Радиоэнзимология - метод исследования свойств и структуры ферментов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, доктор химических наук Орлова, Марина Алексеевна

• Орлова, Марина Алексеевна
• доктор химических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор химических наук Орлова, Марина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I Литературный обзор

1.1 Радиационная инактивация протеолитических ферментов

1.1.1 Сериновые протеиназы

1.1.2 Сульфгидрильные протеиназы

1.1.3 Другие типы протеиназ

1.2 Свойства ангиотензин-превращающего фермента

1.3 Структурные и радиационные свойства пероксидаз растений

1.4 Применение метода радиационной инактивации

ГЛАВА II Материалы и методы

ГЛАВА III Экспериментальные результаты и обсуждение

3 .1 Характерные виды дозовых зависимостей при радиолизе ферментов

3.1.1 Протеиназы

3.1.2 Ангиотензин-превращающий фермент

3.1.3 Пероксидазы растений 95 3.2 Зависимость дозового ответа от рН раствора

3.2.1 Протеиназы

3 .2.2 Ангиотензин-превращающий фермент

3.2.3 Растительные пероксидазы

3 .3 Влияние среды на дозовый ответ

3.4 Изменение субстратной специфичности под действием облучения

3.4.1 Протеиназы

3.4.2 Ангиотензин-превращающий фермент

3.4.3 Пероксидазы растений 143 3 5 Сравнительное изучение методом радиационной инактивации мутантных форм пероксидазы хрена 157 3.6 Влияние некоторых ионов на конформацию и дозовый ответ ферментов

3.6.1 Влияние ионов кальция на протеиназы

3.6.2 Влияние ионов кальция и магния на пероксидазы растений

3 .6.3 Влияние концентрации соли NaCl на дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента

3 .6.4 Влияние концентрации NaCl на дозовый ответ пероксидазы хрена 232 3.6.5 Влияние ионов цинка на стабильность и дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента

3.7 Математическая модель для обоснования появления активации и чередующихся эффектов (осцилляций) на дозовых кривых

3.8 Дозовый ответ ферментов при малых дозах облучения на источник типа плазменный фокус

3.9 Возможные применения метода радиоэнзимологии в дозиметрической и медицинской диагностике

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Радиоэнзимология - метод исследования свойств и структуры ферментов»

Влияние любых видов радиации на неорганические и особенно органические объекты всегда играло огромную роль в жизни человечества. Поэтому медицина со времени открытия радиоактивности тесно связана и с использованием этого воздействия, и с защитой от него.

Ионизирующее излучение занимает особое место в ряду воздействий. Это связано, во-первых, с существованием естественного радиоактивного фона, играющего важную роль в мутационных и эволюционных процессах. Во-вторых, технологическое использование ионизирующего излучения и ядерных реакций привело к возможности высвобождения огромного количества энергии и к загрязнению экосистемы радиоактивными отходами и выбросами. Все это постоянно ведет к повышению коллективной дозы облучения и синергическому действию ионизирующего излучения и других видов радиации совместно с техногенными загрязнителями разных типов, а также с лекарственными препаратами и пищевыми добавками, активно применяемыми сегодня в повседневной жизни. Результат таких совместных воздействий и степень опасности, связанная с модификацией действия излучения этими препаратами, в каждом конкретном случае четко не определены из-за влияния большого числа факторов, а главное из-за неизученного взаимного действия. Таким образом, активно начатые в 50-х годах исследования по действию радиации на биологические объекты до сих пор актуальны, и основное отличие сегодняшнего подхода к этой проблеме заключается в новых методах исследования и развитии концепции комплексного (многофакторного) воздействия и их комплексного изучения. Особое значение такие исследования имеют для фармацевтической химии при разработке новых лекарственных средств, в основном, из-за сочетанного действия радиации и лекарственных средств.

Другой важный аспект использования радиации базируется на том, что радиационное воздействие может служить более быстрым процессом, вызывающим те же изменения, что и другие природные факторы, которые действуют достаточно медленно и поэтому трудно фиксируемы. Это позволяет использовать радиацию для модельных исследований, например, других радикалообразующих процессов. Возможно это и для более сложных процессов. Так, известно [1], что радиационно-индуцируемый рак по механизму возникновения аналогичен химическому и спонтанному. Следует отметить, что в последнее время в медицине возникает много вопросов о действии малых доз радиации, особенно если эти дозы действуют в течении очень короткого времени (импульсное воздействие), а также по-прежнему актуальны вопросы действия лекарственных препаратов при радиотерапии.

Исследования последствий и профилактики радиационных воздействий и радикалообразующих процессов традиционно развиваются в Японии, Польше, России. Прикладные аспекты этих исследований, в частности, касающиеся скриннинга фармакологических агентов, являющихся различного рода модификаторами, используются в США и Франции. По радиационной тематике издаются многочисленные международные журналы (Rad.Res., J.Rad Res, Int.J.Rad.Biol.), однако встречаются работы на эту тему и в других журналах (например, "Медицинская радиология" и др.), если они связаны с комплексным исследованием проблемы.

Один из важнейших аспектов моделирования радикалообразующих процессов связан с радикальным повреждением ферментов и ферментных систем, физиологическую роль которых трудно переоценить. Особенно важно, что сами ферменты являются лекарственными средствами или мишенями для них.

Метод радиационного воздействия на ферменты не является селективным радикалообразующим методом, но имеет свои особенности, способствующие изучению каталитических и кинетических свойств исследуемых объектов. Фундаментальный аспект данной работы связан с разработкой и применением метода, который можно назвать методом радиоэнзимологии, в частности, для целей фармацевтической химии. Метод является комплексным и включает в себя радиохимические, кинетические, каталитические и генноинженерные исследования и направлен на то, чтобы по совокупному конечному изменению свойств объекта сделать прогностический вывод об его особенностях как структурных, так и энзимологических. Прогностические модели могут использоваться в медицине, биотехнологии и фармхимии.

Метод радиационной инактивации, являющийся базовой частью представленного метода радиоэнзимологии, насчитывает достаточно длительный период использования. Изучение поведения ферментов под действием ионизирующего излучения проводилось давно [2,3], как один из способов его действия на организм человека. Сначала эти исследования считались путем к прямому моделированию повреждения организма, но быстро стал понятным сложный характер этой взаимосвязи, и интерес к такого рода исследованиям уменьшился. Однако результатом их явилось появление метода радиационного определения молекулярных масс ферментов, который используется и ныне для сложных ферментных систем [4]. Кроме того, поскольку ферменты представляют достаточно сложные объекты, определение структуры которых является чрезвычайно важной задачей, метод радиационной инактивации стал применяться с целью изучения самих ферментов, их структуры и каталитических свойств, в основном, в водных растворах, где рентгеноструктурный метод не работает, а действие самих ферментов наиболее интересно и перспективно. Что же касается непосредственного действия излучения на твердый или иммобилизованный фермент, то метод радиационной инактивации получил прикладное значения благодаря использованию энзимов в бессеребряных фотографических и радиодозиметрических материалах, а также в медицине и фармацевтической химии. Различие в действии ионизирующего излучения на объект, в том числе и на ферменты в зависимости от условий, заключается в вариации радиационно-химического выхода продуктов радиолиза (т.е. их количества на 100 эВ поглощенной энергии). Соответственно изменяется либо качественный состав этих продуктов при косвенном облучении (т.е. при непосредственном первичном контакте излучения с растворителем, когда на вещество действуют продукты радиолиза воды), либо ионной трек (при прямом действии излучения). Отличие от действия других видов радиации определяется уменьшением длины волны (<100 нм) и возрастанием энергии (область ионизации начинается с 5 эВ).

Данная работа проводилась в течение достаточно длительного времени и представляет обобщенное исследование, посвященное: 1 - разработке комплексного метода (радиоэнзимологии); 2 - его применению для изучения структуры и каталитических свойств трех видов ферментов: сериновых протеиназ (на которых отрабатывался метод), растительных пероксидаз и металлосодержащей гидролазы - ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), и 3 - применению для целей фармацевтической химии с целью создания и классификации новых лекарственных средств. На основании результатов разработаны общие методологические подходы к использованию данного метода и получены принципиально новые данные по свойствам изученных объектов, являющихся лекарственными средствами или их мишенями.

Базовая концепция работы основана на существовании набора допустимых конформационных состояний для каждого фермента, которые существуют в равновесии и могут реализовываться преимущественно в строго определенных условиях. Конформационные изменения молекулы и ее активного центра на первом этапе носят колебательный (обратимый или равновесный) характер (при малых дозах), что соответственно может выражаться в дозовом ответе молекулы фермента в виде эффектов при строго определенных в данных условиях дозах. Кроме того, мы считаем, что сложные ферментные молекулы имеют несколько различных степеней защиты, которые также определяются возможностью изменения конформационного состояния (опять же из числа изначально определенных его структурой и классом). Защитные "действия" молекулы могут протекать без потери каталитической активности (или с протеканием ее чередующихся изменений) при наличии точечных модификаций, которые затем ведут к постепенному разворачиванию с потерей каталитической активности. Т.е., другими словами, мы считаем основополагающим, что конформационные изменения (вызванные точечными модификациями или волновыми явлениями) могут первоначально являться обратимыми, вызывающими конформационный дисбаланс, как форму сохранения структуры и ферментативной активности и характеризуют адаптацию молекулы в данной среде и условиях. При более высоких дозах они становятся необратимыми, что приводит к изменению доступной поверхности молекулы в целом и, соответственно, ее активного центра, т.е. к необратимой инактивации. При этом набор допустимых конформаций и степеней защиты определяется конкретной функцией фермента. Кроме того, существуют особые точки на дозовой кривой, определяемые дозой в совокупности с мощностью дозы и спектром облучения, которые могут на любой стадии воздействия, т.е. даже при очень малых дозах, приводить к фиксации определенной конформации, т.е. к необратимым изменениям, сказывающимся и на каталитической активности. Особенно важной является в структуре фермента функция остатков триптофана, для которых, по предложенной нами гипотезе, при радиолизе в водных растворах может происходить поворот ароматического кольца с одновременным изменением функционирования активного центра. Это особенно важно в случае ферментов, содержащих единственный остаток тритофана.

В работе представлена математическая модель, описывающая конкретный дозовый ответ фермента в условиях существования активации. Она же дает описание условий появления так называемых триггерных эффектов.

В качестве прикладного результата совместно с лабораторией органических меченых соединений кафедры радиохимии разработана прогностическая протеазная модель для анализа органических веществ - потенциальных радиомодификаторов, являющихся лекарственными средствами - при синергическом действии совместно с ионизирующим облучением. В модели может использоваться для обсчета метод QSAR и она имеет перспективу для применения в фармахимии и радиоэкологии. Однако наиболее важной ее возможностью является применение в радиотерапии совместно с химиотерапией для анализа эффективности и опасности применения в этих случаях различных лекарственных препаратов совместно с радиацией.

Вторым приложением работы является создание совместно с кафедрой химической энзимологии (лаб. д.х.н. Казанской Н.Ф.) бессеребряных радиодозиметрических материалов, действие которых основано на инактивации протеиназ. На эту работу было получено авторское свидетельство СССР.

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Орлова, Марина Алексеевна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод радиоэнзим ологии для исследования особенностей структуры (в растворах) и каталитических свойств ферментов, заключающийся в сочетании радиационного воздействия с традиционными кинетическими методами, методом генной инженерии, методом термической активации трития и радиационным изменением субстратной специфичности.

2. При дозах D<Dgo для всех изученных ферментов наблюдается область конформационных превращений, представляющих собой сдвиг конформационного равновесия или изменение конформационного состояния в результате точечных мутаций. При более высоких дозах дозовый ответ молекулы и ее стабильность зависит от этих начальных изменений.

3. Для ряда ферментов (АПФ, растительные пероксидазы) существуют условия, при которых наблюдается явление активации (увеличение эффективности катализа). Явления активации/инактивации могут иметь место при малых дозах (-10 -5 Гр), если источник является импульсным с высокой мощностью дозы.

4. Наличие на дозовой кривой чередующихся процессов активации/инактивации или лаг-периода является признаком защитного механизма в виде конформационного дисбаланса. Этот механизм непосредственно связан с возможностью сохранения молекулой равновесия различных конформационных состояний (АПФ) или имеющихся конформеров (ПХ).

5. Получено математическое обоснование возникновения тонких эффектов (активации-инактивации) на кривой дозового ответа с помощью уравнения для затухающих и возрастающих колебаний ферментативной активности. Выявлены условия пограничных зон, где минимальное изменение условий реакции приводит к изменению схемы процесса и кривой дозового ответа.

6. Зависимость радиационно-химического выхода инактивации от рН для ферментов разных классов (протеиназы, АПФ, ПХ) имеет пик в области рН - 7.0-7.5, что говорит о наличии более развернутого (доступного) конформационного состояния ферментов при переходе от кислых к щелочным растворам. По нашему мнению, это связано с депротонизацией остатков His, не связанных с гемом.

7. Полученные данные указывают на принципиальную роль остатка Тгр 117 в каталитическом процессе ПХ. Предложена концепция для объяснения экспериментальных данных, основанная на том, что происходит изменение плоскости ароматического кольца остатка Tip под действием Н/ОН радикалов за счет их присоединения к нему. Это изменение ведет к конформационным нарушениям, а вероятность процесса возрастает с увеличением плотности радикалов и приводит к изменению трансфера электрона по аминокислотной цепи.

8. На основании изучения ряда мутантных форм ПХ сделан вывод, что поведение субстрат-связывающего центра гваякола зависит от взаимного расположения в молекуле фермента остатков Glu-64, Gin-176 и гема. Отсутствие остатка Тгр и появление дополнительного такого же остатка упрощает дозовый ответ молекулы ПХ, повышая общую стабильность. Роль полярных остатков сводится к удержанию определенной жесткости структуры молекулы, поэтому при замене их увеличивается вариабильность дозового ответа. Остатки Phel43 являются гидрофобным барьером на входе в активный центр. Значение остатков His заключается в поддержании структуры активного центра и кислотно-основного равновесия.

9. Различия в дозовом ответе НПХ и РПХ и изменение их субстратной специфичности при облучении говорят о структурном различии нативного и рекомбинантного фермента, связанные как с фолдингом, так и с наличием углеводных цепей. Доступность каталитического гистидина оказалась в растворе значительно выше расчетной (на основании данных РСА для РПХ) как в НПХ, так и в РПХ

10. Предложена концепция существования набора допустимых конформационных состояний для каждого фермента, которые находятся в равновесии. Равновесие меняется в зависимости от условий среды и изменения условий фолдинга (или точечных мутаций), что приводит к смещению равновесия. Если оно является обратимым, нарушения функции фермента не происходит. Наиболее катастрофическим является необратимое изменение равновесия с фиксацией одного из состояний, что приводит к ужесточению структуры. В ряде случаев может фиксироваться суперактивная форма с появлением активационных процессов

11. Предложены применения метода: для медицинской диагностики сочетанного действия радиации и химических реагентов и в дозиметрии с получением полутоновых изображений.

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Орлова, Марина Алексеевна, 2002 год

1. И. Я. Василенко, Ю. И. Москалев, В. Н. Стрельцов.//Вопросы онкологии, //1985, т. 31, с. 3-6.

2. Сб. Первичные радиобиологические процессы.// Под ред. Н. В. Тимофеева-Ресовского. Атомиздат, М., 1973.

3. Сб. Радиационное поражение и восстановление структур и функций макромолекул.// Под ред. А. В. Савича. Изд. Медицина, М., 1977.

4. J. С. ЕИогу.// TIBS,// 1979, р. 99-100

5. Е. R. Bimbaum, F. Abbot, J. Е. Gomez, D. W. Darnall, //Arch. Biochem. Biophys., //1977, 179, 469-472

6. E. Pollard, F. Buzzell, C. Jeffrays, F. Forro.// Arch. Biochem. Biophys.,//1951, 33, 9-11

7. M. Houslay, J. Ellory, G. Smith, T. Hesketh, J. Stein, G. Warren, J. C. Metcalfe.//Biochem. Biophys. Acta,//1977, 467, 208-210

8. P. Simon, S. Swellens, J. Dumont. //Biochem.J.//1982, 205, 477-481

9. A. S. Verkman, K. Skoreski, D. A. Ausiello. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA,//1984, 81, 150-155.

10. D. P. Alexander, D. A. Charlesby.//Nature//1954,173, 578-579

11. S. R. Levinson, J. C. Ellory. //ochem.Acta. J.,//1974, 137, 123-125

12. К. Г. Циммер. //Проблемы количественной радиобиологии.// Изд. Госатомиздат, М., 1962.

13. R. L. Kincald, Е. Kempner, V. С. Manganielle, G. С. Osborne, М. Vaughan.///. Biol. Chem.,//1981, 256, 11351-11354

14. Т. В. Nielson, P. М. Lad, М. S. Preston, E. Kempner, W. Schlegel, M. Rosbell. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1981, 78, 722-726

15. E. Kempner, W. Schlegel, J. H. Miller, J. Z. Hearon. //J. Biol Chem.//1980, 255,6826-6829-6833

16. E. Kempner, W. Schlegel. //Anal. Biochem.//1979, 92, 2-7

17. R. A. Deering. //Radiat.Res.// 1956, 5, 238-240.

18. E. S. Pollard, W. R. Guld, F. Hutchinson, R. B. Setlow. //Prog. Biophys.//1955,5,238-241

19. Т. K. Hopkins, J. D. Spikes. //Radiat. Res.// 1969, 37, 253-256

20. И И. Сапежинский, //Биополимеры. Кинетика радиационных и фотохимических превращений.//М., Наука, 1988, 214с.

21. P. Riesz, F. Н. White. //Radiat. Res//, 1970, 44, 24-27

22. S. P. Yarmonenko. //Radiobiology//Ed. Mir Publishers, M., 1988.

23. T. Sanner, A. Phihl. //Radiat. Res.//1963, 19, 12-16

24. A. Phihl, T. Sanner. Radiat. Res., 1963, 19, 27-39

25. E. В. Лукашева, H. Ф. Казанская, И. В. Березин. //Вестн.МГУ, сер. Химия// 1986, 27, 86-89.

26. Р. В. Вирник, В. В. Рыльцев, JI. Г. Власов, Е. В. Довбий, А. Т. КалашникУ/Прикл. биохим. микробиол./А983, 19, 533-537

27. В. В. Рыльцев, Л. Г. Власов, Т. И. Самойлова, Л. И. Волковинская, Л. Н. Бондарева, В. Д. Зажирей, С. В. Нетребенко, В. И. Хачиянц. //Прикл. биохим. микробиол.//1984,20, 694.

28. Р. В. Вирник, В. В. Рыльцев, Л. Г. Власов, Г. И. Самойлова, Е. В. Довбий, А.Т.Калашник. //Прикл. биохим. микробиол.//1985,21, 106-110.

29. L. Schachinger, Ch. Schippel, Е. Altmann, В. Diepold, Ch. Yang, M. Jaenke. //Radiat. Environ. Biophys.//1985, 24, 259-264.

30. G. E. Adams, K. F. Baverstock, R. B. Cundall, J. L. Redpath. //Radiat. Res.//1973, 54, 375-381

31. K. R. Lynn, G. Orpen. //Int. J. Radiat. Biol.//1968, 14, 363-366

32. Ch. Ts'ao, W. F. Ward. //Radiat. Res.// 1985, 101, 394-399.

33. A. G. Bezrukova, J. Yu. Ostashevsky. //Int. J. Radiat. Biol.// 1977, 31, 131-137.

34. J. R. Clement, D. A. Armstrong, H. N. V. Klasson. //Can. J. Chem.// 1973,51,2443-2447.

35. A. G. Bezrukova, I. Yu. Ostashevsky. //Int. J. Radiat. Biol//, 1977, 31 349-356.

36. K. R. Lynn, G. Orpen. //Radiat. Res.// 1969, 39, 15-18.

37. JI. А. Баратова, E. H. Богачева, В. И. Гольданский, В. А. Колб, А. С. Спирин, А. В. Шишков. //Тритиевая планиграфия биологических макромолекул.// М. Изд. Наука, 1999.

38. А. В. Шишков. В сб. //Итоги науки и техники// ВИНИТИ, М., 2, 1985, (Серия: Общие проблемы физико-химической биологии).

39. К. Outsuki, М. Fukuhara, К. Sumizu, Н. Hatano. //J. Radiat. Res.// 1970, 11, 113-116.

40. К. Outsuki. //J. Radiat. Res.//1970, 11, 120-123.

41. С. E. Stauffer, D. Etson J/J. Biol. Chem.// 1969, 244, 5333-5337.

42. R. A. Alden, C. S. Wright, F. C. Westall, J. Kraut. //Subtilisin BPN'. Tertiary structure and inhibitor binding.// 1970.

43. L. К. Mee. //Radiat. Res.// 1964, 21, 501-504.

44. L. K. Mee. //Radiat. Res.//1958, 9, 151-154.

45. T. W. Smith, S. J. Adelstein. //Radiat. Res.// 1963, 19, 213-216.

46. L. A. Mounter. //Radiat. Res.//1960, 12, 487-490.

47. E. S. Moore, M. McDonald. //Radiat. Res.// 1955, 3, 38-43.

48. M. McDonald. //J. Gen. Physiol.//1955, 38, 581-584.

49. M. McDonald. //J. Gen. Physiol.//1955, 38, 93-96.

50. M. McDonald. //J. Gen. Physiol.//1954, 27, 62-66.

51. К. R. Lynn. //Radial Res.// 1971, 46, 268-272.

52. K. R. Lynn. //Radial Res.//1970, 43, 525-529.

53. M. А. Орлова. //Успехи химии//1993, 62, 529-542.

54. В. В. Мосолов, //Протеолитические ферметыН М., Наука, 1971 ^ 55. Т. Masuda, J. Ovadia, L. L. Grossweiner. Hint. J. Radial Biol.//1971,20, 447-451.

55. С. Д. Захаров, А. В. Иванов, //Квантовая электроника//1999, 29, 192-203.

56. H. В. Шинкоренко, В. Б. Аггесковский, //Успехи химии// 1982, 51, 713-739.

57. А. В. Иванов, //Мед. Физика//, 1996, 3, 55-57.

58. О. А. Тифлова, Т. И. Кару, Шикробиол.// 1987, 56, 626-629.

59. Н. Ф. Гамалея, Е. К. Шишко, //Изв. АН СССР, Сер. физ.//\Ш, 50, 1027-1032.

60. R. V. Ambartzumian,//Proc. SPIE//1987, 701, 341-343.

61. С. Д. Захаров, С. Н. Перов, Н. А. Панасенко. В сб. //Лазерная биология и лазерная медицина.// Тарту, Изд. ТГУ, 1991, ч.1, с. 16-18.63. 3. А. Хуршилова, М. И. Лейкина, //Весн. Моск. ун-та, Сер. Х1Ш.//1986, 27, 79-81.

62. К. Ооцука, К. Симидзу, Ю. Судзуки, //Сплавы с эффектом памяти формы.//М. Изд. Металлургия. 1990.

63. Н. Tanaka, I. Ohmine, IIJ. Chem. Phys.// 1989, 91, 6318-6322.

64. В. И. Гольданский, ПДАНСССРП 1959, 124, 1261-1264,

65. В. И. Гольданский, //Успехи химии// 1975, 44, 2121-2124.

66. С. Г. Христов, И ДАН СССР// 1961, 136, 663-666.

67. А. М. Дубинская, П. Ю. Бутягин,II ДАН СССР// 1973, 211, 141144.

68. М. А. Орлова. //Канд. дисс.//М. МГУ, 1980.

69. М. А. Орлова, Э. С. Филатов, Е. Ф. Симонов, //Химия выс. эн.// 1979, 13, 468-472.

70. Ch. Ts'ao, W. F. Ward, С. D. Port. //Radial Res.Z/ШЪ, 96, 301304.

71. Э. Я. Граевский. //Сулъфгидрилъные группы и радиочувствителъ ностъ.//Изл. Атомиздат, М., 1969.

72. S. Fuimoto, Т. Nakagawa, S. Inshimitsu, A. Ohara. //Chem. Pharm. Bull.// 1983, 31, 992-995.

73. J. W. Purdie. //Can. J. Chem.// 1971, 49, 725-729.

74. G. Beguta, A. M. Dancewicz. //Int. J. Radial Biol.// 1983, 43, 249253.

75. W. S. Lin, G. Maurice, M. Lai, D. A. Armstrong. //Can. J. Chem.//1976, 54, 242-245.

76. J. W. Purdie. //J. Am. Chem. Soc.// 1967, 89, 226-228.

77. D. W. Grant, S. N. Mason, M. A. Link. //Nature// 1961, 192, 352354.

78. G. M. Gaucher, D. A. Armstrong. //Can. J. Chem.//1973, 51 24432445.

79. G. E. Adams, M. I. Presener, R. H. Bisby, R. B. Cundall, J. R. Key. //Int. J. Radial Res.//1979, 35, 497-501.

80. P. B. Roberts. //Int. J. Radiat. Biol//, 1973, 24, 143-146.

81. О. M. Полторак, E. С. Чухрай, //Ж. физ. хим.//1996, 70, 22782280.

82. С. Cetskia, //Nature//1985, 254, 304-307.

83. С. Chetskia,//J. Mol Biol.//1976,105, 1-9.

84. E. Б. Бурлакова, //Росс. хим. ж.// 1999, 43, 3-5.

85. Л. А. Блюменфельд,//Росс. Хим. Ж.//1999, 43, 15-17.

86. Л. А. Блюменфельд, //Проблемы биологической физики//М. Изд. Наука. 1977.

87. М. R. Ehlers, J. F. Riordan, //Biochemistry//1989, 28, 5311-5314.

88. P. Corvol, T. A. Williams, F. Soubrier, //Meth. Enzym.ll 1995, 248, 283-286.

89. F. Soubrier, F. Alhenc-Gelas, C. Hubert, J. Allegrini, M. John, P. Corvol, //Proc. Nat. Acad. Sci. USA// 1988, 85, 9386-9389.

90. N. M. Hooper, //FEBS Lett.//1994, 354, 1-5

91. N. M. Hooper, //Zink-Metalloperoteases in Health and Disease Ed.1. N.M. Hooper//1996, 1-4.

92. V. Beldent, A. Michaud, I. Wei, M. F. Chavet, P. Corvol, //J.Biol.Chem.// 1993, 268 , 26428-26432.

93. С. В. Гринштейн, И. И. Никольская, Н. Л. Клячко, А. В. Левашов, О. А. Кост,//Биохимия// 1999, 64, 686-690.

94. H.Sakaguchi, S. Hirose, Т. Kume, Н. Hagiwara, //FEBSLett.//1992, 305, 144-146.

95. Ю. E. Елисеева, //Успехи биол. хим.// 1993, 33, 106-109.

96. Ю. Е. Елисеева, //Биоорг. Хим.//1998, 24, 262-265.

97. Т. A. Williams, F. Soubrier, P. Corvol, //Zink Metalloproteases in

98. Health and Disease, Ed. N.M. Hooper// 1996, 83-86.

99. T. A. Williams, K. Barnes, A. J. Turner, N. M. Hooper, //Biochem. J//1992, 288, 878-882.

100. L. Wei, F. Alhenc-Gelas, P. Corvol, E. Clauser J/J. Biol. Chem.// 1991, 266, 9002-9004

101. K. J. Rieger, N. Saez-Servent, M. P. Papet, J. Wdzieezak-Bakata, J. L. Morgat, J. Thorneley, W. Voetter, M. Lenfant, //Biochem. J.//1993,296,373-376.

102. E. Jaspard, L. Wei, F. Alhenc-Gelas//J. Biol. Chem.//1993, 268, 9496-9499.

103. M. R. W. Ehlers, J. F. Riordan, //Biochemistry//1991, 30, 71187121.

104. N. M. Hooper,//M J. Biochem.//1991, 23, 641-644.

105. D. E. Casarini, S. Danilov, К. B. Alves, R. C. L. Siella, F. Gauthier, F. Alhenc-Gelas, //14thInt.Symp.on Kinins//1995, Abst., A-49

106. P. A. Deddish, J. Wang, B. Michel, P. W. Morris, N. O. Davidson, R. A. Skidgel, E. G. Erdos, //Proc. Nat. Acad. Sci. USA// 1994, 91,78-81.

107. A. Rousseau, A. Michaud, M. Chauvet, M. Lenfant, P Corvol, D. Paxton, С. I. Jonnston, HMol. Pharmacol.//1992, 42, 286-291.

108. P. Bunning, J. F. Riordan, /JJ. Inorg. ChemJ± 1985, 24, 183-185.

109. F. Cumin, V. OVelland, P. Corvol, F. Alhenc-Gelas, /JBiochem. Biophys. Res. CommJJ 1989, 163, 718-721.

110. M. R. W. Ehlers, E. A. Fox, D. J. Strydom, J. F. Riordan, IJProc. Nat. Acad. Sci. USA//1989, 86, 7741-7743.

111. Y. N. P. Chen, J. F. Riordan, //Biochemistry/J 1990, 29, 1041510418.

112. Y.-N. Chen, M. R. W. Ehlers, J. F. Riordan, /JBiochem. Biophys. Res. CommJJ 1992,184, 306-311.

113. J. Gardell, D. Hilvert, J. Barnett, E. T. Kaiser, W. J. Ruter, /JJ. Biol. Chem.// 1987,262, 576-578.

114. J. Sen, S. Kasturi, M. A. Jabbar, G. S. Sen, JJ. Biol. Chem./J 1993, 268, 25748-25752.

115. M. J. Cornell, T. A. Williams, N. S. Lamango, D. Coates, P. Corvol, F. Soubrier, J. Hoheisel, H. Lehrach, R. E. Isaak, /JJ. Biol. ChemJJ 1995, 270, 13613-13617.

116. G. Wiffels, C. Fitzgerald, J. Gough, G. Riding, C. Flvin, D. Kemp, P. Willadsen. /JEur. J. Biochem JJ 1996, 237, 41-46.

117. N. C. Lamango, M. Sajid, R. E. Isaak, IJBiochem. J.//1996, 314, 639-642,

118. M. Gajhede, D. J. Schuller, A. Henriksen, A. T. Smith, T. L. Poulos, /JNat. Struct. Biol,/J 1997, 4, 1032-1035.

119. И. Г. Газарян, В сб. (JИтоги науки и техники. Биотехнология// 1992,36, 168-172.

120. I. G. Gazaryan, //In Recent Research Developments in Biophysical Chemistry// 2000, 1, 73-77.

121. K. G. Welinder, HCurr. Opin. Structural Biol.//1992, 2, 388-393.

122. В. C. Finzel, T. L. Poulos, J. Kraut, HJ. Biol. Chem.// 1984, 259,13027-13032.

123. N. Kunishima, К. Fukuyama, H. Matsubara, H. Hatanake,

124. Y. Shibano, T. Amachi, HJ. Mol. Biol.//1994, 235, 3311-3314.

125. J. F. W. Peterson, A. Kadziola, S. Larsen,//FEBS Lett.// 1994, 339, 291-294.

126. T. L. Poulos, S. L. Edwards, H. Wariishi, M. H. Gold, //J. Biol. Chem//1993, 268, 4429-4431.

127. M. Sundaramoorthy, K. Kishi, M. H. Gold, T. L. Poulos, //J. Biol. Chem.//1994, 269, 32759-32763.

128. D. J. Schuller, N. Ban, R. B. Van Huystee, A. Mc Pherson, T. L. Poulos, //Structure//1993, 4, 311 -315

129. A. Henriksen, К. C. Welinder, M. Gajhede,//J. Biol. Chem// 1998, 273, 2241-2244.

130. А. П. Савицкий, //Канд. дисс.//, М., МГУ, 1979

131. R. W. Cowgill, //Biochem. Biophys. Acta// 1968, 168, 417-419.

132. Т. Jonetani, //J. Biol. Chem.// 1967, 242, 5008-5012.

133. H.G.Welinder,//FEBSLettУ/1976, 72, 19-22.

134. Ch. Phelps, L. Forlani, E. Antonini, //Biochem. J.// 1971, 124, 605606.

135. M. В. Волькенштейн, //Молекулярная биофизика//M., Наука

136. JI. В. Абатуров, Я. М. Варшавский, //Мол. биол.//1978,12, 3033.

137. D. Huppert, К. D. Straub, P. М. Rentzepis, //Proc. Nat. Acad. Sci. USA// 1977, 74,4139-4141.

138. P. Ламри, P. Билтонен, В сб. //Структура и стабильность биологических макромолекул// М., Изд. Мир, 1973

139. Г. И. Лихтенштейн, //Биофизиика// 1966, 11, 24-27.

140. А.Н.Вульфсон, Р.В.Тихонов, //ДАН//2001, 380, 400-403

141. G.I.Bergburd, G.H.Carlsson, A.T.Snith, U.Sroke, A.Henriksen, J.Hajdu, //Nature//2002, 417, 463-468.

142. D. K. Bhattacharyya, U. Bandyopadhyay, R. K. Banerjee, II J. Biol Chem//, 1993,268,22292-22296.

143. S. L. Newmyer, P. Ortiz de Montellano, HJ. Biol. Chem.11 1995, 270, 19430-19435.

144. M. I. Savenkova, S. L. Newmyer, P. Ortiz de Montellano, HJ. Biol. Chem.ll 1996, 271, 24598-24603.

145. S. Nagano, M. Tanaka, Y. Watanabe, I. Morishima, //Biochem. Biophys. Res.Comm.//1995, 207, 417-419.

146. S. L. Neymyer, J. Sun, Т. M. Loehr, P. Ortiz de Montellano, //Biochemistry//1996, 35, 12788-12791.

147. J. N. Rodriquez-Lopez, A. T. Smith, R. N. F. Thorneley J/J. Biol.1.org. Chem.// 1996, 1,136-139.

148. J. N. Rodriquez-Lopez, A. T. Smith, R. N. F. Thorneley, //J. Biol. Chem.//1996, 271, 4023-4026.

149. G. Smulevich, M. Paoli, J. F. Burke, S. A. Sanders, R. N. F. Thorneley, A. T. Smith, //Biochemistry// 1994, 33, 7398-7402.

150. A. K. Ablskov, A. T. Smith, С. B. Rasmussen, H. B. Dunford, K. G.Welinder, //Biochemistry// 1997, 36, 9453-9457.

151. N. C. Veitch, Y. Gao, A. T. Smith, C. G. White, //Biochemistry// 1997,36, 14751-14759.

152. A. Khindaria, I. Yamazaki, S. D. Aust, //Biochemistry// 1995, 34, 16860-16865.

153. A. Khindaria, I. Yamazaki, S. D. Aust, //Biochemistry// 1996, 35, 6418-6422.

154. M. Tien, D. Ma, //J. Biol. Chem.// 1997, 272, 8912-8916.

155. R. H. Hasehke, J. M. Friedhoff, //Biochem. Biophys. Res. Comm.// 1978, 80, 1039-1044.

156. I. Morishima, M. Kurono, Y. Shiro,//J. Biol. Chem.// 1986, 261, 9391-9395.

157. Y. Shiro, M. Kurono, I. Morishima, //J. Biol. Chem.//1986, 261,9382-9387.

158. L. Banci, P. Carloni, A. Diaz, G. G. Savelini, //J. Biol. Inorg. Chem.// 1996, 1,264-269.

159. K. R. Barber, M. J. Rodriquez, G. S. Shaw, R. B. Van Huystee, //Eur. J. Biochem// 1995, 232, 825-829.

160. C. Rasmussen, A. N. P. Hiner, A. T. Smith, K. G. Welinder, //J. Biol. Chem.//1998, 273, 2232-2237.

161. M. L. Bender, J. R. Schoenbaum, B. J. Zerner, //J. Biol. Chem.// 1961,236, 2930-2934.

162. J. E. Rapp, C. Numann, С. E. Heim, //Biochemistry// 1966, 5, 4100-4105.

163. F. D. J. Chattaway, //Chem. Soc.//1931, N 9, 2495-2499.

164. M. Kunitz, //J. Gen. Physiol.//1947, 30, 291-296.

165. E. Fisher, //Chemische Berichte// 1901, 34, 433-436.

166. С. Паркер, 11Фотолюминесценция растворов//1972, M., Наука, Мир, 247.

167. Ю. В. Владимиров, //Фотохимия и фотолюминесценция белков//. 1965, М., Наука, 40.

168. И. В. Березин, А. А. Клесов,IIПрактический курс химической и ферментативной кинетики.// 1976, М. МГУ, 17

169. Т. Дэвени, Я. Гергей, //.Аминокислоты, пептиды и белки// 1976, М. Мир, 165

170. О. Ф. Кост, Т. 3. Шарафутдинов, И. А. Ламзина, Н. Ф.

171. Казанская, //Вестн. моек, ун-та, сер. хим.//1990, 31, 82-86.

172. М. R. W. Ehlers, J.-N. P. Chen, J. F. Riordan, //Biochem.// 1991, 30, 1009-1014.

173. H. И. Ларионова, E. В. Маслов, Ю. E. Елисеева, //Биохимия// 1982, 47, 1332-1335.

174. P. Доусон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс, //Справичник биохимика//М., Мир, 1991.

175. В. Holmquist, P. Bunning, J. F. Riordan, //Anal. Biochem.// 1979, 95, 540-544.

176. Ю. E. Елисеева, В Н. Орехович, Л. В. Павлихина, //Биохимия// 1976, 41, 506-511.

177. В.Д. Аллен, //Регистрация нейтронов//Изд. Атомиздат, М., 1962,36/

178. J.R. Schullek, I.B. Wilson, //Arch. Biochem. Biophys.//1988, 265, 346-350

179. А. А. Шевченко, О. А. Кост, H. Ф. Казанская, //Биоорг. Химия// 1994,20,263-266.

180. Н. В.Тимофеев-Ресовский, А. В.Савич, М. И. Шальнов, //Введение в молекулярную радиобиологию//М., Медицина, 1981

181. А. Своллоу, //Радиационная химия органических соединений// 1963, М., Из-во ин. лит-ры.

182. А. М. Egorov, I. G. Gazaiyan, В. В. Kim, V. V. Doseeva, J. L. Kapeliuch, A. N. Veryovkin, V. A. Fechina, //Ann. NY Acad. Sci.// 1994, 721, 73-76.

183. I. G. Gazaryan, V. V. Doseeva, E. A. Mareeva, M. A. Orlova, //Изв. АН, сер. хим.// 1994, 2234-2238.

184. H. S. Pappa, A. E. G. Cass J/Eur. J. Biochem//1993, 212, 227231.

185. I. G. Gazaiyan, S. B. Vlas enko, A. M. Egorov, В. B. Kim, V. V. Pisarev, //Int. Symp. on Biolumin. and Chemilumin.//Cambridg,1990, 139.

186. E. A. Mareeva, M. A. Orlova, V. V. Doseeva, D. V. Loginov, A. G. Galkin, I. G. Gazaiyan, V. I. Tishkov, //Appl. Biochem. Biotechnol.// 1996, 61, 13-19.

187. B. F. Kalb, R. W. Bernlohr, //Anal. Biochem.// 1977, 82, 362-366.

188. О. А. Несмеянова, Т. Ю. Рудашевская, В. И. Гринберг, //Изв. АН, Сер. хим.// 1977, 2590-2594.

189. М. Elliot, N. Janes, //Ger. Offen 1961155, 1970, Chem. Abst.// 1973, 11, 55964e

190. T. Portsman, B. Portsman, //J. Clin. Biochem.//1985, 23, 41-46.

191. Biochimica Information, Ed. J. Keesey, Boehringer Maimheim Biochemicals, Indianapolis, 1987, 57

192. H. Gallati, //J. Clin. Chem. Clin. Biochem.// 1977, 15, 699-704.

193. J. L. Wood, V. Vigneaud,///. Biol. Chem.// 1939,130, 109-114.

194. D. W. Graham, W. T. Ashton, L. Barash, J. E. Brown, R. D. Brown, L. F. Ganning, A. Chen, J. P. Springer, E. F. Rogers, //J.

195. Med. Chem.// 1987, 30, 1074-1077.

196. J. H. Furhop, К. M. Smith, //Laboratory Methods. Porphirins and Metalloproteins//1975, Ed. К. M. Smeth, Elservier, Amsterdam,757.

197. В. H. D. Bielski, A. O. Allen, //J. Phys. Chem.// 1977, 81, 10481052.

198. JI. И. Харченко, Т. E. Павловская, //Радиобиология// 1975, 15, 21-26.

199. M. Burke, L. Augenstein, //Biochem. J.// 1969, 114, 535-538.

200. И.В. Березин, A.A.Kjiqcob,//Краткий курс химической и ферментативной кинетики//М., МГУ, 1976.

201. М. Pantoliano, В. Holmquist, J.F. Riordan, //Biochemistry// 1984, 23, 1037-1042.

202. И. И. Никольская, М. А. Орлова, И. В. Голубцов, //Радиобиология//1986, 26, 302-305

203. В. X. Акпаров, Л. В. Белянова, Л. А. Баратова, С. М. Степанов, //Биохимия//1979, 44, 880-886

204. С. Wright, R. Alden, J. Krauf, //Nature// 1969, 221, 235-237.

205. D. C. Teller, //Nature//1976, 260, 729-731.

206. E. Stellwagen, H. Wilgns, //Nature// 1978, 275, 372-376.

207. P. Bunning, B. Holenquist, J. F. Riordan, //Biochem.// 1983, 22, 103-106.

208. M. A. Orlova, 1.1. Nikolskaya, I. V. Golubtsov, N. F. Kazanskaya, //Rad. Eff. Lett.// 1984, 85, 143-147.

209. M. А. Орлова, О. А. Кост, И. И. Никольская, Н. Н. Трошина, А. А. Шевченко, //Изв. АН, Сер. хим.// 1994, 1322-1325.

210. R. В. Harris, I. В. Wilson, //Int. J. Peptide Protein Res.//1982, 20, 167-171.

211. J. Smulevich, M.A.Miller, J.Kraut, T.Spiro, //BiochemistryII1991, 30, 9546-9550.

212. D. Aronson, L. Мее, C. L. Smith, //In Progress in Radiobiol. Proc. of IVInt. Conf. on Radiobiol.//Cambridge, 1955, 61-63

213. K G. WelrndQT,//Eur.J.Biochem.//1979, 96, 483-487.

214. A. T. Smith, S. A. Sanders, R. N. F. Thorneley, J. F. Burke, R. C. Bray, //Eur. J. Biochem.//1975, 145, 93-98.

215. R. E. Childs, W. G. Bardsley, //Biochem. J.// 1975, 145, 93-98.

216. I. G. Gazaryan, V. V. Doseeva, A. G. Galkin, V. I. Tishkov, //FEBS Lett//, 1994,354,248-251.

217. Y. Morita, J. Funatsu, B. Mikatu, 11 Plant Peroxidases: Biochem. and Physiol.// Ed. K. G. Welinder, Geneva, 1993.

218. K. Plontek, T. Glumoff, K. Winterhalter, IIFEBSLett.il 1993, 315, 119-123.

219. P. R. O. de Montellano, I I Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.// 1992, 32, 89-93.

220. U.Perez, H.B.Dunford, //Biochim.Biophys.Acta//\990, 1038, 98103.

221. A. M. Egorov, I. G. Gazaryan, В. B. Kim, V. V. Doseeva, J. L. Kapeliuch, A. N. Veriokin, V. A. Fechina, //Annals NY Acad. Sci.// 1994, 721, 73-77.

222. И. Г. Газарян, В. В. Досеева, А. Г. Галкин, В. И. Тишков, Е. А. Мареева, М. А. Орлова, //Изв. АН, Сер. хим.//1995, 371-376.

223. W. Blodig, W. A. Doyle, А. Т. Smith, К. Winterhalter, Т. Choinowski, К. Piontek,//Biochemistry// 1998, 37, 8832-8837.

224. М. А. Орлова, //Изв. АН, Сер. хим.//1996, 2828-2836.

225. Y. Ushijima, М. Nakano, S. Takyu, Н. Inaba, Biochem. //Biophys. Res.// 1985, 128, 936-941.

226. A. Morimoto, M.Tanaka, S.Takahashi, K.Ishimori, H.Hori, I.Morishima, //J.Biol.Chem.// 1998, 223, 14753-14758.

227. M.Tanaka, K.Ishimori, I.Morishima, //Biochem.// 1998, 37, 26292634.

228. P.R.Ortiz de Montanello, R.Z.Harris, C.Hartmann, V.P.Miller, S.L.Newmyer, S.Ozaki, In //Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology II Ed. K.G. Welinder, World Health Organization, Geneva, 1993, 137.

229. И. И. Никольская, M. А. Орлова, E. В. Богаевская, //Радиобиология// 26, 844-846.

230. I.G.Gazaryan, I.M. Lagrimini, S.J. George, R.N.F. Thorneley, //Biochem. J.// 1996,320,

231. Я.С. Бугров, С.М.Никольский У/ Дифференциальные уравнения.

232. Кратные интегралы. Ряды. Функции комплексного переменногоУ/ Изд. Наука. М. 1989.

233. Е.Б.Бурлакова, //Частное сообщение//2001 г.

234. М.А.Орлова, И.И.Никольская, Н.Ф. Казанская, И.В. Голубцов, //Авторское свидетельство Ml 111585// от 03 мая 1984 г., Способ регистрации ионизирующего излучения

235. Shonbans G.R„ Zerner В., Bender M.L., //J.Biol.Chem.// 1961, 236, 2930-2933.

236. Л.Т.Золотарева, E.H. Гончаренко, А.А.Мандругин, В.М.Федосеев, //Радиобиология//1980, 20, 449-453.

237. U. Perez, U.B. Dunford, Biochem.Biophys.Acta, 1990, 1038, №1, 98-101.

238. A. Shrake, J. A. Rupley,/. Mol. Biol, 1973, 79, 351-355