Исследование фолдинга флавин-связывающих флуоресцентных белков и инженерия на их основе инструментов для микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Юденко Анна Николаевна

• Юденко Анна Николаевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Юденко Анна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

Вклад автора

Апробация работы

Тезисы конференций

Публикации автора теме диссертации

Структура и объем работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Флавин-связывающие флуоресцентные белки

1.1.1. Природные ЬОУ-домены

1.1.2. Использование БЬБР в качестве флуоресцентных меток

1.1.3. Механизм действия ЬОУ-доменов в природе

1.2. Сенсоры белок-белковых взаимодействий

1.2.1. Зачем нужны сенсоры белок-белковых взаимодействий?

1.2.2. Необратимые сенсоры с нелокализованным сигналом

1.2.3. Обратимые сенсоры с нелокализованным сигналом

1.2.4. Необратимые сенсоры с локализованным сигналом

1.2.5. Обратимые сенсоры с локализованным сигналом

1.3. Оптогенетические инструменты на основе флавин-связывающих белков

1.3.1. Оптогенетические инструменты на основе криптохромов

1.3.2. Оптогенетические инструменты на основе ВШБ-доменов

1.3.3. Оптогенетические инструменты на основе ЬОУ-доменов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Генно-инженерные методы

2.1.1. Создание праймеров

2.1.2. Полимеразно-цепная реакция

2.1.3. Оптимизация нуклеотидных последовательностей

2.1.4. Сборка генов из олигонуклеотидов

2.1.4. Электрофоретический анализ в агарозном геле

2.1.5. Выделение ДНК из агарозного геля и реакционных смесей

2.1.6. Внесение точечных мутаций

2.1.7. Внесение и удаление отрезков ДНК

2.1.8. Рестрикция DpnI

2.1.9. Сборка методом рестрикция-лигирование

2.1.10. Приготовление компетентных клеток

2.1.11. Трансформация клеток E. Coli

2.1.12. Выделение плазмиды из клеток

2.2. Биоинформатические методы

2.3. Экспрессия и очистка белков

2.3.1. Экспрессия белков в жидкой среде и на твердой среде в чашках Петри

2.3.2. Разрушение клеток и центрифугирование

2.3.3. Металл-аффинная хроматография

2.3.4. Гель-проникающая хроматография

2.4. Методы характеризации белков

2.4.1. Электрофоретический анализ в ПАА-геле

2.4.2. Вестерн и дот-блоттинг

2.4.3. Измерение концентрации

2.4.4. Измерение спектров флуоресценции

2.4.5. Измерение термостабильности

2.4.6. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)

2.4.7. Кристаллизация белков

2.5. Работа с эукариотическими клетками и микроскопия

2.5.1. Основные протоколы работы с адгезионными клеточными культурами

2.5.2. Трансфекция

2.5.3. Цитометрия

2.5.4. Конфокальная микроскопия

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Флавин-связывающие флуоресцентные белки из термофильных бактерий

3.1.1. Определение структуры в растворе флавин-связывающих флуоресцентных белков методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)

3.1.2. Использование Са§ЕЬБР в качестве флуоресцентной метки

3.2 Мономерные варианты CagFbFP

3.2.1. Экспрессия и очистка мономерных вариантов CagFbFP

3.2.2. Определение олигомерного состояния методом МУРР

3.3 Разделенный CagFbFP

3.3.1 Биоинформатический поиск мест разреза

3.3.2 Внесение гибких вставок

3.3.4. Применение разделенного Са§ЕЬБР в качестве сенсора белок-белковых

взаимодействий в клетках млекопитающих

3.3.6. Проверка обратимости связывания частей разделенного Са§ЕЬБР. Прототип кальциевого сенсора на основе split-CagFЬFP

3.4. Циркулярно пермутированный CagFbFP

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

В исследованиях биологических объектов огромное место занимают оптические методы. К ним относится и флуоресцентная микроскопия. При получении изображений микроскопических объектов важны разрешение и контраст. Из-за того, что большинство белков не проявляют оптические свойства в видимом диапазоне длин волн, для достижения контраста необходимо использование флуоресцентных меток, которые бывают химическими или же генетически кодируемыми белковыми. В микроскопии живых объектов критически важное место занимают флуоресцентные белки. Помимо контраста они позволяют существенно улучшить разрешение. Современными методами микроскопии достигается на порядок более высокое разрешение, если сравнивать с классическими подходами.

Первая демонстрация возможности использования зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки в 1994 году вызвала взрывной рост как в поиске новых белков, так и в разработке новых подходов в микроскопии. Флуоресцентные белки позволяют напрямую наблюдать за молекулярными процессами в живых клетках и организмах. Подавляющее большинство используемых флуоресцентных белков относятся к классу ОБР-подобных, но этот класс имеет ряд недостатков, которые в некоторых условиях могут оказаться критическими. Для созревания хромофора аналогам GFP требуется молекулярный кислород, что затрудняет их использование в анаэробных условиях. Также для созревания хромофора требуется от нескольких минут до нескольких часов после трансляции, так как он формируется посредством автокаталитической реакции. Кроме того, они имеют относительно большой размер (~240 аминокислотных остатков). Поиск и исследование флуоресцентных белков из других классов могут позволить преодолеть эти ограничения. При этом предпочтение должно отдаваться полипептидам, которым для флуоресценции не требуется добавление экзогенного хромофора.

Флавин-связывающие флуоресцентные белки (FbFP) - сравнительно новый класс белков, полученных из природных фотосенсорных доменов семейства LOV (light-oxygen-voltage). Они флуоресцируют благодаря флавинам (рибофлавин, флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид), которые в норме присутствуют в клетках. FbFP имеют небольшой размер (—110 аминокислотных остатков) и не требуют молекулярный кислород. Они могут быть использованы в качестве генетически-кодируемых флуоресцентных меток для микроскопии живых клеток, в том числе в анаэробных условиях.

При разработке новых флуоресцентных белков для получения более удобного и корректно работающего варианта оптимизируют разные параметры: способность фолдироваться и формировать/связывать хромофор при гетерологической экспрессии, фотостабильноть, яркость, спектральные свойства. Одной из основных характеристик флуоресцентной метки является мономерность. Немономерность белков слияния может приводить к нежелательным артефактам (реорганизация органелл, неправильные взаимодействия и др.), поэтому исследование олигомерного состояния флуоресцентного белка и поиск мономерных вариантов является важной задачей.

Помимо меток, флуоресцентные белки могут быть основой для молекулярных сенсоров. На основе GFP-подобных белков была разработана широкая линейка самых разнообразных сенсоров, которые детектируют ионы, метаболиты, активные формы кислорода, активность киназ и др. [1]. Отдельное место в этом разнообразии занимают зонды белок-белковых взаимодействий (ББВ). Определение ландшафта ББВ критически важно для понимания внутриклеточных процессов. Зонд ББВ может быть реализован посредством разделения флуоресцентного белка на комплементарные части, где первая часть прикрепляется к одному исследуемому белку, а вторая - к другому. По-отдельности части не флуоресцируют, а при возникновении взаимодействия между исследуемыми белками собирается полноразмерный флуоресцирующий белок. Такой зонд позволяет определять не только наличие ББВ, но и локализацию. Впервые флуоресцентный белок был успешно разделен на части в 2000 году [2], и с тех пор описано более 30 разделенных ОБР-подобных белков. Все они, помимо стандартных недостатков, свойственных ОБР, собираются необратимо, то есть невозможно определять прекращение ББВ, следить за динамикой. Чтобы разрешить эту проблему, требуется создание инструментов определения ББВ на основе разделенных флуоресцентных белков из других классов. Ранее описано три типа обратимых разделенных белков: связывающий биливердин БрШ-ШР1.4 [3], связывающий билирубин врШ-ИпаО [4], связывающий аналоги гидроксибензилиденродамина врШБАБТ [5]. Все они требуют либо добавления экзогенного хромофора, либо компенсации недостатка эндогенного хромофора. Перспективным альтернативным классом флуоресцентных белков, который потенциально может преодолеть проблему необратимости без потребности в кислороде или экзогенных хромофорах, являются флавин-связывающие флуоресцентные белки.

Для разработки инструментов для микроскопии на основе флуоресцентного белка требуется систематическое исследование особенностей его структурной организации.

Степень разработанности проблемы

В 2015 году Glantz и соавторами было описано более 6700 последовательностей LOV-доменов (>4000 новых) [6]. На сегодняшний день это самая полная опубликованная база LOV-доменов. В ней представлены последовательности как из прокариот, так и эукариот: архей, бактерий, протистов (включая водоросли), грибов и растений.

Экспериментально исследовано около 20 флавин-связывающих флуоресцентных белков из LOV-доменов разных организмов. Те, для которых было исследовано олигомерное состояние, являются димерами, однако есть и мономеры. Наиболее широко используется мономерный белок iLOV (модифицированный LOV-домен из Arabidopsis thaliana).

Впервые в качестве флуоресцентного белка для микроскопии живых клеток LOV-домен был использован в 2007 году в работе Drepper и соавт. [7]. В 2012 году на нескольких клеточных линиях млекопитающих было показано, что FbFPs могут быть использованы для флуоресцентного мечения в условиях гипоксии [8]. Было показано, что в отличие от eGFP, флуоресценция FbFP не уменьшается ни в пролиферирующих, ни в дифференцированных клетках в условиях гипоксии. В ряде работ показано успешное использование FbFP-меток для исследования бактерий в анаэробных условиях [7,9,10]. Два варианта LOV-доменов (rsLOV1 и rsLOV2), разработанных на основе бактериального фоторецептора YtvA из Bacillus subtilis, были использованы в методах высокоразрешающей микроскопии RESOLFT и STED [11]. Ранее LOV-домен из YtvA дикого типа был применен для еще одного метода микроскопии высокого разрешения PALM [12].

В 2017 году было исследовано восемь FbFP из термофильных организмов, в том числе упоминаемый в данной диссертации MrFbFP из Meiothermus ruber. Однако, нет информации об их олигомерном состоянии, и нет публикаций, где применялись бы эти белки.

На момент начала представленных далее работ не было описано ни одного разделенного или пермутированного LOV-домена (или FbFP). Впоследствии появилась работа Boassa и соавт., где был описан разделенный белок miniSOG, который также относится к флавин-связывающим флуоресцентным белкам [13]. Однако, из-за разного происхождения miniSOG и CagFbFP полученные результаты существенно отличаются. Например, для miniSOG только одно место разделения белка позволяет создать функциональный циркулярно пермутированный вариант, в то время как для CagFbFP таких мест не менее трех. Полное сравнение split-miniSOG и split-CagFbFP приведено в тексте диссертации и соответствующей публикации.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование особенностей фолдинга флавин-связывающих флуоресцентных белков и создание прототипов инструментов для микроскопии на их основе.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Анализ структуры в растворе вариантов флавин-связывающих флуоресцентных белков из термофильных бактерий Chloroflexus aggregans и Meiothermus ruber, выбор наиболее перспективного варианта

2) Выбор и внесение точечных мутаций, потенциально влияющих на олигомерное состояние флуоресцентного белка CagFbFP и определение олигомерного состояния полученных мутантов

3) Проверка возможности использования CagFbFP и мутантов в качестве генетически-кодируемой флуоресцентной метки для микроскопии клеток млекопитающих

4) Биоинформатический анализ всех аннотированных последовательностей LOV-доменов и анализ всех известных структур высокого разрешения LOV-доменов с целью определения наиболее вариативных петель

5) Варьирование длин выбранных на предыдущем этапе петель; определение влияния длины петель на основные характеристики белка (способность связывать хромофор, способность фолдироваться при гетерологической экспрессии в E. coli, термостабильность)

6) Создание разделенного флуоресцентного белка; проверка возможности его использования в качестве сенсора белок-белковых взаимодействий на модельных белках в растворе, а также в клетках бактерий и млекопитающих

7) Проверка обратимости сборки белка из двух частей

8) Создание циркулярно пермутированных вариантов белка и их изучение

Научная новизна

Впервые исследован флавин-связывающий флуоресцентный белок CagFbFP, полученный из LOV-домена растворимой гистидин-киназы из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans. Исследованы особенности фолдинга разных вариантов CagFbFP и охарактеризованы его мономерные мутанты. Показано, что CagFbFP может быть использован в химерных конструкциях с белками слияния для флуоресцентной микроскопии клеток млекопитающих.

Впервые предложен биоинформатический подход поиска потенциальных мест разделения белков на основе множественного выравнивания последовательностей и последующего анализа вариативности длин бесструктурных петель.

Впервые предложено три способа разделения флавин-связывающего флуоресцентного белка на комплементарные пары. Показано, что данные пары могут фолдироваться и формировать функциональный флуоресцентный комплекс. При этом каждая из частей по отдельности не связывает хромофор и не флуоресцирует. На модельных белках показано, что эти комплементарные пары могут быть использованы в качестве зонда белок-белковых взаимодействий в клетках. Впервые создан прототип сенсора кальция на основе флавин-связывающего флуоресцентного белка.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показано, что флавин-связывающий флуоресцентный белок из LOV-домена термофильной бактерии Chloroflexus aggregans (CagFbFP) и его мономерные мутанты могут быть использованы в качестве генетически-кодируемых флуоресцентных меток для визуализации клеток. Из-за высокой стабильности и способности рефолдироваться CagFbFP может быть использован в крайне широком диапазоне условий.

Предложен биоинформатический подход, позволяющий находить наиболее перспективные места разрезов белков для создания стабильных комплементарных частей. Данный подход может быть применен не только для флуоресцентных белков, но и любых глобулярных белков.

Разработаны три пары комплементарных частей CagFbFP, которые могут быть применены в качестве сенсоров белок-белковых взаимодействий в живых клетках и в растворе, в том числе в анаэробных условиях.

На примере кальциевого сенсора, продемонстрирована возможность создавать сенсоры на основе CagFbFP.

Положения, выносимые на защиту

1. Флавин-связывающий флуоресцентный белок CagFbFP из светочувствительной растворимой гистидин-киназы термофильной бактерии Chloroflexus aggregans (кодируемый остатками 47-153 гена Cagg_3753), является димером in vitro.

2. Точечные мутации M51E, V53E и V145E приводят к мономеризации CagFbFP в растворе.

3. CagFbFP может быть использован в качестве генетически-кодируемой флуоресцентной метки для микроскопии клеток млекопитающих.

4. CagFbFP может быть разделен на комплементарные пары тремя способами. При коэкспрессии частей CagFbFP, соответствующих сайтам разрезов A58/D59, P91/Q92, E137/T138, слитых с модельными взаимодействующими белками, происходит комплементация и формирование функционального флуоресцентного комплекса.

5. Анализ вариативности длин петель в последовательностях гомологичных белков позволяет выбрать сайты разделения белка для создания комплементарных полипептидных пар, способных формировать функциональный белок.

6. Разделенный CagFbFP собирается из комплементарных частей обратимо.

Вклад автора

Автор участвовала в планировании и разработке концепций всех описанных исследований, оптимизировала используемые в работе протоколы, участвовала в обсуждении результатов и написании статей; проводила биоинформатический анализ, измерение МУРР и анализ данных, сборку генетических конструкций, экспрессию и очистку рекомбинантных белков, эксперименты по проточной цитометрии, выполняла работу по ведению и трансфекции клеточных линий. Учувствовала в экспериментах по микроскопии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование фолдинга флавин-связывающих флуоресцентных белков и инженерия на их основе инструментов для микроскопии»

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях: 8th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures «Saint Petersburg OPEN 2021» (Санкт-Петербург, 2021); 64-я Всероссийская научная конференция МФТИ. (Долгопрудный. 2021); VI Междисциплинарная конференция «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (2020, Нижний Новгород); 73-я Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижний Новгород, 2020); 62-я Всероссийская научная конференция МФТИ. (Долгопрудный. 2019); International Conference "Biomembranes 2018" (Долгопрудный, 2018); 61-я Всероссийская научная конференция МФТИ. (Долгопрудный. 2018).

Тезисы конференций

1) A Yudenko, A Smolentseva, I Goncharov, V Nazarenko, A Remeeva, I Gushchin. Engineering of a monomeric thermostable LOV domain-derived fluorescent protein // JOURNAL OF BIOENERGETICS AND BIOMEMBRANES. 2018. - Т. 50. - №. 6. - С. 599-599.

2) V. V. Nazarenko, A. Remeeva, A. Yudenko, K. Kovalev, I. M. Goncharov, A. Rogachev, G. Dhoke, U. Schwaneberg, M. D. Davari, K. E. Jaeger, U. Krauss, V. Gordeliy, I. Gushchin. Structural and biophysical studies of a LOV domain-derived fluorescent protein // JOURNAL OF BIOENERGETICS AND BIOMEMBRANES. 2018. - Т. 50. - №. 6. - С. 565-565.

3) A. Remeeva, V. V. Nazarenko, K. Kovalev, A. Yudenko, I. M. Goncharov, V. Gordeliy, I. Gushchin. Characterization of thermostable LOV-based fluorescent protein variants with mutations of a highly conserved glutamine. // JOURNAL OF BIOENERGETICS AND BIOMEMBRANES. - 2018. - Т. 50. - №. 6. - С. 575-575.

4) A. N. Yudenko, A. Smolentseva, I. Maslov, O. Semenov, I. Kaiumov, A. A. Remeeva and I. Gushchin. A split flavin binding fluorescent reporter to detect protein-protein interactions. // 8th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures "Saint Petersburg OPEN 2021". Saint Petersburg. 2021

5) I. Kaiumov, A. Yudenko, I. Gushchin. Circular permutation of thermostable flavin-based fluorescent protein from Chloroflexus aggregans. // 64-ая Всероссийская научная конференция МФТИ. Москва-Долгопрудный-Жуков^ий. 2021

6) А. Н. Юденко, А. А. Смоленцева, В. В. Назаренко, И. М. Гончаров, А. А. Ремеева, И. Ю. Гущин. Разработка разделенного флавин-связывающего флуоресцентного белка для использования в качестве зонда белок-белковых взаимодействий. // МОБИ-ХимФарма2020. Нижний Новгород. 2020

7) А. Н. Юденко, А. А. Смоленцева, В. В. Назаренко, И. М. Гончаров, А. А. Ремеева, И. Ю. Гущин. Разработка флавин-связывающего флуоресцентного белка для использования в качестве метки и зонда белок-белковых взаимодействий. // «Биосистемы: организация, поведение, управление»: 73-я Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых. Нижний Новгород. 2020

8) А.Н. Юденко, А.А. Смоленцева, О.Ю. Семёнов, В.В. Назаренко, И.М. Гончаров, А.А. Ремеева, И.Ю. Гущин. Разработка разделенного LOV-домена для детекции белок-белковых взаимодействий. // 62-я Всероссийская научная конференция МФТИ. Долгопрудный. 2019

9) А. Юденко, А. Смоленцева, И. Гончаров, В. Назаренко, А. Ремеева, И. Гущин. Создание мономерных мутантов lov-домена из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans. // 61-

ая Всероссийская научная конференция МФТИ. Москва - Долгопрудный - Жуковский. 2018

Публикации автора теме диссертации

1. Yudenko, A. Rational design of a split flavin-based fluorescent reporter / A. Yudenko, A. Smolentseva, I. Maslov, O. Semenov, I. M. Goncharov, V. V. Nazarenko, N. L. Maliar, V. Borshchevskiy, V. Gordeliy, A. Remeeva, I. Gushchin // ACS Synthetic Biology. - 2021. - N 10 (1). - P. 72-83.

2. Nazarenko, V. V. A thermostable flavin-based fluorescent protein from Chloroflexus aggregans: a framework for ultra-high resolution structural studies / V. V. Nazarenko, A. Remeeva, A. Yudenko, K. Kovalev, A. Dubenko, I. M. Goncharov, P. Kuzmichev, A. V. Rogachev, P. Buslaev, V. Borshchevskiy, A. Mishin, G. V. Dhoke, U. Schwaneberg, M. D. Davari, K.-E. Jaeger, U. Krauss, V. Gordeliy, I. Gushchin // Photochemical & Photobiological Sciences. -2019. - N 18 (7). - P. 1793-1805.

3. Remeeva, A. Effects of Proline Substitutions on the Thermostable LOV Domain from Chloroflexus aggregans / A. Remeeva, V. V. Nazarenko, I. M. Goncharov, A. Yudenko, A. Smolentseva, O. Semenov, K. Kovalev, V. Gordeliy, I. Gushchin // Crystals. - 2020. - N 10 (4). - P. 256.

4. Remeeva, A. Insights into the mechanisms of light-oxygen-voltage domain color tuning from a set of high-resolution X-ray structures / A. Remeeva, V. V. Nazarenko, K. Kovalev, I. M. Goncharov, A. Yudenko, R. Astashkin, V. Gordeliy, I. Gushchin // PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2021. - N 89 (8) - P. 1005-1016.

5. Goncharov, I. M. High-resolution structure of a naturally red-shifted LOV domain / I. M. Goncharov, A. Smolentseva, O. Semenov, I. Natarov, V. V. Nazarenko, A. Yudenko, A. Remeeva, I. Gushchin // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2021. - N 567 - P.143-147.

6. Smolentseva, A. Extreme dependence of Chloroflexus aggregans LOV domain thermo-and photostability on the bound flavin species / A. Smolentseva, I. M. Goncharov, A. Yudenko, A. Bogorodskiy, O. Semenov, V. V. Nazarenko, V. Borshchevskiy, A. V. Fonin, A. Remeeva, K-E. Jaeger, U. Krauss, V. Gordeliy, I. Gushchin // Photochemical & Photobiological Sciences. -2021.- N 20 (12). - P. 1645-1656.

7. Remeeva A. Development and characterization of flavin-binding fluorescent proteins - Part I -basic characterization / A. Remeeva, A. Yudenko, V. V. Nazarenko, O. Semenov, A. Smolentseva, A. Bogorodskiy, I. Maslov, V. Borshchevskiy, I. Gushchin // Methods in Molecular Biology - принята в печать, планируется к публикации в ноябре 2022

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, три главы, выводы, список использованной литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста и включает 44 рисунка и 28 таблиц. Библиографический указатель содержит 203 источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Флавин-связывающие флуоресцентные белки 1.1.1. Природные LOV-домены

LOV-домены относятся к семейству структурно консервативных PAS-доменов (Per-Arnt-Sim, в базе данных InterPro: IPR000014). Изначально мотивы, характеризующие LOV-домены, были найдены в последовательностях белков из разных организмов, их функция была не вполне ясна. Объединяло все эти белки то, что они регулируются факторами окружающей среды, влияющими на их окислительно-восстановительный статус: светом, кислородом или напряжением, отсюда название «LOV»: light, oxygen, voltage [14,15]. LOV-домены выполняют функцию сенсоров синего и УФ света, они нековалентно связывают флавинмононуклеотид (ФМН) и некоторые его производные, такие как ФАД, рибофлавин, люмихром. LOV-домены имеют консервативную структуру, состоят из 5 антипараллельных Р-нитей и нескольких а-спиралей. Большинство описанных на сегодняшний день природных LOV-доменов содержат цистеин, расположенный вблизи C4a атома ФМН. После облучения синим светом между консервативным цистеином и C4a атомом ФМН образуется ковалентная связь, которая разрывается при переходе домена обратно в неосвещенное состояние.

Рисунок 1. Слева представлена структура флавинов: ФАД, ФМН, рибофлавина, люмихрома. Справа структура CagFbFP (PDB ГО 6RHF) с ФАД (структура взята из PDB ГО 2PD7). Адаптировано из [16].

В 2015 году Glantz и соавторами было описано >6700 последовательностей ЬОУ-доменов ( >4000 новых) [6]. На сегодняшний день это самая полная опубликованная база ЬОУ-доменов. В ней представлены последовательности как из прокариот, так и эукариот: архей, бактерий, протистов (включая водоросли), грибов и растений. Безусловно, стоит ожидать появление новой расширенной базы ЬОУ-доменов, в которую должны войти последовательности, не содержащие консервативный цистеин.

ЬОУ-домены встречаются во многих вариантах белковых архитектур [6]. Под архитектурой подразумевается набор функциональных белковых модулей и их взаимное расположение. ЬОУ-домены часто входят в состав рецепторов, содержащих киназный или другие каталитические домены, и регулируют их активность под воздействием синего света. Часто, но не всегда, сенсорный ЬОУ-домен и каталитический домен соединены а-спиральным линкером [17]. В работе Glantz и соавторов множество ЬОУ-фоторецепторов было разделено на 119 функциональных кластеров. Учитывались белковые модули, составляющие полипептид, но не их порядок (Рисунок 2). Наиболее частым среди найденных 6700 последовательностей оказался вариант, состоящий из двух последовательных ЬОУ-доменов (тандемный ЬОУ или ТЬОУ) и протеинкиназного домена.

Модульная структура белков, содержащих ЬОУ-домены, позволяет использовать их для создания фотоуправляемых белковых инструментов для воздействия на процессы в живых клетках. Сейчас большинство структурно-функциональных исследований ЬОУ-доменов направлено на исследование фотоцикла флавинов. Исследование структурных изменений, приводящих к активации соседних модулей при облучении, в том числе фотозависимой димеризации, является не менее важным для белковой инженерии. Дальнейшее определение принципов передачи оптического сигнала через линкеры в природных фоторецепторах может дать дополнительные возможности для разработки химерных оптогенетических инструментов и фотокаталитических систем.

Рисунок 2. Белки, содержащие LOV-домены, сгруппированы в кластеры по их функциям. Рисунок адаптирован из работы по биоинформатическому поиску LOV-доменов Glantz и соавт. [6]. (А) Десять наиболее распространённых функциональных кластеров белков, содержащих

LOV-домены. Кластеры сформированы по составу доменов, не учитывают их порядок. (B) Наиболее распространенная белковая архитектура, характерная для кластера. Треугольником обозначен N-конец, квадратом - C-конец. (С) Названия белковых доменов. Соответствующие им идентификационные номера в базе данных Pfam: Pkinase - PF00069; PAS - PF00989, PF08446, PF08447, PF08448, PF12860, PF13188, PF13426, PF13596, PF14598, PS50113; F-box - PF00646, PF12937; HATP - PF13581, PF02518; GATA - PF00320; Kelch - PF07646, PF13415, PF13418, PF13854; STAS - PF01740; RR (Response regulator receiver domain) - PF00072; HisKA - PF00512, PF07568, PF07730. TLOV - тандемный LOV (два последовательных - LOV-домена).

1.1.2. Использование FbFP в качестве флуоресцентных меток

Впервые в качестве флуоресцентного белка для микроскопии живых клеток LOV-домен был использован в 2007 году в работе Drepper и соавт. [7]. Для этого консервативный цистеин был заменен на неполярный аланин, чтобы ингибировать фотоцикл и, следовательно, увеличить эмиссию флуоресценции. Более корректно называть такие белки не LOV-доменами, а флавин-связывающими флуоресцентными белками (Flavin-binding Fluorescent Proteins, FbFPs).

По сравнению с широко используемыми GFP-подобными флуоресцентными белками, у FbFP есть ряд преимуществ. Во-первых, им не требуется молекулярный кислород для работы. Во-вторых, они имеют в два раза меньший размер (~12 кДа, у GFP-подобных ~24 кДа). FbFP не требуется время для созревания хромофора, в то время как GFP-подобным необходимо от нескольких минут до нескольких часов от трансляции до перехода в рабочее флуоресцентное состояние [18].

В 2012 году на нескольких клеточных линиях млекопитающих было показано, что FbFPs могут быть использованы для флуоресцентного мечения в условиях гипоксии [8]. Было показано, что в отличие от eGFP флуоресценция FbFP не уменьшается ни в пролиферирующих, ни в дифференцированных клетках в условиях гипоксии (характерные времена 24-72 часа).

В ряде работ показано успешное использование FbFP-меток для исследования бактерий в анаэробных условиях [7,9,10]. Представитель семейства FbFP был использован как маркер бактерий Bifidobacterium в бескислородной среде [19]. EcFbFP был использован для количественного определения уровня экспрессии генов Escherichia coli в реальном времени; показано, что он превосходит GFP-подобный белок YFP при решении таких задач при низкой концентрации растворенного кислорода в среде [20].

Два варианта LOV-доменов (rsLOVl и rsLOV2), разработанных на основе бактериального фоторецептора YtvA из Bacillus subtilis, были использованы в методах высокоразрешающей микроскопии RESOLFT и STED [11]. Ранее, LOV-домен из YtvA дикого типа был применен для

еще одного метода микроскопии высокого разрешения PALM [12]. Как оригинальный YtvA-LOV, так и его производные, являются фотопереключаемыми, в них не производили замену консервативного цистеина вблизи изоаллоксазиновых колец ФМН. При облучении синим светом белок переходит в засвеченное состояние, и при облучении УФ-излучением он может возвращаться в начальное состояния без ковалентной связи между ФМН и цистеином. В реальном эксперименте использовались два стандартных лазера: 488 нм для выключения белка, 405 для включения. YtvA-LOV дикого типа слабо флуоресцировал, не более 10% возвращалось в начальное флуоресцентное состояние. Улучшенные версии белка rsLOVl и rsLOV2 были получены с использованием сайт-направленного и случайного мутагенеза. rsLOVl способен более эффективно переключаться в начальное состояние, его яркость увеличилась в 10 раз по сравнению с диким типом, что позволило применить его в RESOLFT микроскопии с разрешением до 70-80 нм. Второй вариант, rsLOV2, в два раза ярче, но имеет фон при фотопереключении, что не позволяет использовать его для RESOLFT. rsLOV2 был применен в STED микроскопии с разрешением до 50-60 нм.

1.1.3. Механизм действия LOV-доменов в природе

Поглощение фотона из синей части спектра запускает фотоцикл LOV-домена. Из-за структурных перестроек домен переходит в так называемое засвеченное состояние, для которого характерен измененный спектр поглощения с максимумом на длине волны 390 нм. Засвеченное состояние называют S390, темновое - D447 (в случае максимума на 447 нм) (Рисунок 3). Как говорилось выше, в природных LOV-доменах, содержащих цистеин, для засвеченного состояния характерно образование ковалентной связи между ФМН и белком. Это было подтверждено множеством структурных исследований (ЯМР, рентгеноструктурным анализом, FTIR).

300 350 400 450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм

Рисунок 3. Спектры природного LOV-домена YtvA-LOV. Слева показан спектр поглощения, справа спектр флуоресценции при возбуждении на 450 нм. Пунктирной линией показано поглощение после засветки. Адаптировано из [21].

Полная диаграмма Яблонского для LOV-доменов еще не определена. Предположительно основной пик поглощения в районе 450 нм и его плечи отвечают за синглетное состояние Si. Широкий пик поглощения в районе 380 нм может быть отнесен к более высокому возбужденному состоянию S2. Охлаждение белка до криогенных температур позволяет более точно определять положение уровней [22-24].

При температурах ниже 150 К наблюдается фосфоресценция LOV-доменов [22,23]. Максимум фосфоресценции для LOV2 домена фототропина 1 из Avena sativa на длине волны 600 нм, что соответствует триплетному состоянию на 16900 cm-1. При физиологических температурах также детектировали фосфоресценцию на 16600 cm-1 [23]. Ранее для LOV-домена рецептора YtvA из Bacillus subtilis с помощью калориметрических методов было предсказано положение триплетного уровня на 16600 cm-1 [21]. Для свободных флавинов, в частности рибофлавина, также наблюдается фосфоресценция в районе 600 нм при температуре жидкого азота [25].

Характерное время жизни флуоресценции LOV-доменов составляет несколько наносекунд (~1.25 - 5.70 нс) [23,26,27]. Квантовый выход у природных LOV-доменов и модифицированных флавин-связывающих флуоресцентных белков на их основе варьируется от ~0.10 до 0.45 [28-30]. Если сравнивать с другими флуоресцентными белками FbFPs имеют

низкий коэффициент поглощения (12000-17600 М-1 см-1 на длине волны 450 нм), что определяет их относительно низкую яркость (~5000 М-1 см-1) [27-29,31]. При этом свободный ФМН имеет следующие характеристики: время жизни флуоресценции 4.38 нс, квантовый выход 0.25, коэффициент поглощения 12200 М-1 см-1, яркость 3050 М-1 см-1 [31,32].

В природных ЬОУ-доменах переход между темновым и засвеченным состояниями происходит за микросекунды [33,34]. Период полураспада аддукта цистеин-флавин и возвращение ЬОУ-домена в начальное состояние варьируется от секунд до дней [17,35-38].

Таблица 1. Охарактеризованные представители семейства ЬОУ-доменов.

Название ЕЬЕР Организм Мол. масса, кДа Максимум возбуждения, нм Максимум флуоресценции, нм Квантовый выход Коэффициент поглощение, М- 1*см"1 Ссылка

1ЬОУ Arabidopsis 12.1 450 497 0.34 14,800 ± 300 [3941]

рЫЬОУ2. 1 Arabidopsis 12.1 450 497 0.20 н/д [42]

ББРЬБР Dinoroseob acter shibae 15.2 449 498 0.35 14 300 ± 50 0.35 [31,4 3]

Рр^ЬБР Pseudomon as putida 16.3 450 496 0.27 13,900 [44]

Рр2ЕЬБР Pseudomon as putida 16.3 449 495 0.22 14 200 ± 50 [7,44, 45]

Рр2ЕЬБР 0116У Pseudomon as putida 16.3 439 485 0.26 14 200 ± 50 [7,44, 45]

ББРЬБР BacШus suЫШs 28.7 449 495 0.39 13 900 [46]

БСЕЬБР BacШus suЫШs 15.1 448 496 0.44 14 500 [41]

геЬОУ1 BacШus suЫШs 15.6 ~450 498 0.17 10 900 [11]

геЬОУ2 BacШus suЫШs 15.6 ~450 498 0.31 11 400 [11]

Сге1ЬОУ Chlamydom onas reinhardtii 12.9 449 497 0.32 14 200 [47,4 8]

М^ЬБР Meiothermu s ruber 16.4 448 498 0.22 15 200 [29]

ТеБЬБР Thermosyne chococcus elongatus 18.3 445 494 0.13 н/д [29]

УКР^ЬБ Р УКР метагеном ный проект 17.4 446 496 0.31 13 300 [29]

УКР2ЕЬЕ Р УКР метагеном ный проект 13.6 449 497 0.33 н/д [29]

УКРЗЕЬБ Р УКР метагеном ный проект 15.4 449 498 0.20 14 200 [29]

УКР4ЕЬЕ Р УКР метагеном ный проект 15.1 449 496 0.33 14 300 [29]

1.2. Сенсоры белок-белковых взаимодействий

1.2.1. Зачем нужны сенсоры белок-белковых взаимодействий?

Белок-белковые взаимодействия играют базовую роль в большинстве биологических процессов. В 2012 году количество белок-белковых взаимодействий для человека теоретически оценивалось в 300 000 [49]. С высокой долей достоверности подтверждено более 50 000 парных белок-белковых взаимодействий [50] (актуальная информация на ресурсе 1Шр://,^^^1^егаС;оте-atlas.org). Многие ферментативные реакции способны проходить только после формирования комплекса из нескольких полипептидов. Многие рецепторы работают только после гомо- или гетеродимеризации, иногда и после образования олигомеров большего порядка [51]. Примерами являются комплексы рецепторов эпидермального фактора роста НБК2/НБКЗ или НБК2/НБК2 [52], также димер рецепторов нейромедиатора ГАМК (у-Аминомасляная кислота) из класса ОРСЯ [53]. Нарушения в способности рецепторов образовывать димеры связывают с развитием некоторых заболеваний [54]. Многие транспортные функции выполняются белковыми комплексами.

Накопленные экспериментальные данные позволили развить методы предсказания белок-белковых комплексов. В 2021 г. сочетание методов RoseTTAFold и А^аБоЫ позволило построить 106 ранее неизвестных комплексов белков дрожжей и предсказать еще 806 комплексов без информации о структуре [55]. При этом систематично было оценено около 8.3 миллионов взаимодействий пар дрожжевых белков.

В силу несовершенства экспериментальных подходов остаются слабо исследованными взаимодействия между внутренне неупорядоченными белками (англ. intrinsically disordered proteins или IDPs) [56]. Предположительно, из-за пластичности структуры IDPs имеют способность взаимодействовать с большим числом белков. В среднем такие взаимодействия менее стабильные. Для описания таких комплексов не подходит широко используемая модель «ключ-замок» ("lock-and-key"). Для предсказания взаимодействий неупорядоченных или частично упорядоченных белков необходимо развитие альтернативных вычислительных подходов.

Несмотря на то, что разработано большое количество инструментов, определение динамики и локализации белок-белковых взаимодействий в живых клетках остается технически сложной задачей. В большинстве подходов необходимо либо генетически модифицировать, либо конъюгировать изучаемые белки. В работе 2021 года было продемонстрировано, что для исследования димеризации рецепторов можно обойтись без генетической модификации, использовать специфические однодоменные антитела [57].

Удобно разделять все предложенные инструменты по двум параметрам: (i) позволяет ли инструмент детектировать обратимые взаимодействия, (ii) локализован ли детектируемый сигнал в месте взаимодействия. Такая классификация была предложена в обзоре Matthew D. Wiens и Robert E. Campbell [58].

1.2.2. Необратимые сенсоры с нелокализованным сигналом

Сенсоры, изменяющие уровень экспрессии генов

Метод состоит в том, что при возникновении целевого белок-белкового взаимодействия происходит запуск экспрессии сигнального гена.

Применение сигнальных генов лучше всего подходит для детектирования редких взаимодействий, поскольку происходит усилению сигнала. Однако такой метод более чувствителен к неспецифичным взаимодействия, что может приводить к ложноположительным результатам.

Одним из первых сенсоров белок-белковых взаимодействий в живых клетках является молекулярная система из двух фрагментов белка Gal4 [59]. Первый исследуемый белок прикрепляется к ДНК-связывающему домену Gal4, второй исследуемый белок прикрепляется к фрагменту Gal4 активирующему транскрипцию. Если исследуемые белки формируют комплекс, то запускается транскрипция сигнального гена. В качестве сигнального гена использовали ген флуоресцентного белка GFP или люциферазы.

днк-

связываю домен Gal

Рисунок 4. Принцип работы сенсора белок-белковых взаимодействий на основе двух фрагментов белка Gal4 [59].

В 2006 году Wehr и соавт. был разработан сенсор «split-TEV» [60]. TEV-протеазу разделили на две не функциональные части, генетически прикрепили их к целевым белкам. Третьим элементом сенсора являлся транскрипционный фактор с сайтом узнавания TEV-протеазы. Он был прикреплен либо к N-концевой части протеазы, либо к мембране клетки за счёт трансмембранной спирали. Данный сенсор может быть использован без транскрипционного фактора и включения сигнального гена. Можно напрямую детектировать протеолитическую активность разделенной TEV-протеазы, например по люминесценции люциферазы.

Hirrlinger и соавторы для максимального усиления сигнала использовали разработанную ранее систему с Cre рекомбиназой [61]. Она позволяет активировать сигнальный ген необратимо за счет вырезания блокирующего стоп-кодона [62] (Рисунок 5).

Рисунок 5. Принцип работы сенсора белок-белковых взаимодействий на основе Сге рекомбиназы [61].

Еще одним примером сенсора, изменяющего уровень экспрессии, является разделенная Т7 РНК-полимераза, разработанная в 2017 году [63]. Как и в случае БрШ-ТЕУ, части разделенной

ДНК (Репортерный ген)

полимеразы генетически прикреплялись к исследуемым белкам. При взаимодействии белков происходит сборка T7 РНК-полимеразы, после чего запускается синтез РНК сигнального гена. Данная разделенная T7 РНК-полимераза является улучшенной версией разработанных ранее [64][65]. Для поиска новых вариантов был применен метод эволюции с помощью фагов (англ. phage-assisted continuous evolution или PACE). Более ранние версии имели склонность к спонтанной ассоциации двух частей разделенной полимеразы, что приводило к ложноположительным результатам. Авторы работы утверждают, что ими была создана простая и универсальная платформа. При этом очевидным недостатком может являться большой размер T7 РНК-полимеразы, что может повлиять на свойства целевых белков.

Рисунок 6. Принцип работы сенсора белок-белковых взаимодействий на основе разделенной Т7 РНК-полимеразы.

На основе похожего принципа были разработаны подходы для определения белок-белковых взаимодействий в мембранах дрожжей (англ. Membrane yeast two hybrid, сокращенно MYTH) [66] и млекопитающих (англ. Mammalian membrane two hybrid, сокращенно MaMTH) [67]. Созданный ранее разделенный на две части убиквитин [68] был соединен с искусственным транскрипционным фактором, который отрезался при взаимодействии исследуемых мембранных белков и запускал транскрипцию сигнального гена.

Сенсоры, влияющие на выживаемость клеток

Такие сенсоры могут быть сконструированы на основе систем, описанных в предыдущем пункте, где в качестве сигнального используется какой-либо ген, влияющий на выживаемость клеток. Например ген, кодирующий белок, который отвечает за устойчивость к антибиотику. Либо сенсор должен состоять из фрагментов разделенного фермента, который напрямую влияет на жизненно важные функции клетки.

В 2002 году была разработана разделенная Р-лактамаза [69]. Р-лактамазы инактивируют бета-лактамными антибиотики (пенициллины, цефалоспорины и др). Эффективность сборки

фермента напрямую влияла на резистентность бактерий к антибиотику. Это позволило провести случайный мутагенез по трем позициям и отобрать вариант, обеспечивающий увеличение активности реконструированной Р-лактамазы в 4 раза. На модельных взаимодействующих белках FKBP12 и FRB было показано, что сенсор может быть использован не только в бактериях, но и в клетках млекопитающих. Для этого в среду должен быть добавлен флуорогенный субстрат CCF2/AM. При расщеплении флуоресценция CCF2/AM меняется с зеленой (520 нм) на синюю (447 нм) [70].

Дигидрофолатредуктазы (англ. dihydrofolate reductase, DHFR) - жизненно важные ферменты, которые катализируют восстановление дигидрофолата, необходимое для биосинтеза серина, метионина, пуринов и тимидилата. Мышиная DHFR была разделена на два фрагмента и впервые использована в качестве сенсора белок-белковых взаимодействий в 1999 г. [71]. Как и в предыдущем примере, могут быть применены две стратегии определения взаимодействия: либо следить за выживаемостью клеток, либо использовать флуоресцентное вещество, связывающееся специфично с реконструированным ферментом. В качестве такого вещества был использован ингибитор дигидрофолатредуктазы fMTX (конъюгированный с флуоресцеином метотрексат), который способен проникать через клеточную мембрану и связываться только с собранной из двух фрагментов дигидрофолатредуктазой.

Разделенные ферменты

Такие сенсоры основаны на генетическом разделении фермента на фрагменты и детектировании продукта реакции каким-либо способом (по люминесценции, по флуоресценции, по окраске образца и др. ). Если сравнивать с часто используемыми разделенными флуоресцентными белками, как правило такие сенсоры более чувствительны, поскольку происходит усиление сигнала за счет накопления продукта реакции. К разделенным ферментам относится описанная выше split-TEV-протеаза

С помощью разделенной пероксидазы хрена были показаны синапсы между двумя нейронами в мозгу мыши (in vivo) [72]. Пероксидаза хрена - широко используемый в молекулярной биологии фермент, катализирует окисление большого количества субстратов. Однако для создания эффективно работающего разделенного варианта белка потребовался перебор большого количества мест разреза и последовательный скрининг библиотек мутантов каждого из фрагментов белка. Недостатком разделенной пероксидазы хрена является необходимость гема и экзогенных субстратов, что не вызывает проблем в случае клеточных тестов, но может быть преградой в экспериментах in vivo.

Рисунок 7. Принцип работы сенсора белок-белковых взаимодействий на основе разделенного интеина [73].

Необычный метод был предложен в статье Yao и соавт. [73]. В качестве фермента был использован интеин. В качестве субстрата выступают исследуемые белки: после образования их комплекса и сборки разделенного интеина происходит их сшивка (образование пептидной связи между С- и N- концами двух белков и отрезание разделенного интеина) (Рисунок 7). Детектировать сшитые белки можно используя Вестерн-блот или иммуноферментный анализ. Авторы утверждают, что по сравнению с другими метод имеет улучшенную чувствительность без потери специфичности. Было показано, что он может быть использован на животной модели C. elegans.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Юденко Анна Николаевна, 2022 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Depaoli M.R. et al. Live cell imaging of signaling and metabolic activities // Pharmacol. Ther. The Authors, 2019. Vol. 202. P. 98-119.

2. Ghosh I. et al. Antiparallel Leucine Zipper-Directed Protein Reassembly : Application to the Green Fluorescent Protein Department of Molecular Biophysics and Biochemistry The dissection and subsequent reassembly of a protein from peptidic fragments provides an avenue for. 2000. № 11. P. 5658-5659.

3. Tchekanda E., Sivanesan D., Michnick S.W. An infrared reporter to detect spatiotemporal dynamics of protein-protein interactions // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 6. P. 641-644.

4. To T.L., Zhang Q., Shu X. Structure-guided design of a reversible fluorogenic reporter of protein-protein interactions // Protein Sci. 2016. Vol. 25, № 3. P. 748-753.

5. Tebo A.G., Gautier A. A split fluorescent reporter with rapid and reversible complementation // Nat. Commun. Springer US, 2019. Vol. 10, № 1. P. 1-8.

6. Glantz S.T. et al. Functional and topological diversity of LOV domain photoreceptors // PNAS. 2016.

7. Drepper T. et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen // Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 25, № 4. P. 443-445.

8. Walter J. et al. Flavin Mononucleotide-Based Fluorescent Proteins Function in Mammalian Cells without Oxygen Requirement // PLoS One. 2012. Vol. 7, № 9. P. 1-8.

9. Piekarski T. et al. Genetic tools for the investigation of Roseobacter clade bacteria // BMC Microbiol. 2009. Vol. 9.

10. Chia H.E., Marsh E.N.G., Biteen J.S. Extending fluorescence microscopy into anaerobic environments // Curr. Opin. Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2019. Vol. 51. P. 98-104.

11. Gregor C. et al. Novel reversibly switchable fluorescent proteins for RESOLFT and STED nanoscopy engineered from the bacterial photoreceptor YtvA // Sci. Rep. Springer US, 2018. № November 2017. P. 1-9.

12. Losi A. et al. A photochromic bacterial photoreceptor with potential for super-resolution microscopy // Photochem. Photobiol. Sci. 2013. Vol. 12, № 2. P. 231-235.

13. Boassa D. et al. Split-miniSOG for Spatially Detecting Intracellular Protein-Protein Interactions by Correlated Light and Electron Microscopy // Cell Chem. Biol. Elsevier Ltd., 2019. Vol. 26. P. 1 -10.

14. Huala E. et al. Arabidopsis NPH1: A protein kinase with a putative redox-sensing domain // Science (80-. ). 1997. Vol. 278, № 5346. P. 2120-2123.

15. Christie J.M. et al. LOV (light, oxygen, or voltage) domains of the blue-light photoreceptor phototropin (nph1): Binding sites for the chromophore flavin mononucleotide // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. Vol. 96, № 15. P. 8779-8783.

16. Smolentseva A. et al. Extreme dependence of Chloroflexus aggregans LOV domain thermo-and photostability on the bound flavin species // Photochem. Photobiol. Sci. Springer International Publishing, 2021. Vol. 20, № 12. P. 1645-1656.

17. Harper S.M., Neil L.C., Gardner K.H. Structural basis of a phototropin light switch // Science (80-. ). 2003. Vol. 301, № 5639. P. 1541-1544.

18. Balleza E., Kim J.M., Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells // Nat. Methods. 2018. Vol. 15, № 1. P. 47-51.

19. Landete J.M. et al. Anaerobic green fluorescent protein as a marker of Bifidobacterium strains // Int. J. Food Microbiol. Elsevier B.V., 2014. Vol. 175. P. 6-13.

20. Drepper T. et al. Flavin mononucleotide-based fluorescent reporter proteins outperform green fluorescent protein-like proteins as quantitative in vivo real-time reporters // Appl. Environ. Microbiol. 2010. Vol. 76, № 17. P. 5990-5994.

21. Losi A., Quest B., Gärtner W. Listening to the blue: The time-resolved thermodynamics of the bacterial blue-light receptor YtvA and its isolated LOV domain // Photochem. Photobiol. Sci. 2003. Vol. 2, № 7. P. 759-766.

22. Gauden M. et al. Low-temperature and time-resolved spectroscopic characterization of the LOV2 domain of Avena sativa phototropin 1 // Femtosecond Laser Appl. Biol. 2004. Vol. 5463, № September 2004. P. 97.

23. Van Stokkum I.H.M. et al. The primary photophysics of the Avena sativa phototropin 1 LOV2 domain observed with time-resolved emission spectroscopy // Photochem. Photobiol. 2011. Vol. 87, № 3. P. 534-541.

24. Iwata T. et al. Light-induced structural changes in the LOV2 domain of Adiantum phytochrome3 studied by low-temperature FTIR and UV-visible spectroscopy // Biochemistry. 2003. Vol. 42, № 27. P. 8183-8191.

25. Sun M., Moore T.A., Song P.-S. Molecular Luminescence Studies of Flavins. I. The Excited States of Flavins // J. Am. Chem. Soc. 1972. Vol. 94, № 5. P. 1730-1740.

26. Song S.H. et al. Absorption and emission spectroscopic characterisation of combined wildtype LOV1-LOV2 domain of phot from Chlamydomonas reinhardtii // J. Photochem. Photobiol. B Biol. 2005. Vol. 81, № 1. P. 55-65.

27. Homans R.J. et al. Two photon spectroscopy and microscopy of the fluorescent flavoprotein, iLOV // Phys. Chem. Chem. Phys. Royal Society of Chemistry, 2018.

28. Ko S. et al. Engineered Arabidopsis Blue Light Receptor LOV Domain Variants with Improved Quantum Yield, Brightness, and Thermostability // J. Agric. Food Chem. 2019.

29. Wingen M. et al. Novel Thermostable Flavin-binding Fluorescent Proteins from Thermophilic Organisms // Photochem. Photobiol. 2017. Vol. 93, № 3. P. 849-856.

30. Halavaty A.S., Moffat K. Coiled-coil dimerization of the LOV2 domain of the blue-light photoreceptor phototropin 1 from Arabidopsis thaliana // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. International Union of Crystallography, 2013. Vol. 69, № 12. P. 1316-1321.

31. Wingen M. et al. The photophysics of LOV-based fluorescent proteins-new tools for cell biology // Photochem. Photobiol. Sci. 2014. Vol. 13, № 6. P. 875-883.

32. Whitby L.G. A New Method for Preparing Flavin-adenine Dinucleotide // Biochem. J. 1953. Vol. 54. P. 437-442.

33. Alexandre M.T.A. et al. Primary reactions of the LOV2 domain of phototropin studied with ultrafast mid-infrared spectroscopy and quantum chemistry // Biophys. J. Biophysical Society, 2009. Vol. 97, № 1. P. 227-237.

34. Andrikopoulos P.C. et al. QM calculations predict the energetics and infrared spectra of

transient glutamine isomers in LOV photoreceptors // Phys. Chem. Chem. Phys. Royal Society of Chemistry, 2021. Vol. 23, № 25. P. 13934-13950.

35. Schwerdtfeger C., Linden H. VIVID is a flavoprotein and serves as a fungal blue light photoreceptor for photoadaptation // EMBO J. 2003. Vol. 22, № 18. P. 4846-4855.

36. Kasahara M. et al. Photochemical properties of the flavin mononucleotide-binding domains of the phototropins from Arabidopsis, rice, and Chlamydomonas reinhardtii // Plant Physiol. 2002. Vol. 129, № 2. P. 762-773.

37. Swartz T.E. et al. The Photocycle of a Flavin-binding Domain of the Blue Light Photoreceptor Phototropin // J. Biol. Chem. © 2001 ASBMB. Currently published by Elsevier Inc; originally published by American Society for Biochemistry and Molecular Biology., 2001. Vol. 276, № 39. P. 36493-36500.

38. Li L.L. et al. Resonance energy transfer sensitises and monitors in situ switching of LOV2-based optogenetic actuators // Nat. Commun. 2020. Vol. 11, № 1. P. 1-18.

39. Davari M.D. et al. Photophysics of the LOV-Based Fluorescent Protein Variant iLOV-Q489K Determined by Simulation and Experiment // J. Phys. Chem. B. 2016. Vol. 120, № 13. P. 33443352.

40. Chapman S. et al. The photoreversible fluorescent protein iLOV outperforms GFP as a reporter of plant virus infection // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105, № 50. P. 20038-20043.

41. Mukherjee A. et al. Characterization of Flavin-Based Fluorescent Proteins: An Emerging Class of Fluorescent Reporters // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 5.

42. Christie J.M. et al. Structural tuning of the fluorescent protein iLOV for improved photostability // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287, № 26. P. 22295-22304.

43. Endres S. et al. Structure and function of a short LOV protein from the marine phototrophic bacterium Dinoroseobacter shibae // BMC Microbiol. 2015. Vol. 15, № 1.

44. Jentzsch K. et al. Mutual exchange of kinetic properties by extended mutagenesis in two short LOV domain proteins from Pseudomonas putida // Biochemistry. 2009. Vol. 48, № 43. P. 10321-10333.

45. Krauss U. et al. Initial characterization of a blue-light sensing, phototropin-related protein from

Pseudomonas putida: A paradigm for an extended LOV construct // Phys. Chem. Chem. Phys. 2005. P. 2804-2811.

46. Möglich A., Moffat K. Structural Basis for Light-dependent Signaling in the Dimeric LOV Domain of the Photosensor YtvA // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 373, № 1. P. 112-126.

47. Mukherjee A. et al. Engineering and characterization of new LOV-based fluorescent proteins from chlamydomonas reinhardtii and vaucheria frigida // ACS Synth. Biol. 2015. Vol. 4, № 4. P. 371-377.

48. Endres S. et al. An optogenetic toolbox of LOV-based photosensitizers for light-driven killing of bacteria // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 1-14.

49. Zhang Q.C. et al. Structure-based prediction of protein-protein interactions on a genome-wide scale // Nature. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 490, № 7421. P. 556-560.

50. Luck K. et al. A reference map of the human binary protein interactome // Nature. Springer US, 2020. Vol. 580, № 7803. P. 402-408.

51. Wouters E. et al. Luminescence- and fluorescence-based complementation assays to screen for gpcr oligomerization: Current state of the art // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, № 12. P. 1-35.

52. Diwanji D. et al. Structures of the HER2-HER3-NRG1ß complex reveal a dynamic dimer interface // Nature. Springer US, 2021. Vol. 600, № 7888. P. 339-343.

53. Rondard P. et al. Functioning of the dimeric GABAB receptor extracellular domain revealed by glycan wedge scanning // EMBO J. 2008. Vol. 27, № 9. P. 1321-1332.

54. Seeman P. Dopamine D2 receptors as treatment targets in schizophrenia // Clin. Schizophr. Relat. Psychoses. 2010. Vol. 4, № 1. P. 56-73.

55. Humphreys I.R. et al. Computed structures of core eukaryotic protein complexes // Science (80-. ). 2021. Vol. 374, № 6573.

56. Uversky V.N. Intrinsically disordered proteins and their "Mysterious" (meta)physics // Front. Phys. 2019. Vol. 7, № FEB. P. 8-23.

57. Kim S.J., Dixon A.S., Owen S.C. Split-enzyme immunoassay to monitor EGFR-HER2 heterodimerization on cell surfaces // Acta Biomater. 2021. Vol. 135. P. 225-233.

58. Wiens M.D., Campbell R.E. Surveying the landscape of optogenetic methods for detection of protein-protein interactions // Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2018. Vol. 10, № 3. P. 1-15.

59. Fields S., Song O.K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions // Nature. 1989. Vol. 340, № 6230. P. 245-246.

60. Wehr M.C. et al. Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV // Nat. Methods. 2006. Vol. 3, № 12. P. 985-993.

61. Hirrlinger J. et al. Split-Cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo // PLoS One. 2009. Vol. 4, № 1. P. 1-10.

62. Mattheakis L.C. et al. Expression of Cre recombinase as a reporter of signal transduction in mammalian cells // Chem. Biol. 1999. Vol. 6, № 11. P. 835-844.

63. Pu J., Zinkus-Boltz J., Dickinson B.C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform // Nat. Chem. Biol. 2017. Vol. 13, № 4. P. 432-438.

64. Shis D.L., Bennett M.R. Library of synthetic transcriptional AND gates built with split T7 RNA polymerase mutants // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. Vol. 110, № 13. P. 5028-5033.

65. Segall-Shapiro T.H. et al. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase // Mol. Syst. Biol. 2014. Vol. 10, № 7. P. 742.

66. Snider J. et al. Detecting interactions with membrane proteins using a membrane two-hybrid assay in yeast // Nat. Protoc. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 5, № 7. P. 1281-1293.

67. Petschnigg J. et al. The mammalian-membrane two-hybrid assay (MaMTH) for probing membrane-protein interactions in human cells // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 5. P. 585-592.

68. Johnsson N., Varshavsky A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. Vol. 91, № 22. P. 10340-10344.

69. Wehrman T. et al. Protein-protein interactions monitored in mammalian cells via complementation of ß-lactamase enzyme fragments // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 6. P. 3469-3474.

70. Zlokarnik G. et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with

beta-lactamase as reporter // Science (80-. ). 1998. Vol. 279. P. 84-88.

71. Remy I., Michnick S.W. Clonal selection and in vivo quantitation of protein interactions with protein-fragment complementation assays // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. Vol. 96, № 10. P. 5394-5399.

72. Martell J.D. et al. A split horseradish peroxidase for the detection of intercellular protein -protein interactions and sensitive visualization of synapses. 2016. № April.

73. Yao Z. et al. Split Intein-Mediated Protein Ligation for detecting protein-protein interactions and their inhibition // Nat. Commun. Springer US, 2020. Vol. 11, № 1.

74. Galarneau A. et al. ß-Lactamase protein fragment complementation assays as in vivo and in vitro sensors of protein-protein interactions // Nat. Biotechnol. 2002. Vol. 20, № 6. P. 619-622.

75. Lee K.H. et al. Visualizing dynamic interaction between calmodulin and calmodulin-related kinases via a monitoring method in live mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. Vol. 107, № 8. P. 3412-3417.

76. Taslimi A. et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5.

77. Cabantous S., Terwilliger T.C., Waldo G.S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. 2005. Vol. 23, № 1. P. 102-107.

78. Romei M.G., Boxer S.G. Split Green Fluorescent Proteins: Scope, Limitations, and Outlook // Annu. Rev. Biophys. 2019. Vol. 48, № 1. P. 19-44.

79. Cabantous S. et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association // Sci. Rep. 2013. Vol. 3. P. 1-9.

80. Waadt R. et al. Multicolor bimolecular fluorescence complementation reveals simultaneous formation of alternative CBL/CIPK complexes in planta // Plant J. 2008. Vol. 56, № 3. P. 505516.

81. Köker T., Fernandez A., Pinaud F. Characterization of Split Fluorescent Protein Variants and Quantitative Analyses of Their Self- Assembly Process // Sci. Rep. 2018. № January. P. 1-15.

82. Hu C., Kerppola T.K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells

using multicolor fluorescence complementation analysis. 2003. Vol. 21, № May. P. 539-545.

83. Shyu Y.J. et al. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions // Biotechniques. 2006.

84. Wang S. et al. GMars-T Enabling Multimodal Subdiffraction Structural and Functional Fluorescence Imaging in Live Cells // Anal. Chem. 2018. Vol. 90, № 11. P. 6626-6634.

85. Wang S. et al. Development of bimolecular fluorescence complementation using rsEGFP2 for detection and super-resolution imaging of protein-protein interactions in live cells // Biomed. Opt. Express. 2017. Vol. 8, № 6. P. 3119.

86. Sarkar M., Magliery T.J. Re-engineering a split-GFP reassembly screen to examine RINGdomain interactions between BARD1 and BRCA1 mutants observed in cancer patients // Mol. Biosyst. 2008. Vol. 4, № 6. P. 599-605.

87. Remy I., Michnick S.W. A cDNA library functional screening strategy based on fluorescent protein complementation assays to identify novel components of signaling pathways // Methods. 2004. Vol. 32, № 4. P. 381-388.

88. Ueyama T. et al. Sequential Binding of Cytosolic Phox Complex to Phagosomes through Regulated Adaptor Proteins: Evaluation Using the Novel Monomeric Kusabira-Green System and Live Imaging of Phagocytosis // J. Immunol. 2008. Vol. 181, № 1. P. 629-640.

89. Kojima T. et al. Novel screening system for protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in Saccharomyces cerevisiae // J. Biosci. Bioeng. The Society for Biotechnology, Japan, 2011. Vol. 111, № 4. P. 397-401.

90. Wang S. et al. Live Cell Visualization of Multiple Protein-Protein Interactions with BiFC Rainbow // ACS Chem. Biol. 2018. Vol. 13, № 5. P. 1180-1188.

91. Xia P. et al. Superresolution imaging reveals structural features of eb1 in microtubule plus-end tracking // Mol. Biol. Cell. 2014. Vol. 25, № 25. P. 4166-4173.

92. Hertel F. et al. RefSOFI for Mapping Nanoscale Organization of Protein-Protein Interactions in Living Cells // Cell Rep. 2016. Vol. 14, № 2. P. 390-400.

93. Lee Y.R. et al. Development of bimolecular fluorescence complementation using dronpa for visualization of protein-protein interactions in cells // Mol. Imaging Biol. 2010. Vol. 12, № 5. P.

468-478.

94. Feng S. et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling // Nat. Commun. Springer US, 2017. Vol. 8, № 1.

95. Hu C. et al. Visualization of Interactions among bZIP and Rel Family Proteins in Living Cells Using Bimolecular Fluorescence Complementation. 2002. Vol. 9. P. 789-798.

96. Wagner J. et al. A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer. // Cell. 2019. Vol. 177, № 5. P. 1330-1345.e18.

97. Ohashi K. et al. Visualization of cofilin-actin and Ras-Raf interactions by bimolecular fluorescence complementation assays using a new pair of split Venus fragments // Biotechniques. 2012. Vol. 52, № 1. P. 45-50.

98. Ottmann C. et al. Applicability of superfolder YFP bimolecular fluorescence complementation in vitro // Biol. Chem. 2009. Vol. 390, № 1. P. 81-90.

99. Jach G. et al. An improved mRFP1 adds red to bimolecular fluorescence complementation // Nat. Methods. 2006. Vol. 3, № 8. P. 597-600.

100. Chen M. et al. Three-Fragment Fluorescence Complementation Coupled with Photoactivated Localization Microscopy for Nanoscale Imaging of Ternary Complexes // ACS Nano. 2016. Vol. 10, № 9. P. 8482-8490.

101. Liu Z. et al. Super-resolution imaging and tracking of protein-protein interactions in subdiffraction cellular space // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5.

102. Kodama Y., Wada M. Simultaneous visualization of two protein complexes in a single plant cell using multicolor fluorescence complementation analysis // Plant Mol. Biol. 2009. Vol. 70, № 12. P. 211-217.

103. Wang S. et al. Spying on protein interactions in living cells with reconstituted scarlet light // Analyst. Royal Society of Chemistry, 2018. Vol. 143, № 21. P. 5161-5169.

104. Nickerson A. et al. Photoactivated localization microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for nanoscale imaging of protein-protein interactions in cells // PLoS One. 2014. Vol. 9, № 6.

105. Kost L.A. et al. Bimolecular fluorescence complementation based on the red fluorescent protein FusionRed // Russ. J. Bioorganic Chem. 2016. Vol. 42, № 6. P. 619-623.

106. Fan J.Y. et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 367, № 1. P. 47-53.

107. Keem J.O. et al. Splitting and self-assembling of far-red fluorescent protein with an engineered beta strand peptide: Application for alpha-synuclein imaging in mammalian cells // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2011. Vol. 32, № 34. P. 9051-9058.

108. Chu J. et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. 2009. Vol. 25. P. 234-239.

109. Han Y. et al. In vivo imaging of protein-protein and RNA-protein interactions using novel far-red fluorescence complementation systems // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 13.

110. To T.L., Zhang Q., Shu X. Structure-guided design of a reversible fluorogenic reporter of protein-protein interactions // Protein Sci. 2016. Vol. 25, № 3. P. 748-753.

111. Shcherbakova D.M. et al. Bright monomeric near-infrared fluorescent proteins as tags and biosensors for multiscale imaging // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 7.

112. Filonov G.S., Verkhusha V. V. Resource A Near-Infrared BiFC Reporter for In Vivo Imaging of Protein-Protein Interactions // Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 20, № 8. P. 1078-1086.

113. Tebo A.G. et al. Orthogonal fluorescent chemogenetic reporters for multicolor imaging // Nat. Chem. Biol. Springer US, 2021. Vol. 17, № 1. P. 30-38.

114. Yudenko A. et al. Rational Design of a Split Flavin-Based Fluorescent Reporter // ACS Synth. Biol. 2021. Vol. 10, № 1. P. 72-83.

115. Alford S.C. et al. Dimerization-dependent green and yellow fluorescent proteins // ACS Synth. Biol. 2012. Vol. 1, № 12. P. 569-575.

116. Alford S.C. et al. A fluorogenic red fluorescent protein heterodimer // Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 19, № 3. P. 353-360.

117. Ding Y. et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange // Nat. Methods. 2015. Vol. 12, № 3. P. 195-198.

118. Mo G.C.H. et al. Genetically encoded biosensors for visualizing live-cell biochemical activity at super-resolution // Nat. Methods. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 14, № 4. P. 427-434.

119. Mitiouchkina T. et al. Plants with genetically encoded autoluminescence // Nat. Biotechnol. Springer US, 2020. Vol. 38, № 8. P. 944-946.

120. Krichevsky A. et al. Autoluminescent plants // PLoS One. 2010. Vol. 5, № 11. P. 1-6.

121. Paulmurugan R., Umezawa Y., Gambhir S.S. Noninvasive imaging of protein-protein interactions in living subjects by using reporter protein complementation and reconstitution strategies // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 24. P. 15608-15613.

122. Luker K.E. et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 33. P. 12288-12293.

123. Paulmurugant R., Gambhir S.S. Monitoring protein-protein interactions using split synthetic renilla luciferase protein-fragment-assisted complementation // Anal. Chem. 2003. Vol. 75, № 7. P. 1584-1589.

124. Oh-hashi K., Hirata Y., Kiuchi K. SOD1 dimerization monitoring using a novel split NanoLuc, NanoBit // Cell Biochem. Funct. 2016. Vol. 34, № 7. P. 497-504.

125. Dixon A.S. et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells // ACS Chem. Biol. 2016. Vol. 11, № 2. P. 400-408.

126. Zhao J. et al. Self-Assembling NanoLuc Luciferase Fragments as Probes for Protein Aggregation in Living Cells // ACS Chem. Biol. 2016. Vol. 11, № 1. P. 132-138.

127. Remy I., Michnick S.W. A highly sensitive protein-protein interaction assay based on Gaussia luciferase // Nat. Methods. 2006. Vol. 3, № 12. P. 977-979.

128. Luker K.E., Gupta M., Luker G.D. Imaging chemokine receptor dimerization with firefly luciferase complementation // FASEB J. 2009. Vol. 23, № 3. P. 823-834.

129. Armando S. et al. The chemokine CXC4 and CC2 receptors form homo- and heterooligomers

that can engage their signaling G-protein effectors and ßarrestin // FASEB J. 2014. Vol. 28, № 10. P. 4509-4523.

130. Casado-Anguera V. et al. Evidence for the heterotetrameric structure of the adenosine A 2A -dopamine D 2 receptor complex // Biochem. Soc. Trans. 2016. Vol. 44, № 2. P. 595-600.

131. Laschet C., Dupuis N., Hanson J. A dynamic and screening-compatible nanoluciferase-based complementation assay enables profiling of individual GPCR-G protein interactions // J. Biol. Chem. 2019. Vol. 294, № 11. P. 4079-4090.

132. Dupuis N. et al. Activation of the orphan G protein-coupled receptor GPR27 by surrogate ligands promotes ß-arrestin 2 recruitment // Mol. Pharmacol. 2017. Vol. 91, № 6. P. 595-608.

133. Wouters E. et al. Distinct dopamine D2 receptor antagonists differentially impact D2 receptor oligomerization // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20, № 7.

134. DIxon A.S. et al. A Tri-part Protein Complementation System Using Antibody-Small Peptide Fusions Enables Homogeneous Immunoassays // Sci. Rep. Springer US, 2017. Vol. 7, № 1. P. 1-13.

135. Ohmuro-Matsuyama Y., Ueda H. Homogeneous Noncompetitive Luminescent Immunodetection of Small Molecules by Ternary Protein Fragment Complementation // Anal. Chem. 2018. Vol. 90, № 5. P. 3001-3004.

136. Contag C.H., Bachmann M.H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2002. Vol. 4. P. 235-260.

137. Azad T., Tashakor A., Hosseinkhani S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives // Anal. Bioanal. Chem. 2014. Vol. 406, № 23. P. 5541-5560.

138. Kurihara M. et al. Ultra sensitive firefly luciferase-based protein-protein interaction assay (FlimPIA) attained by hinge region engineering and optimized reaction conditions // Biotechnol. J. 2016. Vol. 11, № 1. P. 91-99.

139. Ohmuro-Matsuyama Y. et al. A protein-protein interaction assay based on the functional complementation of mutant firefly luciferases // Anal. Chem. 2013. Vol. 85, № 16. P. 79357940.

140. Marques S.M., Esteves Da Silva J.C.G. Firefly bioluminescence: A mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions // IUBMB Life. 2009. Vol. 61, № 1. P. 6-17.

141. Ohmuro-Matsuyama Y. et al. Improving the Stability of Protein-Protein Interaction Assay FlimPIA Using a Thermostabilized Firefly Luciferase // Front. Bioeng. Biotechnol. 2021. Vol. 9, № November. P. 1-8.

142. Shu X. et al. Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome // Science (80-. ). 2009. Vol. 324, № 5928. P. 804-807.

143. Kumagai A. et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle // Cell. Elsevier Inc., 2013. Vol. 153, № 7. P. 1602-1611.

144. Kwon J. et al. Bright ligand-activatable fluorescent protein for high-quality multicolor live-cell super-resolution microscopy // Nat. Commun. Springer US, 2020. Vol. 11, № 1. P. 1-11.

145. Shitashima Y. et al. A dual-ligand-modulable fluorescent protein based on UnaG and calmodulin // Biochem. Biophys. Res. Commun. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 496, № 3. P. 872879.

146. Plamont M.A. et al. Small fluorescence-activating and absorptionshifting tag for tunable protein imaging in vivo (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2015) 113 (497-50 DOI:10.1073/pnas.1513094113) // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016. Vol. 113, № 10. P. E1412.

147. Bajar B.T. et al. A guide to fluorescent protein FRET pairs // Sensors (Switzerland). 2016. Vol. 16, № 9. P. 1-24.

148. Nguyen A.W., Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET // Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23, № 3. P. 355-360.

149. Ma L., Yang F., Zheng J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies // J. Mol. Struct. Elsevier B.V., 2014. Vol. 1077. P. 87-100.

150. Boute N., Jockers R., Issad T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET // Trends Pharmacol. Sci. Elsevier Science Ltd, 2002. Vol. 23, № 8. P. 351-354.

151. Lu X., Shen Y., Campbell R.E. Engineering photosensory modules of non-opsin-based

optogenetic actuators // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, № 18. P. 1-25.

152. Edgett K.S. et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis // Science (80-. ). 2008. Vol. 322, № December. P. 1535-1539.

153. Kennedy M.J. et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells // Nat. Methods. 2010. Vol. 7, № 12. P. 973-975.

154. Taslimi A. et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase // Nat. Chem. Biol. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 12, № 6. P. 425-430.

155. Park H. et al. Optogenetic protein clustering through fluorescent protein tagging and extension of CRY2 // Nat. Commun. Springer US, 2017. Vol. 8, № 1. P. 1-7.

156. Lee S. et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 6. P. 633-636.

157. Kim N.Y. et al. Optogenetic control of mRNA localization and translation in live cells // Nat. Cell Biol. Springer US, 2020. Vol. 22, № 3. P. 341-352.

158. Kennis J.T.M., Mathes T. Molecular eyes: Proteins that transform light into biological information // Interface Focus. 2013. Vol. 3, № 5.

159. Christie J.M. et al. LOV to BLUF: Flavoprotein contributions to the optogenetic toolkit // Mol. Plant. 2012. Vol. 5, № 3. P. 533-544.

160. Kaushik M.S. et al. Modular diversity of the bluf proteins and their potential for the development of diverse optogenetic tools // Appl. Sci. 2019. Vol. 9, № 18. P. 1-28.

161. Nagahama T. et al. Functional transplant of photoactivated adenylyl cyclase (PAC) into Aplysia sensory neurons // Neurosci. Res. 2007. Vol. 59, № 1. P. 81-88.

162. Fraikin G.Y. et al. Bacterial photosensory proteins: Regulatory functions and optogenetic applications // Microbiol. (Russian Fed). 2015. Vol. 84, № 4. P. 461-472.

163. Iseki M. et al. A blue-light-activated adenylyl cyclasemediates photoavoidance in Euglenagracilis // Nature. 2002. Vol. 5. P. 1047-1051.

164. Ryu M.H. et al. Natural and engineered photoactivated nucleotidyl cyclases for optogenetic applications // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285, № 53. P. 41501-41508.

165. Stierl M. et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 2. P. 1181— 1188.

166. Losi A., Gardner K.H., Möglich A. Blue-Light Receptors for Optogenetics // Chem. Rev. 2018. Vol. 118, № 21. P. 10659-10709.

167. Ryu M.H. et al. Optogenetic module for dichromatic control of c-di-GMP signaling // J. Bacteriol. 2017. Vol. 199, № 18.

168. Barends T.R.M. et al. Structure and mechanism of a bacterial light-regulated cyclic nucleotide phosphodiesterase // Nature. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 459, № 7249. P. 1015-1018.

169. Wu Y.I. et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells // Nature. 2009. Vol. 461, № 7260. P. 104-108.

170. Mills E. et al. Engineering a photoactivated caspase-7 for rapid induction of apoptosis // ACS Synth. Biol. 2012. Vol. 1, № 3. P. 75-82.

171. Gil A.A. et al. Optogenetic control of protein binding using light-switchable nanobodies // Nat. Commun. Springer US, 2020. Vol. 11, № 1. P. 1-12.

172. Guntas G. et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015. Vol. 112, № 1. P. 112-117.

173. Wang X., Chen X., Yang Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 3. P. 266-269.

174. Motta-Mena L.B. et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics // Nat. Chem. Biol. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 10, № 3. P. 196202.

175. Grusch M. et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light // EMBO J. 2014. Vol. 33, № 15. P. 1713-1726.

176. Yazawa M. et al. Induction of protein-protein interactions in live cells using light // Nat. Biotechnol. 2009. Vol. 27, № 10. P. 941-945.

177. Polstein L.R., Gersbach C.A. Light-Inducible Gene Regulation with Engineered Zinc Finger Proteins // Photoswitching Proteins Methods Protoc. Methods Mol. Biol. 2014. Vol. 1148. P. 89-107.

178. Sawa M. et al. FKF1 and GIGANTEA Complex Formation Is Required for Day-Length Measurement in Arabidopsis // Science (80-. ). 2007. Vol. 318, № October. P. 261-266.

179. Shcherbakova D.M. et al. Natural Photoreceptors as a Source of Fluorescent Proteins, Biosensors, and Optogenetic Tools // Annual Review of Biochemistry. 2015. Vol. 84, № 1. 519-550 p.

180. Goglia A.G., Toettcher J.E. A bright future: optogenetics to dissect the spatiotemporal control of cell behavior // Curr. Opin. Chem. Biol. Elsevier Ltd, 2019. Vol. 48. P. 106-113.

181. Rost B.R. et al. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience // Neuron. Elsevier Inc., 2017. Vol. 96, № 3. P. 572-603.

182. Seifert S., Brakmann S. LOV Domains in the Design of Photoresponsive Enzymes // ACS Chem. Biol. 2018.

183. Xiong A.S. et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 2. P. 791-797.

184. Hoover D.M., Lubkowski J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30, № 10. P. 1-7.

185. Trehan A. et al. REPLACR-mutagenesis, a one-step method for site-directed mutagenesis by recombineering // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6, № January. P. 1-9.

186. Sievers F., Higgins D.G. Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences // Protein Sci. 2018. Vol. 27, № 1. P. 135-145.

187. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. // Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41, № 1. P. 207-234.

188. Putnam C.D. et al. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: Defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution // Q. Rev. Biophys. 2007. Vol. 40, № 3. P. 191-285.

189. Pernot P. et al. New beamline dedicated to solution scattering from biological macromolecules at the ESRF // J. Phys. Conf. Ser. 2010. Vol. 247.

190. Manalastas K. et al. ATSAS 3.0: Expanded functionality and new tools for small-angle scattering data analysis // J Appl Cryst. International Union of Crystallography, 2021. № 54. P. 343-355.

191. Konarev P. V. et al. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis // J. Appl. Crystallogr. 2003. Vol. 36, № 5. P. 1277-1282.

192. Nazarenko V. V. et al. A thermostable flavin-based fluorescent protein from: Chloroflexus aggregans: A framework for ultra-high resolution structural studies // Photochem. Photobiol. Sci. Royal Society of Chemistry, 2019. Vol. 18, № 7. P. 1793-1805.

193. Piiadov V. et al. SAXSMoW 2.0: Online calculator of the molecular weight of proteins in dilute solution from experimental SAXS data measured on a relative scale // Protein Sci. 2019. Vol. 28, № 2. P. 454-463.

194. Korasick D.A., Tanner J.J. Determination of protein oligomeric structure from small-angle X-ray scattering // Protein Sci. 2018. Vol. 27, № 4. P. 814-824.

195. Grudinin S., Garkavenko M., Kazennov A. Pepsi-SAXS: An adaptive method for rapid and accurate computation of small-angle X-ray scattering profiles // Acta Crystallogr. Sect. D Struct. Biol. International Union of Crystallography, 2017. Vol. 73, № 5. P. 449-464.

196. Goldenzweig A., Fleishman S.J. Principles of Protein Stability and Their Application in Computational Design // Annu. Rev. Biochem. 2018. Vol. 87, № January. P. 105-129.

197. Pudasaini A. et al. Kinetics of the LOV domain of ZEITLUPE determine its circadian function in arabidopsis // Elife. 2017. Vol. 6, № 1. P. 1-27.

198. Lokhandwala J. et al. Structural biochemistry of a fungal LOV domain photoreceptor reveals an evolutionarily conserved pathway integrating light and oxidative stress // Structure. 2015. Vol. 23, № 1. P. 116-125.

199. Zoltowski B.D. et al. Conformational Switching in the Fungal Light Sensor Vivid // Science (80-. ). 2007. Vol. 5827, № 316. P. 1054-1057.

200. Röllen K. et al. Signaling States of a Short Blue-Light Photoreceptor Protein PpSB1-LOV

Revealed from Crystal Structures and Solution NMR Spectroscopy // J. Mol. Biol. Elsevier Ltd, 2016. Vol. 428, № 19. P. 3721-3736.

201. Eliseev I.E. et al. Crystal structures of a llama VHH antibody BCD090-M2 targeting human ErbB3 receptor // F1000Research. 2018. Vol. 7.

202. Eliseev I.E. et al. Targeting erbb3 receptor in cancer with inhibitory antibodies from llama // Biomedicines. 2021. Vol. 9, № 9. P. 1-18.

203. Barykina N. V et al. FGCaMP7 , an Improved Version of Fungi-Based Ratiometric Calcium Indicator for In Vivo Visualization of Neuronal Activity. 2020. 1-33 p.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности основных белков, исследованных в диссертации

CagFbFP:

Нуклеотидная последовательность для экспрессии в E. coli'.

TATACATATGGCCAGCGGTATGATTGTTACCGATGCCGGTGCAGATCAGCCGATTGTTTTTGT TAATCGTGCATTTAGCACCATCACCGGCTATGCACCGAATGAAGTTCTGGGTCGTAATGCTCGTTTTC TGCAAGGTCCGCAGACCGATGCAGCAACCGTTGCACGTCTGCGTGAAGCCATTGCAGCAGCACGTCCG ATTCAAGAACGTATTCTGAATTATCGTAAAGATGGTCAGCCGTTTTGGAATCAGCTGAGCATTAGTCC GGTTCGTGATGAAACCGGCAATGTTGTTGCATTTGTTGGTGTTCAGACAGATGTTACCGCACATCATC ATCACCATCACTAAGGATCCGGCT

CagFbFP-long:

Нуклеотидная последовательность для экспрессии в E. coli.

ATGAGCGCAAGCGAACATAGCACCCAAGAAACCGAACTGGCACAGCAGATTGCCGATCTGCAA GCAGAAATTACCCGTCTGCGTACCCAGAATCGTTTTCTGCTGGCAGCAGTTAATGAAATGGCCAGCGG TATGATTGTTACCGATGCCGGTGCAGATCAGCCGATTGTTTTTGTTAATCGTGCATTTAGCACCATCA CCGGCTATGCACCGAATGAAGTTCTGGGTCGTAATGCTCGTTTTCTGCAAGGTCCGCAGACCGATGCA GCAACCGTTGCACGTCTGCGTGAAGCCATTGCAGCAGCACGTCCGATTCAAGAACGTATTCTGAATTA TCGTAAAGATGGTCAGCCGTTTTGGAATCAGCTGAGCATTAGTCCGGTTCGTGATGAAACCGGCAATG

TTGTTGCATTTGTTGGTGTTCAGACAGATGTTACCGCACAGGTTGCAGTTGAACAGGCACTGGCAGAA CGTGAACAGCTGCTGCGTGCCGTTGAAAAAATGGCACACCACCATCACCATCACTAA

MrFbFP:

Нуклеотидная последовательность для экспрессии в E. coli'.

ATGCGCGACGAAATTTTTCGTATTGCCGTTGAAACCATTCTGGCAGGCGTTGTTATTACCGAT GCACAGCTGCCGGATTATCCGATTGTTTATTGTAATCCGGGTTTTGTTCAGCTGACCGGCTATCCGAG CGAAGAAGTTCTGGGTCGTAATGCTCGTTTTCTGCAAGGTCCGGCAACCAATCCTGAAACCGTTGCAC GTCTGCGTCGTGCAATCCATGAAGGTCGTCCGGCACATGTTCTGCTGCTGAATTATCGTAAAGATGGT CAGCCGTTTTGGAATGATCTGCGTATTGCTCCGGTTCGTGATGTTGAAGGCCGTCTGACCCATTTTGT TGGTATTCAGAGTGATGTTAGCGCCAAAGTTGAAGGTGTTCGTCTGCTGGAACAGGCACTGGAAGAAT GGCGTAGCACCGTTGATACCCTGCATCATCATCACCATCAC

CagFbFP c N-концевым SUMO:

Нуклеотидная последовательность calov_Nter-SUMO-TEV.

ATGCATCATCACCACCATCACATGGGGTCCCTGCAGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAG CCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGA GATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGG GTAAGGAAATGGACTCCTTAACGTTCTTGTACGACGGTATTGAAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAA GATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGAGGTGAGAATCTGTA CTTCCAGGGTGCCAGCGGTATGATTGTTACCGATGCCGGTGCAGATCAGCCGATTGTTTTTGTTAATC GTGCATTTAGCACCATCACCGGCTATGCACCGAATGAAGTTCTGGGTCGTAATGCTCGTTTTCTGCAA GGTCCGCAGACCGATGCAGCAACCGTTGCACGTCTGCGTGAAGCCATTGCAGCAGCACGTCCGATTCA AGAACGTATTCTGAATTATCGTAAAGATGGTCAGCCGTTTTGGAATCAGCTGAGCATTAGTCCGGTTC GTGATGAAACCGGCAATGTTGTTGCATTTGTTGGTGTTCAGACAGATGTTACCGCATAA

Таблица п1. Аминокислотные последовательности используемых белков. Начальный вариант таблицы приведен в статье автора диссертации [114].

Название Последовательность

конструкции

СаяБЬРР МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2

ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

CagFbFP-long МЕКЗЕРЬЗАЗЕНЗТ<2ЕТЕЬА<2<21АВЫ2АЕ1ТКЬКТ<2ЫКЕЬЬААШЕМАЗОМ1УТВАОАВ<2Р1УЕУМ

КАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫСКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВ0<2РЕШ№ЬЗ1З

РУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТА<2УАУЕ<2АЬАЕКЕ<2НННННН

МгБЬРР-1о^ МКВЕ1ЕК1АУЕТ1ЬА0УУ1ТВА<2ЬРВУР1УУСЫР0ЕУ2ЬТ0УРЗЕЕУЬ0КЫАКЕЫ20РАТЫРЕТУА

КЬККА1НЕОКРАНУЬЬЬЫУККВО<2РЕШЫВЬК1АРУКВУЕОКЬТНЕУ31<2ЗВУЗАКУЕОУКЬЬЕ<2АЬ

ЕЕШИЗТУВТЬНННННН

еа1оу №ег- МННННННМОЗЫ2ВЗЕУ№ЕАКРЕУКРЕУКРЕТНтаЬКУЗВОЗЗЕ1ЕЕК1ККТТРЬККЬМЕАЕАКК<2

8иМО-ТБУ 0КЕМВЗЬТЕЬУВ01Е1<2АВ<2ТРЕВЬВМЕВЫВ11ЕАНКЕ<2100ЕЫЬУЕ<20АЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕ

ШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВ0<2РЕШ№ЬЗ

ТЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУЭТВУТА

ЬОУ581ш2 МАЗ0М1УТВА0А00В<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР

1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ581ш5 МАЗ0М1УТВА0А0З0З0В<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АА

АКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ581ш9 МАЗ0М1УТВА0А00З000З00В<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕ

А1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ9Нш2 МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20А00<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР

1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ9Нш5 МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20А0З0З0<2ТВААТУАКЬКЕА1АА

АКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ9Нш9 МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20А00З000З00<2ТВААТУАКЬКЕ

А1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ1371ш2 МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2

ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕООТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ1371ш5 МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2

ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕОЗОЗОТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ1371ш9 МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2

ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕООЗОООЗООТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ581шТБУ МАЗОМ1УТВАОАОООЗООЗОЗЕЫЬУЕ<2ЗООЗООООЗОВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1ТОУАРЫЕУЬОКЫАКЕ

Ы20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВ0<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТ0ЫУУАЕУЗУ2ТВУТА

НННННН

ЬОУ9НшТБУ МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20А000З00З0ЗЕЫЬУЕ<2З00З00

ЗОЗО<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТА

НННННН

ЬОУ1371шТБУ МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВААТУАКЬКЕА1АААКР1<2

ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕОООЗООЗОЗЕЫЬУЕ<2ЗООЗООООЗОТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТА

НННННН

ЬОУ581шТБУ- МАЗ0М1УТВА0А0З00ЗЕЫЬУЕ<2З0З0З0В<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20Р<2ТВА

8ЬоП АТУАКЬКЕА1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

ЬОУ9НшТБУ- МАЗ0М1УТВА0АВ<2Р1УЕШКАЕЗТ1Т0УАРЫЕУЬ0КЫАКЕЫ20А0З00ЗЕЫЬУЕ<2З0З0З0<2ТВА

8ЬоП АТУАКЬКЕА1АААКР1<2ЕК1ЬЫУККВО<2РЕШ№ЬЗ1ЗРУКВЕТОЫУУАЕУЗУ2ТВУТАНННННН

LOV137insTEV- MASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ

short ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDEGSGGSENLYFQSGSGSGTGNVVAFVGVQTDVTAHHHHHH

SUMO-LOV4S- MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ

5S-NZ GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGAGGSGGA

LKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ

SUMO-LOV48- MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ

5S GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGA

CZ-LOV59-153- MEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQGGSGGDQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFL

His QGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAH

HHHHH

SUMO-LOV4S- MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ

91-NZ GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGADQPIVF

VNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGAGGSGGALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ

SUMO-LOV4S- MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ

91 GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGADQPIVF

VNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGA

CZ-LOV92-153- MEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQGGSGGQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKD

His GQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAHHHHHH

SUMO-LOV48- MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ

137-NZ GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGADQPIVF

VNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLS

ISPVRDEGGSGGALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ

SUMO-LOV4S- MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ

137 GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGADQPIVF

VNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLS

ISPVRDE

CZ-LOV13S- MEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQGGSGGTGNVVAFVGVQTDVTAHHHHHH

153-His

MTS-CagFbFP MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNE

VLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFV

GVQTDVTA

MTS-LOV4S- MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGAGGSGGALKKELQANKKELAQL

5S-NZ KWELQALKKELAQ

MTS-LOV4S-5S MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGA

MTS-CZ- MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVGSGMEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLA

LOV59-153 QGGSGGDQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNY

RKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTA

MTS-LOV4S- MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNE

91-NZ VLGRNARFLQGAGGSGGALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ

MTS-LOV4S-91 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNE

VLGRNARFLQGA

MTS-CZ- MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVGSGMEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLA

LOV92-153 QGGSGGQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDV

TA

MTS-LOV4S- MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNE

137-NZ VLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDEGGSGGALK

KELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ

MTS-LOV4S-137

MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVMASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNE VLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDE

MTS-CZ-LOV138-153

MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLGPPVGSGMEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLA QGGSGGTGNVVAFVGVQTDVTA

SUMO-LOV48-91-CaM

MHHHHHHMGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQ GKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGENLYFQGASGMIVTDAGADQPIVF VNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGAGGSGGVSLMADSLTEEQVSEYKEAFSLFDKDGDGQITTK ELGTVMRSLDQNPSESELQDMINEVDAGSDGTIDFPEFLTMMAREMKYRDTEEEIREVCKVFDRDN DGFIDAAELRHVMTSIGEKLTDDEVDEMIREADQDGDGRIDYNEFVQLMMQK

M13-LOV92-153-His

MRSRRLLKKAIDTVRAINKLREGMGGGGSGGQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFW NQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAHHHHHH

permLOV5 S -ins5

MHHHHHHDQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILN YRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAGSGSGASGMIVTDAGA

permLOV5 S-ins6

MHHHHHHDQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILN YRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAGGSGSGASGMIVTDAGA

permLOV5 S-ins7

MHHHHHHDQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILN YRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAGSGSGSGASGMIVTDAGA

permLOV91 -ins7

MHHHHHHQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTD VTAGSGSGSGASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGP

permLOV137-ins7

MHHHHHHTGNVVAFVGVQTDVTAGSGSGSGASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGR NARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDE

LAMP3S3-calov-LAMP

MAAPGSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASAAMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTFD LPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNAS SKEIKTVESITDIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDRPSP TTAPPAPPSPSPSPVPKSPSVDKYNVSGTNGTCLLASMGLQLNLTYERKDNTTVTRLLNINPNKTS ASGSCGAHLVTLELHSEGTTVLLFQFGMNASSSRFFLQGIQLNTILPDARDPAFKAANGSLRALQA TVGNSYKCNAEEHVRVTKAFSVNIFKVWVQAFKVEGGQFGSVEECLLDENSMLGSGSGASGMIVTD AGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKD GQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAGSGSGIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHA GYQTI

OSER-CagFbFP

MDPVVVLGLCLSCLLLLSLWKQSYGGGKLRILQSTVPRARDPPVATMASGMIVTDAGADQPIVFVN RAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSIS PVRDETGNVVAFVGVQTDVTA

CagFbFP-Tubulin

MASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTASGLRSGSGGGSASGGSGSVRECISI HVGQAGVQIGNACWELYCLEHGIQPDGQMPSDKTIGGGDDSFNTFFSETGAGKHVPRAVFVDLEPT VIDEVRTGTYRQLFHPEQLITGKEDAANNYARGHYTIGKEIIDLVLDRIRKLADQCTGLQGFLVFH SFGGGTGSGFTSLLMERLSVDYGKKSKLEFSIYPAPQVSTAVVEPYNSILTTHTTLEHSDCAFMVD NEAIYDICRRNLDIERPTYTNLNRLISQIVSSITASLRFDGALNVDLTEFQTNLVPYPRIHFPLAT YAPVISAEKAYHEQLSVAEITNACFEPANQMVKCDPRHGKYMACCLLYRGDVVPKDVNAAIATIKT KRSIQFVDWCPTGFKVGINYQPPTVVPGGDLAKVQRAVCMLSNTTAIAEAWARLDHKFDLMYAKRA FVHWYVGEGMEEGEFSEAREDMAALEKDYEEVGVDSVEGEGEEEGEEY

LAMP1-CagFbFP

MAAPGSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASAAMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTFD LPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNAS SKEIKTVESITDIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDRPSP TTAPPAPPSPSPSPVPKSPSVDKYNVSGTNGTCLLASMGLQLNLTYERKDNTTVTRLLNINPNKTS ASGSCGAHLVTLELHSEGTTVLLFQFGMNASSSRFFLQGIQLNTILPDARDPAFKAANGSLRALQA TVGNSYKCNAEEHVRVTKAFSVNIFKVWVQAFKVEGGQFGSVEECLLDENSMLIPIAVGGALAGLV LIVLIAYLVGRKRSHAGYQTIGSTGSTGSTGAVDGTAGPGSIATASGMIVTDAGADQPIVFVNRAF

STITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQERILNYRKDGQPFWNQLSISPVR

DETGNVVAFVGVQTDVTA

CagFbFP-M5 iE MASGEIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ

ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAHHHHHH

CagFbFP-V53E MASGMIETDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ

ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGVQTDVTAHHHHHH

CagFbFP-Vi45E MASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ

ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFEGVQTDVTAHHHHHH

CagFbFP-Vi47E MASGMIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ

ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFVGEQTDVTAHHHHHH

CagFbFP-M5 iE- MASGEIVTDAGADQPIVFVNRAFSTITGYAPNEVLGRNARFLQGPQTDAATVARLREAIAAARPIQ

Vi45E ERILNYRKDGQPFWNQLSISPVRDETGNVVAFEGVQTDVTAHHHHHH

БЛАГОДАРНОСТИ

В первую очередь я бы хотела поблагодарить Анастасию Смоленцеву, за интересную совместную работу, помощь в проведении экспериментов по разделенному CagFbFP.

Выражаю исключительную благодарность своему научному руководителю Ивану Гущину за возможность проводить исследования и замечательный стиль руководства.

Сотрудников лаборатории структурного анализа и инжиниринга мембранных систем: Веру Назаренко, Олега Семенова, Андрея Николаева, Елизавету Кузнецову, Алину Ремееву, Ивана Гончарова.

Сотрудников и руководство Центра исследования молекулярных механизмов старения МФТИ за организацию исследовательской работы. Благодарю за продуктивную работу и интересные обсуждения коллег из Центра: Сергея Бухдрукера, Егора Марьина, Ивана Маслова, Анастасию Гусач, Сергея Баженова, Нину Маляр, Федора Цыброва, Елизавету Подоляк, Алексея Алексеева, Халида Мустафина, Германа Легкуна, Александру Лигинину, Полину Хорн, Юрия Рижикова, Андрея Рогачева, Сергея Бухаловича, Павла Буслаева, Степана Осипова, Екатерину Бесценную, Алексея Мишина, Анну Анатольевну Рощенко.

Благодарю коллег из Академического университета за продуктивное выполнение совместных научных проектов и незабываемую атмосферу: Антона Букатина, Станислава Шмакова, Игоря Елисеева, Ивана Тертерова.

Выражаю благодарность Ивану Маслову и Екатерине Бесценной за помощь в проведении экспериментов по микроскопии. Якову Каюмову - за проведение экспериментов по характеризации циркулярно пермутированных вариантов CagFbFP.

За чтение текста диссертации и автореферата: Алексея Дергачева, Кирсана Манджиева, Полину Чикида, Ивана Маслова, Ивана Тертерова.

Также хочу поблагодарить моих друзей, которые поддерживали меня во время моей научной деятельности: Полину Чикида, Антона Христолюбова, Андрея Пржибельского, Илью Архипова, Михаила Петрова.

Благодарю свою семью, особенно своих родителей Николая Васильевича и Елену Алексеевну Юденко, за безусловную поддержку.