Исследование взаимодействий агентов на основе наночастиц с эукариотическими клетками с целью создания эффективных систем контролируемой доставки лекарственных средств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Мочалова Елизавета Никитична

• Мочалова Елизавета Никитична
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Мочалова Елизавета Никитична

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад

Степень достоверности и апробация результатов

Научные статьи в рецензируемых журналах

Патенты на изобретения

Тезисы конференций

Глава 1. Обзор литературы

1. Наночастицы для биомедицинских применений

1.1 Разнообразие наночастиц и возможности их модификации

1.2 Взаимодействие наночастиц с клетками

2. Методы исследования клеток и клеточных взаимодействий с наночастицами

2.1 Конфокальная микроскопия

2.2 Сканирующая электронная микроскопия

2.3 Проточная цитометрия

2.4 Визуализирующая проточная цитометрия

2.5 МРО-цитометрия

3. Клеточная смерть

3.1 Основные пути клеточной смерти: апоптоз, некроз и аутофагия

3.2 Инструменты для изучения клеточной смерти

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы и оборудование

2.1.1 Материалы

2.1.2 Оборудование

2.2 Получение клеток

2.2.1 Клеточные культуры

2.2.2 Мышиные перитонеальные макрофаги

2.2.3 Эритроциты

2.3 Мечение антител, белков и клеток флуоресцентными и другими метками

2.3.1 Су5-меченые антитела против белка F4/80 и Cy5-меченый аннексин V

2.3.2 ФИТЦ-меченые антитела против рецептора HER2/neu и ФИТЦ-меченый аннексин V

2.3.3 Су3-меченые эритроциты

2.3.4 Биотин-меченый бычьий сывороточный альбумин и биотин-меченые антитела против рецептора HER2/neu

2.3.5 Конъюгат стрептавидина с моноклональным антителом против рецептора HER2/neu

2.4 Функционализация частиц

2.4.1 Иммобилизация распознающих биорецепторов посредством сорбции

2.4.2 Ковалентное связывание распознающих биорецепторов с карбоксильными группами на поверхности частиц с помощью карбодиимидного метода

2.4.3 Ковалентное связывание распознающих биорецепторов с тозиловыми группами на поверхности частиц

2.5 Определение уровней экспрессии рецептора HER2/neu у различных клеточных линий

2.6 Фагоцитоз эритроцитов

2.7 Изучение специфичности связывания нано- и микрочастиц с клетками

2.7.1 Коммерческие 3-мкм Dynabeads M-280 (для анализа связывания с помощью свёрточных нейронных сетей)

2.7.2 Различные коммерческие нано- и микрочастицы

2.7.3 Гематитные наночастицы

2.7.4 Гётитоподобные наночастицы оксигидроксидов железа

2.7.5 Наночастицы на основе металл-органических координационных полимеров

2.8 Изучение цитотоксичности наночастиц

2.8.1 Цитотоксичность гематитных наночастиц

2.8.2 Избирательная цитотоксичность наночастиц на основе металл-органических координационных полимеров

2.9 Изучение специфичности связывания умных наноагентов и их селективности к входным ДНК-молекулам

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Анализ изображений визуализирующей проточной цитометрии с помощью свёрточных нейронных сетей

3.1.1 Количественный анализ нацеливания частиц на клетки

3.1.2 Количественный анализ фагоцитоза эритроцитов

3.2 Исследование взаимодействий агентов на основе наночастиц с эукариотическими клеткамибб

3.2.1 Специфичное нацеливание коммерческих частиц на раковые клетки.................................бб

3.2.2 Исследование взаимодействий наночастиц на основе оксидов и оксигидроксидов железа с эукариотическими клетками

3.2.2.1 Специфичное нацеливание гематитных наночастиц на эритроциты

3.2.2.2 Специфичное нацеливание гётитоподобных наночастиц оксигидроксидов железа на раковые клетки

3.2.2.3 Инициирование клеточной гибели гематитными наночастицами, допированными европием

3.2.3 Избирательное уничтожение раковых клеток с помощью наночастиц на основе металл-органических координационных полимеров

3.2.4 Исследование взаимодействий умных ДНК-зависимых наноагентов с раковыми клетками

Заключение

Благодарности

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование взаимодействий агентов на основе наночастиц с эукариотическими клетками с целью создания эффективных систем контролируемой доставки лекарственных средств»

Актуальность темы исследования

На сегодняшний день в клинической практике для лечения онкологических заболеваний используют хирургические методы, лучевую и гормональную терапии, химиотерапию и другие методы, а также их комбинации. Химиотерапия приводит к уничтожению отдельных опухолевых клеток или целой опухоли, а также способствует замедлению роста опухоли и уменьшению её размеров. Стандартные низкомолекулярные препараты, используемые для химиотерапии, не имеют достаточной специфичности в отношении очага болезни - целевых опухолевых клеток и тканей, что снижает общую эффективность и безопасность лечения [1]. Наномедицина возникла как стратегия преодоления этого и других ограничений и призвана улучшить терапевтический эффект лекарств при минимизации их системной токсичности. Наночастицы выступают в качестве носителей лекарств и могут использоваться для адресной доставки препаратов преимущественно к клеткам и тканям с патологиями, защиты лекарственных молекул от деградации, обеспечения доставки малорастворимых соединений и комбинаций нескольких лекарств, а также для увеличения проникновения препаратов через биологические барьеры и обеспечения их контролируемого воздействия на мишень путем регулирования скорости и режима дозирования [2, 3].

Среди основных механизмов доставки наночастиц к клеткам-мишеням выделяют пассивную и активную доставки. Принцип пассивной доставки заключается в том, что быстрорастущие опухоли выстраивают развитую систему кровеносных сосудов для получения из организма питательных веществ, и при характерных для опухолей условиях (воспаление, гипоксия и др.) эндотелий сосудов становится более проницаемым, чем у здоровых тканей, обеспечивая усиленное проникновение наночастиц к опухолевым клеткам. Однако у пассивного метода доставки существуют значительные ограничения: повышенная проницаемость сосудов не характерна для медленнорастущих опухолей; кроме того, проницаемость сосудов неоднородна даже в пределах одной и той же опухоли [4]. Возможным решением для преодоления этих ограничений может быть переход к активной доставке, основанной на использовании распознающих биорецепторов для специфического связывания с мишенью. Тем не менее, на сегодняшний день для клинического использования одобрено множество нанопрепаратов для пассивной доставки (в том числе БохП® и Сае1ух®) и ни одного - для активной [3, 5, 6]. Таким образом, существует острая потребность в

разработке новых агентов на основе наночастиц для адресной доставки лекарств посредством распознавания клеток-мишеней различными биорецепторами.

Важной стадией создания подобных наноагентов является изучение различных аспектов их взаимодействия с клетками, в частности, их специфичности. Так, наночастицы, функционализированные антителами или иными распознающими опухолевые клетки биорецепторами, должны эффективно связываться с патогенными клетками и не связываться со здоровыми. На сегодняшний день, микроскопические методы не позволяют проводить быстрый анализ большого количества клеток, а цитометрические подходы предполагают субъективное применение ограниченного набора параметров для анализа данных. И хотя эти методы активно применяются на практике, они не предоставляют точной информации об эффективности связывания наночастиц и клеток. В связи с этим, в настоящее время существует высокая потребность в разработках новых производительных методов количественного анализа указанных процессов.

Одним из главных ограничений широкого внедрения нанотехнологий в клиническую практику является высокая скорость их выведения из кровотока клетками иммунной системы, а именно клетками системы мононуклеарных фагоцитов. Детальное исследование процессов фагоцитоза является ключом к повышению терапевтической эффективности существующих и созданию новых препаратов. В частности, исследования эритроцитарно-макрофагальных взаимодействий крайне необходимы в области наномедицины для разработки стратегий увеличения продолжительности циркуляции наноматериалов в крови методами переноса на эритроцитах (т.н. эритроцитарного «хитчхайкинга») [7], цитоблокады системы мононуклеарных фагоцитов [8] и др., что позволит внедрить совершенно новые подходы в диагностике и терапии опухолевых заболеваний. Понимание тонкостей фагоцитоза эритроцитов также необходимо для изучения эритропоэза и его патологий (например, при некоторых видах анемии и полицитемии) [9]. Анализ взаимодействий макрофагов с клетками чрезвычайно важен и для многих других передовых областей биологии и медицины. В частности, взаимодействия между опухоль-ассоциированными макрофагами и опухолевыми клетками определяют такие фундаментальные процессы, как пролиферация опухоли, её ангиогенез, инвазия и иммуносупрессия [10]. Фагоцитоз ВИЧ-1-инфицированных Т-клеток, приводящий к макрофагальной инфекции, является важным аспектом патогенеза этого опасного вируса [11].

Данная диссертационная работа посвящена исследованию взаимодействий агентов на основе наночастиц с эукариотическими клетками с целью создания систем для высокоспецифичного нацеливания на опухолевые клетки и их избирательного уничтожения, а также разработке

биофизических методов количественного анализа нацеливания частиц на клетки и фагоцитоза эритроцитов.

Степень разработанности темы исследования

На сегодняшний день предложено большое количество различных наночастиц, свойства которых можно тонко настроить для решения конкретных медико-биологических задач [12, 13]. Кроме того, существует множество стратегий загрузки лекарств в структуру наночастиц [14], а для функционализации поверхности наночастиц используется широкий набор различных биорецепторов на основе аптамеров, антител, белков, пептидов и низкомолекулярных соединений [15].

Различные модификации могут быть использованы для создания более сложных наночастиц, обладающих способностью переключаться между различными состояниями под воздействием различных физико-химических триггеров. Это могут быть как сравнительно простые стимулы -свет, изменения pH и температуры, так и более сложные как, например, изменения локальной концентрации определенных молекул. Такие материалы особенно интересны для решения задач диагностики и терапии, так как могут оставаться инертными до тех пор, пока не активируются под воздействием различных маркеров в микроокружении опухоли. При активации, такой «умный» наноагент может выполнять заложенное в нем терапевтическое действие, например, связывание с опухолевой клеткой, высвобождение лекарства и т. д. [16].

Несмотря на большое количество исследований in vivo эффективности нанопрепаратов, именно клетки зачастую выступают в качестве главного биологического модельного объекта. На первых этапах разработок тестирование наночастиц и терапевтических подходов непосредственно в животных сопряжено с рядом технических и этических сложностей, а многообразие взаимосвязанных и одновременно проходящих в организме процессов не всегда позволяет достоверно вычленить эффекты, вызванные действием изучаемых нанопрепаратов. Большой пласт исследований посвящен изучению связывания наночастиц с мембранами клеток, интернализации и последующей локализации внутри клеток, а также изучению их специфичности, цитотоксичности и других параметров [17, 18]. Понимание этих и других аспектов необходимо для создания новых систем эффективной и безопасной доставки лекарств к опухолевым клеткам.

Цели и задачи

Целью работы являлось исследование взаимодействий агентов на основе наночастиц с эукариотическими клетками для создания эффективных систем контролируемой доставки лекарственных средств.

Задачи:

1. Разработать подход для количественного анализа а) нацеливания частиц на клетки и б) фагоцитоза эритроцитов.

2. Показать возможность специфичного нацеливания на эритроциты и раковые клетки новых типов наночастиц на основе биосовместимого класса материалов - оксидов и оксигидроксидов железа. Установить влияние формы и допирования металлами на цитотоксичность данных наночастиц.

3. Показать возможность специфичного нацеливания на раковые клетки наночастиц на основе металл-органических координационных полимеров, обладающих уникально высокой сорбционной емкостью, за счет функционализации антителами. Продемонстрировать избирательное уничтожение раковых клеток под действием данных наночастиц.

4. Разработать систему нацеливания на клетки «умных» наноразмерных материалов, способных избирательно изменять свою аффинность к мишеням посредством входных молекулярных ДНК-сигналов.

Научная новизна

В данной работе впервые для количественного анализа нацеливания частиц на клетки и фагоцитоза по данным визуализирующей проточной цитометрии применены свёрточные нейронные сети. Впервые продемонстрировано нацеливание функционализированных гематитных наночастиц на эукариотические клетки.

Ранее в целях специфичного клеточного нацеливания поверхность наночастиц на основе металл-органических координационных полимеров функционализировали гиалуроновой кислотой, фолиевой кислотой, пептидами и аптамерами. Однако не проводилось исследований, использующих в качестве нацеливающих биорецепторов такие универсальные биомолекулы как антитела. В данной работе впервые показано, что наночастицы на основе металл-органических координационных

полимеров, функционализированные антителами, способны к высокоспецифичному нацеливанию на раковые клетки и к их избирательному уничтожению.

Кроме того, впервые разработана система нацеливания на клетки «умных» агентов на основе наночастиц, покрытых гибкой полимерной цепью, которая регулирует доступность терминального рецептора для связывания с мишенью под действием входных молекулярных ДНК-сигналов.

Теоретическая и практическая значимость

В данной диссертационной работе предложены новые решения для всестороннего развития подходов к адресной доставке лекарственных препаратов. Разработаны биофизические методы для количественного анализа фагоцитоза и взаимодействий между клетками и частицами; установлены важные для биомедицинских применений закономерности взаимодействия клеток и наночастиц для целого ряда материалов. Кроме того, продемонстрированы возможности различных типов наночастиц связываться с высокой специфичностью с эритроцитами и раковыми клетками, в том числе с клетками-мишенями посредством анализа ДНК-молекул в микроокружении, а также обладать неизбирательной и избирательной цитотоксичностью.

Методология и методы исследования

Разработанные подходы для количественного анализа нацеливания частиц на клетки и фагоцитоза эритроцитов основаны на синергии визуализирующей проточной цитометрии и методов обнаружения объектов на изображениях с помощью глубокого обучения, а именно с помощью свёрточных нейронных сетей. В данной работе также был использован широкий спектр современных независимых биофизических методов исследования взаимодействий наночастиц с клетками, а именно: конфокальная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, проточная цитометрия, визуализирующая проточная цитометрия и MPQ-цитометрия (от англ. «Magnetic Particle Quantification» - измерение количества магнитных частиц). Краткий обзор данных методов приведен в разделе «Методы исследования клеток и клеточных взаимодействий с наночастицами» главы «Обзор литературы». Подробные протоколы работы описаны в главе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые предложен и реализован подход на основе анализа изображений визуализирующей проточной цитометрии с помощью свёрточных нейронных сетей для количественного анализа а) нацеливания частиц на клетки и б) фагоцитоза эритроцитов.

2. Установлено влияние различных полимерных покрытий гематитных наночастиц на их специфичность связывания с клетками. Показана возможность высокоспецифичного нацеливания гематитных наночастиц на эритроциты. С помощью визуализирующей проточной цитометрии продемонстрировано влияние формы и допирования металлами гематитных наночастиц на их цитотоксичность и показано, что веретенообразные Еи-допированные наночастицы способны инициировать гибель клеток, в отличие от кубических Еи-допированных и недопированных.

3. Установлено влияние различных полимерных покрытий гётитоподобных наночастиц оксигидроксида железа на их специфичность связывания с клетками. Показана возможность высокоспецифичного нацеливания гётитоподобных наночастиц оксигидроксида железа на раковые клетки.

4. Впервые показано, что наночастицы на основе металл-органических координационных полимеров, функционализированные антителами, способны к высокоспецифичному нацеливанию на раковые клетки и к их избирательному уничтожению. Установлено влияние на эффективность взаимодействия данных наночастиц с клетками таких параметров, как тип полимерного покрытия, концентрация наночастиц, а также количество терапевтической нагрузки.

5. Впервые разработана система нацеливания на клетки «умных» наноразмерных материалов, которые меняют свою аффинность к мишени посредством входных молекулярных ДНК-сигналов. Продемонстрировано, что полученные наноагенты способны идентифицировать клетки-мишени с помощью анализа сразу нескольких параметров - уровня экспрессии HER2/neu рецептора на поверхности и ДНК-молекул в микроокружении клетки. Кроме того, показана селективность этих агентов к входным ДНК-молекулам разной степени комплементарности к распознающей ДНК на поверхности наноагента (полностью комплементарные, имеющие однонуклеотидный полиморфизм, частично комплементарные и некомплементарные ДНК различной длины).

Личный вклад

При разработке подхода точного количественного анализа изображений визуализирующей проточной цитометрии с помощью свёрточных нейронный сетей все эксперименты по нацеливанию частиц на клетки и ключевые эксперименты по фагоцитозу эритроцитов выполнены автором лично. Остальная часть работы, в том числе написание программного кода, выполнена под руководством автора диссертации.

Автор самостоятельно создала все используемые в работе наноагенты на основе коммерческих нано- и микрочастиц, выполнила эксперименты по определению уровней экспрессии рецептора HER2/neu у различных клеточных линий, эксперименты по нацеливанию всех упомянутых в работе наноагентов на модельные клетки в целях определения специфичности и селективности взаимодействий, а также последующую регистрацию, обработку и интерпретацию результатов с использованием проточного цитометра, визуализирующего проточного цитометра и MPQ-детектора. Автором выполнена основная часть экспериментов по исследованию цитотоксичности наночастиц и оптимизировано большинство используемых в работе протоколов. Кроме того, автор принимала непосредственное участие в планировании постановки экспериментов и написании текстов статей.

Автор выражает глубокую благодарность коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертации получили квалифицированную апробацию на 7 международных и всероссийских научных конференциях:

1. 19th International Conference Laser Optics ICLO 2020 (Санкт-Петербург, Россия, 2020 г.).

2. International Conference "The Regulation of Proteostasis in Cancer" (Санкт-Петербург, Россия, 2019 г.).

3. 26th Conference of European Cell Death Organization (Санкт-Петербург, Россия, 2018 г.).

4. 12th International Conference on the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers (Копенгаген, Дания, 2018 г.).

5. 18th International Conference Laser Optics ICLO 2018 (Санкт-Петербург, Россия, 2018 г.).

6. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2017 г.).

7. 60-ая научная конференция МФТИ (Долгопрудный, Россия, 2017 г.).

По результатам работы опубликовано 13 научных статей в рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение и 4 тезиса конференций.

Научные статьи в рецензируемых журналах

1. Cherkasov V. R.,* Mochalova E. N.,* Babenyshev A. V.,* Vasilyeva A.V., Nikitin P.I., Nikitin M. P. Nanoparticle beacons: supersensitive smart materials with on/off-switchable affinity to biomedical targets // ACS Nano. - 2020. - Т.14, №2. - C.1792-1803, * - равный вклад авторов.

2. Mochalova E. N., Kotov I. A., Lifanov D. A., Chakraborti S., Nikitin M.P. Imaging flow cytometry data analysis using convolutional neural network for quantitative investigation of phagocytosis // Biotechnology and Bioengineering. - 2022. - Т.119, №2. - C.626-635.

3. Mochalova E. N., Kotov I. A., Rozenberg J. M., Nikitin M.P. Precise quantitative analysis of cell targeting by particle-based agents using imaging flow cytometry and convolutional neural network // Cytometry. Part A. - 2020. - Т.97, №3. - C.279-287.

4. Cherkasov V. R., Mochalova E. N., Babenyshev A. V., Rozenberg J. M., Sokolov I. L., Nikitin M. P. Antibody-directed metal-organic framework nanoparticles for targeted drug delivery // Acta Biomaterialia. - 2020. - Т.103. - C.223-236.

5. Lunin A. V., Korenkov E. S., Mochalova E. N., Nikitin M. P. Green synthesis of size-controlled in vivo biocompatible immunoglobulin-based nanoparticles by a swift thermal formation // ACS Sustainable Chemistry & Engineering. - 2021. - Т.9, №39. - C.13128-13134.

6. Lunin A. V., Kolychev E. L., Mochalova E. N., Cherkasov V. R., Nikitin M. P. Synthesis of highly-specific stable nanocrystalline goethite-like hydrous ferric oxide nanoparticles for biomedical applications by simple precipitation method // Journal of Colloid and Interface Science. - 2019. - Т.541. - C.143-149.

7. Orlov A. V., Pushkarev A. V., Mochalova E. N., Nikitin P. I., Nikitin M. P. Development and label-free investigation of logic-gating biolayers for smart biosensing // Sensors and Actuators B: Chemical. - 2018. - Т.257. - C.971-979.

8. Znoyko S. L., Orlov A. V., Pushkarev A. V., Mochalova E. N., Guteneva N. V., Lunin A. V., Nikitin M. P., Nikitin P. I. Ultrasensitive quantitative detection of small molecules with rapid lateral-flow assay based on high-affinity bifunctional ligand and magnetic nanolabels // Analytica Chimica Acta. - 2018. - Т.1034. - C.161-167.

9. Bragina V. A., Khomyakova E., Orlov A. V., Znoyko S. L., Mochalova E. N., Paniushkina L., Shender V. O., Erbes T., Evtushenko E. G., Bagrov D. V., Lavrenova V. N., Nazarenko I., Nikitin P. I. Highly Sensitive Nanomagnetic Quantification of Extracellular Vesicles by Immunochromatographic Strips: A Tool for Liquid Biopsy // Nanomaterials. - 2022. - Т.12, №9. - C.1579.

10. Lunin A. V., Lizunova A. A., Mochalova E. N., Yakovtseva M. N., Cherkasov V. R., Nikitin M. P., Kolychev E. L. Hematite nanoparticles from unexpected reaction of ferrihydrite with concentrated acids for biomedical applications // Molecules. - 2020. - Т.25, №8. - C.1984.

11. Lunin A. V., Sokolov I. L., Zelepukin I. V., Zubarev I. V., Yakovtseva M. N., Mochalova E. N., Rozenberg J. M., Nikitin M. P., Kolychev E. L. Spindle-like MRI-active europium-doped iron oxide nanoparticles with shape-induced cytotoxicity from simple and facile ferrihydrite crystallization procedure // RSC Advances. - 2020. - Т.10. - C.7301-7312.

12. Orlov A. V., Znoyko S. L., Pushkarev A. V., Mochalova E. N., Guteneva N. V., Lunin A.V., Nikitin M. P., Nikitin P. I. Data on characterization and validation of assays for ultrasensitive quantitative detection of small molecules: Determination of free thyroxine with magnetic and interferometric methods // Data in Brief. - 2018. - Т.21. - C.1603-1611.

13. Krechetov S. P., Miroshkina A. M., Yakovtseva M. N., Mochalova E. N., Babenyshev A. V., Maslov I. V., Loshkarev A. A., Krasnyuk I. I. Radachlorin-containing microparticles for photodynamic therapy // Advanced pharmaceutical bulletin. - 2021. - Т.11, №3. - C.458-468.

Патенты на изобретения

Колычев Е. Л., Лунин А. В., Мочалова Е. Н., Яковцева М. Н., Черкасов В. Р., Никитин М. П. «Способ получения частиц гематита с помощью сильных минеральных кислот», RU № 2 770 641, выдан: 19.04.2022.

Тезисы конференций

1. Mochalova E. N. Rational design of nanoparticle-based agents for effective targeted drug and gene delivery to eukaryotic cells. 19th International Conference Laser Optics ICLO 2020 (Санкт-Петербург, Россия), 2020.

2. Mochalova E. N., Yakovtseva M. N., Krechetov S. P., Cherkasov V. R., Nikitin M. P. Development of magnetic particle-based theranostic agents with high specificity to cellular targets. Cell Death Discovery, International Conference "The Regulation of Proteostasis in Cancer" (Санкт-Петербург, Россия), 2020.

3. Mochalova E. N., Sokolov I. L., Nikitina I. L., Orlov A. V., Shevchenko K. G. Fabrication of highly specific drug delivery nanoagents and investigation of their interaction with cells. Cell Death Discovery, 26th Conference of European Cell Death Organization (Санкт-Петербург, Россия), 2019.

4. Mochalova E. N., Pushkarev A. V., Nikitin P. I., Nikitin M. P. Intelligent nanoparticle-based agents for biomedical applications: rapid design using a lateral flow assay. 18th International Conference Laser Optics ICLO 2018 (Санкт-Петербург, Россия), 2018.

Глава 1. Обзор литературы

1. Наночастицы для биомедицинских применений

Наночастицы, благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, представляют большой интерес в самых различных областях биологии и медицины. На сегодняшний день этот класс материалов применяется для диагностики, магнитной трансфекции, магнитной сепарации, биоимиджинга, терапии (например, для гипертермии, фотодинамической терапии), адресной доставки лекарств и генов и др. [19, 20].

В приложениях адресной доставки наночастицы выступают в качестве носителей низко- и высокомолекулярных лекарств и позволяют увеличить их терапевтический эффект, сводя к минимуму побочные эффекты. Такие наноагенты могут использоваться для защиты лекарственных молекул от деградации и увеличения их времени циркуляции в кровотоке, для обеспечения доставки малорастворимых препаратов и комбинаций нескольких лекарств, для доставки препаратов преимущественно к тканям и клеткам с патологиями (без влияния на здоровые ткани и клетки), а также для прохождения эпителиальных/эндотелиальных барьеров и обеспечения контролируемого действия препаратов на мишень путем регулирования скорости и режима дозирования [2, 3]. Помимо перечисленных выше свойств, наночастицы можно легко модифицировать и включать в их состав инструменты для диагностического мониторинга с помощью различных методов визуализации.

Комплексная стратегия разработки подобных агентов на основе наночастиц и проверки их надлежащей эффективности может состоять из четырех этапов. Первый этап - это синтез наночастиц. Второй этап состоит в наделении наночастиц дополнительным функционалом: загрузке лекарств, покрытии полимером, функционализации биорецепторами, мечении. Третий этап -нацеливание наночастиц на клетки и исследование аспектов их взаимодействия. И, наконец, на конечном четвертом этапе можно исследовать поведение разработанных наноагентов in vivo [21].

1.1 Разнообразие наночастиц и возможности их модификации

На сегодняшний день предложено большое количество различных подходов синтеза, которые позволяют получить широкий набор наночастиц различных материалов, размеров, форм

(Рисунок 1). Среди всего этого многообразия можно подобрать наночастицы, имеющие наиболее подходящие свойства для решения конкретных медико-биологических задач.

Рисунок 1. Многообразие наночастиц (НЧ) по типу материала, размерам и формам (не ограничивается тем, что представлено на рисунке). Адаптировано из [12, 13].

Для наделения наночастиц дополнительным функционалом используют также большое количество различных подходов. Остановимся на некоторых из них на примере липосом. Липосома представляет собой сферическую везикулу, имеющую по крайней мере один липидный бислой. Амфифильные свойства липидов позволяют интегрировать гидрофобные лекарства в липидный бислой, а гидрофильные вещества - во внутреннее водное ядро (Рисунок 2а).

Рисунок 2. Обеспечение дополнительного функционала наночастиц на примере липосомы. а: Загрузка лекарств и генов. б: Покрытие полимером. в: Функционализация биорецепторами. г: Мечение (МРТ - магнитно-резонансная томография). Адаптировано из [15].

Наночастицы при введении в организм начинают активно удаляться из кровотока клетками иммунной системы, а именно клетками системы мононуклеарных фагоцитов (прежде всего, это клетки Купфера в печени и тканевые макрофаги селезенки). Чтобы продлить время циркуляции наночастиц, а следовательно, и повысить терапевтическую эффективность, поверхность наночастиц модифицируют полиэтиленгликолем. Данный полимер уменьшает неспецифичное взаимодействие наночастиц с белками крови и тем самым «прячет» их от распознавания [2]. Также поверхность можно модифицировать и другими полимерами (Рисунок 2б) для стабилизации, обеспечения необходимого поверхностного заряда, который имеет большое влияние на эффективность связывания наночастиц с мембранами клеток и скорость интернализации, или функциональных групп, которые могут быть использованы для дальнейших модификаций различными распознающими биорецепторами.

Распознающие биорецепторы (например, аптамеры, антитела, различные белки и пептиды, низкомолекулярные соединения) используют для специфичного нацеливания наноагентов на патогенные клетки (Рисунок 2в) путем использования молекул, имеющих сродство к молекулам-маркерам мишени (например, к сверхэкспрессированным рецепторам, молекулам микроокружения и др.) [22].

Кроме того, для визуализации наночастиц можно использовать различные метки, например, флуоресцентные или МРТ-контрастные (Рисунок 2г) [23]. Метки могут быть как инкапсулированы внутри липосомы, так и находиться на её поверхности. Важно отметить, что зачастую введение меток в структуру наноагента можно выполнять и на стадии синтеза.

При использовании других типов наночастиц вместо липосом можно получить новый дополнительный функционал. Так, например, квантовые точки обеспечивают уникальные флуоресцентные свойства: широкий спектр поглощения, узкий пик флуоресценции, высокую яркость свечения и фотостабильность [24]. Для магнитных наночастиц при использовании внешних магнитных полей можно контролировать их накопление в нужных тканях (магнитная доставка в опухоль) [25] и разрушать опухолевые клетки локальным нагревом за счет переменного магнитного поля (магнитная гипертермия) [26].

После создания наноагентов необходимо убедиться в их надлежащей эффективности. Для этого необходимо подробно изучить их взаимодействие с клетками, а затем провести исследования in vivo.

1.2 Взаимодействие наночастиц с клетками

Плазматическая мембрана отделяет содержимое клетки от внешней среды и обеспечивает её целостность. Небольшие и неполярные молекулы легко проходят через липидный бислой. Крупные объекты, в том числе наночастицы, и полярные молекулы пересекают мембрану другими способами: ионы и белки транспортируются с помощью специализированных транспортных белков; другие макромолекулы, их агрегаты и наночастицы, как правило, интернализуются посредством эндоцитоза. При эндоцитозе наночастицы располагаются в ограниченных мембраной везикулах, т.н. эндосомах, которые позднее созревают до лизосом или аутофагосом. Наконец, после созревания содержимое мембранных везикул выходит из клетки посредством экзоцитоза. Тем не менее, многие наноматериалы способны преодолевать мембранный барьер до созревания эндосомы и проникать в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мочалова Елизавета Никитична, 2022 год

Список литературы

1. Wong C. H. Estimation of clinical trial success rates and related parameters / Wong C. H., et al. // Biostatistics. - 2019. - Т.20, №2. - C.273-286.

2. Mohanraj V. J. Nanoparticles - A Review / Mohanraj V. J., Chen Y. // Tropical Journal of Pharmaceutical Research. - 2006. - Т.5, №1. - C.561-573.

3. Pearce A. K. Insights into Active Targeting of Nanoparticles in Drug Delivery: Advances in Clinical Studies and Design Considerations for Cancer Nanomedicine / Pearce A. K., O'Reilly R. K. // Bioconjugate chemistry. - 2019. - Т.30, №9. - C.2300-2311.

4. Attia M. F. An overview of active and passive targeting strategies to improve the nanocarriers efficiency to tumour sites / Attia M. F., et al. // The Journal of pharmacy and pharmacology. - 2019.

- Т.71, №8. - C.1185-1198.

5. Anselmo A. C. Nanoparticles in the clinic / Anselmo A. C., Mitragotri S. // Bioengineering & translational medicine. - 2016. - Т.1, №1. - C.10-29.

6. Anselmo A. C. Nanoparticles in the clinic: An update / Anselmo A. C., Mitragotri S. // Bioengineering & translational medicine. - 2019. - Т.4, №3. - e10143.

7. Zelepukin I. V. Nanoparticle-based drug delivery via RBC-hitchhiking for the inhibition of lung metastases growth / Zelepukin I. V., et al. // Nanoscale. - 2019. - Т.11, №4. - C.1636-1646.

8. Nikitin M. P. Enhancement of the blood-circulation time and performance of nanomedicines via the forced clearance of erythrocytes / Nikitin M. P., et al. // Nature biomedical engineering. - 2020. - Т.4, №7. - C.717-731.

9. de Back D. Z. Of macrophages and red blood cells; a complex love story / de Back D. Z., et al. // Frontiers in physiology. - 2014. - Т.5. - C.9.

10. Hamilton G. Circulating tumor cell interactions with macrophages: implications for biology and treatment / Hamilton G., Rath B. // Translational lung cancer research. - 2017. - Т.6, №4. - C.418-430.

11. Baxter A. E. Macrophage infection via selective capture of HIV-1-infected CD4+ T cells / Baxter A. E., et al. // Cell host & microbe. - 2014. - Т.16, №6. - C.711-721.

12. Itani R. siRNA Conjugated Nanoparticles-A Next Generation Strategy to Treat Lung Cancer / Itani R., Al Faraj A. // International journal of molecular sciences. - 2019. - Т.20, №23. - C.6088.

13. Heinz H. Nanoparticle decoration with surfactants: Molecular interactions, assembly, and applications / Heinz H., et al. // Surface Science Reports. - 2017. - Т.72, №1. - C.1-58.

14. Liu Y. Development of High-Drug-Loading Nanoparticles / Liu Y., et al. // ChemPlusChem. - 2020.

- Т.85, №9. - C.2143-2157.

15. Riaz M. K. Surface Functionalization and Targeting Strategies of Liposomes in Solid Tumor Therapy: A Review / Riaz M. K., et al. // International journal of molecular sciences. - 2018. - Т.19, №1.

- C.195.

16. Tregubov A. A. Advanced Smart Nanomaterials with Integrated Logic-Gating and Biocomputing: Dawn of Theranostic Nanorobots / Tregubov A. A., et al. // Chemical reviews. - 2018. - Т.118, №20.

- C.10294-10348.

17. Cho E. C. Understanding the role of surface charges in cellular adsorption versus internalization by selectively removing gold nanoparticles on the cell surface with a I2/KI etchant / Cho E. C., et al. // Nano letters. - 2009. - Т.9, №3. - C.1080-1084.

18. Chu Z. Unambiguous observation of shape effects on cellular fate of nanoparticles / Chu Z., et al. // Scientific reports. - 2014. - Т.4. - C.4495.

19. McNamara K. Nanoparticles in biomedical applications / McNamara K., Tofail S. A. M. // Advances in Physics: X. - 2017. - Т.2, №1. - C.54-88.

20. Yakovtseva M. N. Magnetic and Gold Nanoparticles Optimized for Cancer Treatment via Cell Hitchhiking / Yakovtseva M. N., et al. // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). - 2020.

- C.1.

21. Lu A.-H. Magnetic nanoparticles: synthesis, protection, functionalization, and application / Lu A.-H., et al. // Angewandte Chemie. - 2007. - Т.46, №8. - C.1222-1244.

22. Arruebo M. Magnetic nanoparticles for drug delivery / Arruebo M., et al. // Nano Today. - 2007. - Т.2, №3. - C.22-32.

23. Hak S. A high relaxivity Gd(III)DOTA-DSPE-based liposomal contrast agent for magnetic resonance imaging / Hak S., et al. // European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics. - 2009. - Т.72, №2. - C.397-404.

24. Chinen A. B. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence / Chinen A. B., et al. // Chemical reviews. - 2015. - Т.115, №19. - C.10530-10574.

25. Pankhurst Q. A. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine / Pankhurst Q. A., et al. // Journal of Physics D: Applied Physics. - 2003. - Т.36. - C.167-181.

26. Giustini A. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia in cancer treatment / Giustini A. J., et al. // Nano LIFE. - 2010. - Т.1, №01n02.

27. Manzanares D. Endocytosis: The Nanoparticle and Submicron Nanocompounds Gateway into the Cell / Manzanares D., Ceña V. // Pharmaceutics. - 2020. - Т.12, №4. - C.371.

28. Verma A. Effect of surface properties on nanoparticle-cell interactions / Verma A., Stellacci F. // Small.

- 2010. - Т.6, №1. - C.12-21.

29. Chithrani B. D. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells / Chithrani B. D., et al. // Nano letters. - 2006. - Т.6, №4. - C.662-668.

30. Wang J. A Confocal Endoscope for Cellular Imaging / Wang J., et al. // Engineering. - 2015. - Т.1, №3. - C.351-360.

31. Shang L. Nanoparticle interactions with live cells: Quantitative fluorescence microscopy of nanoparticle size effects / Shang L., et al. // Beilstein journal of nanotechnology. - 2014. - Т.5.

- C.2388-2397.

32. Wang S. H. Dendrimer-Functionalized Iron Oxide Nanoparticles for Specific Targeting and Imaging of Cancer Cells / Wang S. H., et al. // Advanced Functional Materials. - 2007. - Т.17, №16. - C.3043-3050.

33. Wang T. Cellular uptake of nanoparticles by membrane penetration: a study combining confocal microscopy with FTIR spectroelectrochemistry / Wang T., et al. // ACS nano. - 2012. - Т.6, №2.

- C.1251-1259.

34. Braun G. B. Etchable plasmonic nanoparticle probes to image and quantify cellular internalization / Braun G. B., et al. // Nature materials. - 2014. - Т.13, №9. - C.904-911.

35. A Beginners' Guide to Scanning Electron Microscopy / ред. Ul-Hamid A. - Cham: Springer International Publishing, 2018. - 14 c.

36. Mohammed A. Scanning electron microscopy (SEM): a review / Mohammed A., Abdullah A. // Proceedings of 2018 International Conference on Hydraulics and Pneumatics. - C.77-85.

37. Goldstein A. High resolution SEM imaging of gold nanoparticles in cells and tissues / Goldstein A., et al. // Journal of microscopy. - 2014. - Т.256, №3. - C.237-247.

38. Singh A. V. Cancer cells biomineralize ionic gold into nanoparticles-microplates via secreting defense proteins with specific gold-binding peptides / Singh A. V., et al. // Acta biomaterialia. - 2018. - T.71.

- C.61-71.

39. Hermann R. Immunogold labeling in scanning electron microscopy / Hermann R., et al. // Histochemistry and Cell Biology. - 1996. - T.106. - C.31-39.

40. Adan A. Flow cytometry: basic principles and applications / Adan A., et al. // Critical reviews in biotechnology. - 2017. - T.37, №2. - C.163-176.

41. McKinnon K. M. Flow Cytometry: An Overview / McKinnon K. M. // Current protocols in immunology. - 2018. - T.120. - 5.1.1-5.1.11.

42. Dashkova V. Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis / Dashkova V., et al. // Methods.

- 2017. - T.112. - C.188-200.

43. Cosette J. Combination of imaging flow cytometry and time-lapse microscopy for the study of labelfree morphology dynamics of hematopoietic cells / Cosette J., et al. // Cytometry. Part A. - 2017.

- T.91, №3. - C.254-260.

44. Hennig H. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning / Hennig H., et al. // Methods. - 2017. - T.112. - C.201-210.

45. Probst C. Characterization of Protein Particles in Therapeutic Formulations Using Imaging Flow Cytometry / Probst C., et al. // Journal of pharmaceutical sciences. - 2017. - T.106, №8. - C.1952-1960.

46. Krechetov S. P. Radachlorin-Containing Microparticles for Photodynamic Therapy / Krechetov S. P., et al. // Advanced pharmaceutical bulletin. - 2021. - T.11, №3. - C.458-468.

47. Lunin A. V. Hematite Nanoparticles from Unexpected Reaction of Ferrihydrite with Concentrated Acids for Biomedical Applications / Lunin A. V., et al. // Molecules. - 2020. - T.25, №8. - C.1984.

48. Lunin A. V. Synthesis of highly-specific stable nanocrystalline goethite-like hydrous ferric oxide nanoparticles for biomedical applications by simple precipitation method / Lunin A. V., et al. // Journal of colloid and interface science. - 2019. - T.541. - C.143-149.

49. Cherkasov V. R. Antibody-directed metal-organic framework nanoparticles for targeted drug delivery / Cherkasov V. R., et al. // Acta biomaterialia. - 2020. - T.103. - C.223-236.

50. Lunin A. V. Green Synthesis of Size-Controlled in Vivo Biocompatible Immunoglobulin-Based Nanoparticles by a Swift Thermal Formation / Lunin A. V., et al. // ACS Sustainable Chemistry & Engineering. - 2021. - T.9, №39. - C.13128-13134.

51. Lunin A. V. Spindle-like MRI-active europium-doped iron oxide nanoparticles with shape-induced cytotoxicity from simple and facile ferrihydrite crystallization procedure / Lunin A. V., et al. // RSC Advances. - 2020. - T.10. - C.7301-7312.

52. Ploppa A. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative burst / Ploppa A., et al. // Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. - 2011. - T.71, №5. - C.362-369.

53. Rhys H. I. Neutrophil Microvesicles from Healthy Control and Rheumatoid Arthritis Patients Prevent the Inflammatory Activation of Macrophages / Rhys H. I., et al. // EBioMedicine. - 2018. - T.29.

- C.60-69.

54. Kim E. W. Vitamin D status contributes to the antimicrobial activity of macrophages against Mycobacterium leprae / Kim E. W., et al. // PLoS neglected tropical diseases. - 2018. - T.12, №7.

- e0006608.

55. Lippeveld M. Classification of Human White Blood Cells Using Machine Learning for Stain-Free Imaging Flow Cytometry / Lippeveld M., et al. // Cytometry. Part A. - 2020. - T.97, №3. - C.308-319.

56. Voronin D. V. Detection of Rare Objects by Flow Cytometry: Imaging, Cell Sorting, and Deep Learning Approaches / Voronin D. V., et al. // International journal of molecular sciences. - 2020.

- T.21, №7. - C.2323.

57. Saeys Y. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data / Saeys Y., et al. // Nature reviews. Immunology. - 2016. - T.16, №7. - C.449-462.

58. Doan M. Diagnostic Potential of Imaging Flow Cytometry / Doan M., et al. // Trends in biotechnology.

- 2018. - T.36, №7. - C.649-652.

59. Mochalova E. N. Precise Quantitative Analysis of Cell Targeting by Particle-Based Agents Using Imaging Flow Cytometry and Convolutional Neural Network / Mochalova E. N., et al. // Cytometry. Part A. - 2020. - T.97, №3. - C.279-287.

60. Kotov I. A. Precise Quantitative Analysis of Cell Targeting by Particle-Based Agents Using Imaging Flow Cytometry and Deep Learning Object Detection / Kotov I. A., et al. // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). - 2020. - C.1.

61. Erdbrügger U. Imaging flow cytometry elucidates limitations of microparticle analysis by conventional flow cytometry / Erdbrügger U., et al. // Cytometry. Part A. - 2014. - T.85, №9. - C.756-770.

62. Görgens A. Optimisation of imaging flow cytometry for the analysis of single extracellular vesicles by using fluorescence-tagged vesicles as biological reference material / Görgens A., et al. // Journal of extracellular vesicles. - 2019. - T.8, №1. - C.1587567.

63. Headland S. E. Cutting-edge analysis of extracellular microparticles using ImageStream(X) imaging flow cytometry / Headland S. E., et al. // Scientific reports. - 2014. - T.4. - C.5237.

64. Mochalova E. N. Imaging flow cytometry data analysis using convolutional neural network for quantitative investigation of phagocytosis / Mochalova E. N., et al. // Biotechnology and bioengineering. - 2021. - T.119, №2. - C.626-635.

65. Maan H. Quantifying the effect of A. thaliana root on antibiotic production in the beneficial bacterium, B. subtilis / Maan H., et al. // bioRxiv. - 2021. - .

66. Luo S. Machine-Learning-Assisted Intelligent Imaging Flow Cytometry: A Review / Luo S., et al. // Advanced Intelligent Systems. - 2021. - T.3, №11. - C.2100073.

67. Nitta, N. Intelligent Image-Activated Cell Sorting / N. Nitta, et al. // Cell. - 2018. - T.175, №1. - 266-276.e13.

68. Eulenberg P. Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning / Eulenberg P., et al. // Nature communications. - 2017. - T.8, №1. - C.463.

69. Doan M. Objective assessment of stored blood quality by deep learning / Doan M., et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2020. - T.117, №35.

- C.21381-21390.

70. Göröcs Z. A deep learning-enabled portable imaging flow cytometer for cost-effective, high-throughput, and label-free analysis of natural water samples / Göröcs Z., et al. // Light, science & applications. - 2018. - T.7. - C.66.

71. Dunker S. Pollen analysis using multispectral imaging flow cytometry and deep learning / Dunker S., et al. // The New phytologist. - 2021. - T.229, №1. - C.593-606.

72. Nikitin M.P. Ultrasensitive detection enabled by nonlinear magnetization of nanomagnetic labels / Nikitin M.P., et al. // Nanoscale. - 2018. - T.10, №24. - C.11642-11650.

73. Guteneva N. V. Rapid lateral flow assays based on the quantification of magnetic nanoparticle labels for multiplexed immunodetection of small molecules: application to the determination of drugs of abuse / Guteneva N. V., et al. // Microchimica Acta. - 2019. - Т.186, №9. - C.621.

74. Bragina V. A. Analytical Platform with Selectable Assay Parameters Based on Three Functions of Magnetic Nanoparticles: Demonstration of Highly Sensitive Rapid Quantitation of Staphylococcal Enterotoxin B in Food / Bragina V. A., et al. // Analytical chemistry. - 2019. - Т.91, №15. - C.9852-9857.

75. Znoyko S. L. Nanomagnetic lateral flow assay for high-precision quantification of diagnostically relevant concentrations of serum TSH / Znoyko S. L., et al. // Talanta. - 2020. - Т.216. - C.120961.

76. Orlov A. V. Ultrasensitive interferometric and magnetic analytical systems for simultaneous express detection of multiple disease biomarkers / Orlov A. V., et al. // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). - 2020. - C.1.

77. Znoyko S. L. Multiparametric Characterization and Quantitative Detection of Extracellular Vesicles by a Combination of Optical and Magnetic Techniques / Znoyko S. L., et al. // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO). - 2020. - C.1.

78. Bragina V. A. Highly Sensitive Nanomagnetic Quantification of Extracellular Vesicles by Immunochromatographic Strips: A Tool for Liquid Biopsy / Bragina V. A., et al. // Nanomaterials.

- 2022. - Т.12, №9. - C.1579.

79. Tregubov A. A. Magnetic hybrid magnetite/metal organic framework nanoparticles: facile preparation, post-synthetic biofunctionalization and tracking in vivo with magnetic methods / Tregubov A. A., et al. // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. - 2018. - Т.449. - C.590-596.

80. Zelepukin I. V. Fast processes of nanoparticle blood clearance: Comprehensive study / Zelepukin I. V., et al. // Journal of Controlled Release. - 2020. - Т.326. - C.181-191.

81. Shipunova V. O. MPQ-cytometry: a magnetism-based method for quantification of nanoparticle-cell interactions / Shipunova V. O., et al. // Nanoscale. - 2016. - Т.8, №25. - C.12764-12772.

82. Mohammadinejad R. Necrotic, apoptotic and autophagic cell fates triggered by nanoparticles / Mohammadinejad R., et al. // Autophagy. - 2019. - Т.15, №1. - C.4-33.

83. Sohaebuddin S. K. Nanomaterial cytotoxicity is composition, size, and cell type dependent / Sohaebuddin S. K., et al. - 2010. - Т.7, №22. - C.1-17.

84. Kroemer G. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death / Kroemer G., et al. // Cell Death & Differentiation. - 2009. - Т.16. - C.3-11.

85. Sun H. Gold Nanoparticle-Induced Cell Death and Potential Applications in Nanomedicine / Sun H., et al. // International journal of molecular sciences. - 2018. - Т.19, №3. - C.754.

86. Asadzadeh Z. An Emerging Approach for Combination Therapy of Cancer: The Role of Immunogenic Cell Death / Asadzadeh Z., et al. // Cancers. - 2020. - Т.12. - C.1047.

87. Lemasters J. J. Mitochondrial dysfunction in the pathogenesis of necrotic and apoptotic cell death / Lemasters J. J., et al. // Journal of Bioenergetics and Biomembranes. - 1999. - Т.31, №4. - C.305-319.

88. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death / Elmore S. // Toxicologic pathology. - 2007.

- Т.35, №4. - C.495-516.

89. Fink S. L. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells / Fink S. L., Cookson B. T. // Infection and immunity. - 2005. - Т.73, №4. - C.1907-1916.

90. Patil A. A. Cell death in culture: Molecular mechanisms, detections, and inhibition strategies / Patil A. A., et al. // Journal of Industrial and Engineering Chemistry. - 2020. - Т.91. - C.37-53.

91. Ly J. D. The mitochondrial membrane potential in apoptosis; an update / Ly J. D., et al. // Apoptosis.

- 2003. - Т.8. - C.115-128.

92. Sivandzade F. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe / Sivandzade F., et al. // Bio-protocol. - 2019. - T.9, №1. - e3128.

93. Porter A. G. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis / Porter A. G., Jänicke R. U. // Cell Death & Differentiation. - 1999. - T.6, №2. - C.99-104.

94. Forrester H. B. Using computerized video time lapse for quantifying cell death of X-irradiated rat embryo cells transfected with c-myc or c-Ha-ras / Forrester H. B., et al. // Cancer research. - 1999.

- T.59, №4. - C.931-939.

95. Crowley L. C. Analyzing Cell Death by Nuclear Staining with Hoechst 33342 / Crowley L. C., et al. // Cold Spring Harbor protocols. - 2016. - T.2016, №9. - C.778-781.

96. Belloc F. A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells / Belloc F., et al. // Cytometry. - 1994.

- T.17, №1. - C.59-65.

97. Zhang M. BAPTA blocks DNA fragmentation and chromatin condensation downstream of caspase-3 and DFF activation in HT-induced apoptosis in HL-60 cells / Zhang M., et al. // Apoptosis. - 2001.

- T.6. - C.291-297.

98. Cummings B. S. Measurement of cell death in mammalian cells / Cummings B. S., Schnellmann R. G. // Current protocols in pharmacology. - 2004. - T.Chapter 12. - Unit 12.8.

99. Krysko D. V. Apoptosis and necrosis: detection, discrimination and phagocytosis / Krysko D. V., et al. // Methods. - 2008. - T.44, №3. - C.205-221.

100. Crowley L. C. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry / Crowley L. C., et al. // Cold Spring Harbor protocols. - 2016. - T.2016, №11. - C.953-957.

101. Ray A. Isolation of mouse peritoneal cavity cells / Ray A., Dittel B. N. // Journal of visualized experiments: JoVE. - 2010. - №35. - C.1488.

102. Yamamoto Y. Genetic control of macrophage susceptibility to infection by Legionella pneumophila / Yamamoto Y., et al. // FEMS Microbiology Immunology. - 1992. - T.89. - C.137-146.

103. Ren S. Faster R-CNN: Towards Real-Time Object Detection with Region Proposal Networks / Ren S., et al. // arXiv. - 2015. - 1506.01497.

104. Taylor L. Improving Deep Learning with Generic Data Augmentation / Taylor L., Nitschke G. // Proceedings of the 2018 IEEE Symposium Series on Computational Intelligence (SSCI 2018). - 2018.

- C.1542-1547.

105. Ringaci A. Metal-organic frameworks for simultaneous gene and small molecule delivery in vitro and in vivo / Ringaci A., et al. // Chemical Engineering Journal. - 2021. - T.418. - C.129386.

106. Sokolov I. L. Smart materials on the way to theranostic nanorobots: Molecular machines and nanomotors, advanced biosensors, and intelligent vehicles for drug delivery / Sokolov I. L., et al. // Biochimica et biophysica acta. General subjects. - 2017. - T.1861, №6. - C.1530-1544.

107. Jose J. Magnetic nanoparticles for hyperthermia in cancer treatment: an emerging tool / Jose J., et al. // Environmental science and pollution research international. - 2020. - T.27, №16. - C.19214-19225.

108. Blasiak B. Applications of Nanoparticles for MRI Cancer Diagnosis and Therapy / Blasiak B., et al. // Journal of Nanomaterials. - 2013. - T.2013. - C.1-12.

109. Sizikov A. A. Magnetofection In Vivo by Nanomagnetic Carriers Systemically Administered into the Bloodstream / Sizikov A. A., et al. // Pharmaceutics. - 2021. - T.13, №11. - C.1927.

110. Szaloki G. Compensation in multicolor flow cytometry / Szaloki G., Goda K. // Cytometry. Part A.

- 2015. - T.87, №11. - C.982-985.

111. Ipseiz N. Effective In Vivo Gene Modification in Mouse Tissue-Resident Peritoneal Macrophages by Intraperitoneal Delivery of Lentiviral Vectors / Ipseiz N., et al. // Molecular therapy. Methods & clinical development. - 2020. - Т.16. - C.21-31.

112. Pietkiewicz S. Quantification of apoptosis and necroptosis at the single cell level by a combination of Imaging Flow Cytometry with classical Annexin V/propidium iodide staining / Pietkiewicz S., et al. // Journal of immunological methods. - 2015. - Т.423. - C.99-103.

113. Xiao Y. Object Detection Based on Faster R-CNN Algorithm with Skip Pooling and Fusion of Contextual Information / Xiao Y., et al. // Sensors. - 2020. - Т.20, №19. - C.5490.

114. Girshick R. Region-Based Convolutional Networks for Accurate Object Detection and Segmentation / Girshick R., et al. // IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. - 2016. - Т.38, №1. - C.142-158.

115. Hasan S. A Shift in Myeloid Cell Phenotype via Down Regulation of Siglec-1 in Island Macrophages of Bone Marrow Is Associated With Decreased Late Erythroblasts Seen in Anemia of Critical Illness / Hasan S., et al. // Frontiers in medicine. - 2019. - Т.6. - C.260.

116. Tay J. Imaging flow cytometry reveals that granulocyte colony-stimulating factor treatment causes loss of erythroblastic islands in the mouse bone marrow / Tay J., et al. // Experimental hematology. - 2020.

- Т.82. - C.33-42.

117. Salama A. Drug-induced immune hemolytic anemia / Salama A. // Expert opinion on drug safety.

- 2009. - Т.8, №1. - C.73-79.

118. Brenner J. S. Red Blood Cell Hitchhiking: A Novel Approach for Vascular Delivery of Nanocarriers / Brenner J. S., et al. // Annual review of biomedical engineering. - 2021. - Т.23. - C.225-248.

119. Bracq L. Mechanisms for Cell-to-Cell Transmission of HIV-1 / Bracq L., et al. // Frontiers in immunology. - 2018. - Т.9. - C.260.

120. Rieger A. M. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms / Rieger A. M., et al. // Developmental and comparative immunology. - 2010. - Т.34, №11. - C.1144-1159.

121. Pelletier M. G. H. Characterization of neutrophils and macrophages from ex vivo-cultured murine bone marrow for morphologic maturation and functional responses by imaging flow cytometry / Pelletier M. G. H., et al. // Methods. - 2017. - Т.112. - C.124-146.

122. Orlandi F. Combination of epitope-optimized DNA vaccination and passive infusion of monoclonal antibody against HER2/neu leads to breast tumor regression in mice / Orlandi F., et al. // Vaccine.

- 2011. - Т.29, №20. - C.3646-3654.

123. Hermanson G. T. Bioconjugate techniques / Hermanson G. T. - San Diego: Academic Press, 2008.

- 1202 c.

124. Mochalova E. N. Rational Design of Nanoparticle-Based Agents for Effective Targeted Drug and Gene Delivery to Eukaryotic Cells / Mochalova E. N. // 2020 International Conference Laser Optics (ICLO).

- 2020. - C.1.

125. Guo H. Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability / Guo H., Barnard A. S. // Journal of Materials Chemistry A. - 2013. - Т.1, №1. - C.27-42.

126. Shokrollahi, H. A review of the magnetic properties, synthesis methods and applications of maghemite / H. Shokrollahi // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. - 2017. - Т.426. - C.74-81.

127. Worm H. U. On the superparamagnetic - stable single domain transition for magnetite, and frequency dependence of susceptibility / Worm H. U. // Geophysical Journal International. - 1998. - Т.133, №1.

- C.201-206.

128. Hu Y. Construction of iron oxide nanoparticle-based hybrid platforms for tumor imaging and therapy / Hu Y., et al. // Chemical Society reviews. - 2018. - T.47, №5. - C.1874-1900.

129. Vazquez-Prada K. X. Targeted Molecular Imaging of Cardiovascular Diseases by Iron Oxide Nanoparticles / Vazquez-Prada K. X., et al. // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology.

- 2021. - T.41, №2. - C.601-613.

130. Kievit F. M. PEI-PEG-Chitosan Copolymer Coated Iron Oxide Nanoparticles for Safe Gene Delivery: synthesis, complexation, and transfection / Kievit F. M., et al. // Advanced functional materials. - 2009.

- T.19, №14. - C.2244-2251.

131. Lu M. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease / Lu M., et al. // American journal of hematology. - 2010. - T.85, №5. - C.315-319.

132. Vangijzegem T. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics / Vangijzegem T., et al. // Expert opinion on drug delivery. - 2019. - T.16, №1. - C.69-78.

133. Arami H. In vivo delivery, pharmacokinetics, biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles / Arami H., et al. // Chemical Society reviews. - 2015. - T.44, №23. - C.8576-8607.

134. IDEAS User Manual 6.0, 2013. - 332 c.

135. Rodrigues M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer / Rodrigues M. A. // Cytometry. Part A. - 2018. - T.93, №7. - C.706-726.

136. Kina T. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage / Kina T., et al. // British Journal of Haematology. - 2000. - T.109. - C.280-287.

137. Mortimore J. L. Analysis of red and yellow ochre samples from Clearwell Caves and Catalhoyük by vibrational spectroscopy and other techniques / Mortimore J. L., et al. // Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy. - 2004. - T.60, №5. - C.1179-1188.

138. Lee J. H. Rod-shaped iron oxide nanoparticles are more toxic than sphere-shaped nanoparticles to murine macrophage cells / Lee J. H., et al. // Environmental toxicology and chemistry. - 2014. - T.33, №12. - C.2759-2766.

139. Huang X. The effect of the shape of mesoporous silica nanoparticles on cellular uptake and cell function / Huang X., et al. // Biomaterials. - 2010. - T.31, №3. - C.438-448.

140. Tarantola M. Toxicity of gold-nanoparticles: synergistic effects of shape and surface functionalization on micromotility of epithelial cells / Tarantola M., et al. // Nanotoxicology. - 2011. - T.5, №2.

- C.254-268.

141. Carnovale C. Identifying Trends in Gold Nanoparticle Toxicity and Uptake: Size, Shape, Capping Ligand, and Biological Corona / Carnovale C., et al. // ACS Omega. - 2019. - T.4, №1. - C.242-256.

142. Ahamed M. Role of Zn doping in oxidative stress mediated cytotoxicity of TiO2 nanoparticles in human breast cancer MCF-7 cells / Ahamed M., et al. // Scientific reports. - 2016. - T.6. - C.30196.

143. Ahamed M. Ag-doping regulates the cytotoxicity of TiO2 nanoparticles via oxidative stress in human cancer cells / Ahamed M., et al. // Scientific reports. - 2017. - T.7, №1. - C.17662.

144. Thurber A. Improving the selective cancer killing ability of ZnO nanoparticles using Fe doping / Thurber A., et al. // Nanotoxicology. - 2012. - T.6, №4. - C.440-452.

145. Falsafi M. Smart metal organic frameworks: focus on cancer treatment / Falsafi M., et al. // Biomaterials science. - 2021. - T.9, №5. - C.1503-1529.

146. Khan N. A. Adsorptive removal of hazardous materials using metal-organic frameworks (MOFs): a review / Khan N. A., et al. // Journal of hazardous materials. - 2013. - T.244-245. - C.444-456.

147. Ghanbari T. A review on production of metal organic frameworks (MOF) for CO2 adsorption / Ghanbari T., et al. // The Science of the total environment. - 2020. - T.707. - C.135090.

148. Li Y. Gas adsorption and storage in metal-organic framework MOF-177 / Li Y., Yang R. T. // Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. - 2007. - Т.23, №26. - C.12937-12944.

149. Wang S. Synergistic catalysis of ZIF-67@CNTOH in thermal decomposition of ammonium Perchlorate / Wang S., et al. // Journal of Materials Science. - 2020. - Т.55, №11. - C.4646-4655.

150. Lu G. Covalently integrated core-shell MOF@COF hybrids as efficient visible-light-driven photocatalysts for selective oxidation of alcohols / Lu G., et al. // Journal of Energy Chemistry. - 2020.

- Т.43. - C.8-15.

151. Lee J. Y. Metal-organic framework materials as catalysts / Lee J. Y., et al. // Chemical Society reviews.

- 2009. - Т.38, №5. - C.1450-1459.

152. Majumdar S. Mg-MOF-74/Polyvinyl acetate (PVAc) mixed matrix membranes for CO2 separation / Majumdar S., et al. // Separation and Purification Technology. - 2020. - Т.238. - C.116411.

153. Liu B. Improved CO2 separation performance and interfacial affinity of mixed matrix membrane by incorporating UiO-66-PEI@[bmim][Tf2N] particles / Liu B., et al. // Separation and Purification Technology. - 2020. - Т.239. - C.116519.

154. Liu J. Single-phase ZnCo2O4 derived ZnO-CoO mesoporous microspheres encapsulated by nitrogen-doped carbon shell as anode for high-performance lithium-ion batteries / Liu J., et al. // Journal of Alloys and Compounds. - 2020. - Т.825. - C.153951.

155. Wen X. Applications of metal-organic framework-derived materials in fuel cells and metal-air batteries / Wen X., et al. // Coordination Chemistry Reviews. - 2020. - Т.409. - C.213214.

156. Dong L. An enzyme-free ultrasensitive electrochemical immunosensor for calprotectin detection based on PtNi nanoparticles functionalized 2D Cu-metal organic framework nanosheets / Dong L., et al. // Sensors and Actuators B: Chemical. - 2020. - Т.308. - C.127687.

157. Yin Y. Protein-Metal Organic Framework Hybrid Composites with Intrinsic Peroxidase-like Activity as a Colorimetric Biosensing Platform / Yin Y., et al. // ACS applied materials & interfaces. - 2016.

- Т.8, №42. - C.29052-29061.

158. Xu W. Glucose Oxidase-Integrated Metal-Organic Framework Hybrids as Biomimetic Cascade Nanozymes for Ultrasensitive Glucose Biosensing / Xu W., et al. // ACS applied materials & interfaces.

- 2019. - Т.11, №25. - C.22096-22101.

159. Meng Z. Functional metal-organic framework-based nanocarriers for accurate magnetic resonance imaging and effective eradication of breast tumor and lung metastasis / Meng Z., et al. // Journal of colloid and interface science. - 2021. - Т.581, №A. - C.31-43.

160. Zhang H. Theranostic Mn-Porphyrin Metal-Organic Frameworks for Magnetic Resonance Imaging-Guided Nitric Oxide and Photothermal Synergistic Therapy / Zhang H., et al. // ACS applied materials & interfaces. - 2018. - Т.10, №34. - C.28390-28398.

161. Lawson H. D. Metal-Organic Frameworks for Drug Delivery: A Design Perspective / Lawson H. D., et al. // ACS applied materials & interfaces. - 2021. - Т.13, №6. - C.7004-7020.

162. Pandya S. R. Metal-Organic Framework-Based Nanostructures for Biomedical Applications / Pandya S. R., Undre S. B., 2021. - 20 c.

163. Ma X. Metal-organic frameworks towards bio-medical applications / Ma X., et al. // Materials Chemistry Frontiers. - 2021. - Т.5, №15. - C.5573-5594.

164. Ma Y. Metal-Organic Frameworks and Their Composites Towards Biomedical Applications / Ma Y., et al. // Frontiers in molecular biosciences. - 2021. - Т.8. - C.805228.

165. Cabrera-Garcia A. Amino modified metal-organic frameworks as pH-responsive nanoplatforms for safe delivery of camptothecin / Cabrera-Garcia A., et al. // Journal of colloid and interface science.

- 2019. - Т.541. - C.163-174.

166. Dong K. Metal-Organic Framework-Based Nanoplatform for Intracellular Environment-Responsive Endo/Lysosomal Escape and Enhanced Cancer Therapy / Dong K., et al. // ACS applied materials & interfaces. - 2018. - T.10, №38. - C.31998-32005.

167. Carrillo-Carrion C. Aqueous Stable Gold Nanostar/ZIF-8 Nanocomposites for Light-Triggered Release of Active Cargo Inside Living Cells / Carrillo-Carrion C., et al. // Angewandte Chemie. - 2019.

- T.131, №21. - C.7152-7156.

168. Roth Stefaniak K. Photo-triggered release of 5-fluorouracil from a MOF drug delivery vehicle / Roth Stefaniak K., et al. // Chemical communications. - 2018. - T.54, №55. - C.7617-7620.

169. Yang X. Nanoscale ATP-Responsive Zeolitic Imidazole Framework-90 as a General Platform for Cytosolic Protein Delivery and Genome Editing / Yang X., et al. // Journal of the American Chemical Society. - 2019. - T.141, №9. - C.3782-3786.

170. Sun Q. Hyaluronic acid-targeted and pH-responsive drug delivery system based on metal-organic frameworks for efficient antitumor therapy / Sun Q., et al. // Biomaterials. - 2019. - T.223. - C.119473.

171. Chen Y. Folic acid-nanoscale gadolinium-porphyrin metal-organic frameworks: fluorescence and magnetic resonance dual-modality imaging and photodynamic therapy in hepatocellular carcinoma / Chen Y., et al. // International journal of nanomedicine. - 2019. - T.14. - C.57-74.

172. Shi Z. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor / Shi Z., et al. // Biomaterials science. - 2018. - T.6, №10. - C.2582-2590.

173. Dong K. Facile preparation of metal-organic frameworks-based hydrophobic anticancer drug delivery nanoplatform for targeted and enhanced cancer treatment / Dong K., et al. // Talanta. - 2019. - T.194.

- C.703-708.

174. Liu X. Co-Administration of iRGD with Sorafenib-Loaded Iron-Based Metal-Organic Framework as a Targeted Ferroptosis Agent for Liver Cancer Therapy / Liu X., et al. // International journal of nanomedicine. - 2021. - T.16. - C.1037-1050.

175. Chen W.-H. Targeted VEGF-triggered release of an anti-cancer drug from aptamer-functionalized metal-organic framework nanoparticles / Chen W.-H., et al. // Nanoscale. - 2018. - T.10, №10.

- C.4650-4657.

176. Jia Q. A y-cyclodextrin-based metal-organic framework embedded with graphene quantum dots and modified with PEGMA via SI-ATRP for anticancer drug delivery and therapy / Jia Q., et al. // Nanoscale. - 2019. - T.11, №43. - C.20956-20967.

177. Ranson M. R. Treatment of advanced breast cancer with sterically stabilized liposomal doxorubicin: results of a multicenter phase II trial / Ranson M. R., et al. // Journal of Clinical Oncology. - 1997.

- T.15, №10. - C.3185-3191.

178. Perez E. A. Cardiac safety analysis of doxorubicin and cyclophosphamide followed by paclitaxel with or without trastuzumab in the North Central Cancer Treatment Group N9831 adjuvant breast cancer trial / Perez E. A., et al. // Journal of Clinical Oncology. - 2008. - T.26, №8. - C.1231-1238.

179. Rivankar S. An overview of doxorubicin formulations in cancer therapy / Rivankar S. // Journal of cancer research and therapeutics. - 2014. - T.10, №4. - C.853-858.

180. Löwenberg B. High-Dose Daunorubicin in Older Patients with Acute Myeloid Leukemia / Löwenberg B., et al. // The New England Journal of Medicine. - 2009. - T.361. - C.1235-1248.

181. Wallberg F. Analysis of Apoptosis and Necroptosis by Fluorescence-Activated Cell Sorting / Wallberg F., et al. // Cold Spring Harbor protocols. - 2016. - T.2016, №4. - pdb.prot087387.

182. Ott M. Promotion of glioblastoma cell motility by enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) is mediated by AXL receptor kinase / Ott M., et al. // PloS one. - 2012. - T.7, №10. - e47663.

183. Nikitin M. P. Biocomputing based on particle disassembly / Nikitin M. P., et al. // Nature nanotechnology. - 2014. - T.9, №9. - C.716-722.

184. Shawn M. D. A Logic-Gated Nanorobot for Targeted Transport of Molecular Payloads / Shawn M. D., et al. // Science. - 2012. - T.335, №6070. - C.831-834.

185. Pushkarev A. V. Smart Biolayers on Solid Phase: Rational Design and Investigation by Spectral-Phase Interferometry / Pushkarev A. V., et al. // 2018 International Conference Laser Optics (ICLO). - 2018. - C.563.

186. Smith E. A. Formation, Spectroscopic Characterization, and Application of Sulfhydryl-Terminated Alkanethiol Monolayers for the Chemical Attachment of DNA onto Gold Surfaces / Smith E. A., et al. // Langmuir. - 2001. - T.17, №8. - C.2502-2507.

187. Laborde H. M. Adsorption, kinetics and biochemical interaction of biotin at the gold-water interface / Laborde H. M., et al. // Thin Solid Films. - 2013. - T.540. - C.221-226.

188. Cherkasov V. R. Nanoparticle Beacons: Supersensitive Smart Materials with On/Off-Switchable Affinity to Biomedical Targets / Cherkasov V. R., et al. // ACS nano. - 2020. - T.14, №2. - C.1792-1803.

189. Orlov A.V. Data on characterization and validation of assays for ultrasensitive quantitative detection of small molecules: Determination of free thyroxine with magnetic and interferometric methods / Orlov A.V., et al. // Data in Brief. - 2018. - T.21. - C.1603-1611.

190. Znoyko S.L. Ultrasensitive quantitative detection of small molecules with rapid lateral-flow assay based on high-affinity bifunctional ligand and magnetic nanolabels / Znoyko S.L., et al. // Analytica chimica acta. - 2018. - T.1034. - C.161-167.

191. Orlov A. V. Development and label-free investigation of logic-gating biolayers for smart biosensing / Orlov A. V., et al. // Sensors and Actuators B: Chemical. - 2018. - T.257. - C.971-979.

192. Mochalova E.N. Intelligent Nanoparticle-Based Agents for Biomedical Applications: Rapid Design Using a Lateral Flow Assay / Mochalova E.N., et al. // 2018 International Conference Laser Optics (ICLO). - 2018. - C.569.

193. Zadeh J.N. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems / Zadeh J.N., et al. // Journal of computational chemistry. - 2011. - T.32, №1. - C.170-173.