Tinoko, I., Estimation of secondary structure in ribonucleic acids, / Tinoko, I., Uhlenbeck, 0. C., and Levine, M. D., // Nature (London), 230,362,1971.

158. Thiel H-J. Protein encoded in 5 region of the pestivirus genome considered taxonomi / Thiel H-J. // Vet. Microbiol. 1992. Vol.33

159. Tecott L., In situ gibridisation: Application in neurology. / Tecott L., Eberwine J.H., Valentino K.L // Oxford 1999 p.1609-1702

160. Tyler D.E., Comparative pathologic, immunologic, and clinical responses produced by selected agents of the bovine mucosal desease virus diarhea complex / Tyler D.E., Ramsey F.K. // J.Am.Vet.Res. Vol.26, p. 903-913. -1965.

161. Tsubo Т., Detection of В VDv in bovine embrios derived from persistentli infected heifers by PCR. / Tsubo Т., Imada T. // Veter.rec. Vol.142.N5. pl58-159. 1998.

162. Wensvoort G. Immunoaffiniti purificatyon and characterisation of the envelope protein El of hog cholera virus / Wensvoort G. Boonstra J. // Gen. Virology. 1990. Vol.71, p. 32-40.

163. Weiland E., A second envelope glycoprotein mediates neutralysatyon of a pestyvirus / Weiland E., Ahl R // J.Virology. 1992, Vol. 66. P. 132-134.

164. Weiland E., A second envelope glicoprotein mediates neitralisation of Pestivirus / Weiland E., Ahl R., Stark R., et al. //J.Virol. 1990,Vol.71

165. Collet M.S., Recent advances in Pestivirus Research / Collet M.S., Moenning V et al.//J.Gen. Virology,1989, Vol.70.

166. Wensvoort G. Immunoaffinity purification and characterization of the envelope protein El Hog Cholera Virus / Wensvoort G. // J. Gen. Virology,1990, Vol.66

167. Wolfmeier A, Genomic and serological differences among German BVDV field isolates /Wolfmeier A, Wolf G., et al.// arch. Virol. -1997 Vol. 142, № 10, P 2049-2057.

168. Wolfmeier A. Genomic 5 UTR and serological differences among German BVdv field isolates / // Arch. Virol. -1997. Vol. 142. N. 10. P. 2049-2057.

169. Wengler G. Flaviviridae In. Classification and nomenclature of viruses. / Wengler G. // Arch.Virol. 2; p.223-233; 1988

170. Wensvoort G., ВVDV-infection in piglets from sows vaccinated against svine fewer with contaminated vaccine. / Wensvoort G., Terpstra С.// Res.Vet. Sci. 45; p. 143-148; 1988

171. Wang M.R., Simultaneous in situ gibridisation with biotin labeled centromeric and library DNA probes: a useful method for identific translocations. / Wolfmeier A, //Analytical Cellular. Path. 1995; 8; 53; 56

172. Waterman, M. S., Consensus patterms in sequences, Mathematical Methods for E Sequences, /Waterman, M. S J I Ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1988.

173. Waterman, M. S., General methods of sequence comparison, / Waterman, M. S., // Bull. Math. Biol., 473,1984.

174. Waterman, M. S., Some biological sequence metrics, / Waterman, M. S., // Adv. Math., 20,367,1976.

175. Waterman, M. S., Multiple sequence alignment by consensus, Nucl. Acids Res., 14,9095,1986.

176. Waterman, M. S., Sequence alignment in the neighborhood of the optimum with general applications to dynamic programming, / Waterman, M. S., // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80,3123,1983.

177. Waterman, M. S., Efficient sequence alignment algorithms, / Waterman, M. S.,//J. Theor. Biol., 108, 333,1984.

178. Weiss, R., Oncogenes and growth factors, / Weiss, R., // Nature (London), 304, 12,1983.

179. Waterman, M. S., Phase transitions in sequence matches and nucleic acid structure, / Waterman, M. S., Gordon, L., and Arratia, R., // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84,1239,1987.

180. Waterman, M. S., Secondary structure of single-stranded nucleic acids, / Waterman, M. S., // Stud. Found. Combinatorics Adv. Math. Suppl. Stud., 1,167, 1978.

181. Waterman, M. S., RNA secondary structure: a complete mathematical analysis, / Waterman, M. S., and Smith, T. F., // Math. Biosci., 42,257,1978.

182. Wilbur, W. J., Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks, / Wilbur, W. J., // Proc. Nath. Acad. Sci. U.S.A., 80,726,1983.

183. Waterman, M. S., Ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1988.

184. Y.Zhou, Differentiation of Hog Cholera and Bovine Viruses in Pigs using Monoclonal Antibodies. / Waterman, M. S., //J. Vet.Med. B36 76-80 1989.

185. Zadhava A. Prevalence of antibodies to bovine viral diarhoea virus and/or border desease virus in domestic ruminants./ Y.Zhou, V.Moenmng, Cheik O.Z. et al. // J.vet.Med.Ser. B.199 Vol.45. N.6. p.345-351.-1998.

186. Zijl M., Lie attenuated pseudorabies virus expressing envelope glycoprotein E2 of hog cholerae virus protected cwine againsd both pseudorabies and hog cholera./ Zijl M., Wensvoortg., Kluiver E // J.Virology. 1991, Vol. 65. P.125-129.

187. Zwieb, C., Secondary structure comparisons between small unit ribosomal RNA molecules from six different species,/ Zwieb, C., Glotz, C., and Brimacombe, R. Zwieb, C., Glotz, C., and Brimacombe, R.„ // Nucl. Acids Res., 9,3621,1981.