Разработка микрофлюидного устройства с оптическим иммуносенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.01, кандидат наук Есикова, Надежда Александровна

• Есикова, Надежда Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Есикова, Надежда Александровна

Содержание

Введение

1. Литературный обзор

1.1 Микрофлюидные аналитические системы

1.1.1 Микрофлюидные устройства: материалы,

методы изготовления

1.1.2 Иммунный анализ

1.1.3 Иммобилизация белков

1.2 Пористые структуры

1.2.1 Изготовление, исследование, классификация

и применение пористых структур

1.2.2 Методы исследования оптических и

структурных характеристик пористых структур

1.2.3 Модели эффективной среды; определение оптических

и структурных характеристик пористых пластин

1.3 Выводы к главе 1

2. Экспериментальная часть

2.1 Методы, образцы и оборудование

2.1.1 Принцип работы сенсорного элемента

2.1.2 Иммобилизация белка на стекло

2.1.3 Образцы пористого и двухфазного стекла

2.1.4 Оборудование

2.1.5 Макеты устройства детектирования

2.2 Исследование пористого стекла методами оптической спектрометрии

2.2.1 Влияние нагрева на спектры светопропускания

пористых стекол

2.2.2 Флуоресценция исходных образцов двухфазных и пористых стекол

2.2.3 Определение спектрального диапазона преобладания

релеевского рассеяния

2.2.4 Оценки оптических и структурных характеристик ПС методом оптической спектрометрии

2.2.5 Диффузно рассеивающие ПС

2.2.6 Выводы к разделу 2.2

2.3 Сенсорный оптический элемент на основе пористого стекла

2.3.1 Оценка рабочего диапазона концентраций

2.3.2 Адаптация метода иммобилизации для ПС

2.3.3 Влияние концентрации исходного раствора меченого инсулина на иммобилизацию

2.3.4 Исследование иммобилизации меченого

инсулина на двухфазное стекло

2.3.5 Исследование возможности создания сенсорного элемента на основе пористого стекла

2.3.6 Исследование равномерности иммобилизации белка методом атомно-силовой микроскопии

2.3.7 Выводы к разделу 2.3

2.4. Исследование сенсорного элемента и постановка анализа на

микрофлюидном устройстве

2.4.1. Зависимость интенсивности флуоресценции от соотношения концентраций белков

2.4.2 Оценка концентраций белка для иммобилизации

2.4.3 Экспериментальный подбор концентрации БСА

2.4.4 Определение длительности проведения

иммунной реакции

2.4.5. Обнаружение инсулина в пробе

2.4.6. Обнаружение инсулина на микрофлюидном устройстве

2.5. Разработка конструкции микрофлюидного устройства

2.5.1 Микрофлюидное устройство с интегрированным сенсорным элементом

2.5.2 Мультисенсорный элемент на основе пористого стекла

2.5.3 Выводы к разделу 2.5

Заключение

Список сокращений и обозначений

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка микрофлюидного устройства с оптическим иммуносенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла»

Введение

Тенденция миниатюризации в области экспресс-анализа жидких биологических проб отобразилась в развитии двух подходов, связанных с созданием микрофлюидных устройств и биочипов. К преимуществам микрофлюидных устройств (МФУ) относятся широкие возможности манипуляций с жидкой пробой.

Высокоспецифичным методом обнаружения аналита в биопробе является постановка иммунных реакций. Иммунный анализ находит широкое применение в медицине, фармакологии, мониторинге окружающей среды, пищевой промышленность. Чувствительность обнаружения при этом, в частности, зависит от условий проведения реакции и характеристик системы детектирования. Гетерогенный количественный иммунный анализ, осуществляемый на микропланшетах, характеризуется высокой чувствительностью и производительностью, но требует значительного времени для проведения анализа (для инсулина от 4,5 ч.). А множество экспресс-тестов на основе иммунной реакции рассчитаны лишь на качественный или полуколичественный анализ. Конкурентный иммунный анализ позволяет обнаружить мелкие белки и сократить длительность анализа.

Постановка конкурентного иммунного анализа на МФУ дает возможность объединить преимущества иммунного анализа (высокая специфичность) и микрофлюидики (возможность проведения отдельных стадий или всего анализа в микромасштабе на одном устройстве за счет простоты манипуляции с пробой, экспрессность и т. д.). Наиболее чувствительным и простым для реализации в таких устройствах является флуоресцентный метод детектирования иммунных комплексов.

Использование пористых структур в качестве основы сенсорного

элемента позволяет дополнительно повысить чувствительность за счет

увеличения площади сенсорного слоя в малом объеме. Перспективным

представляется пористое стекло (ПС), основными характеристиками

5

которого являются развитая поверхностная структура (пористость до 50%, регулируемый размер пор), оптическая прозрачность в широком спектральном диапазоне, физическая и химическая стойкость, высокая воспроизводимость характеристик образцов внутри одной серии.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод об актуальности разработки микрофлюидного устройства с биосенсорных элементом на основе пористого стекла для иммунного анализа.

Цель работы

Разработка и создание микрофлюидного устройства с интегрированным биосенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла для проведения иммунного анализа.

Основные задачи

1. Исследование натриевоборосиликатных двухфазных и полученных из них пористых стекол методами оптической спектроскопии и высокоразрешающей микроскопии.

2. Обоснование и выбор метода иммобилизации белка и адаптация его для пористого стекла.

3. Разработка, изготовление и исследование микрофлюидного устройства с интегрированным биосенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла.

4. Апробация метода иммунного анализа с применением отдельно биосенсорного элемента и на микрофлюидном устройстве с интегрированным сенсорным элементом (на примере инсулина).

Научная новизна

— Впервые обнаружена немонотонная зависимость интенсивности флуоресценции биосенсорного элемента на основе натриевоборосиликатного пористого стекла 8В8-МАП от соотношения концентраций антигенов и

1 6

антител (Сптс-^С^о) в диапазоне концентраций СптсмпбК^-Ю" +2,3-10") М иС,8о=(3-Ю'8-2-10-7) М.

— На основании данных оптической спектроскопии в видимом диапазоне (коэффициент поглощения и показатель преломления) согласно моделям эффективных сред получены оценки структурных характеристик (в частности, пористость) микро- и макропористых натриевоборосиликатных стекол (8В-МИП-И 8В-МАП).

— Получены оценки размеров комплексов иммобилизованного на пористое стекло инсулина методом сканирующей ближнепольной оптической микроскопии, размер (0,4...1,3мкм) и форма которых зависят от концентрации инсулина в растворе.

Практическая значимость работы:

— Способ получения МФУ с интегрированным биосенсорным элементом на основе ПС для иммунного анализа позволяет оперативно изготавливать прототипы устройств со встроенными сенсорными элементами.

— Методика иммобилизации инсулина и методом ковалентного связывания адаптирована для изготовления биосенсорного элемента на основе ПС 8В8-МАП.

— Методологический подход к оцениванию структурных характеристик макропористых стекол 8В-МАП с высоким светопропусканием и низким релеевским светорассеянием, полученные по данным оптической спектроскопии, могут применяться для неразрушающего контроля ПС.

— Макет детектора для микрофлюидного устройства используется при проведении научно-исследовательских работ ИАП РАН (по НИР «Разработка принципов организации мультисенсорных систем и их информационного обеспечения в медико-биологических исследованиях» (2009-2012 гг) и грантам КНВШ за 2008-2013 гг).

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ изготовления биосенсорного элемента на основе пористого стекла методом иммобилизации белка (ковалентного связывания), для которого подобраны условия подготовки, активации и силанизации поверхности ПС.

2. Способ создания микрофлюидного устройства на основе биосенсорного элемента из пористого стекла и двухуровневой системы подвода/отвода пробы к нему, реализованный в конструкции из полидиметилсилоксана.

3. Метод обнаружения содержания инсулина в 40 мкл пробы в

7 6

диапазоне концентраций (2,9-10" -К2,3-10" ) М за время менее чем 2 ч при постановке конкурентного иммунного анализа на МФУ с биосенсорным элементом на основе пористого стекла.

4. Методология оценивания оптических (коэффициент поглощения, показатель преломления) и структурных (пористость, средний размер пор) характеристик пористых стекол с высоким светопропусканием (~ 90%) и низким релеевским светорассеянием при помощи моделей эффективных сред по данным оптической спектрометрии в диапазоне длин волн (360+420) нм.

Апробация работы: Основные результаты диссертации доложены на следующих международных и российских конференциях и семинарах: Eight and ninth seminar on porous glasses - special glasses. PGL'2007 и PGL'2009 (Poland. Wroclaw); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии. 2007 и 2010гг. (г.Москва, г.Волгоград); VII и VIII международной конференции «Прикладная оптика-2008» и «Прикладная оптика-2010» (г. Санкт-Петербург); IX Молодежной научной конференции, посвященной 60-летию Института химии силикатов РАН. 2008 (г. Санкт-Петербург); XX симпозиуме «Современная химическая физика» 2008 (г. Туапсе); «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» И. 2011 (г. Казань); 5-й Международной научно-технической конференции

«Сенсорная электроника и микросистемные технологии» (СЕМСТ-5). 2012 (Украина, г. Одесса,).

Работа выполнена в рамках грантов РФФИ №08-08-00733-а и 09-02-09482-мобз; научной программы СПбНЦ РАН, раздел «Комплексные междисциплинарные проекты», проект «Микрофлюидные аналитические системы с интегрированными наноструктурами (пористыми стеклами)» за 2009 и поддержана грантами КНВШ для студентов и аспирантов ВУЗов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга за 2008-2010 гг. и субсидии КНВШ молодым ученым, молодым кандидатам наук ВУЗов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга за 2012 г.; программой «У.М.Н.И.К.» за 2012 и 2013 гг.

1. Литературный обзор

1.1 Микрофлюидные аналитические системы

Одним из перспективных направлений развития приборостроения является разработка микроаналитических систем на основе микрофлюидных устройств (МФУ). Эти системы обладают такими преимуществами перед традиционными макроаналогами, как высокая экспрессность анализа, малый расход пробы и реагентов, возможность объединения отдельных стадий или всего анализа на одном компактном чипе, полный контроль и управление всеми аналитическими операциями, низкое энергопотребление и т д. За последние 10 лет опубликовано более 10000 статей по микрофлюидике. Только в США свыше 1000 патентов связано с микрофлюидикой [1].

В начале 1990х A. Manz разработал концепцию аналитических систем на мирочиповой платформе [2]. В то же время с развитием технологий выделилось такое научное направление, как микрофлюидика, посвященное изучению поведения жидкостей и газов в микромасштабах. Системы на основе микрофлюидных чипов получили название ^iTAS (Micro Total Analysis System, микросистемы для полного анализа), или lab-on-chip (лаборатория на чипе). Основным принципом создания этих систем является интегрирование всех функций аналитической лаборатории, включая транспортировку пробы, пробоподготовку, точное дозирование, перемешивание с реагентами, нагрев, титрование и другие операции в устройстве размером в несколько квадратных сантиметров [3]. С тех пор ведутся активные работы по разработке микрочиповых устройств, функциональных элементов для них, методов получения микро- и наноструктур.

МФУ представляет собой стеклянную, кремниевую или полимерную пластину с системой каналов с интегрированными функциональными элементами и интерфейсом для связи со внешними устройствами (например,

устройствами для ввода пробы и реагентов). Разновидность МФУ в планарном исполнении - микрофлюидный чип (МФЧ).

Несмотря на то, что исследования и разработки ведутся более 25 лет, до сих пор не сложилась четкая терминология и классификация в данном направлении. Например, в [4] под микрофлюидными чипами понимаются лишь чипы, предназначенные для анализа, хотя известно о существовании микрофлюидных чипов для проведения синтеза [5, 6].

В данной работе рассматриваются вопросы создания МФУ для анализа биологических проб путем постановки иммунной реакции.

Уровень современных технологий позволяет изготовить и разместить все необходимые для анализа устройства в небольшом объеме и даже интегрировать основную их часть в МФУ. Однако, стоимость такой интегрированной аналитической системы высока, поэтому для решения многих практических задач применяются внешние системы детектирования и управления процессами, проводимыми на МФУ. Такой подход позволяет создавать более дешевые устройства, основанные на использовании коммерческих приборов и оборудования (детектров, внешних насосов, дозаторов и т.д.).

Авторы [1] вводят определение микрофлюидной платформы (МФП), представляющей собой набор функциональных элементов, позволяющих реализовать определенные действия с пробой, которые легко комбинировать друг с другом в рамках определенных технологий. МФП задают общее направление миниатюризации, интеграции, автоматизации и создания систем для проведения множества параллельных измерений. Разработка систем из отдельных функциональных элементов и самих элементов для той или иной МФП представляется авторам более целесообразной, чем развитие отдельных изолированных систем lab-on-chip.

МФП можно классифицировать в соответствии с основным принципом

движения жидкости (капиллярные, под действием давления, под действием

центробежных сил, электрокинетические и акустические) [1], по

11

доминирующему способу/методу управления движением жидкости (силовыми полями, постоянными/переменными электрическими полями, электромагнитными полями, магнитными полями, ультразвуковыми полями и комбинированными методами) или по методам изготовления. Поскольку метод изготовления и получаемые характеристики структур во многом определяются материалом МФУ, то можно также ввести соответствующую классификацию (стеклянные, кварцевые, кремниевые, полимерные и гибридные устройства). Наибольшее распространение находят полимерные материалы, поскольку они отличаются доступностью и разнообразием свойств. Свойства материалов, применяемых для микрофлюидных устройств, и методы их обработки подробно описаны в обзорных статьях, например в

[3].

1.1.1 Микрофлюидные устройства: материалы, методы изготовления

Полимерные материалы для МФУ выгодно отличаются низкой стоимостью и большим ассортиментом имеющихся в продаже вариантов материалов. Одним из наиболее распространенных материалов является полндгшетшсгшоксаи (ПДМС). Это недорогой эластомерный материал, устойчивый к кислотам и щелочам, обладающий высокой оптической прозрачностью в видимом диапазоне [3]. Из ПДМС изготавливаются простые и дешевые МФЧ однократного применения [7]. Способы изготовления МФУ из ПДМС подробно описаны в [8]. В [9, 10] приведены методы модификации поверхности ПДМС, позволяющие изменить свойства поверхности или сформировать на ней функциональные группы. Кроме того, ПДМС может применяться для герметизации микрофлюидных чипов [11], он позволяет соединять стекло или полимеры при комнатной температуре. Полностью отвержденный и обработанный кислородной плазмой, ПДМС хорошо соединяется со стеклянной или кремниевой поверхностью [12]. Основным недостатком ПДМС является пористость.

Другим распространенным в микрофлюидике полимером является потшетшметакршат (ПММА) - линейный термопластичный полимер (марки Perspex, Plexiglas, ТОСП и др.). ПММА оптически прозрачен для видимого и ближнего УФ-диапазонов (коэффициент светопропускания достигает 92-93%), имеет меньшую собственную флуоресценцию, чем другие полимеры (например, поликарбонат). Хорошо поддается различным видам обработки, позволяющим сформировать изделия с микроструктурами: горячее тиснение, штамповка (импринтинг) при комнатной температуре, литьевое формование (injection molding), лазерная абляция и другие [13]. Применение ПММА для микрофлюидных устройств освещено в обзоре [14]. ПММА обладает хорошей химической устойчивостью к кислотам, щелочам, маслам. Может быть подвергнут вторичной переработке.

Также для создания чипов находит применение поликарбонат (ПК). Он устойчив к спиртам и кислотам, обладает хорошей прозрачностью в широком спектральном диапазоне. Но большой ассортимент марок ПК с различными свойствами создает определенные препятствия для широкого применения. Но, тем не менее, некоторые марки ПК успешно применяются для изготовления микрочипов, позволяющих реализовать методы полимеразной цепной реакции [15].

Методы получения каналов и структур в ПДМС, ПММА и ПК хорошо изложены в литературных источниках. Например, в [16] описано применение «мягкой литографии» для микро- и нанофлюидики.

Если способы получения полимерных структур за последние годы

были адаптированы для изготовления микро- и наноразмерных элементов, то

соединение элементов в единую микрофлюидную систему так и осталось

труднорешаемой технологической задачей [3]. Одним из подходов к

решению этой задачи является использование функциональных элементов,

являющихся частью топологии, и формируемых в материале чипа при его

создании (ступеньки в каналах, ситообразные структуры, смесители и т п).

Широкое распространение получила модификация поверхности каналов уже

13

готовых чипов: от получения сплошной гидрофобной/гидрофильной [17] поверхности и до формирования сенсорного слоя [17-19] или электродов [17] в герметизированном канале. Однако, изготовление многих элементов в процессе создания чипа или в уже готовом чипе технологически сложно или невозможно, что приводит к необходимости интегрирования отдельных элементов в МФУ.

В [20] соединение эластичной мембраны ЕЬАБТОБТЬ (на основе кремния) с ПММА конструкцией проведено при помощи плазменной обработки. Однако, соединение производилось под давлением, что не допустимо для хрупких пористых стекол. В [21] исследована возможность непосредственного соединения ПММА тонкой пленкой ПДМС. Соединилось только 50% поверхности пластин из ПММА. В работах [22, 23] показана возможность соединения этих материалов при помощи адгезивов.

С позиции выбора топологии, доступности технологий изготовления и методов интегрирования функциональных элементов для МФУ представляется перспективным применение ПДМС, поскольку работа с ним не требует сложного дорогостоящего оборудования и может быть проведена в обычной исследовательской лаборатории. Для формирования систем из этого материала наиболее часто используется метод «мягкой литографии», представляющий собой репликацию топологии с мастер-формы (из фоторезиста или кремния) на мягком эластомере [24]. Также этот материал может применяться для соединения элементов разрабатываемого устройства.

1.1.2 Иммунный анализ

Белки напрямую связаны с биологическими функциями организма и могут испытывать посттрансляционные воздействия, играющие важную роль в патологических процессах. Выявлено множество белковых маркеров различных заболеваний на ранней стадии, поэтому анализ белков очень важен для диагностики многих заболеваний [25].

Высокоспецифичным методом обнаружения белков является иммунный анализ - метод, в котором для обнаружения аналита используется взаимодействие «антитело-антиген». Иммунный анализ применяется для количественного анализа белков и мелких молекул в медицине [26-28], фармакологии [26], мониторинге окружающей среды [26, 28, 29], пищевой промышленности [26, 28]. В зависимости от целей, осуществляется определение как антигенов, так и антител.

Иммунный анализ разделяют на прямой и конкурентный. В прямом иммунном анализе антигены связываются с превосходящим числом антител, а детектирование проводится либо по флуоресценции определяемого антигена, либо после следующей реакции с мечеными антителами, связывающимися с другим эпитопом антигена. Такая постановка анализа, называемая «сэндвич», применима только для крупного аналита (>1000 Ба) с несколькими эпитопами; уровень сигнала пропорционален концентрации антигена [30, 31]. При конкурентной реакции интересующие антигены (из пробы) конкурируют с экзогенными мечеными антигенами за ограниченное число сайтов антител. В этом случае величина сигнала обратно пропорциональна концентрации белка. Этот вариант важен для маленьких антигенов с ограниченным числом эпитопов (связывающихся сайтов). Также к преимуществам конкурентного иммунного анализа можно отнести меньшее количество этапов анализа, что приводит к более высокому быстродействию.

Чувствительность анализа во многом зависит от используемых меток. Это могут быть ферменты, флуорофоры, радиоактивные метки (радиоиммунный анализ или изотопный анализ), квантовые точки, ДНК-метки (иммуно-ПЦР) [32, 33]) и другие. В последние годы появились и активно развиваются прямые методы детектирования протекания иммунной реакции, основанные на эффектах поверхностного плазмонного резонанса, рамановского рассеяния, изменения характеристик элементов атомно-силового микроскопа [26, 33, 34].

Иммунный анализ подразделяется на гомогенный и гетерогенный. В гомогенном анализе взаимодействие антител с антигенами происходит в растворе. Преимуществом является отсутствие потребности предварительной подготовки и возможность последующего быстрого электрофоретического разделения [26]. В гетерогенном анализе антитела иммобилизуются на твердую подложку (образуя чувствительный слой) и взаимодействуют с антигенами из раствора в приповерхностном слое [30]. Преимуществом данного подхода является высокое соотношение площади поверхности к объему при иммобилизации на сложные поверхности, что приводит к высокой чувствительности [26]. Разными авторами рассмотрены проведение иммунного анализа на нанотрубках, наночастицах разных материалов (золото, Si02, магнитные частицы), в пористых пленках и пористом кремнии [31, 28]. Согласно [35] применение пористых матриц на основе полимерных мембран или гидрогелей позволяет получить более естественную для белка среду, чем при работе с плоской поверхностью, и снизить его денатурацию.

Классическим в иммунном анализе считается метод ELISA (enzyme-

linked immunosorbent assay, твердофазный иммуноферментный анализ). Он

применяется уже более трех десятилетий и показал себя точным и надежным

[25]. Обычно этот метод реализуется в две стадии. На первой антитела,

адсорбированные на нерастворимом носителе или ковалентно связанные с

ним, взаимодействуют с антигеном. Несвязавшиеся компоненты отмывают и

затем добавляют раствор, содержащий антитела, конъюгированные с

ферментом. Это могут быть как сами антитела, полученные к данному

антигену, так и, в более общем случае, любые антитела, специфичные к

анализируемым белкам. Вторая стадия процесса также завершается

отмывкой несвязавшихся компонентов реакционной смеси, после чего в

систему вводят субстрат для осуществления индикаторной ферментативной

реакции. [36] Недостаток этого метода - работа с большими объемами пробы

(по 50 мкл на лунку), что приводит к необходимости разбавления пробы в

случае ее малых исходных объемов (соответственно, повышению предела

16

обнаружения) и большим расстояниям диффундирования к сенсорному слою (т.е. продолжительному времени инкубирования). Также для анализа необходимы специфические комбинации энзим-флуорофор, которые не препятствовали бы протеканию иммунной реакции.

Согласно данным фирмы CUSABIO BIOTECH CO., Ltd. (Китай) анализ на ELISA Kit занимает от 1 до 4,5 ч в зависимости от аналита [37]. Это обусловлено в основном временем инкубирования, непосредственно связанным с расстоянием и скоростью диффузии молекул аналита к иммобилизованным на поверхность антителам [30], а также с количеством стадий анализа.

Существуют технологии, позволяющие проводить мультиплексный анализ., т. е. определение нескольких аналитов в одной пробе. Традиционно мультиплексный иммунный анализ (МИА) проводится на микропланшетах. Реализовано несколько подходов к организации МИА: создание нескольких независимых сенсорных зон, использование различных меток для обнаружения разных аналитов [30] или совмещение этих подходов. Например, в случае применения метода ELISA вторичные антитела к разным антигенам связываются с метками, обладающими флуоресценцией на разных длинах волн. Также известно два подхода для детектирования результата такого анализа: 1) одновременное детектирование отдельных сенсорных зон или реакторов, либо 2) последовательное детектирование результата анализа разных проб или аналитов (длительный процесс в случае стандартных микроматриц с 96 лунками) [28].

Постановка анализа на микрофлюидном устройстве позволяет объединить достоинства иммунных методов и микрофлюидики: специфичность, экспрессность, чувствительность, низкий расход пробы и реагентов, возможности совмещения нескольких стадий или всего анализа на одном устройстве и автоматизации процесса и т.д.

Иммунный анализ на микрофлюидном устройстве (или

микрофлюидный иммунный анализ [26, 30]) обладает следующими

17

преимуществами над традиционными методами: (1) увеличение отношения площади поверхности к объему ускоряет протекание реакции антитела с антигеном, (2) меньшие размеры подводящей системы и реакторов снижают расход реагентов и пробы и (3) автоматизация управления потоками приводит к улучшению воспроизводимости и повышению производительности анализа. Эти характеристики потенциально могут привести к увеличению производительности и снижению стоимости по сравнению с традиционным иммунным анализом [30]. Однако, образование пузырьков воздуха и «мертвые» зоны снижают воспроизводимость анализа [26].

Оба вида иммунного анализа (гомогенный, гетерогенный) могут быть реализованы на микрофлюидном чипе. В гетерогенном анализе антитела иммобилизуются на поверхность микрофлюидного устройства или на микрочастицы, находящиеся в устройстве. В гомогенном варианте связавшиеся и несвязавшиеся антитела разделяются в соответствии с их электрофоретической подвижностью в микроканалах [30].

Немалое влияние на чувствительность, продолжительность и предел обнаружения анализа оказывают стадии доставки аналита и вымывания несвязавшихся белков. В каналах микрофлюидных чипов, в отличие от традиционных микропланшетов, возможно улучшение условий транспортировки аналита к чувствительной поверхности за счет, например, организации потока, перпендикулярного потоку пробы и сенсорному слою. При ламинарности потока это приведет к тому, что транспортируемая проба будет «прижата» к части канала с чувствительным слоем [38]. Другим вариантом улучшения транспорта является интегрирование в микрочип дополнительных функциональных элементов (смесителей или насосов) или приложение активных сил (механических, электрических или магнитных) для управления потоками [30].

Одним из распространенных методов повышения чувствительности

иммунного анализа является использование магнитных и немагнитных

18

частиц. С одной стороны это приводит к возрастанию соотношения площади поверхности к объему и повышает воспроизводимость процесса доставки антител, упрощает перемешивание реагентов и вымывание несвязавшегося белка, с другой стороны, возникает риск адсорбции этих частиц на стенках устройства, засорения каналов, увеличения гидродинамического сопротивления, а также появления светорассеяния на этих частицах. Применение микрочастиц для иммунного анализа рассмотрено в [25, 30].

Другим методом повышения чувствительности является переход от плоской подложки к ЗБ структурам, таким как нанопористый кремний [39], нановискеры, пористая керамика и др. Среди них выгодно выделяются пористые стекла (ПС), отличительной особенностью которых являются: развитая поверхностная структура, оптическая прозрачность в широком спектральном диапазоне, физическая и химическая устойчивость, биосовместимость, возможность формирования структуры с заданными размерами пор [40]. Пористые стекла затрудняют диффузию аналита к иммобилизованной чувствительной поверхности, однако структура и распределение зарядов на поверхности позволяют использовать явление осмоса при градиенте концентрации и/или организовать электроосмотический подвод пробы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Есикова, Надежда Александровна, 2013 год

Список литературы:

1. Mark D., Haeberle S., Roth G., von Stettenzab F., Zengerle R. Microfluidic lab-on-a-chip platforms: requirements, characteristics and applications // Chem. Soc. Rev. 2010. №.39. P. 1153-1182.

2. Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B: Chemical. 1990. №1. P. 244-248

3. Abgrall P., Gue A.-M. Lab-on-chip technologies: making a microfluidic network and coupling it into a complete microsystem—a review // J. Micromech. Microeng. 2007. №17. P. R15-R49

4. Белых И.А., Грек A.M., Сакун A.B., Марущенко B.B., Гаташ С.В. Аналиты в биосенсорах // Бюф1зичний вюник. 2010. Т. 25. №2. С. 144158.

5. Matsumura Y., Inami W., Kawata Y. Laser control of self-organization process in microscopic region and fabrication of fine microporous structure // Advances in Optical Technilogies. 2012. ID 371390 (5).

URL: http://www.hindawi.com/iournals/aot/2012/371390/

6. Behzad K., Mat Yunus W. M., Talib Z. A., Zakaria A., Bahrami A., Shahriari E. Effect of etching time on optical and thermal properties of p-type porous silicon prepared by electrical anodisation method // Int. J. Electrochem. Sci. 2012. №7. P. 8266-8275.

URL: http://www.electrochemsci.org/papers/vol7/7098266.pdf

7. Friend J., Yeo L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane// Biomicrofluidics 2010. №4. ID 026502 (5).

8. Sia S.K., Whitesides G.M., Microfluidic devices fabricated in PDMs for biological studies // Electrophoresis. 2003. №24. P. 3563-3576.

9. Zhou J, Khodakov DA, Ellis AV, Voelcker NH. Surface modification for PDMS-based microfluidic devices. //Electrophoresis. 2012. V. 33. №1. P. 89-104.

1 O.Zhou J., Ellis A.V., Voelcker N. H. Review: Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices // Electrophoresis. 2010. №31. P. 2-16.

1 l.Wu H., Huang В., Zare R.N. Construction of microfluidic chips using polydimethylsiloxane for adhesive binding//Lab Chip. 2005. №5. P. 13931398.

12. Low temperature bonding for wafer scale packaging and assembliny of micromachined sensors / Ma X., Gierhart В., Collins S.D., Smith R.L. Univ. California, Davis, 95 616 Final Rep. 1998-99 for MICRO Project 98-144.

13.Mathur A., Roy S.S., Tweedie M., Mukhopadhyay S., Mitra S.K., McLaughlin J.A. Characterisation of PMMA microfluidic channels and devices fabricated by hot embossing and sealed by direct bonding// Current Applied Physics. 2009. №9. P. 1199-1202.

14.Chen Y., Zhang L., Chen G. Fabrication, modification and application of Poly(methyl methacrylate) microfluidic chips // Electrophoresis. 2008. №29. P. 1801-1814.

15.Chen J., Wabuyele M., Chen H., Patterson D., Hupert M., Shadpour H., Nikitopoulos D., Soper S.A.. Electrokinetically synchronized polymerase chain reaction microchip fabricated in polycarbonate// Anal Chem. 2005. № 77. V. 2. P. 658-666.

16.Kim P, Kwon K.W., Park M.C., Lee S.H., Kahp S.M.K., Suh Y. Soft Lithography for Microfluidics: a Review // BIOCHIP JOURNAL. 2008. V. 2. №1. P. 1-11.

17.Priest C. Surface patterning of bonded microfluidic channels // Biomicrofluidics. 2010. № 4. ID 032206. 4(3):32206. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2967238/pdf/BIQMGB-000004-032206 l.pdf

18.Xiong L., Regnier F.E., Channel -specific coatings on microfabricated chips //Journal of chromatography A. 2001. №924. P. 165-176.

19. Chandrasekaran A., Acharya A., You J.L., Soo K.Y., Packirisamy M., Stiharu I., Darveau A. Hybrid integrated silicon microfluidic platform for fluorescence based biodetection // Sensors. 2007. №7. P. 1901-1915.

20. Simone G., Perozziello G., Sardella G., Disegna I., Tori S., Manaresi N., Medoro G. A microvalve for hybrid microfluidic systems// Microsystem Technologies. 2010. V. 16, №7. P. 1269-1276.

21.Chow W.W.Y., Lei K.F., Shi G., Li W.J., Huang Q. Microfluidic fabrication by PDMS-interface bonding II Smart Materials and Structures. 2006. V. 15. №1. P. 112-115.

22.Tana H. Y., Lokea W. K., Nguyen N.-T. A reliable method for bonding polydimethylsiloxane (PDMS) to polymethylmethacrylate (PMMA) and its application in micropump // Sensors and Actuators. 2010. V. 151. №1.

P. 133-139.

23.Kim K., Park S.W., Yang S. S. The optimization of PDMS-PMMA bonding process using silane primer//BioChip J. 2010. V. 4. №2. P. 148-154.

24.McDonald J. C., Whitesides G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices // Acc. Chem. Res. 2002. №35. P. 491-499.

25.Choi S., Goryll M., Sin L.Y.M., Wong P.K., Chae J. Microfluidic-based biosensors toward point-of-care detection of nucleic acids and proteins // Microfluid Nanofluid. 2011. №10. P. 231-247.

26. Lin C.-C., Wang J.-H., Wu H.-W., Lee G.-B. Microfluidic immunoassays // JALA 2010. V. 15. №3. P. 253-274.

27.Trout D.B., Seltzer J. M., Page E.H., Biagini R.E., Schmechel D., Lewis D.M., Boudreau A.Y. Clinical use of immunoassays in assessing exposure to fungi and potential health effects related to fungal exposure // ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOLOGY. 2004. №92. P. 483-491.

28.Wang C., Wu J., Zong C., Xu J., Ju H.-X. Chemiluminescent Immunoassay and Its Applications // Chin J Anal Chem. 2012. V. 40. №1. P. 3-10.

29.Plaza G., Ulfig K., Tien A.J. Immunoassays and Environmental Studies//Polish Journal of Environmental Studies. 2000 V. 9. № 4. P. 231236.

30. Ng A. H. C., Uddayasankar U., Wheeler A. R. Immunoassays in microfluidic systems // Anal Bioanal Chem. 2010. №397. P. 991-1007.

31 .Monosik R., Stred'ansky M., Sturdik E. Biosensors — classification,

characterization and new trends // Acta Chimica Slovaca. 2012. V. 5, №1. P. 109—120.

32. Janssen K.P.F., Knez K., Spasic D., Lammertyn J. Nucleic Acids for UltraSensitive Protein Detection // Sensors (Basel). 2013. V. 13. №1. P. 13531384.

33.Kim J., Junkin M., Kim D.-H., Kwon S., Shin Y. S., Wong P. K., Gale В. K. Application, Technique and microfluidic interface for nanoscale biosensing, Microfluid Nanofluid // 2009. V. 7, №2, P. 149-167.

34.Nakanishi K., Sakiyama Т., Kumada Y., Imamura K., Imanaka H. Recent advantages in controlled immobilization of proteins onto the surface of solid substrate and its possible application to proteomics // Current proteomics. 2008. №5. P. 161-175.

35.Jonkheijm P., Weinrich D., Schroder H., Niemeyer С. M., Waldmann H. Chemical Strategies for Generating Protein Biochips // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. №47. P. 9618 - 9647. URL: www.angewandte.org

36.Иммуноферментный анализ: пер. с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа. — М.: Мир, 1988.-446с

37.URL: http://www.cusabio.com

38.Hofmann О, Voirin G, Niedermann Р, Manz A Three-dimentional microfluidic confinement for afficient sample delivery to biosensor surfaces. Application to immunoassays on planar optical waveguides. // Anal. Chem. 2002. №74. P. 5243-5250.

39.De Stefano L., Rotoroti L., Rea I., Rendina I., Arcari P., Lamberti A., Sanges C. DNA optical detection based on porous silicon technology: from biosensors to biochips // Sensors. 2007. №7. P. 214-221.

40.Цыганова T.A. Физико-химические процессы формирования структуры пористых стекол в кислотно-солевых растворах : автореф. дис. ... канд. хим. наук: 02.00.04 / Цыганова, Татьяна Анатольевна. - С-Пб., 2010. -20с.

41.Yeom S.-H., Kang В.-Н., Kim K.J., Kang S.-W. Nanostructures in biosensor - a review//Frontiers in Bioscience. 2011. №16. P. 997-1023.

42.Rasooly A., Herold К. E. (eds.) Methods in Molecular Biology: Biosensors and Biodetection, Vol. 504 © Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009

43.Curtis D. Chin, Vincent Linder, Samuel K. Sia Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices //Lab Chip. 2012. №12. P. 2118-2134.

44.Yakovleva J., Davidsson R., Bengtsson M., Laurell Т., Emneus J. Microfluidic enzyme immunosensors with immobilised protein A and G using chemiluminescence detection. // Biosens Bioelectron. 2003. №19. P. 21-34.

45.Rusmini F., Zhong Z., Feijen J. Protein immobilization strategies for protein biochips // Biomacromoleculas. 2007. №8. P. 1775-1789.

46.Молчанова О.С. Пористое стекло. // Труды, посвященные памяти И.В. Гребенщикова. .-Л.; Оборонгиз, 1956. Т. 24. №145. С. 86-114.

47.Мазурин, О.В. Двухфазные стекла: структура, свойства, применения. / О.В. Мазурин, Т.П. Роскова, В.И. Аверьянов, Т.В Антропова. - JL: Наука, 1991.-276 с.

48.Жданов С.П. Структура пористых стекол по адсорбционным данным // Труды ГОИ памяти И.В. Гребенщикова. - Л.; Оборонгиз, 1956. Т. 24. №145. С. 86-114.

49.IUPAC, MEMS: Design and fabrication. URL: http://www.iupac.org

50.Головань Л.А., Тимошенко В.Ю., Кашкаров П.К. Оптические свойства нанокомпозитов на основе пористых систем // Успехи физических наук. 2007. Т. 177. №6 С. 619-638.

51 .Крейсберг В.А., Ракчеев В.П., Антропова Т.В. Влияние концентрации кислоты на морфологию микро- и мезопор пористых стекол// Физика и химия стекла. 2006. Т. 32, №6. С. 845-854.

52.Antropova T.V. The physical-chemical model of leaching process of the phase-separated alkali borosilicate glasses and formation of porous glass structure // Физика и химия стекла. 2012. №38, Т. 6. С. 806-811.

53.Роскова Г.П., Цехомская Т.С., Вензель Б.И. Светопропускание пористых стекол различной структуры // Физика и химия стекла. 1998. Т. 14. №6. С. 911-914.

54.Yao S., Santiago J.G. Porous glass electroosmotic pumps: theory // J. Colloid and Interface Science. 2003. V. 268. №2. P. 133 - 142.

55.Yao S., Hertzog D.E., Zeng S., Mikkelsen J.C., Santiago J.G. Porous glass electroosmotic pumps: design and experiments // J. Colloid and Interface Science 2003. V. 268. №2. P. 143-153.

56.Cullis A.G., Canham L.T., Calcott P.D. The structural and luminescence properties of porous silicon // J. Appl. Phys. 1997. №82. 909

57.Behzad K., Mat Yunus W.M., Talib Z.A., Zakaria A., Bahrami A., Shahriari E. Effect of etching time on optical and thermal properties of p-type porous silicon prepared by electrical anodisation method // Advances in Optical Technologies. 2012. Article ID 581743,9 pages

58.Burggraaf A.J., Keizer; Burggraaf A.J., Transport and separation properties of membranes with gases and vapours. In: Burggraaf A.J., Cot L., eds. Fundamentals of inorganic membrane science and technology. Elsevier, Amsterdam, 1996. P.331-427.

59.Xu J., Vaillant R., Attinger D. Use of a porous membrane for gas bubble removal in microfluidic channels: physical mechanisms and design criteria // Microfluidics and Nanofluidics. 2010. №9. P. 765-772.

60.Matsumura Y., Inami W., Kawata Y. Laser control of self-organization process in microscopic region and fabrication of fine microporous structure // Advances in Optical Technologies. 2012. Article ID 371390,5 pages

61.Рощина T.M. Адсорбционные явления и поверхность // Соросовский образовательный журнал. 1998. №2. С. 89-94.

URL: http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/493.html

62.Handbook of microscopy for nanotechnology. / Edited byYao N., Wang Z.L. - Kluwer Academic Press, 2005. - P. 745.

63.Дроздова И.А., Антропова T.B.. Исследование пористых стекол методом электронной микроскопии и микродифракции // Журнал прикладной химии. 1993. Т. 66. №10. С. 2198-2207.

64.Дроздова И.А., Антропова Т.В. Использование различных методов электронной микроскопии для исследования неоднородностей в пористых стеклах // Журнал прикладной химии. 1995. Т. 68. №2. С. 326327.

65.Альтшулер Г.Б., Баханов В.А., Дульнева Е.Г., Мешковский И.К. Исследование оптических характеристик активных элементов из

кварцевого микропористогостекла // Оптика и спектроскопия. 1983. Т. 55, №2. С. 369-374.

66.Роскова Г.П., Морозова Э.В., Баханов В.А. Светопропускание пористых пластин, получаемых из двухфазных натриевоборосиликатных стекол с различной структурой//Физика и химия стекла. 1991. Т. 17, №4. С. 623-630.

67.Смирнова И.С., Антропова Т.В., Сидорова М.П., Ермакова Л.Э., Роскова Г.П. Влияние условий получения микропористых стекол на их светопропускание и величины коэффициентов структурного электросопротивления // Физика и химия стекла. 1996. Т. 22, №4. С. 551-558.

68.Кучинский С.А., Суханов В.И., Хазова М.В., Доценко А.В. Эффективные оптические постоянные пористого стекла // Оптика и спектроскопия. 1991. Т. 70, №1. С. 150-154.

69.Кучинский С.А., Суханов В.И., Хазова М.В. Принципы формирования голограмм в капиллярных композитах// Оптика и спектроскопия. 1992. Т. 72, №3. С. 716-730.

70.Виноградов А.П. Электродинамика композитных материалов / А.П. Виноградов. Под ред. Б.З. Каценеленбаума. - М: Эдиториал УРСС, 2001.-208 с.

71.Евстрапов А.А., Есикова Н.А., Антропова Т.В. Исследование пористых стекол методами оптической спектроскопии // Оптический журнал. 2008. Т. 75, №4. С. 71-77.

72.Иванов А.П. Оптика рассеивающих сред. / А.П. Иванов — Минск: «Наука и техника», 1969. - 592с.

73.Шишловский А.А. Прикладная физическая оптика. / А.А. Шишловский. - М.: Физматгиз, 1961. - 822с.

74.Evstrapov A.A., Esikova N.A., Antropova T.V. Spectral characteristics and structure of porous glasses // Optica Applicata. 2005. V. 35, №4. P.753-759.

75.0vechko V.S., Dmitruk A.M., Fursenko O.V., Lepeshkina T.P. Ellipsometry and spectroscopy of porous glass surfaces // Vacuum. 2001. №61. P. 123128.

76.Толмачев В.А. Определение пористости неоднородных пленок адсорбционно-эллипсометрическим методом // Оптика и спектроскопия. 1998. Т. 84, №4. С. 653-657.

77.Dotsenko A., Efremov A., Kuchinsky S. Modelling the optical properties of heterogeneous glasses // Proc. Int. Congr. Glass. V. 1. Invited Papers, Edinburg, Scotland, 1-6 July 2001, 198-214

78.Верещагин В.Г., Дынич Р.А., Понявина А.Н. Эффективные оптические параметры пористых диэлектрических структур // Спектроскопия твердого тела. 1998. Т. 84, №3. С.486-490.

79-Нои С., Herr А.Е. Review: Clinically relevant advances in on-chip affinity-based electrophoresis and electrochromatography // Electrophoresis. 2008. №29. P. 3306-3319.

80.Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функций клетки: Пер. с англ. / А. Ленинджер. - М.: Мир, 1976.-960 с.

81 .Антропова Т.В., Анфимова И.Н., Головина Г.Ф.. Влияние состава и температуры тепловой обработки пористых стекол на их структуру и светопропускание // Физика и химия стекла. 2009. Т. 35. №. 6. С. 755766.

82.Собина Е.П. Влияние физико-химических факторов на спектры диффузного отражения в ближней инфракрасной области влагосодержащих порошкообразных веществ : автореф. дис.... канд. хим. наук: 02.00.04 / Собина Егор Павлович. Екатеринбург, 2009. - 24 с.

83.Вечкасов И.А., Кручинин Н.А, Поляков А.И., Резинкин В.Ф. Приборы и методы анализа в ближней инфракрасной области. М.: «Химия», 1977 -357с.

84.ОСТ 3-1899-81 «Заготовки для выщелачивания из стекла ДВ-1. Технические условия».

85.Reigosa R.M.J. Handbook of Plant Ecophysiology Techniques. / R.M.J. Reigosa. - Netherlands: Springer, 2001. P. 283-295.

86.Evstrapov A., Esikova N., Rudnitskaja G., Antropova T. Porous glasses as sensor elements for microfluidic chips // Optica Applicata 2010. V. 40, №2. P. 333-340.

87.Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. / Под ред. Г.В. Лисичкина. - М.:Химия, 1986. - 248 с.

88.Marc R.E., Murry R.F., Basinger S.F. Pattern recognition of amino acid signatures in retinal neurons // J. Neurosci. 1995. №15. P. 5106-5129.

89.Das A., Chitra R., Choudhury R.R., Ramanadham M. Structural changes during the unfolding of Bovine serum albumin in the presence of urea: A small-angle neutron scattering study // Pramana - J.Phys. 2004. V. 63, №2. P. 363-368.