Исследование и разработка микрофлюидных устройств для анализа биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.11.14, кандидат наук Кухтевич, Игорь Владимирович

• Кухтевич, Игорь Владимирович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Кухтевич, Игорь Владимирович

Содержание

Сокращения

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Классификация микрофлюидных устройств для анализа и исследования биологических объектов

1.2. Тенденции развития современных микрофлюидных устройств

для анализа и исследования биологических объектов

1.3. Методы моделирования, применяемые при расчете функциональных элементов микрофлюидных устройств

1.4. Контроль и измерение характеристик функциональных элементов микрофлюидных устройств

1.5. Проведение измерений методом атомно-силовой микроскопии в жидких средах

1.6. Постановка цели и задачи исследования

Глава 2. Моделирование массопереноса жидкости и движения микрочастиц в микрофлюидных устройствах. Разработка топологий микрофлюидных устройств

2.1. Моделирование массопереноса жидкости в чипах с ловушками

для фиксации микрочастиц

2.2. Моделирование процесса гидродинамического разделения частиц

2.3. Топологии микрофлюидных чипов с гидродинамическими ловушками для фиксации микрочастиц

2.4. Топология микрофлюидного чипа для гидродинамического разделения частиц

2.5. Результаты и их обсуждение

2.6. Заключение к главе

Глава 3. Изготовление микрофлюидных устройств и контроль их характеристик

3.1. Материалы микрофлюидных чипов

3.2. Изготовление стеклянных микрофлюидных чипов с гидродинамическими ловушками и контроль их

геометрических размеров

3.3. Отработка технологического процесса изготовления микроструктур в стекле методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением

3.4. Изготовление микрофлюидных чипов из полидиметилсилоксана

3.5. Оценка влияния погрешности изготовления на объем элемента

и гидравлическое сопротивление канала

3.6. Герметизация микрофлюидных чипов разных топологий

3.7. Гидравлические интерфейсы для микрофлюидных чипов и вспомогательные устройства

3.8. Результаты и их обсуждение

3.9. Заключение к главе

Глава 4. Экспериментальные исследования и тестирование

4.1. Испытания микрофлюидных устройств

4.1.1. Экспериментальная установка для проведения испытаний микрофлюидных чипов

4.1.2. Проверка функционирования микрофлюидных чипов при

помощи раствора флуоресциина

4.1.3. Экспериментальные исследования по фиксации микрообъектов

в микрофлюидных чипах с ловушками

4.1.4. Экспериментальные исследования по разделению микрочастиц

в микрофлюидных чипах для гидродинамического разделения

4.2. Измерения микрообъектов и тестовых структур в жидких средах

методом атомно-силовой микроскопии

3

4.2.1. Изучение особенностей проведения измерений методом АСМ в жидких средах

4.2.2. Исследование калибровочной решетки TGQ1 методом сканирующей электронной микроскопии

4.2.3. Визуализация биологических объектов в жидкой среде методом атомно-силовой микроскопии

4.3. Результаты и их обсуждение

4.4. Заключение к главе

Заключение

Список публикаций по материалам работы

Список литературы

Сокращения

EpCAM - epithelial-cell-adhesion-molecule (молекулы, находящиеся на эпителиальных клетках)

GFP - green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок) PBS - phosphate buffered saline (натрий-фосфатный буфер) ACM - атомно-силовая микроскопия АФ - автофлуоресценция

ДЛСМ - двухфотонная сканирующая лазерная микроскопия ДМФК - динамическая микроскопия фазового контраста ИМ - интерференционная микроскопия К8 - крон

KAPP - когерентное антистоксовое Рамановское (комбинационное) рассеивании

ККТ - красные кровяные тельца

КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

МКО - метод конечных объемов

МКР - метод конечных разностей

МКЭ - метод конечных элементов

МФУ - микрофлюидное устройство

МФЧ - микрофлюидный чип

ПДМС - полидиметисилоксан

ПК - поликарбонат

ПММА - полиметилметакрилата

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста

СИ - сканирующая интерферометрия

СИП - сфокусированный ионный пучок

СМИП - сканирующая микроскопия ионной проводимости СЭМ - сканирующая электронная микроскопия ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование и разработка микрофлюидных устройств для анализа биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения»

Введение

Актуальность темы

Постановка всех стадий и этапов анализа на одном компактном устройстве - суть концепции «лаборатория на чипе» (lab on a chip), которая успешно применяется при исследовании жидких многокомпонентных проб и биологических объектов (клеток, бактерий и др.). Основой «лаборатории на чипе» является микрофлюидное устройство (МФУ), которое содержит различные функциональные элементы: каналы, смесители, нагреватели, фильтры, резервуары, реакционные камеры, устройства разделения пробы, сенсоры и т.д. Данные элементы предназначены для выполнения аналитических, технологических и прочих операций с пробой. Исходя из задач анализа формируется перечень операций, реализуемых в МФУ, что определяет набор необходимых функциональных элементов.

Планарной реализацией МФУ без вспомогательных элементов (гидравлический интерфейс, фитинги и т.д.) является микрофлюидный чип (МФЧ). Одним из направлений развития МФЧ является интегрирование в них микро- и наноразмерных элементов, позволяющих выделять целевые биологические объекты, фиксировать (или разделять) и детектировать их. Снижение стоимости МФЧ может быть обеспечено за счет повышения доступности современных методов изготовления, применяемых в микро- и нанотехнологиях (лазерная литография, ионная литография и др.), использования полимерных материалов - полидиметисилоксан (ПДМС), поликарбонат и т.д., которые позволяют оперативно получать прототипы чипов, например, методом отливки по шаблону.

Прослеживается тенденция использования МФЧ совместно с

приборами микроскопии высокого разрешения (конфокальной лазерной

сканирующей микроскопии (KJICM), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и

др.), позволяющими осуществлять визуализацию биологических объектов с

7

высоким пространственным разрешением и получать новую информацию о них. При проведении исследований методом АСМ в жидкости чаще всего используют воду, однако, изучение биологических объектов требует применения растворов с различным водородным показателем (pH), в частности натрий-фосфатного буфера (phosphate buffered saline, PBS). Для фиксации биологических объектов на время их измерений методом АСМ следует использовать специальные методы пробоподготовки (химическая обработка пробы, применение гелей и т.д.), которые рассчитаны на ограниченный круг объектов, что приводит к необходимости адаптации методов под конкретную задачу.

Таким образом, требуется создание доступных в лабораторных условиях МФЧ с интегрированными микро- и наноразмерными функциональными элементами для исследования биологических объектов методами микроскопии, т.к. эти МФЧ позволяют осуществлять манипуляции отдельными объектами или их небольшими группами, проводить исследования, которые невозможно реализовать методами, традиционно применяемыми в биологии и медицине.

Аналитические приборы и системы на основе МФЧ существуют не первое десятилетие, но вопросы контроля их характеристик и метрологической аттестации остаются в значительной степени нерешенными, что связанно с отсутствием: единых стандартов изготовления МФЧ; единого регламента по выбору материалов, технологий обработки и герметизации чипов; методик контроля геометрических размеров функциональных элементов МФЧ.

Итак, актуальным является разработка МФЧ с интегрированными микро- и наноразмерными элементами для фиксации и разделения биологических объектов, обеспечение совместимости МФЧ с различными методами микроскопии, в том числе высокого разрешения. Контроль погрешностей, обусловленных технологиями изготовления, требует

8

отдельного внимания, ведь именно точность изготовления элементов чипов будет определять их аналитические и функциональные характеристики. При разработке МФЧ для приборов АСМ необходимым является решение комплекса задач, связанных с фиксацией и поддержанием условий функционирования исследуемых биологических объектов. С учетом вышеизложенного и на основании анализа литературных данных были сформулированы цель и задачи работы.

Цель работы: проведение теоретических, технологических и экспериментальных исследований, направленных на разработку, изготовление, контроль геометрических размеров и испытание МФУ, предназначенных для фиксации и разделения биологических микрообъектов, и визуализация последних методами оптической и атомно-силовой микроскопии.

Основные задачи работы:

1) моделирование массопереноса жидкости в гидродинамических ловушках для фиксации микрочастиц, гидродинамического разделения частиц различных размеров в реакционной камере и разработка топологий МФЧ;

2) отработка технологии изготовления микроструктур в стекле марки Крон 8 (К8) методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и контроль их геометрических размеров;

3) разработка технологий изготовления и создание экспериментальных образцов МФЧ с ловушками для фиксации микрочастиц, для разделения частиц и контроль геометрических размеров их элементов, определяющих функциональные и аналитические характеристики чипа (анализируемый объем и т.д.);

4) разработка методического подхода для оценки влияния погрешности изготовления микроразмерных каналов на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала);

5) испытание экспериментальных образцов МФЧ с использованием модельных объектов (полимерных микрочастиц и бактерий) для проверки адекватности результатов моделирования и подтверждения работоспособности конструкций;

6) изучение особенностей проведения измерений геометрических размеров калибровочной решетки в жидких средах (дистиллированная вода, PBS, боратный буфер, NaOH) методом АСМ и разработка методики фиксации бактерий в воде на время проведения измерений.

Методы исследования

Для решения поставленных задач применялись следующие аналитические методы: анализ литературных источников по тематике диссертации; математическое моделирование массопереноса жидкости и движения микрочастиц путем решения уравнения Навье-Стокса при помощи программного продукта COMSOL Multiphysics; оптическая микроскопия для контроля микроразмерных структур и апробации МФЧ; сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) для контроля наноразмерных структур МФЧ; KJTCM для апробации работы МФЧ; АСМ для изучения тестовых структур и биологических объектов в жидкости; статистическая обработка экспериментальных результатов; нахождение аппроксимирующих функций путем приведения функциональной зависимости к форме линейного тренда в новой системе координат.

Кроме того, для изготовления МФЧ использовались следующие технологические методы, фотолитография с последующим кислотным травлением для изготовления заготовок МФЧ из стекла К8; травление сфокусированным ионным пучком (СИП) для изготовления микро- и наноразмерных структур в заготовках МФЧ из стекла; лазерная литография с последующим кислотным травлением для изготовления тестовых структур и шаблонов МФЧ из стекла; отливка ПДМС по шаблону для получения

полимерных МФЧ; герметизация МФЧ за счет использования адгезии между стеклом и ПДМС.

Научная новизна

1. Предложены технологии изготовления, созданы и испытаны оригинальные конструкции МФЧ: а) с гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) для фиксации микрочастиц размером до 3 мкм из потока; б) с реакционной камерой для гидродинамического разделения микрочастиц размерами 3-10 мкм в потоке.

2. В результате технологических исследований по изготовлению тестовых микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и контроля их геометрических размеров методом оптической микроскопии, получены данные, позволяющие определить режим изготовления требуемых структур в стеклянных подложках с необходимой точностью.

3. Разработан методический подход для оценки влияния погрешности технологии изготовления на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала), учитывающий расчетные и полученные значения геометрических размеров каналов.

4. Разработана новая методика фиксации бактерий E.Coli на пленке агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе), нанесенной на поверхность слюды, которая позволяет предотвратить ее набухание и деформацию, возникающую при проведении измерений методом АСМ в дистиллированной воде, визуализировать группы и отдельные бактерии, а также оценить их геометрические размеры.

Достоверность научных результатов обеспечивается корректностью

постановки задач исследования, в том числе при проведении

математического моделирования, воспроизводимостью результатов

измерений, статистической обработкой полученных результатов,

11

соответствием расчетных и экспериментальных данных, включая исследование тестовых объектов с заданными характеристиками. Результаты диссертации были представлены на международных и всероссийских конференциях, форумах, ассамблеях и школах, а также опубликованы в журналах рекомендуемых ВАК.

Практическая значимость определяется:

1) разработанными топологиями и экспериментальными образцами МФЧ с интегрированными гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) и для гидродинамического разделения частиц, которые позволяют исследовать микрочастицы методами KJICM и оптической микроскопии;

2) разработанной технологией изготовления микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением, которая дает возможность создавать функциональные структуры с заданной точностью размеров.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложенные конструкции гидродинамических ловушек (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) позволяют выделять из потока жидкости, удерживать и исследовать отдельные микрочастицы (полимерные частицы размером 3 мкм, бактерии E.Coli) или их группы методом KJICM.

2. Результаты моделирования траекторий движения полимерных частиц разных размеров (3 и 10 мкм) в реакционной камере МФЧ для гидродинамического разделения частиц и полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности дискриминации частиц по геометрическим размерам, что позволяет создавать новые информационно-измерительные приборы.

3. Технологии изготовления микро- и наноразмерных структур в подложках

из стекла К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным

12

травлением и методом СИП, метод отливки ПДМС по шаблону, а также метод герметизации за счет использования адгезии между стеклом и ПДМС применимы для создания гибридных (полимер-стеклянных) МФЧ с функциональными элементами, геометрические размеры которых выполнены с заданной точностью, определяемой требуемыми аналитическими характеристиками.

4. Методический подход, разработанный для оценки объема элемента и гидравлического сопротивления канала в зависимости от технологии изготовления (с учетом расчетных и полученных значений геометрических размеров каналов), позволяет оценить ее влияние на функционирование МФЧ: удерживание микрочастиц и разделение их по геометрическим размерам.

5. Методика фиксации бактерий E.Coli на пленке агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе), нанесенной на поверхность слюды, позволяет предотвратить ее набухание и деформацию при проведении измерений методом АСМ в дистиллированной воде, что дает возможность получать изображения протяженных участков, визуализировать отдельные бактерии и их группы, а также определять их геометрические размеры.

Реализация работы

Результаты диссертации использовалась при выполнении государственных контрактов в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№ П557, №14.740.11.1218) и проектов по программе У.М.Н.И.К. (№ 14193, № 16939).

Апробация работы

Основные результаты исследований и разработок, представленные в

диссертации, докладывались и обсуждались на следующих конференциях,

форумах, ассамблеях и школах: VIII Всероссийская межвузовская

конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011); European Materials

Research Society 2011 Spring Meeting (Nice, France, 2011); International

13

Conference on Materials for Advanced (Suntec, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011); 16-я Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2011); I Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); II Научно-практическая конференция молодых ученых РАН (Санкт-Петербург, 2012); 4-я Всероссийская конференция «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2012); Conference «Microfluidics 2012» (Heidelberg, Germany,

2012); IV Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 2012); IV Международный Казанский инновационный нанотехнологический форум (Казань, 2012); II Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2013); III Научно-практическая конференция молодых ученых РАН (Санкт-Петербург,

2013).

Публикации

Основные результаты диссертации изложены в 21 печатной работе, из них 6 опубликованы в журналах, входящих в перечень рекомендуемый ВАК. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы из 133 наименований. Текст диссертации изложен на 187 страницах, содержит 42 рисунка и 19 таблиц.

Глава 1. Литературный обзор

Данная глава представляет собой аналитический обзор, посвященный МФУ для изучения биологических объектов (клеток, бактерий и т.д.), а также исследованиям и разработкам, направленным на проведение измерений методом АСМ в жидких средах. Обсуждаются методы моделирования, применяемые при расчете функциональных элементов МФУ, вопросы контроля и измерения их характеристик.

1.1. Классификация микрофлюидных устройств для анализа и

исследования биологических объектов

На настоящий момент существует множество разнообразных конструкций МФУ, что обуславливает необходимость их классификации. Один из подходов к классификации МФУ [1] базируется на разделении по пяти группам, в соответствии с преобладающими принципами движения потоков в устройстве (капиллярные, под действием давления, под действием центробежных сил, электрокинетические и акустические). .Во многих исследованиях встречаются устройства и системы на их основе, в которых сочетаются различные принципы движения потоков, так что достаточно сложно определить доминирующий. Еще сложнее использовать такой подход в случае устройств для исследований биологических микрообъектов (клеток, бактерий и т.д.), так как в них транспортировка микрочастиц может осуществляться с применением одних принципов, фиксация и удерживание других (например, сочетание гидродинамического транспорта и диэлектрофореза, оптического пинцета, электрофореза и т.д.). Становиться очевидным, что этого подхода явно недостаточно, поэтому целесообразно рассмотреть три отличных от представленного выше принципа классификации МФУ, а именно:

• по функциональному назначению;

• в соответствии с решаемыми задачами;

• по методам регистрации/детектирования объекта исследования.

На основании литературных данных приводимых в обзорах, посвященных МФУ для исследования биологических микрообъектов [2-9], представляется возможным разделить существующие на сегодняшний день МФУ по функциональному назначению [10], а именно:

• сортировка/разделение микрочастиц;

• фиксация и удержание микрочастиц;

• культивирование биологических объектов (клеток, бактерий и т.д.);

• пробоподготовка/обработка образцов.

К первой группе функционального назначения МФУ следует отнести МФЧ предлагаемый в статье [11], который предназначен для изолирования и сортировки циркулирующих раковых клеток из крови пациентов, больных опухолями эпителиального происхождения. Чип химически функционализирован антителами к специфическим молекулам, находящимся на эпителиальных клетках (ерйЬеНа1-се11-асШеБюп-то1еси1е, ЕрСАМ). Этим обеспечивалась специфичность захвата клеток опухолей, так как ЕрСАМ отсутствуют в клетках крови.

Сортировка клеток часто используется в лабораториях при клинических исследованиях и диагностике. Актуальными областями применения являются: выделение лимфоцитов человека из крови для анализа на вирус иммунодефицита, изучение стволовых клеток и использование цитосенсоров для обнаружения различных заболеваний [12]. Разработка аналитических платформ (систем) на базе микрофлюидных технологий может быть успешным подходом для решения подобных задач. Одним из главных преимуществ таких платформ (систем) является их небольшая стоимость по сравнению с полноразмерными платформами и системами, а

также их малый размер. Кроме того, характеристики устройств на основе микрофлюидных технологий не уступают полноразмерным аналогам по точности и скорости проведения анализа [13]. Ключевым моментом является то, что МФЧ могут быть сделаны одноразовыми, что обеспечивает стерильность и возможность безопасной работы с биологически опасными материалами, такими как кровь. Помимо этого, устройства на основе МФЧ позволяют существенно снизить объем необходимого образца и реагентов для анализа, таким образом, заметно уменьшая стоимость анализа [14].

Следующим примером МФУ первой группы назначения является МФЧ для проточной цитометрии, описываемый в статьях [15, 16]. Данный чип состоит из микроканала для транспортировки образца и резервуаров по краям канала, а детектирование осуществляется с помощью фокусирования лазера в микроканале и регистрации сигнала от клеток с помощью ПЗС-матрицы или фотоумножителя. Конструкция МФЧ позволяет применять для детектирования методы микроскопии высокого разрешения, такие как КЛСМ и микроскопия полного внутреннего отражения, что существенно повышает точность и порог детектирования, а также дает возможность применять широкий спектр флуоресцентных красителей.

Возможность изолировать и сконцентрировать гомогенную популяцию клеток из гетерогенной смеси клеток является важным для получения точной информации о биохимии определенных клеточных типов в смеси. Микрофлюидные технологии позволяют изолировать малое количество клеток (иногда одиночные клетки) из большой популяции клеток на основе физических и химических свойств, что дает возможность обнаруживать гетерогенности внутри гомогенных популяций клеток [17].

Примером подобного устройства, также относящегося к МФУ первой

группы, может являться составная часть установки, предложенной авторами

в статье [18]. Эта установка представляет собой экспериментальную

цитометрическую сортирующую микрофлюидную платформу для

17

генетического скрининга сложных фенотипов биологических клеток. Различные подходы позволяют наблюдать и изолировать одиночные мутантные клетки внутри анализируемой популяции. Микрофлюидная проточная камера используется для захвата и фиксации клеток с целью последующего анализа методами микроскопии и может быть оптимизирована для захвата одиночных клеток. После анализа интересующих клеток прикладывается радиационное давление от инфракрасного лазерного диода для поднятия клеток из лунок-ловушек в поток. Освобожденные клетки могут быть собраны для дальнейшего анализа. Данный пример является хорошей иллюстрацией применения нескольких принципов, побуждающих движение изучаемых объектов: под действием гидродинамических сил и электромагнитного (лазерного) излучения.

Следующий пример МФУ первой группы приведен в статье [19]. Авторы представили МФУ для разделения флуоресцентно меченых шариков по интенсивности флуоресценции. Система, основанная на МФУ, выполняла 3 функции, фокусировка, детектирование, разделение. Полистирольные флуоресцентно меченые шарики вводились в МФУ и фокусировались в центре несущего канала при помощи гидродинамических потоков из боковых каналов. Флуоресценция шариков возбуждалась лазером, а регистрация флуоресценции выполнялось при помощи фотоумножителя. Далее шарики разделялись на три группы при помощи диэлектрофоретических сил индуцированных микроэлектродами при приложении напряжения. Итак, данная статья является еще одним примером совмещения двух принципов движения объектов исследования (под действием гидродинамических и диэлектрофоретических сил).

Ко второй группе функционального назначения МФУ следует отнести

МФЧ представленный в статье [20]. Изготовленный из ПДМС чип,

содержащий массивы и-образных гидродинамических ловушек

использовался для фиксации на них клеток НеЬа. В чипе не проводилась

18

какая-либо предварительная модификация поверхности ловушек, а загрузка клеток производилась менее чем за 30 сек. Чип использовался для изучения процесса развития 100 одновременно зафиксированных в ловушках клеток в течение 24 часов.

Примером МФУ, относящегося ко второй группе, может служить устройство, приведенное в статье [21], которое предназначено для исследования слияния клеток. Функциональные элементы устройства представляют собой массив двухсторонних ловушек. Эксперименты на устройстве проводились на различных типах клеток, в том числе фибробластах, мышиных эмбриональных стволовых клетках и клетках миеломы, при этом эффективность слияния достигала 70%. Загрузка и слияние клеток в двухсторонних ловушках осуществлялась в три этапа: 1) в меньшую из двух чашек ловушек загружался один из видов, выбранных для изучения клеток; 2) размещенные в маленькой чашке ловушек клетки переправлялись в большую чашку; 3) поверх размещенных в большой чашке ловушек клеток загружался второй тип клеток.

Другой пример МФУ, относящегося ко второй группе и совместимого с методом АСМ, представлен в статье [22] Авторы предложили использовать открытые микрофлюидные каналы с микроловушками для фиксации одиночных клеток с помощью капиллярных сил. Таким образом, в каналы обеспечивается свободный доступ зондов для атомно-силовой микроскопии, что позволило создать прецизионную систему, обеспечивающую получение новых данных о клетках, а также удерживать их в естественной среде на время измерений.

К третьей группе функционального назначения МФУ, следует отнести

представленное в статье [23] устройство, предназначенное для выращивания

суспензиальных клеток. Клетки под действием силы тяжести помещались в

специальные камеры, которые изолировали их от гидродинамических сил,

сохраняя при этом возможность замены среды.

19

Пример МФУ, одновременно относящегося к третьей и четвертой группе, приведен в статье [24]. В статье представлена высокопроизводительная микрофлюидная система, которая содержит 7 параллельных каналов. В свою очередь каждый канал содержит 32 микрофлюидные камеры квадратной формы. Через каналы в данные камеры производилась загрузка культуры бактерий E.Coli НВ101. Используя принцип, что L-арабинозы (L-Ara) может вызвать рекомбинацию E.Coli штамма НВ101 pGLO для синтеза зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP), был выполнен анализ выделения GFP в режиме реального времени для различных начальных плотностей бактерий. Кроме того, наблюдалось изменение бактериальная морфология во время обработки антибиотиками.

К четвертой группе функционального назначения МФУ, следует отнести устройство, представленное в статье [25], которое способно выполнять в реальном времени подсчет клеток и их лизис с помощью электрического поля, создаваемого оптическим излучением. Сначала клетки гидродинамически фокусировались в середине канала, а затем производился их счет при помощи пары погруженных оптических волокон. После подсчета клеток на слой фотопроводящего материала, нанесенного на индий-олово-оксид подложку, фокусировалось оптическое излучение для того, чтобы индуцировать электрическое поле, необходимое для лизиса клеток. Таким образом, клетки лизировались непрерывно за счет генерации трансмембранного потенциала.

Примером МФУ одновременно второй и четвертой группы является

устройство, представленное в статье [26], которое предназначено для

электропорации клеток Не La с целью окраски GFP. Для электропорации

применялся массив золотых микроэлектродов покрытых тонкой пленкой

наноструктурированного (размер зерна 8-20 нм) диоксида титана (ТЮ2), с

целью улучшения биосовместимости и адгезии клеток. Также на устройстве

20

осуществлялось выращивание клеток НеЬа при помощи стандартных протоколов.

Кроме классификации МФУ по функциональному назначению, можно провести их классификацию в соответствие с решаемой устройствами задачей или рядом задач:

• диагностические;

• аналитические/исследовательские;

• технологические.

К МФУ, решающему первую группу задач, следует отнести устройство, рассматриваемое в статье [27]. Авторы сообщают о разработке МФУ и оптической системы измерения окклюзионных тромбоцитов тромбозы при начальных скоростях сдвига, в интервале от физиологических до патологических состояний (500 - 13000 с"1), внутри четырех стенотических (сужающихся) каналов.

Примером МФУ для решения первой и третьей групп задач является интегрированный МФЧ для проведения количественной полимеразой цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, представленный в статье [28]. На МФЧ реализованы следующие стадии: фиксация единичной клетки, лизис, синтез комплементарных ДНК, ПЦР анализ. Пропуская способность МФЧ равна 300 клеток за цикл. Фиксация отельных клеток осуществляется при помощи единичных ловушек расположенных в центре специальных камер, в которых после фиксации выполняется процедура лизиса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кухтевич, Игорь Владимирович, 2013 год

Список литературы

1. Mark D., Haeberle S., Roth G., Von Stetten F., Zengerlez R. Microfluidic lab-on-a-chip platforms: requirements, characteristics and applications // Chemical Society Reviews. 2010. V. 39. R 1153-1182.

2. Zhao С.-Х., Middelberg A.P.J. Two-phase microfluidic flows // Chemical Engineering Science. 2011. V. 66. P. 1394-1411.

3. Rivet C., Lee H., Hirsch A., Hamilton S., Lu H. Microfluidics for medical diagnostics and biosensors // Chemical Engineering Science. 2011. V. 66. P. 1490-1507.

4. Pratt E.D., Huang C., Hawkins B.G., Gleghorn J.P., Kirby B.J. Rare cell capture in microfluidic devices // Chemical Engineering Science. 2011. V. 66. P. 1508-1522.

5. Giordano B.C., Burgi D.S., Hart S.J., Terray A. On-line sample pre-concentration in microfluidic devices: A review // Analytica Chimica Acta. 2012. V. 718. P. 11-24.

6. Le Gac S., Van den Berg A. Single cells as experimentation units in lab-on-a-chip devices // Trends in Biotechnology. 2009. V. 28. N.2. P. 55-62.

7. Lavrik N.V., Taylor L.T., Sepaniak M.J. Nanotechnology and chip level systems for pressure driven liquid chromatography and emerging analytical separation techniques: A review // Analytica Chimica Acta. 2011. V. 694. P. 6-20.

8. Wang L., Li P.C.H. Microfluidic DNA microarray analysis: A review// Analytica Chimica Acta. 2011. V. 687. P. 12-27.

9. Xu Y., Yang X., Wang E. Review: Aptamers in microfluidic chips // Analytica Chimica Acta. 2010. V. 683. P. 12-20.

10. Кухтевич И.В., Евстрапов А.А. Микрофлюидные устройства для исследования биологических проб: классификация по функциональному назначению и последние разработки // Сборник тезисов III Научно-

практической конференции молодых ученых РАН «Фундаментальная и прикладная наука глазами молодых ученых. Успехи, перспективы, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 года). С. 24-27.

11. Nagrath S., Sequist L.V., Maheswaran S., Bell D.W., Irimia D., Ulkus L., Smith M.R., Kwak E.L.,Digumarthy S., Muzikansky A., Ryan P., Balis U.J., Tompkins R.G., Haber D.A., Toner M. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology // Nature. 2007. V. 450. P. 1235-1239.

12. Didar T.F., Tabrizian M. Adhesion based detection, sorting and enrichment of cells in microfluidic Lab-on-Chip devices // Lab on a Chip. 2010. V. 10. 3043-3053.

13. Radisic M., Iyer R.K., Murthy S.K. Micro- and nanotechnology in cell separation // International Journal of Nanomedicine. 2006. V. 1. № 1. P. 3 -14.

14. Godin J., Chen C.-H., Cho S.H., Qiao W., Tsai F„ Lo Y.-H. Microfluidics and photonics for Bio-System-on-a-Chip: a review of advancements in technology towards a microfluidic flow cytometry chip // Journal of Biophotonics. 2008. V. 1. № 5. P. 355-376.

15. Takeda K., Jimma F. Maintenance free biosafety flowcytometer using disposable microfluidic chip (FISHMAN-R) // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2009. V. 76B. P. 405-406.

16. Takao M., Jimma F., Takeda K. Expanded applications of new-designed microfluidic flow cytometer (FISHMAN-R) // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2009. V. 76B. P. 405.

17. El-Ali J., Sorger P.K., Jensen K.F. Cells on chips // Nature Insight: Lab on a chip. 2006. V. 442, № 7101. P. 367-418.

18. Kovac J., Voldman J. Facile image-based cell sorting using OPTO-FluCS

(Opto-fluidic cell sorting) // Proceedings of 10th International Conference on

173

Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Tokyo, Japan, 5-9 November 2006). P. 1483-1485.

19. Kim H.-J., Moon H.-S., Kwak B.S., Jung H.-I. Microfluidic device to separate micro-beads with various fluorescence intensities // Sensors and Actuators B. 2011. V. 160. P. 1536-1543.

20. Di Carlo D., Wu L.Y., Lee L.P. Dynamic single cell culture array // Lab on a Chip. 2006. V. 6. P. 1445-1449.

21. Skelley A.M., Kirak O., Suh H., Jaenisch R., Voldman J. Microfluidic control of cell pairing and fusion // Nature Methods. 2009. V. 6. P. 147-152.

22. Ryu W.H., Huang Z., Park J.S., Moseley J., Grossman A.R., Fasching R.J., Prinz F.B. Open micro-fluidic system for atomic force microscopy-guided in situ electrochemical probing of a single cell // Lab on a chip. 2008. V. 8. P. 1460-1467.

23. Lecault V., Van Insberghe M., Sekulovic S., Knapp D.J.H.F., Wohrer S., Bowden W., Viel F., McLaughlin T., Jarandehei A., Miller M. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays // Nature Methods 2011. V. 8. P. 581-586.

24. Sun P., Liu Y., Sha J., Zhang Z., Tu Q., Chen P., Wang J. High-throughput microfluidic system for long-term bacterial colony monitoring and antibiotic testing in zero-flow environments // Biosensors and Bioelectronics. 2011. V. 26. P. 1993-1999.

25. Lin Y.-H., Lee G.-B. An integrated cell counting and continuous cell lysis device using an optically induced electric field // Sensors and Actuators B: Chemical. 2010. V. 145. P. 854-860.

26. Odorizzi L., Ress C., Collini C., Morganti E., Lorenzelli L., Coppede N., Alabi A.B., Iannotta S., Cazzanelli E., Vidalino L., Macchi P. An integrated platform for in vitro single-site cell electroporation: Controlled delivery and electrodes functionalization // Sensors and Actuators B:

Chemical. 2012. V. 170. P. 182-188.

174

27. Wallace H., George W. Microfluidic system for multichannel optical measurement of shear-induced platelet thrombosis in unfractionated blood // Proceedings of 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Seattle, Washington, USA, 2-6 October 2011). P. 541 - 543.

28. White A.K, Van Insberghe M., Petriv O.I., Hamidi M., Sikorski D., Marra M.A., Piret J., Aparicio S., Hansen C.L. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2011. V. 108. P. 13999-14004.

29. Stimberg V.C., Van den Berg A., Le Gac S. Integrated microfluidic platform for bilayer studies and experimentation on single pore-forming species // Proceedings of 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Seattle, Washington, USA, 2-6 October 2011). P. 1400-1402.

30. Wang H.-W., Bao N., Le T.T., Lu C., Cheng J.-X. Microfluidic CARS cytometry // Optics Express. 2008. V. 16. N. 8. P. 5782-5789.

31. Su X., Kirkwood S.E., Gupta M., Marquez-Curtis L., Qiu Y., Janowska-Wieczorek A., Rozmus W., Tsui Y.Y. Microscope-based label-free microfluidic cytometry // Optics Express. 2011. V. 19. N. 1. P. 387-398.

32. Skafte-Pedersen P., Hemmingsen M., Sabourin D., Blaga F.S., Bruus H., DufVa M. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access // Biomedical Microdevices. 2012. V. 14. N. 2. P. 385-399.

33. Mielnik M.M., Saetran L.R. Micro Particle Image Velocimetry - an overview // Turbulence. 2004. V. 10. P. 83-90.

34. Gossett D.R., Tsea H.T.K., Lee S.A., Ying Y., Lindgren A.G., Yang O.O., Rao J., Clark A.T., Di Carlo D. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. // Proceedings of the National

Academy of Sciences of the USA. 2012. V. 109. № 20. P. 7630-7635.

175

35. Godaa K., Ayazi A., Gossett D.R., Sadasivam J., Lonappan C.K., Sollier E., Fard A.M., Hur S.C., Adam J., Murray C., Wang C., Brackbill Nora, Di Carlo D., Jalali B. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2012. V. 109. №29. P. 11630-11635.

36. Rosenbluth M.J., Lam W.A., Fletche D.A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry // Lab on a chip. 2008. V. 8. № 7. P. 1062-1070.

37. Sraj I., Eggleton C.D., Jimenez R., Hoover E., Squier J., Chichester J., Marr D.W.M. Cell deformation cytometry using diode-bar optical stretchers // Journal of Biomedical Optics. V. 15. № 4. P. 047010-1 - 047010-7.

38. Andersson H., Baechi T., Hoechl M., Richter C. Autofluorescence of living cells//Journal of Microscopy. 1998. 191, 1-7.

39. DaCosta R., Wilson B., Marcon, N. New optical technologies for earlier endoscopic diagnosis of premalignant gastrointestinal lesions // Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2002. V. 17. P. 85-104.

40. Emmelkamp J., Wolbers F., Andersson H., DaCosta R.S., Wilson B.C., Vermes I., Van den Berg A. The potential of autofluorescence for the detection of single living cells for label-free cell sorting in microfluidic systems // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 3740-3745.

41. Takehara H., Nagaoka A., Noguchi J., Akagi T., Kasai H., Ichiki T. Microfluidic interface devices for in vivo analysis of neural cells using 2-photon laser scanning microscopy // Proceedings of 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Groningen, Netherlands, 3 - 7 October 2010). P. 2111-2113.

42. Zeng F., Rohde C.B., Yanik M.F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation // Lab on a chip. 2008. V. 8. P. 653-656.

43. Breslauer D.N., Lee P.J., Lee L.P. Microfluidics-based systems biology // Molecular BioSystems. 2006. V. 2. P. 97-112.

44. Takayama S., Ostuni E., Le Due P., Naruse K., Ingber D.E., Whitesides G.M. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams // Chemistry & Biology. 2003. V10. P. 123-130.

45. Sawano A., Takayama S., Matsuda M., Miyawaki A. Lateral propagation of EGF signaling after local stimulation is dependent on receptor density // Developmental Cell. 2002. V. 3. P. 245-257.

46. Herbst R.S. Review of epidermal growth factor receptor biology // International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 2004. V. 59. № 2. Supplement. P. 21-26.

47. Zhang H., Berezov A., Wang Q., Zhang G., Drebin J., Murali R., Greene M.I. ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies // Journal of Clinical Investigation. 2007. V. 117. № 8. P. 2051-2058.

48. Song J.W., Gu W., Futai N., Warner K.A., Nor J.E., Takayama S. Computer-controlled microcirculatory support system for endothelial cell culture and shearing // Analytical Chemistry. 2005. V. 77. P. 3993 -3999.

49. Huh D., Fujioka H., Tung Y.C., Futai N., Paine R., Grotberg J.B., Takayama S. Acoustically detectable cellular-level lung injury induced by fluid mechanical stresses in microfluidic airway systems // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2007. V. 104. P. 18886 -18891.

50. Lam W.A., Rosenbluth M.J., Fletcher D.A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffiiess //Blood. 2007. V. 109. № 8. P. 3505-3508.

51. Taniguchi Y., Choi P., Li G.H., Babu M., Hearn J., Emili A., Xie X. Quantifying E-coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells // Science. 2010. V. 329. P. 533-538.

52. Bow H., Pivkin I.V., Diez-Silva M., Goldfless S.J., Dao M., Niles J.C.,

Suresh S., Han J. A microfabricated deformability-based flow cytometer with

application to malaria // Lab on a Chip. 2011. V. 11. P. 1065-1073.

177

53. Lee P.J., Helman N.C., Lim W.A., Hung P.J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging // BioTechniques. 2008. V. 44. № 1. P. 91-95.

54. Singhal A., Haynes C.A., Hansen C.L. Microfluidic measurement of antibody-antigen binding kinetics from low-abundance samples and single cells //Analytical Chemistry. 2010. V. 82. P. 8671-8679.

55. Ярилин А.А. Апоптоз и его роль в целостном организме // Глаукома 2003, В. 2.С. 46-54.

56. Munoz-Pinedo С., Green D.R., Van den Berg A. Confocal restricted-height imaging of suspension cells (CRISC) in a PDMS microdevice during apoptosis // Lab on a chip. 2005. V. 5. P. 628-633.

57. Denz C., Holtmann F., Woerdemann M., Oevermann M. Nonlinear dynamic phase contrast microscopy for microfluidic and microbiological applications // Proceedings of SPIE. 2008. V. 7038. P. 70380X-1- 70380X-9.

58. Schoenwald K., Peng Z.C., Noga D., Qiu S.R., Sulchek T. Integration of atomic force microscopy and a microfluidic liquid cell for aqueous imaging and force spectroscopy // Review of Scientific Instrumentation. 2010. V. 81. (published online).

59. Upadhye K.V., Candiello J.E., Davidson L.A., Lin H. Whole-Cell Electrical Activity Under Direct Mechanical Stimulus by AFM Cantilever Using Planar Patch Clamp Chip Approach // Cellukar and molecular bioengineering. 2011. V. 4. № 2. P. 270-280.

60. Chen J., Zheng Y., Tan Q., Shojaei-Baghini E., Zhang Y., Prasad P., Wu X.Y., Sun Y.. Classification of cell types using mechanical and electrical measurement on single cells // Proceedings of 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Seattle, Washington, USA, 2-6 October 2011). P. 795-797.

61. Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B: Chemical. 1990. V.l. P. 244-248.

62. Кухтевич И.В., Евстрапов А.А. Тенденции развития микрофлюидных аналитических систем на чипах для исследования биологических проб // Сборник тезисов II Научно-практической конференции молодых ученых РАН «Фундаментальная и прикладная наука глазами молодых ученых. Успехи, перспективы, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 28-30 мая 2012 г.). С. 18-20.

63. Guo F., French J.B., Li P., Zhao H., Chan C.Y., Fick J.R., Benkovic S.J., Huang T.J. Probing cell-cell communication with microfluidic devices // Lab on a chip. 2013. V. 13. P. 3152-3162.

64. Yetisen A.K., Akram M.S., Lowe C.R. Paper-based microfluidic point-of-care diagnostic devices // Lab on a chip. 2013. V. 13. P. 2210-2251.

65. Primiceri E., Chiriaco M.S., Rinaldi R., Maruccio G. Cell Chips as new tools for cell biology - results, perspectives and opportunities // Lab on a chip. 2013. V. 13. P. 3789-3802.

66. Li S.-J., Li J., Wang K., Wang C., Xu J.-J., Chen H.-Y., Xia X.-H., Huo Q. A Nanochannel Array-Based Electrochemical Device for Quantitative Labelfree DNA Analysis // ACS Nano. 2010. V. 4. № 11. P. 6417-6424.

67. Kaji N., Okamoto Y., Tokeshi M., Baba Y. Nanopillar, nanoball, and nanofibers for highly efficient analysis of biomolecules // Chemical Society Reviews. 2010. V. 39. P. 948-956.

68. Белоусов К.И., Кухтевич И.В. Моделирование процессов массопереноса и фиксации микрочастиц в микрофлюидных чипах с гидродинамическими ловушками // Сборник тезисов II Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 9-12 апреля 2013 г.). С. 271-273.

69. Dongqing L. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. Springer, 2008. 2242 p.

70. Трудоношин В.А., Трудоношин И.В., Шуткин H.H. Метод конечных

разностей: учебный материал. Режим доступа:

179

Ьйр://гк6.Ьш8Шти/е1ес1гоп1с_ЬоокУШпс110п_шоёеУшкг/шкг.Ь1т (дата обращения 15.05.2012).

71. Смирнов Е.М., Зайцев Д.К. Метод конечных объемов в приложении к задачам гидрогазодинамики и теплообмена в областях сложной геометрии // Научно технические ведомости. 2004. № 2. С. 70-81.

72. Трудонопшн В.А., Уваров М.Ю. Введение в метод конечных элементов: учебный материал. Режим доступа: http://rk6.bmstu.ru/electronic_book/function_model/mke/rnke.html (дата обращения 15.05.2012).

73. Klapperich С.М. Microfluidic diagnostics: time for industry standarts // Expert Review of Medical Devices. 2009. V. 6. № 3. P. 211-213.

74. Shilpiekandula V., Burns D.J., Rifai K.E., Youcef-Toumi K., Shiguang L., Reading I., Yoon S.F. Metrology of Microfluidic Devices: A Review// Proceedings of 1st ICOMM. (Illinois, USA, 13-15 September 2006). N 49.

75. Chang W.-H., Yang S.-Y., Wang C.-H., Tsai M.-A., Wang P.-C., Chen T.-Y., Chen S.-C., Lee G.-B. Rapid isolation and detection of aquaculture pathogens in an integrated microfluidic system using loop-mediated isothermal amplification // Sensors and actuators B. Chemical. 2013. V. 180. P. 96-106.

76. Hansen H.N., Carneiro K., Haitjema H., De Chiffre L. Dimensional Micro and Nano Metrology // CIRP Annals - Manufacturing Technology. 2006. V. 55. №2. P. 721-743.

77. Wilkening G., Bosse H. Nano- and micrometrology - State-of-the-art and future challenges // Journal of Metrology Society of India. 2005. V. 20. № 2. P. 125-151.

78. Xu Z.G., Li S.G., Fang Z.P., Yoon S.F., Zhao J.H. 3D profile stitching technology based on the fiducial markers for microfluidic devices// SIM Tech technical reports. 2009. V. 10. № 3. P. 138.

79. Rai-Choudhury P. Handbook of microlithography, micromachining and microfabrication, Volume 1: Microlithography. SPIE Optical Engineering Press, 1997. 768 p.

80. Johnson D.J., Al-Malek S.A., Al-Rashdi B.A.M., Hilal N. Atomic force microscopy of nanofiltration membranes: Effect of imaging mode and environment//Journal of Membrane Science. 2012. V. 389. P. 486-498.

81. Moribe K., Limwikrant W., Higashi K., Yamamoto K. Structural evaluation of probucol nanoparticles in water by atomic force microscopy // International Journal of Pharmaceutics. 2012. V. 427. P. 365-371.

82. Yamamoto A. A uniqe antilipidemic drug-probucol // Journal of atherosclerosis and thrombosis. 2008. V. 15. №. 6. P. 304-305.

83. Sugihara T., Hayashi I., Onishi H., Kimura K., Tamura A. Sub-nanometer-resolution imaging of peptide nanotubes in water using frequency modulation atomic force microscopy // Chemical Physics. 2013. V. 419. P. 74-77.

84. Kageshimaa M., Jensenius H., Dienwiebel M., Nakayama Y., Tokumoto H., Jarvis S.P., Oosterkamp T.H.. Noncontact atomic force microscopy in liquid environment with quartz tuning fork and carbon nanotube probe // Applied Surface Science. 2002. V. 188. P. 440-444.

85. Persson B.N.J., Ganser C., Schmied F., Teichert C., Schennach R., Gilli E., Hirn U. Adhesion of cellulose fibers in paper // Journal of Physics: Condensed Matter. V. 25. №. 4. P .045002.

86. Touhami A., Jericho M.H., Beveridge T.J. Atomic Force Microscopy of Cell Growth and Division in Staphylococcus aureus // Journal of bacteriology. 2004. V. 186. № 11. P. 3286-3295.

87. Kailas L., Ratcliffe E.C., Hayhurst E.J., Walker M.G., Foster S.J., Hobbs J.K. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes // Ultramicroscop. 2009. V. 109. № 7. P. 775-780.

88. Lyubchenko Y.L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging // Micron. 2011. V. 42. № 2. P. 196-206.

89. Yamashita H., Taoka A., Uchihashi T., Asano T., Ando T., Fukumori Y. Single-Molecule Imaging on Living Bacterial Cell Surface by High-Speed AFM // Journal of molecular biology. 2012. V. 422. № 2. P. 300-309.

90. Balashev K., Callisen T.H., Svendsen A., Bjornholm T. Savinase action on bovine serum albumin (BSA) monolayers demonstrated with measurements at the air-water interface and liquid Atomic Force Microscopy (AFM) imaging // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2011. V. 88. P. 582-586.

91. Lu Z.-X., Zhang Z.-L., Shi W.-L., Pang D.-W., Xie Z.-X., Sheng P. Heat-fixation Method Used in an Atomic Force Microscopy Study of Cell Morphology // Analytical sciences. 2008. V. 24. P. 257-260.

92. Chao Y., Zhang T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy // Applied Microbiology and Biotechnology. 2011. V. 92. № 2. P. 381-392.

93. Muramatsu H., Chiba N., Homma K., Nakajima K., Ataka T., Ohta S., Kusumi A., Fujihira M. Scanning near-field optic/atomic force microscopy in liquids // Thin Solid Films. 1996. V. 273. P. 335-338.

94. Meyer R.L., Zhou X., Tang L., Arpanaei A., Kingshott P., Besenbacher F. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions//Ultramicroscopy. 2010. V. 110. N. 11. P. 1349-1357.

95. Niedzwiecka A., Lekka M., Nilsson P., Virtanen A. Global architecture of human poly(A)-specific ribonuclease by atomic force microscopy in liquid and dynamic light scattering // Biophysical Chemistry. 2011. V. 158. P. 141— 149.

96. Dague E., Jauvert E., Laplatine L., Viallet B., Thibault C., Ressier L.

Assembly of live micro-organisms on microstructured PDMS stamps by

convective/capillary deposition for AFM bio-experiments // Nanotechnology.

2011. V. 22. № 39. p. 395102-1 - 395102-7.

182

97. Dufrene Y.F. Atomic Force Microscopy, a Powerful Tool in Microbiology // Jurnal of bacteriology. 2002. V. 184. № 19. P. 5205-5213.

98. Hwang I.-S., Yang C.-W., Su P.-H., Hwu E.-T., Liao H.-S. Imaging soft matters in water with torsional mode atomic force microscopy // Ultramicroscopy. 2012.

DOI: http://dx.doi.Org/10.1016/j.ultramic.2012.07.001.

99. Ortega-Esteban A., Horcas I., Hernando-Perez M., Ares P., Perez-Berna A.J., San Martin C., Carrascosa J.L., De Pablo P. J., Gomez-Herreroa J. Minimizing tip-sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid // Ultramicroscopy. 2012. V. 114. P. 56-61.

100. Ushikia Т., Nakajimaa M., Choi M., Cho S.-J., Iwata F. Scanning ion conductance microscopy for imaging biological samples in liquid: A comparative study with atomic force microscopy and scanning electron microscopy//Micron. 2012. V. 43. P. 1390-1398.

101. Mikamo E., Tanaka C., Kanno Т., Akiyama H., Jung G., Tanakab H., Kawai T. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiaein liquid solution observed by atomic force microscopy // Journal of Structural Biology. 2005. V. 151. P. 106-110.

102. Bruus H. Theoretical microfluidics. Oxford university press, 2008. 339 p.

103. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы с интегрированными наноразмерными структурами для фиксации биологических объектов // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. №3. С. 17-22.

104. Kersaudy-Kerhoas М., Dhariwal R., Desmulliez M.P.Y. Recent advances in microparticle continuous separation // IET Nanobiotechnology. 2008. V. 2. № 1. P. 1-13.

105. Morijiri Т., Sunahiro S., Senaha M., Yamada M., Seki M. Sedimentation pinched-flow fractionation for size- and density-based particle sorting in

microchannels // Microfluidics and Nanofluidics. 2011. V 11. № 1. P. 105— 110.

106. Karabulut H. Physical meaning of Lagrange multipliers // European Journal of Physics. 2006. V. 27. P. 709-718.

107. Stein E., De Borst R., Hughes T.J.R. Encyclopedia of Computational Mechanics. Volume 1. Fundamentals. Wiley John & Sons, 2004. 798 p.

108. ООО «Электростекло». Материал - оптическое стекло К8. Режим доступа: http://www.elektrosteklo.ru/K8jrus.htm (дата обращения 17.11.2012).

109. Dow Corning Corporation. Sylgard 184 silicone elastomer KIT. Режим доступа:

http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?r= 131 en (дата обращения 17.11.2012).

110. Elveflow Microfluidic Innovation Center. PDMS: A review. Режим доступа: http://www.elveflow.com/microfluidic-reviews-and-tutorials/the-poly-di-methyl-siloxane-pdms-and-microfluidic (дата обращения 17.11.2012).

111. Tarbague H., Lachaud J.-L., Destor S., Vellutini L., Pillot J.-P., Bennetau В., Pascal E., Moynet D., Mossalayi D., Rebiere D., Dejous C. PDMS (Polydimethylsiloxane) Microfluidic Chip Molding for Love Wave Biosensor // Journal Integrated Circuits and Systems. 2010. V. 5. № 2. P. 125-133.

112. Чарыков A.K. Математическая обработка результатов химического анализа. JL: Издательство «Химия», 1984. 168 с.

113. Евстрапов А.А., Мухин И. С., Кухтевич И. В., Букатин А.С. Применение ионной литографии для формирования наноразмерных каналов микрофлюидных чипов в стеклянных подложках // Научно-технический вестник СПбГУ ИТМО. 2010. № 4. С. 59-64.

114. Евстрапов А.А., Мухин И.С., Кухтевич И.В., Букатин А С. Метод сфокусированного ионного пучка при формировании наноразмерных

структур в микрофлюидных чипах // Письма в ЖТФ. 2011. Т. 37. №20. С. 32-40.

115. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения // Научно-технический вестник информационных технологий, механики и оптики. 2012. № 1С. 111-115.

116. Bukatin A., Mukhin I., Kukhtevich I., Evstrapov A. Focused ion beam lithography for creating microfluidic chips with integrated functional nanostructures // Abstracts of ICMAT 2011 (Suntec, Singapore, 26 June - 1 July 2011). P. 35.

117. Буляница A.Jl. Принципы построения градуировочных зависимостей в приборах химического и биологического экспресс-анализа. Типография «Фалкон Принт». ИАП РАН. Санкт-Петербург. 2012. 28 с.

118. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Мухин И.С. Биосенсоры на основе микро-и нанофлюидных технологий // Сборник трудов VIII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых (Санкт-Петерубург, 12-15 апреля 2011 г.). С. 345-346.

119. Kukhtevich I.V., Evstrapov А.А., Bukatin A.S., Mukhin I.S. Microfluidic chips with nanostructures for investigation of biological objects by methods of high resolution microscopy // Abstracts of Lab-On-A-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 30 June - 1 July 2011). Режим доступа: http://www.eposters.net/index.aspx?id=3588 (дата обращения 14.02.2013).

120. Evstrapov A.A., Mukhin I.S., Bukatin A.S., Kuhtevich I.V. Ion and electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in microfluidic chips // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 2012. V. 282. P. 145-148.

121. Mukhin I.S., Evstrapov A.A., Kuhtevich I.V., Bukatin A.S., Golubok A.O.

Ion and electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in

185

microfluidic chips // Proceedings of EMRS 2011 Spring Meeting (Nice, France, 10-12 May 2011). PB251.

122. Кухтевич И.В. Микрофлюидные чипы с интегрированными микро- и наноразмерными структурами // Сборник трудов 16-й Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 15 декабря 2011 г.). С. 114.

123. Кухтевич И.В., Букатин A.C., Мухин И.С., Чубинский-Надеждин В.И., Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии // Сборник тезисов I Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 10 -13 апреля 2012 г.). С. 361-362.

124. Евстрапов A.A., Буляница A.JL, Рудницкая Г.Е., Лукашенко Т А., Есикова H.A., Тупик А.Н., Кухтевич И.В., Букатин A.C. Аналитические приборы для исследований биологических проб на основе микрофлюидных платформ // Сборник тезисов докладов 4 Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 26 - 30 июня 2012 г.). С. 102.

125. Kukhtevich I.V., Bukatin A.S., Chubinskiy-Nadezhdin V.l., Mukhin I.S., Evstrapov A.A. Microfluidic chips with traps for single cell analysis // Proceedings of Microfluidics 2012 (Heidelberg, Germany, 25-27 July 2012). P. 153.

126. Кухтевич И.В., Букатин A.C., Мухин И.С., Чубинский-Надеждин В.И., Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы с интегрированными микро- и наноразмерными функциональными элементами для исследования биологических объектов // Сборник тезисов IV Международного Казанского инновационного нанотехнологического форума (Казань, 27-29 ноября 2012 г.). С. 307-309.

127. Жуков М.В. Кухтевич И.В. Выявление особенностей проведения

измерений методом атомно-силовой микроскопии в жидких средах //

186

Сборник тезисов II Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 9-12 апреля 2013 г.). С. 325-326.

128. Компания НТ-МДТ. TGQ1. Режим доступа: http.V/www.ntmdt-tips.com/products/view/tgql (дата обращения 01.03.2013).

129. Bruker Corporation. SNL-10. Режим доступа: https ://www. brukerafmprobes. com/Product. aspx?ProductID=3 693 (дата обращения 01.03.2013).

130. Кухтевич И.В., Жуков М.В., Чубинский-Надеждин В.И., Букатин А.С., Евстрапов А.А. Фиксация бактерий E.Coli на подложке для измерений в жидкости методом атомно-силовой микроскопии // Научное приборостроение. 2012. Т. 22. №4. С. 56-61.

131. Жуков М.В., Кухтевич И.В., Букатин А.С., Чубинский-Надеждин В.И., Евстрапов А.А. Фиксация бактерий E.Coli в жидкости во время измерений методом атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов IV Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 15-16 ноября 2012 г). С. 213-216 .

132. Кухтевич И.В., Жуков М.В. Изучение бактерий E.Coli в жидкости методом атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов II Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 9-12 апреля 2013 г.). С. 331-332.

133. Prescott LM, Harley JP, Klein D. Microbiology (7th Ed). McGraw-Hill companies, New York. - 2008.