Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Крындушкин, Дмитрий Сергеевич

• Крындушкин, Дмитрий Сергеевич
• кандидат физико-математических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Крындушкин, Дмитрий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Молекулярные механизмы белковой наследственности.

Феномен прионов".

1. Прионы млекопитающих.

1.1. Прионы - новый класс инфекционных агентов.

1.2. Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком РгР80.

1.3. Доказательства прионной гипотезы.

1.3.1. Использование экспериментальных животных для исследования инфекционностн прионов. Существование межвидового барьера.

1.3.2. Изучение прионов млекопитающих с помощью трансгенных животных.

1.3.3. Взаимодействие РгР& и РгРс. Изучение прионного превращения белка РгР in vitro. Штаммы прионов.

1.4. Молекулярные модели прионного перехода.

1.5. Предполагаемая функция белка РгР. Может ли патологический эффект PrPSc объясняться инактивацией белка?.

1.5.1. Структура белка РгР. Си2+-связывающая активность РгР.

1.5.2. Роль белка РгР в защите клеток нервной системы.

2. Прионы низших эукариот.

2.1. Нехромосомные детерминанты [PSJ*] и [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Цнтоплазматический детерминант [Het-s] гриба Podospora anserina.

2.2. Молекулярная природа детерминанта [PSf J: прионный переход белка Sup35. 24 2.2.1. Структура и функция белка Sup35. Роль N- концевого домена в возникновении и поддержании детерминанта [PSf].

2.2.2. Экспериментальные доказательства прионных свойств белка Sup35.

2.2.3. Мутации в гене SUP35, приводящие к потере прионного детерминанта [PSt], Штаммы прионного детерминанта [PSf].

2.3. Создание гибридного приона на основе N- концевого домена ортолога Sup из дрожжей Pichia methanolica.

2.4. Сходство прионной формы белков Sup35 и Ure2 с амилоидами млекопитающих. Структура амилоидных фибрилл.

2.5. Биологическое значение прионов низших эукариот.

3. Клеточные факторы, влияющие на поддержание прионного состояния белков.

3.1. Шапероны: классификация и функциональное значение. ^

3.2. Влияние шаперонов на лрионный переход РгР in vitro и in vivo.

3.3. Роль шаперона HsplQ4 в поддержании детерминанта [PS/1"]. Действие GuHCl на обусловлено инактивацией Hsp 104.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания»

Термин "прион" появился в связи с исследованием ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы с неизвестной этнологией, таких как скрейпи овец и болезнь Крейцфельда-Якоба человека. Несмотря на то, что эти болезни, особенно у животных, известны довольно давно, природа их оставалась неизвестной вплоть до последнего времени. Медленный прогресс в исследовании этих болезней был связан как с необычно долгим инкубационным периодом при развитии заболевания, так и со способом их возникновения: они могут возникать спорадически и в то же время могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. Разнообразие путей возникновения ставило в тупик большинство исследователей. В 1967 была предложена «белковая» гипотеза, согласно которой инфекционный агент (получивший название "прион") представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподцержанию при помощи автокаталитического механизма. На сегодняшний день эту гипотезу можно считать доказанной. Ее подтверждают практически все экспериментальные данные, а также тот факт, что до сих пор не удалось найти какую-либо нуклеиновую кислоту, связанную с передачей этих инфекционных заболеваний.

За последние десять лет появились работы, показывающие существование прионных белков не только у млекопитающих, но и у дрожжей 5. сегешше и гриба Роёоярога атеппа. Если у млекопитающих существование прионов во всех известных случаях связано с патологией, то у низших эукариот данное явление может иметь адаптивное значение. У дрожжей прионоподобные свойства белков лежат в основе механизмов эпигенетической наследственности и регуляции экспрессии генов на постгрансляционном уровне.

Изучение прионов у дрожжей открывает новые перспективы в понимании сущности этого явления. Возможно, феномен прионов гораздо шире распространен в природе и играет существенно большее значение у различных организмов, чем это известно на сегодняшний день. Поиск в геномных базах выявляет значительное количество белков у различных организмов, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей. Это наводит на мысль о том, что белки со способностью приобретать альтернативную самоподдерживающуюся кон формацию широко распространены и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке. Кроме того, до сих пор остается открытой проблема диагностики и лечения прионных болезней у человека. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи данных заболеваний от животных к человеку при употреблении в пищу мяса больных животных. Ввиду того, что дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих, изучение механизмов образования и элиминации прионов у дрожжей позволит глубже понять патогенез прионных заболеваний и разработать подходы к их терапии.

Таким образом, на сегодняшний день актуальной представляется задача поиска белков, критичных для поддержания прионного детерминанта у дрожжей. Подобные белки могли бы в перспективе быть использованы как "молекулярное лекарство" для лечения прионных заболеваний человека и животных. Регуляция экспрессии таких белков в клетке также может представлять интерес как для биологии, так и для медицины. Данная диссертационная работа включает в себя попытку реализации этого замысла с использованием дрожжевого прионного детерминанта.

Несмотря на наличие доказательств прионный гипотезы для ряда белков млекопитающих и низших эукариот, на сегодняшний день получено очень мало данных о структурной организации прионов. Практически все имеющиеся данные получены в экспериментах, проводимых с прионными белками in vitro. Отсутствие структурных данных существенно затрудняет понимание процессов, происходящих в клетке на молекулярном уровне. Поэтому одной из задач нашей работы явилось создание нового методического подхода, дающего информацию о структуре прионов дрожжей, а также использование этого метода для изучения механизмов их репликации. Подобный методический подход может быть использован в будущем и для анализа других прионных белков.

Обзор литературы

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БЕЛКОВОЙ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ. ФЕНОМЕН

ПРИОНОВ"

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Крындушкин, Дмитрий Сергеевич

выводы

1) Сверхэкспрессия шаперонов из семейств Нэр70 и Нзр40, а также транскрипционных факторов ввпв н вШ и рибосомного белка ИррО элиминирует прионный детерминант [Р81УР5].

2) Белки 8зп8, 5Ш и 1£рр0 регулируют экспрессию шаперонов, при этом связывается с последовательностью НЭЕ, характерной для промоторов генов шаперонов, и активирует транскрипцию, опосредованную этим элементом. Такая регуляция может объяснять антиприонные эффекты сверхэкспрессии этих белков.

3) Разработаны новые методы выделения прионных частиц и оценки их размера, основанные на устойчивости этих частиц к додецил сульфату натрия. Показано, что прионные частицы имеют сложную структурную организацию, представляя собой агрегаты небольших полимеров белка 8ир35.

4) Штаммы прионного детерминанта [Р51*~\ различаются друг от друга по размеру полимеров.

5) Сверхэкспрессия шаперона приводит к уменьшению размера прионных полимеров ЭирЗЗ, в то время как снижение активности шаперона НэрКМ, напротив, приводит к увеличению их размера. На основании этих результатов высказаны гипотезы об участии этих шаперонов в поддержании детерминанта [Р5!/4] в клетках дрожжей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе был впервые предпринят систематический анализ факторов, влияющих на поддержание прионных детерминантов [РЗ/*] и [РЗ/4^] дрожжей 3. сегеушае. Проведенный поиск позволил обнаружить ряд белков 3. сегеутае, которые могут оказывать влияние на процесс прионного перехода белков 8ир35 и 8ир35-Р8, среди которых основную роль играют шапероны семейств №р70 и Нзр40, Остальные найденные в работе белки, по-видимому, действуют на прионный детерминант опосредованно, регулируя экспрессию шаперонов. Так, было установлено, что транскрипционный фактор Звпв может репрессировать многие гены шаперонов семейства №р70; транскрипционный фактор ЭШ может связываться с промоторной последовательностью НЭЕ, присутствующей во многих генах шаперонов, и активировать экспрессию с нее. Рибосомный белок ЯррО при сверхэкспресии может накапливаться во внерибосомных комплексах и также влиять на экспрессию шаперонов. Все эти факты могут представлять интерес при исследовании функций найденных белков в дрожжевой клетке.

Подобный поиск "антиприонных" факторов у дрожжей 3. сегеушае может иметь важное биомедицинское значение для лечения прионных и амилоидных заболеваний человека и животных. Согласно имеющимся литературным данным, дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих. Кроме того, многие из найденных белков (особенно шапероны) консервативны и присутствуют у всех эукариот от дрожжей до человека, что позволяет предполагать их возможное использование в будущем как "молекулярное лекарство" от различных прионных болезней.

Для проведения более углубленного исследования молекулярных механизмов, приводящих к элиминации прионных детерминантов, нами был разработан новый подход, включающий в себя метод очистки прионных агрегатов из дрожжей 3. сегеш^ае, а также электрофоретический метод анализа прионных агрегатов, позволяющий оценивать их размер. Применение этого метода позволило получить новую информацию о структурной организации прионных агрегатов в дрожжевой клетке и впервые получить электронно-микроскопические фотографии этих агрегатов. Кроме того, было проведено исследование влияния различных "антиприонных" воздействий на размер прионных полимеров, что позволило затем предложить молекулярные механизмы, лежащие в основе этих воздействий. Так, мы проанализировали влияние уменьшения и увеличения Нэр104 на размер прионных полимеров, и нашли доказательства "фрагментирующей" модели действия этого белка на детерминант [РЗГ*]. Кроме того, мы предложили механизм действия найденного в скрининге шаперона семейства Нвр40 $1в1, а также низкомолекулярного вещества виНС! на прионный детерминант.

Разработанный метод универсален и может быть применен для других типов дрожжевых прионов, а также использован для установления механизмов действия других "антипрнонных" факторов. Ввиду того, что дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих, данный метод может быть полезен и при изучении прионных болезней человека и животных.

110

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Крындушкин, Дмитрий Сергеевич, 2004 год

1. Инге-Вечтомов С.Г. и Адрианова В.М. (1970). Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. Генетика, 11,103-115.

2. Aigle,M.L.F. (1975). Genetical aspects of URE3., a non-Mendelian, cytoplasmically inherited mutation in yeast. Mol. Gen. Genet, 136, 327-336.

3. Bach,S., Talarek,N., Andrieu,T., VierfondJ.M., Mettey.Y., Galons,H., Dormont,D., Meijer,L., Cullin,C,, and Blondel,M. (2003). Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay. Nat. Biotechnol., 21, 1075-1081.

4. Becker,!, Walter,W., Yan,W., and Craig,E.A. (1996). Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydjlp, in protein translocation in vivo. Mol. Cell Biol., 16, 4378-4386.

5. Belli,G., Gari,E., Piedrafita,L., Aldea,M., and Heuero.E. (1998). An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Res., 26,942-947.

6. Bessen,R.A. and Marsh,R.F. (1992). Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol., 73, 329-334.

7. Bessen,R.A. and Marsh,R.F. (1994). Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol., 68, 7859-7868.

8. Boeke.J.D., LaCroute,F,, and Fink,G.R. (1984). A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol. Gen. Genet, 197, 345-346.

9. Bounhar,Y., Zhang,Y., Goodyer.C.G., and LeBlanc.A (2001). Prion protein protects human neurons against Bax-mediated apoptosis. J. Biol. Chem., 19; 276, 39145-39149.

10. Bradford,M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72,248254.

11. Bradley,M.E., Bagriantsev.S., Vishveshwara,N., and Liebman,S.W. (2003). Guanidine reduces stop codon read-through caused by missense mutations in SUP35 or SUP45. Yeast, 20,625-632.

12. Brown,D.R. (2001). Copper and prion disease. Brain Res. Bull., 55, 165-173.

13. Brown,D.R., Nicholas,R.S., and Canevari,L. (2002). Lack of prion protein expression results in a neuronal phenotype sensitive to stress. J. Neurosci, Res., 67, 211-224.

14. Brown,D.R., Qin,K., Herms,J.W., Madlung,A., Manson,J., Strome.R., Fraser,P.E., Kruck,T., von Bohlen,A., Schulz-Schaeffer,W., Giese.A., Westaway,D., and Kretzschmar,H. (1997). The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature, 390, 684687.

15. Brown,D.R., Wong,B.S., Hafiz,F., Clive.C., Haswell,S.J., and Jones,I.M. (1999). Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. Biochem. J., 344 Pt 1:1-5., 1-5.

16. Bueler,H., Fischer,M., Lang,Y., Bluethmann,H., Lipp,H.P., DeArmond,S.J., Prusiner,S.B., Aguet,M., and Weissmann.C. (1992). Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature, 356, 577-582.

17. Bukau,B. and Horwich,A.L. (1998). The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92, 351-366.

18. Caughey,B., Kocisko,D.A., Raymond,G.J., and Lansbury.P.T., Jr. (1995). Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem. Biol., 2, 807-817.

19. Caughey,B., Raymond,G.J., and Bessen,R.A. (1998). Strain-dependent differences in betasheet conformations of abnormal prion protein. J. Biol. Chem., 273,32230-32235.

20. Chabry.J., Caughey.B., and Chesebio,B. (1998). Specific inhibition of in vitro formation of protease-resistant prion protein by synthetic peptides. J. Biol. Chem., ITS, 13203-13207.

21. Chai,Y., Koppenhafer.S.L., Bonini,N.M., and Paulson,H.L. (1999). Analysis of the role of heat shock protein (Hsp) molecular chaperones in polyglutamine disease. J. Neurosci, 19, 10338-10347.

22. Chang,H.C. and Lindquist,S. (1994). Conservation of Hsp90 macromolecular complexes in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 269, 24983-24988.

23. Chemoff,Y.O., Derkach,LL., and Inge-Vechtomov,S.G. (1993). Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet., 24,268-270.

24. Chernofif,Y.O., Galkin,A.P., Lewitin,E., Chernova,T.A., Newnam,G.P., and Belenkiy,S.M. (2000). Evolutionary c onservation o f prion-forming a bilities of the yeast Sup35 protein. Mol Microbiol, 35, 865-876.

25. ChemoffjY.O., Lindquist,S.L., Ono,B., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (1995). Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion- like factor PSf). Science, 268, 880-884.

26. Chernoff.Y.O., Newnam,G.P„ Kumar,J., Allen,K., and Zink,A.D. (1999). Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PST\ prion. Mol. Cell Biol., 19, 8103-8112.

27. Chiarini,L.B., Freitas,A.R., Zanata,S.M., Brentani,R.R., Martins,V.R., and Linden,R. (2002). Cellular prion protein transduces neuroprotective signals. EMBO J., 21, 33173326.

28. Cohen,F.E., Pan,K.M., Huang,Z., Baldwin,M., Fletterick,R.J., and Prusiner,S.B. (1994). Structural clues to prion replication. Science, 264, 530-531.

29. Cooper,K.F., Mallory,MJ., Smith,J.B., and Strich,R. (1997). Stress and developmental regulation of the yeast C-type cyclin Ume3p (Srbl Ip/Ssn8p). EMBO J., 16,4665-4675.

30. Cooper,K.F., Mallory,M.J., and Strich.R. (1999). Oxidative stress-induced destruction of the yeast C-type cyclin Ume3p requires phosphatidylinositol-specific phospholipase C and the 26S proteasome. Mol. Cell Biol, 19, 3338-3348.

31. Coschigano,P.W. and Magasanik,B. (1991). The URE2 gene product of Saccharomyces cerevisiae plays an important role in the cellular response to the nitrogen source and has homology to glutathione s-transferases. Mol Cell Biol, 11, 822-832.

32. Coustou,V., Deleu.C., Saupe,S., and Begueret,J. (1997). The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 94, 9773-9778.

33. Cox,B.S. (1965), Psi, a cytoplasmic supressor of super-supressor in yeast. Heredity, 20, 505-521.

34. Cox,B.S., Tuite.MF., and McLaughlin,C.S. (1988). The psi factor of yeast: a problem in inheritance. Yeast, 4, 159-178.

35. DebBurman,S.K., Raymond,GJ., Caughey,B-, and Lindquist.S. (1997). Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 94, 13938-13943.

36. DePace,A.H., Santoso,A., Hillner.P., and Weissman,J.S. (1998). A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion. Cell, 93, 1241-1252.

37. DePace,A.H. and Weissman.J.S. (2002). Origins and kinetic consequences of diversity in Sup35 yeast prion fibers. Nat. Struct. Biol., 9, 389-396.

38. Derkatch,I.L., Chernoff,Y.O., Kushnirov,V.V., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (1996). Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 144, 1375-1386.

39. Doel,S.M., McCready,S.J., Nierras,C.R., and Cox,B.S. (1994). The dominant PNM2-mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene. Genetics, 137, 659-670.

40. Eaglestone,S.S., Cox,B.S., and Tuite,M.F. (1999). Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by environmental stress through a prion-mediated mechanism. EMBO J., 18, 1974-1981.

41. Eaglestone,S.S., Ruddock,L.W., Cox,B.S„ and Tuite,M.F. (2000). Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PSI(+). of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97,240-244.

42. Edenhofer.F., Rieger,R., Famulok,M., Wendler,W., Weiss,S., and Winnacker,E.L. (1996). Prion protein PrPc interacts with molecular chaperones of the Hsp60 family. J. Virol., 70, 4724-4728.

43. Elghetany,M.T. and Saleem,A. (1988). Methods for staining amyloid in tissues: a review. Stain Technol, 63,201-212.

44. Ferreira.P.C., Ness,F., Edwards,S.R., Cox,B.S., and Tuite,M.F. (2001). The elimination of the yeast PS?. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation. Mol. Microbiol, 40, 1357-1369.

45. Fritz,J.D,, Wolff,J.A., and Greaser,M.L. (1993). Partial titin cDNA sequence isolated from rabbit cardiac muscle RNA. J. Muscle Res. CellMotil., 14, 347-350.

46. Gabizon.R., McKinley,M.P., Groth,D., and Prusiner,S.B. (1988). Immunoaffinity purification and neutralization of scrapie prion infectivity. Proc, Natl. Acad. Sci. U. S. A, 85, 6617-6621.

47. Gajdusek,D.C., Gibbs,C.J., and Alpers,M. (1966). Experimental transmission of a Kuru-like syndrome to chimpanzees. Nature, 19;209, 794-796.

48. Gerlach,W.L. (1975). Genetic properties of some amber-ochre supersuppressors in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Gen. Genet., 138, 53-63.

49. Ghaemmaghami,S., Huh,W.K., Bower,K., Howson.R.W., Belle,A., Dephoure.N., 0'Shea,E.K,, and Weissman,J.S. (2003). Global analysis of protein expression in yeast. Nature, 425, 737-741.

50. Gietz,R.D., Schiestl,R.H., Willems,A.R., and Woods,R.A. (1995). Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS- DNA/PEG procedure. Yeast, 11, 355360.

51. Gietz,R.D. and Sugino,A. (1988), New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene, 74, 527534.

52. Glover,J.R., Kowal,A.S., Schirmer.E.C., Patino,M,M., Liu,JJ„ and Lindquist,S. (1997). Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of -PS/1"., a heritable prion-like factor of 5. cerevisiae. Cell, 89, 811-819.

53. Glover,J.R. and Lindquist,S. (1998). Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell, 94, 73-82.

54. Grantcharova,V., Alm,E.J., Baker,D., and Horwich,A.L. (2001). Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol, 11, 70-82.

55. GriffithJ.S. (1967). Self-replication and scrapie. Nature, 215, 1043-1044.

56. Grimminger,V., Richter,K., Imhof,A., Buchner,J., and Walter,S. (2003). The prion curing agent guanidinium chloride specifically inhibits ATP hydrolysis by. Hspl04. J. Biol. Chem., (в печати).

57. Hetz,C., Maundrell.K., and Soto,C. (2003). Is loss of function of the prion protein the cause of prion disorders? Trends Mol. Med., 9, 237-243.

58. Houry,W.A. (2001). Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm. Curr. Protein Pept. Sci., 2,227-244.

59. Hsiao,K.K., Scott,M., Foster,D., Groth,D.F., DeArmond,S.J., and Prusiner,S.B. (1990). Spontaneous neurodegeneration in transgenic mice with mutant prion protein. Science, 250, 1587-1590.

60. Inoue.H., Nojima,H., and Okayama,H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96,23-28.

61. JarrettJ.T. and Lansbury,P.T., Jr. (1993). Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell, 73, 1055-1058.

62. JonesJ.S. and Prakash,L- (1990). Yeast Saccharomyces cerevisiae selectable markers in pUC18 polylinkers. Yeast, 6, 363-366.

63. Jung,G., Jones,G., and Masison,D.C. (2002). Amino acid residue 184 of yeast Hspl04 chaperone is critical for prion-curing by guanidine, prion propagation, and thermotolerance. Proc. Natl, Acad. Sci. U. S. A, 99, 9936-9941.

64. Jung,G. and Masison,D.C. (2001). Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions. Curr. Microbiol, 43, 7-10.

65. Kascsak,R.J., Rubenstein,R., and Carp,R.I. (1991). Evidence for biological and structural diversity among scrapie strains. Curr. Top. Microbiol. Immunol, 172:139-52., 139-152.

66. Kimura,Y., Koitabashi,S., and Fujita,T. (2003). Analysis of yeast prion aggregates with amyloid-staining compound in vivo. Cell Struct. Funct., 28, 187-193.

67. King,C.Y. (2002). Supporting the structural basis of prion strains: induction and identification of PS/. variants. J. Mol Biol. 307, 1247-1260.

68. Kochneva-Pervukhova,N.V., Chechenova,M.B., Valouev,I.A., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (2001). PSI *. prion generation in yeast: characterization of the "strain" difference. Yeast, 18,489-497.

69. Kocisko,D.A., ComeJ.H., Priola,S.A., Chesebro,B-, Raymond,G.J., Lansbury,P.T., and Caughey,B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature, 370, 471-474.

70. Kopito,R.R. (2000). Aggresomes, inclusion bodies and protein a ggregation. Trends Cell Biol., 10, 524-530.

71. Kushnirov,V.V., Kochneva-Pervukhova.N.V., Chechenova,M.B., Fiolova,N.S., and Ter-Avanesyan,M.D. (2000). Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica. EMBO J., 19,324-331.

72. Kushnirov,V.V. and Ter-Avanesyan,M.D. (1998). Structure and replication of yeast prions. Cell, 94, 13-16.

73. Kushnirov,V.V., Ter-Avanesyan,M.D., Telckov,M.V., Surguchov,A.P., Smirnov,V.N., and Inge-Vechtomov,S.G. (1988). Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene, 66,45-54.

74. Kuwahara,C., Takeuchi,A.M., Nishimura,T., Haraguchi.K., Kubosaki,A., Matsumoto.Y., Saeki,K., Matsumoto,Y., Yokoyama,T., Itohara,S., and Onodera,T. (1999). Prions prevent neuronal cell-line death. Nature, 400, 225-226.

75. Laemmli.U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

76. Laue.T.M. and Rhodes,D.G. (1990). Determination of size, molecular weight, and presence of subunits. Methods Enzy/nol., 182:566-87., 566-587.

77. Lindquist,S., Patino,M.M., Chemoff,Y.O., Kowal,A.S., Singer,M.A., Liebman,S.W., Lee,K.H., and Blake,T. (1995). The role of Hspl04 in stress tolerance and PSt. propagation in Saccharomyces cerevisiae. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol, 60, 451460.

78. Lowndes,N.F., Johnson,A.L., and Johnston,L.H. (1991). Coordination of expression of DNA synthesis genes in budding yeast by a cell-cycle regulated trans factor. Nature, 350, 247-250.

79. Masison,D.C. and Wickner,R.B. (1995). Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells. Science, 270, 93-95.

80. McMahon,H.E., Mange,A., Nishida,N., Creminon,C., Casanova,D., and Lehmann,S. (2001). Cleavage of the amino terminus of the prion protein by reactive oxygen species. J. Biol. Chem. 19;276, 2286-2291.

81. Miller JH (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 352-354.

82. Myers,A.M., Tzagoloff,A., Kinney,D.M., and Lusty,C.J. (1986). Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of lacZ fusions. Gene, 45, 299-310.

83. Narayanan,S., Bosl,B., Walter,S., and Reif,B. (2003). Importance of low-oligomeric-weight species for prion propagation in the yeast prion system Sup35/Hspl04. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 100, 9286-9291.

84. Newnam,G.P., Wegrzyn,R.D., Lindquist,S.L., and Chernoff,Y.O. (1999). Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing. Mol. Cell Biol., 19, 1325-1333.

85. Nicolet,C.M. and Craig,E.A. (1989). Isolation and characterization of 577/, a stress-inducible gene from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol., 9, 3638-3646.

86. Oesch,B., Westaway,D., Walchli.M., McKinley,M.P., Kent,S.B., Aebersold,R., Bany,R.A., Tempst,P., Teplow.D.B., Hood,L.E., and . (1985). A cellular gene encodes scrapie PrP 2730 protein. Cell, 40, 735-746.

87. Osherovich,L.Z. and Weissman,J.S. (2001). Multiple GIn/Asn-rich prion domains confer susceptibility to induction of the yeast PS/(+). prion. Cell, 106, 183-194.

88. Parsell,D.A., Kowal,A.S., Singer,M.A., and Lindquist,S. (1994). Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature, 372,475-478.

89. Patino,M.M., Liu,J.J., Glover,J.R., and Lindquist,S. (1996). Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science, 273,622-626.

90. Paushkin.S.V., Kushnirov,V.V., Smimov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1996). Propagation of the yeast prion-like /357+. determinant is mediated by oligomerization of the Si/P35-encoded polypeptide chain release factor. EMBOJ., 15, 3127-3134.

91. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1997a). In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. Science, 277,381-383.

92. Paushkin.S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1997b). Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell Biol., 17,2798-2805.

93. Perutz,M.F., Finch,J.T., BerrimanJ,, and Lesk,A. (2002a). Amyloid fibers are water-filled nanotubes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99, 5591-5595.

94. Prusiner,S.B. (1982). Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 216, 136-144.

95. Prusiner.S.B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science, 252, 1515-1522.

96. Prusiner,S.B., Bolton,D.C., Groth,D.F., Bowman,K.A., Cochran,S.P., and McKinley.M.P. (1982). Further purification and characterization of scrapie prions. Biochemistry, 21, 69426950.

97. Prusiner,S.B., Hadlow,W.J., Garfin,D.E., Cochran,S.P., Baringer,J.R., Race,R.E., and Eklund.C.M. (1978). Partial purification and evidence for multiple molecular forms of the scrapie agent. Biochemistry, 17, 4993-4999.

98. Prusiner.S.B., McKinley,M.P., Bowman,K.A., Bolton,D.C., Bendheim,P.E., Groth,D.F., and Glenner,G.G. (1983). Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell, 35, 349-358.

99. Rose.A.B. and Broach,J.R. (1990). Propagation and expression of cloned genes in yeast: 2-micions circle-based vectors. Methods Enzymol, 185:234-79., 234-279.

100. Safar.J., Wille,H., Itri,V., Groth,D., Serban,H., Torchia,M., Cohen,F.E., and Prusiner,S.B. (1998). Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat. Med., 4, 1157-1165.

101. Sambrook.J., Fritsch,E.E., and Maniatis,T. (1989a). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

102. Sambrook,J., Fritsch,E.E., and Maniatis.T. (1989b), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

103. Sanger,F., Nicklen,S., and Coulson,A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 74, 5463-5467.

104. Santos,C. and Ballesta,J.P. (1994). Ribosomal protein PO, contrary to phosphoproteins PI and P2, is required for ribosome activity and Saccharomyces cerevisiae viability. J. Biol. Chem., 269,15689-15696.

105. Santoso,A., Chien,P., Osherovich,L.Z., and WeissmanJ.S. (2000), Molecular basis of a yeast prion species barrier. Cell, 100,277-288.

106. Sarokin,L, and Carlson,M. (1986). Short repeated elements in the upstream regulatory region of the SUC2 gene of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol., 6, 2324-2333.

107. Scott,M., Groth,D., Foster,D., Torchia,M., Yang,S.L., DeArmond,S.J., and Piusiner,S.B. (1993). Propagation of prions with artificial properties in transgenic mice expressing chimeric PrP genes. Cell, 73, 979-988.

108. Sherman,F., Fink,G.R., and Hicks,J.B. (1986). Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

109. Sigurdsson,E.M., Wisniewski,T., and Frangione.B. (2002). Infectivity of amyloid diseases. Trends Mol. Med., 8, 411-413.

110. Simons.K. and Ehehalt,R. (2002). Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest, 110, 597-603.

111. Song,W. and Carlson,M. (1998). Srb/mediator proteins interact functionally and physically with transcriptional repressor Sfll. EMBOJ., 17,5757-5765.

112. Song,W„ Treich,I., Qian,N„ Kuchin,S., and Carlson,M. (1996). SSN genes that affect transcriptional repression in Saccharomyces cerevisiae encode SIN4, ROX3, and SRB proteins associated with RNA polymerase II. Mol. Cell Biol., 16,115-120.

113. Soti.C. and Csermely,P. (2003). Aging and molecular chaperones. Exp. Gerontol., 38, 1037-1040.

114. Sparrer,H.E., Santoso,A., Szoka,F.C., Jr., and WeissmanJ.S. (2000). Evidence for the prion hypothesis: induction of the yeast PSf~\ factor by in vitro- converted Sup35 protein. Science, 289, 595-599.

115. StansfieId,I., Akhmaloka, and Tuite,M.F. (1995a). A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes. Curr. Genet., 27,417-426.

116. Tanaka M., Chien P. and Weissman J. (2004). Conformational Variations in an Infectious Protein Determine Prion Strain Differences. Nature, (в печати).

117. TatzeltJ., Prusiner,S.B., and Welch,W.J. (1996). Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein. EMBO J., 15,6363-6373.

118. Taylor,K.L., Cheng,N., Williams,R.W., Steven,A.C., and Wickner,R.B. (1999). Prion domain inidation о f amyloid formation in vitro from native Ure2p. Science, 283, 13391343.

119. Ter-Avanesyan,M.D., Dagkesamanskaya,A.R., Kushnirov,V.V., and Smimov,V.N. (1994). The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant PSt. in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 137, 671676.

120. Towbin,H., Staehelin,T., and Gordon,J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc, Natl. Acad. Set. U. S. A, 76, 4350-4354.

121. True,H.L. and Lindquist,S.L. (2000). A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature, 407,477-483.

122. Tuite,M.F., Lund,P.M., Futcher,A.B., Dobson,M.J., Cox,B.S., and McLaughlin,C.S. (1982). Relationship of the \psi\ factor with other plasmids of Saccharomyces cerevisiae. Plasmid, 8,103-111.

123. Tuite,M.F., Mundy,C,R., and Cox,B.S. (1981). Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi-J in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 98, 691-711.

124. Urakov.V.N., Valouev,I.A., Lewitin,E.I., Paushkin,S.V., Kosorukov,V.S., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (2001). Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae. BMC. Mol. Biol., 2, 9.

125. WaIsh,D.M., Klyubin,I., FadeevaJ.V., Rowan,M.J., and Selkoe.D.J. (2002). Amyloid-beta oligomers: their production, toxicity and therapeutic inhibition. Biochem. Soc. Trans., 30, 552-557.

126. Wang,K. (1982). Purification of titin and nebulin. Methods Enzymol., 85 Pt B:264-74., 264-274.

127. Warner,J.R., Vilardell,J., and Sohn,J.H. (2001). Economics of ribosome biosynthesis. Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol., 66:567-74., 567-574.

128. WarrickJ.M., Chan,H.Y., Gray-Board, Chai,Y., Paulson,H.L., and Bonini,N.M. (1999). Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet., 23,425-428.

129. Wegrzyn,R.D., Bapat,K„ Newnam,G.P., Zink,A.D., and Chernoff,Y.O. (2001). Mechanism. of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast. Mol. Cell Biol., 21,4656-4669.

130. Welch,W.J. and Gambetti,P. (1998). Chaperoning brain diseases. Nature, 392,23-24.

131. Wickner,R.B. (1994), URE3. as an altered URE2 protein; evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science, 264, 566-569.

132. Yan,W. and Craig,E.A. (1999). The glycine-phenylalanine-rich region determines the specificity of the yeast Hsp40 Sisl. Mol. Cell Biol, 19, 7751-7758.

133. Yeh,L.C., Horowitz,P.M., and Lee.J.C. (1988). Studies of RNA-protein interactions in the yeast 5 S ribonucleoprotein particles by fluorescence and tritium exchange. Implications forribosomal assembly. J. Biol. Chem., 263, 17412-17417.

134. Yoo,B.C., Kim,S.H., Cairns,N., Fountoulakis,M., and Lubec,G. (2001). Deranged expression of molecular chaperones in brains of patients with Alzheimer's disease. Biochem. Biophys. Res. Commutt., 280, 249-258.

135. Young,J.C., Barral,J.M., and Ulrich,H.F. (2003). More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem. Sci., 28, 541-547.

136. Я выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Михаилу Давидовичу Тер-Аванесяну за неизменный интерес к моей работе, множество полезных советов, а также практическую помощь при проведении некоторых экспериментов.

137. Искренне благодарен Виталию Владимировичу Кушнирову за помощь в планировании и проведении экспериментов, доброжелательность и дружеское участие.

138. Очень благодарен М.О. Агафонову за множество советов при выполнении работы, а также ценные критические замечания.

139. Благодарен И.М. Александрову за участие в выполнении экспериментов, описанных в Главе 4.1. Хочу поблагодарить также

140. Н.В. Кочневу-Первухову за советы по постановке генетических экспериментов

141. A.B. Воротникова за помощь в выборе маркеров для электрофоретического метода, атакже при получении фотографий с флуоресцентного микроскопа

142. А.Б. Сальникову и О.В. Миткевич за помощь в проведении некоторых экспериментов

143. H.A. Киселева и В.Я. Стельмащука за получение электронно-микроскопических снимков

144. Е. Craig, J.P. Ballesta, Н. Ruis, M.F. Tuite за предоставление некоторых антител и плазмид

145. Г.В. Фоминова, В.Н. Уракова, И.А. Валуева, И.С. Шкундину, М.Б. Чеченову, Н.В. Романову, А.Н. Пакайзер, Т.А. Аверину и С.С. Соколова за полезные советы и обсуждение результатов работы.