Структурные и биофизические исследования флуоресцентных белков семейства LOV из термофилов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Назаренко Вера Вадимовна

• Назаренко Вера Вадимовна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Назаренко Вера Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту:

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Вклад автора

Структура и объем работы

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Основы флуоресценции и ее роль в изучении биологических объектов

1.2. Флуоресцентные белки

1.3. Флавин-связывающие флуоресцентные белки (FbFPs)

1.3.1. Разнообразие LOV-домен-содержащих белков

1.3.2. Структурные особенности LOV-доменов

1.3.3. Фотоцикл LOV-домена

1.3.4. Конформационные изменения при освещении: роль консервативного глутамина

1.3.5. Механизмы передачи сигнала LOV-доменами

1.3.6. Применение белков на основе LOV-доменов

1.3.6.1. Генетически кодируемые флуоресцентные метки

1.3.6.2. Фотосенсибилизаторы

1.3.6.3. Биосенсоры

1.3.6.4. Оптогенетические инструменты

1.3.7. Дизайн флавин-связывающих белков с новыми свойствами

1.3.7.1. Методы дизайна белков

1.3.7.2. Дизайн стабильного белка

1.3.7.3. Дизайн стабильных белков на основе LOV-доменов

1.3.7.4. Спектральная настройка флуоресцентных белков на основе LOV-доменов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы бактерий

2.1.2. Плазмиды и векторы

2.1.3. Ферменты

2.1.4. Реактивы

2.1.5. Среды для выращивания бактериальной культуры

2.1.6. Буферы и растворы

2.1.7. Оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Дизайн праймеров и сборка конструкций

2.2.2. Полимеразная цепная реакция

2.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле

2.2.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli

2.2.5 Выделение плазмидной ДНК из агарозного геля и реакционных смесей

2.2.6. Секвенирование ДНК

2.2.7. Рестрикция

2.2.8. Лигирование

2.2.9. Трансформация клеток E. coli

2.2.10. Культивирование клеток E. coli (штамм Dh10b) для наработки плазмидной ДНК

2.2.11. Культивирование клеток E. coli (штамм C41(DE3)) и экспрессия белка

2.2.12. Выделение белка из клеток

2.2.13. Очистка белка с помощью никель-хелатной хроматографии (Ni-NTA)

2.2.14. Очистка белка с помощью гель-фильтрационной хроматографии (SEC)

2.2.15. Электрофорез белков в ДСН-ПААГ (в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия)

2.2.16. Окраска ДСН-ПААГ раствором кумасси

2.2.17. Концентрирование белка

2.2.18. Измерение концентрации ДНК, белка и клеток на наноспектрофотометре

2.2.19. Проведение тестов для определения термостабильности белка на основе флуоресценции флавинов

2.2.20. Проведение тестов для определения спектра возбуждения, поглощения и флуоресценции белка

2.2.21. Кристаллизация

2.2.22. Определение и уточнение структуры

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Характеристика нового флуоресцентного белка CagFbFP из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans

3.1.1. Описание генетической последовательности

3.1.2. Обобщенная сравнительная характеристика CagFbFP и CagFbFPe

3.1.3. Стабильность CagFbFP

3.1.4. Структурные особенности CagFbFP

3.2. Влияние пролиновых замен на термостабильность нового флуоресцентного белка CagFbFP

3.2.1. Идентификация позиций для замен пролина

3.2.2. Характеристика мутантов Ala ^ Pro CagFbFP

3.2.3. Термостабильность пролиновых мутантов

3.2.4. Исследования структуры пролиновых вариантов CagFbFP

3.3. Структурные и спектральные эффекты мутаций консервативного глутамина Q148 в CagFbFP

3.3.1. Общие характеристики вариантов Q148X

3.3.2. Спектроскопическая характеристика мутантов Q148X

3.3.3. Зависимость спектроскопических характеристик мутантов Q148X от pH

3.3.4. Структурный анализ мутантов Q148X

3.3.4.1. Структура CagFbFP

3.3.4.2. Структура варианта Q148N

3.3.4.3. Структура варианта Q148E

3.3.4.4. Структура варианта Q148D

3.3.4.5. Структура варианта Q148K

3.3.4.6. Структура варианта Q148R

3.3.4.7. Структура варианта Q148H

3.3.4.8. Обсуждение

3.4. Молекулярные основы спектральной настройки флавин-связывающих флуоресцентных белков с синим и красным смещением

3.4.1. Сравнительная характеристика CagFbFP-Q148K и ÏLOV-Q489K

3.4.2. Спектральные свойства FbFP с красным смещением

3.4.3. Структурная основа спектральных свойств iLOV и CagFbFP с красным смещением

3.4.4. Фотофизика новых вариантов

3.4.5. Двухцветная микроскопия новых FbFP

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные и биофизические исследования флуоресцентных белков семейства LOV из термофилов»

Актуальность темы исследования

Генетически кодируемые флуоресцентные белки произвели революцию в клеточных биологических исследованиях в середине 1990-х годов, когда был клонирован [1] и использован для отслеживания экспрессии генов [2] зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea victoria, а впоследствии и его многочисленные мутанты и родственные белки [3]. С тех пор флуоресцентные белки широко используются в биологических и медицинских исследованиях как генетически кодируемые метки, с помощью которых, используя флуоресцентную микроскопию, можно изучать различные процессы как в клетках, так и in vivo. Благодаря вкладу в молекулярную, клеточную и химическую биологию их первооткрыватели были удостоены Нобелевской премии по химии в 2008 году "за открытие и исследование зеленого флуоресцентного белка" [4].

Однако, несмотря на широкий спектр приложений, GFP и родственные флуоресцентные белки имеют некоторые ограничения. Автокаталитическое, многоступенчатое образование хромофора GFP-подобных флуоресцентных белков зависит от присутствия молекулярного кислорода [5]. В анаэробных условиях флуоресцентные белки GFP семейства могут синтезироваться, но их хромофоры подвергаются неполному созреванию, и флуоресценция не наблюдается. Следовательно, достаточное количество молекулярного кислорода является необходимым условием для их флуоресценции. Это условие не всегда выполняется: например, в анаэробных бактериях или в опухолевых клетках млекопитающих. Также для созревания хромофора требуется длительное время (от нескольких минут до часов) [6], что ограничивает наблюдение за белками с коротким временем жизни. Относительно большой размер GFP (~25 кДа) может приводить к стерическим ограничениям и мешать функционированию целевого белка. Поэтому значительный интерес был направлен на разработку альтернативных генетически кодируемых флуоресцентных репортеров, у которых бы отсутствовали эти ограничения.

В 2007 году в качестве альтернативных флуоресцентных репортерных белков были предложены независимые от кислорода флавин-связывающие флуоресцентные белки (FbFPs) [7]. FbFP представляют собой небольшие (~12 кДа) флуоресцентные белки, полученные из LOV-доменов - частей фоторецепторов различных организмов, чувствительных к синему и УФ свету, путем замены фотоактивного цистеина на нереактивную аминокислоту. Они связывают флавины (рибофлавин, RF; флавинмононуклеотид, FMN; флавинадениндинуклеотид, FAD) в качестве хромофора,

которым для созревания не нужен кислород. Соответственно, формирование флуоресцентного сигнала возможно и в анаэробных условиях и, в отличие от GFP-белков, репортерные LOV белки быстро приобретают свою флуоресцентно-активную конформацию из-за их быстрого фолдинга и спонтанного включения хромофора, что позволяет применять их в качестве репортеров в режиме реального времени [8]. Поскольку флавины повсеместно присутствуют во всех живых клетках, FbFP не требуют добавления экзогенных хромофоров или введения дополнительных генов биосинтеза хромофоров.

Несмотря на то, что LOV-домены достаточно неплохо исследованы и FbFP на их основе уже используются в микроскопии, актуальным направлением является повышение их общей, оптической и термической стабильности, а также поиск и создание вариантов со смещенным максимумом поглощения или флуоресценции, как это сделано для GFP [4]. Приложения, такие как получение многоцветных изображений, разработка FRET-биосенсоров на основе FbFP, многоцветная корреляционная световая электронная микроскопия и оптогенетика на основе LOV, требуют расширения палитры цветов FbFP, что является сложной задачей, так как поглощение и флуоресценция FbFP определяется свойствами нековалентно связанных флавинов, на оптические свойства которых, как предполагалось, не могут влиять мутации полипептидной цепи. Таким образом, палитра разных цветов в совокупности со способностью флуоресцировать в анаэробных условиях, быстрой кинетикой сборки и небольшим размером ~ 12-16 кДа, сделают FbFP незаменимыми инструментами там, где GFP терпят неудачу.

Степень разработанности темы

Флавин-связывающие флуоресцентные белки (FbFP) принадлежат к высоко консервативному семейству фоторецепторов, известных как белки, чувствительные к свету, кислороду и напряжению (LOV). Хотя белки LOV широко изучались с конца 90-х годов [9,10], только с 2007 года [7,11] они были предложены для использования в качестве флуоресцентных репортеров для биологических исследований. Флуоресцентные варианты белков LOV были сконструированы путем мутации ключевого цистеина в FMN-связывающем кармане на аланин, который блокирует фотоцикл белка и приводит к зеленой флуоресценции (Хтах = 495 нм) [7,11]. Было показано, что FbFP экспрессируются и флуоресцируют в анаэробных условиях [12,13], тем самым демонстрируя большое преимущество перед зондами на основе GFP для визуализации в условиях низкого содержания кислорода [14].

Повышенная термостабильность является желательным свойством флуоресцентных белков, например, для их использования в качестве флуоресцентных репортеров в термофильных организмах, но первые FbFP денатурировали при умеренных температурах [15]. С помощью мутаций удалось повысить температуру плавления BsFbFP на 31 °C, но было неясно, как повлияли введенные стабилизирующие мутации на яркость белка [16]. Также, другими авторами были использованы методы геномного анализа для обнаружения термостабильных белков естественного происхождения. Первый белок, идентифицированный с помощью такого подхода, CreiLOV, был получен из домена фототропина LOV1 водоросли Chlamydomonas reinhardtii [17], а в 2017 году были открыты термостабильные FbFP из термофильных организмов, некоторые из которых продемонстрировали замечательную термо- и фотостабильность [18].

Что касается разнообразия спектров, то все известные на момент подготовки диссертации LOV-домены с их естественными хромофорами имеют максимумы поглощения в диапазоне от ~ 440 до ~ 450 нм. Ни одна из протестированных мутаций не оказала сильного влияния на спектры поглощения LOV-доменов. Спектры мутантов обычно лишь слегка смещены в синий цвет, с максимальным сдвигом 10 нм для замен Gln^Leu [19-21]. Только модификация хромофора [22-25] приводила к значительным сдвигам максимума поглощения как в синюю, так и в красную область. Тем не менее, нужно отметить, что использование модифицированных хромофоров для приложений LOV-доменов не представляется особенно практичным. В то время как природные хромофоры, такие как FMN или FAD, повсеместно встречаются в большинстве живых клеток, модифицированные хромофоры необходимо синтезировать и добавлять экзогенно для применения in vivo; они могут быть токсичными для клеток или их связывание может быть слабее по сравнению с природными флавинами.

Цели и задачи

Цель работы заключалась в структурном и функциональном исследовании нового, ранее не изучавшегося LOV-домена из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans для создания на его основе флуоресцентной метки. Для реализации цели работы были поставлены следующие задачи:

1) Создание генетических конструкций, оптимизированных под экспрессию в клетках E. coli, фрагментов LOV-домена из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans различной длины для определения наиболее подходящей последовательности, кодирующей белок с сохраненными основными свойствами и функциями.

2) Экспрессия и очистка соответствующих созданным конструкциям белков, изучение их физико-химических свойств.

3) Кристаллизация оптимального варианта CagFbFP, сбор дифракционных данных, получение и анализ его структуры.

4) Определение способов дополнительной стабилизации белка.

5) Изучение физических основ сдвига спектра флуоресценции белка при мутации ключевого консервативного глутамина 148, создание вариантов CagFbFP, спектрально сдвинутых в красную и синюю область.

6) Демонстрация применимости нового белка CagFbFP в качестве флуоресцентной

метки.

Научная новизна

Впервые охарактеризован флавин-связывающий белок CagFbFP, полученный из гистидинкиназы термофильной бактерии СМогоАехт aggregans, содержащей домен LOV. Структуры высокого разрешения показали наличие двух конформаций у консервативного глутамина, одна из которых является очень редкой и наличие которой возможно отражает наличие нового механизма передачи сигнала. Впервые показана замена на пролин как возможный способ стабилизации LOV-доменов. Впервые создана и охарактеризована структурно и спектроскопически панель из мутантов консервативного глутамина на полярные и заряженные аминокислоты, по результатам чего были выдвинуты предположения о причинах синего сдвига спектров полученных мутантов. На основе CagFbFP создан красносмещенный вариант термостабильного флавин-связывающего флуоресцентного белка. Впервые показана применимость FbFP в двухцветной микроскопии, основанной на спектральном разделении.

Теоретическая и практическая значимость работы

Показано, что замена определенных аминокислот на пролин является возможной стратегией стабилизации LOV-домена СЫогоАехш aggregans. Поскольку последовательности и структуры доменов LOV в целом являются довольно консервативными, эффекты описанных мутаций могут быть перенесены на другие белки, принадлежащие к этому семейству для создания наиболее стабильных вариантов.

В ходе выполнения диссертационной работы была создана панель вариантов термостабильного белка LOV CagFbFP, спектры флуоресценции которых смещены в синюю область и один в красную область. Для всех белков были получены структуры

высокого разрешения. Полученные данные по спектроскопии и рентгеновской кристаллографии обеспечили четкое структурное и функциональное понимание спектральной настройки в флавин-связывающих флуоресцентных белков.

Идентифицированные мутанты с синим и красным смещением для термостабильного CagFbFP позволяют проводить двухцветную микроскопию с одной длиной волны возбуждения и наблюдением в одном спектральном диапазоне. Эта комбинация открывает возможность многоцветной визуализации в анаэробных условиях, где GFP и родственные белки не работают из-за их кислородзависимого созревания флуорофора, что, несомненно, показывает практическую значимость данной работы.

Данное исследование выделяет термостабильный CagFbFP как полезную основу для разработки новых вариантов LOV-домена. Он явно переносит радикальные изменения в FMN-связывающем кармане, и даже тогда он все еще остается относительно термостабильным. Таким образом, CagFbFP является многообещающей моделью для структурных исследований LOV-доменов сверхвысокого разрешения и для применения в качестве флуоресцентного репортера, что было зафиксировано патенте на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

1. Связывающий флавин белок CagFbFP, полученный из гистидинкиназы термофильной бактерии CЫoroflexш aggregans, содержащей домен LOV, может быть использован в качестве термостабильной флуоресцентной метки.

2. Кристаллы CagFbFP и его вариантов позволяют получать структуры высокого разрешения активного сайта.

3. В CagFbFP консервативный глутамин 148 может принимать нестандартную конформацию, в которой двугранный угол х2 равен 180°.

4. Термостабильность CagFbFP может быть повышена с помощью замены его аминокислот, в частности А95, на пролин.

5. Мутации Q148H, Q148K, Q148R, Q148N, Q148D, Q148E приводят к сдвигу спектров эмиссии флуоресценции CagFbFP в синюю область до 6 нм, а двойная мутация Q148K/I52T - в красную область на 7 нм.

6. Идентифицированные варианты с синим и красным смещением позволяют производить двухцветный имиджинг, основанный на спектральном разделении.

Степень достоверности и апробация результатов

Структуры белков, полученные в ходе исследовательской работы, были депонированы в банк данных трёхмерных структур белков и нуклеиновых кислот Protein Data Bank, PDB. Основные материалы диссертационной работы докладывались на 2 международных конференциях: 43rd FEBS Congress, 7-12 июля 2018, Прага, Чехия; Биомембраны 2018, Долгопрудный, и 3 всероссийских конференциях: 60-я Научная конференция МФТИ, 20-25 ноября 2017, Долгопрудный, 61-я Всероссийская научная конференция МФТИ, 19-25 ноября 2018, Долгопрудный, 64-я Всероссийская научная конференция МФТИ, Долгопрудный, 2021.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 7 работ в рецензируемых научных журналах, индексируемых базами Scopus и Web of Science, а также 3 работы в сборнике тезисов международной конференции и 2 работы в трудах всероссийских конференций. Получен Российский патент на изобретение № 2746432 "Использование CagFbFP в качестве флуоресцентной метки", авторы: Гущин Иван Юрьевич, Юденко Анна Николаевна, Ремеева Алина Анваровна, Назаренко Вера Вадимовна, Гончаров Иван Михайлович.

Вклад автора

Автор непосредственно участвовала в создании всех генетических конструкций, необходимых для проведения исследования. Автор лично проводила экспрессию, выделение и очистку методом металл-афинной хроматографии белков, готовила образцы для кристаллизации, участвовала в получении кристаллографических данных и решении структур ряда белков. Автор лично получала спектрометрические данные и данные стабильности белков по флуоресценции флавинов и занималась их обработкой, а также участвовала в экспериментах по двухцветной микроскопии, для которой подбирала условия и готовила образцы. Автор принимала участие в подготовке научных статей, опубликованных в соавторстве.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, три главы, заключение, выводы, список использованной литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста и включает 73 рисунка и 8 таблиц. Библиографический указатель содержит 187 источников.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Основы флуоресценции и ее роль в изучении биологических объектов

Явление флуоресценции заключается в поглощении света и излучении света с большей длиной волны в течение нескольких наносекунд после поглощения. Процессы, которые при этом происходят с системой, удобно изображать диаграммой, придуманной Александром Яблонским в 1930-х годах (Рис. 1) [26].

Рисунок 1 - Диаграмма Яблонского, отображающая энергетические состояния молекулы. Адаптировано из [26].

При достаточной энергии падающего фотона система может перейти из основного синглетного ^о) в возбужденное синглетное ^1, S2 и т.д.) электронное состояние. В левой части диаграммы (Рис. 1) представлены синглетные состояния, т. е. состояния электронной системы с нулевым суммарным спином (содержат парные +1/2 и -1/2 спиновые состояния электронов). Возбужденные состояния относительно недолговечны, поэтому система претерпевает безызлучательный переход (колебательную релаксацию) на нижний колебательный подуровень Sl, а затем возвращается в основное состояние Sо с испусканием фотона (Рис. 2). Безызлучательный переход может происходить между электронными состояниями одной мультиплетности, тогда он называется внутренней конверсией, но также возможен переход между состояниями разной мультиплетности — интеркомбинационная конверсия. В этом случае система, прежде чем вернуться в Sо, совершает переход из Sl в промежуточное по энергии триплетное состояние Т1 (справа на диаграмме изображены триплетные состояния, в которых внешний электрон, перемещенный на новую орбиталь, также претерпел последующее изменение спина на противоположное, а суммарный спин электронной системы стал равен 1). Переходы между

состояниями с разной мультиплетностью согласно квантовой теории запрещены, но все же происходят из-за спин-орбитального взаимодействия, хоть и с меньшей вероятностью. Поэтому время между поглощением фотона и фосфоресцентным испусканием (излучательным переходом между состояниями с разной мультиплетностью Т1 ® So) значительно превышает аналогичное время при флуоресценции (излучательном переходе между состояниями с одной мультиплетностью Sl ® So) (Рис. 2) [26,27].

Рисунок 2 - Время, которое занимают различные этапы возбуждения и испускания флуоресценции и фосфоресценции. Адаптировано из [26].

Поскольку излучение происходит с самого нижнего колебательного уровня Sl, энергия испускаемого фотона обычно меньше энергии поглощенного фотона, что приводит к так называемому сдвигу Стокса - разнице между возбуждающей и испускаемой длинами волн (Рис. 3) [26,27]. Интересно, что спектр излучения обычно является зеркальным отражением спектра поглощения перехода So ® Sl. Это сходство возникает из-за того, что электронное возбуждение не сильно меняет геометрию ядер. Следовательно, расстояние между уровнями колебательной энергии возбужденных состояний такое же, как и в основном состоянии [27]. Перекрытие спектров излучения и возбуждения происходит, когда в момент возбуждения молекула находилась в одном из высших колебательных состояний основного состояния So. В таких случаях фотон может вернуться в So с большим скачком энергии, чем это было необходимо для достижения Sl (Рис. 3) [26].

Рисунок 3 - Диаграмма Яблонского и спектры поглощения и испускания обычного флуорофора FITC. Стрелки окрашены в соответствии с длиной волны фотонов. Адаптировано из [26].

Как правило, большие Стоксовы сдвиги имеют преимущество, потому что легче разделить возбуждающий и излучаемый свет, и как раз это свойство делает флуоресценцию настолько важной для микроскопии. Благодаря полной фильтрации возбуждающего света без блокирования излучаемой эмиссии можно видеть только флуоресцирующие объекты, даже отдельные флуоресцентные молекулы, если фон не имеет автофлуоресценции [26]. За последние несколько десятилетий были разработаны тысячи флуоресцентных зондов, которые позволяют маркировать практически любые элементы биологических систем. Широкий спектральный диапазон доступных флуоресцентных зондов позволяет одновременно визуализировать несколько различных клеточных или молекулярных компонент. Прорывом в развитии флуоресцентной микроскопии стало открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP), за которым последовало открытие широкого класса природных флуоресцентных белков. Они позволили посредством генной инженерии производить неинвазивное мечение белков внутри живой клетки.

1.2. Флуоресцентные белки

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea victoria и родственные ему флуоресцентные белки широко применяются в различных областях исследований [4]. С момента его открытия был разработан широкий класс производных и гомологов GFP,

демонстрирующих улучшенные свойства, а также различные цвета флуоресценции, которые охватывают весь видимый спектр (Рис. 4) [28].

(А)

(Б)

м

■V '¿-''iJrfS

8 # / О

mRFP1 -derived

Evolved by SHM

Exc 380 411«; 488 516 «ним 540 548 554 568 574 587 595 596 605 590 nm Em 440 47мю 509 529 iv-mj 553 562 581 585 596 610 620 625 636 648 nm

1 1 , ' '

mm тт

<33323333333

^-п-п-Do Ш ^ °

<Л о о л О 2 5 % 5 S 3 §

I ^ I 1 S 3

Рисунок 4 - (А) Флуоресцентные белки, полученные из Aequorea GFP или Discosoma ЯГР, наработанные в бактериях и очищенные [4]. (Б) Внутриклеточная локализация выбранных мономерных флуоресцентных белков, сшитых с целевыми белками, отображаемых с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Изображения имеют псевдоцвет, чтобы соответствовать профилю излучения флуоресцентных белков [29].

К преимуществам этого класса флуоресцентных белков относятся их высокая яркость флуоресценции, автокаталитическая сборка внутреннего хромофора и наличие большого числа вариантов с различными характеристиками. Однако существуют некоторые приложения, в которых белки семейства GFP имеют очень низкую эффективность, или для которых в принципе отсутствуют GFP-подобные флуоресцентные белки с необходимыми свойствами. Ограничения GFP-подобных белков включают, в частности, зависимость образования хромофора от молекулярного кислорода [5], что может ограничить его использование в анаэробных условиях, таких как опухолевая гипоксия, церебральная ишемия или развитие биопленок [7,30]. Также недостатками являются относительно большой размер (~ 25 кДа), что может приводить к стерическим ограничениям и нефункциональным химерным GFP-белкам, и ограничение их поглощения

и флуоресценции видимой частью спектра. Другими факторами, которые также следует учитывать, являются медленное созревание флуорофора GFP, а также стабильность при разной температуре и рН. Поэтому значительный интерес был направлен на разработку альтернативных генетически кодируемых флуоресцентных репортеров, которые бы покрывали эти ограничения. На помощь пришли естественные фоторецепторы и их фотосенсорные домены, которые стали использоваться в качестве шаблонов для разработки флуоресцентных белков со свойствами, которые не могут быть предложены GFP-подобными белками [31,32].

Большинство известных фоторецепторов происходят из белков фотосинтетических организмов, которые преобразуют энергию фотонов в биохимические реакции, но также играют важную роль и во многих организмах, включая растения, бактерии, грибы и высшие эукариоты. Для восприятия света фоторецепторы обычно содержат экзогенную молекулу-кофактор, называемую хромофором, которая поглощает свет и передает энергию белковой основе. В результате фотохимических превращений в хромофоре и конформационных изменений в белковом остове происходит активация рецептора и распространение сигнала [32].

Фоторецепторы, используемые в конструкции оптических инструментов, можно разделить на несколько классов в соответствии с их хромофорами и светочувствительными доменами белков. Первый класс - флавопротеины, которые включают флавинмононуклеотид (FMN) или флавинадениндинуклеотид (FAD) в качестве хромофора и чувствительны к ультрафиолетовому и синему свету (~300-500 нм), такие как рецепторы с доменами LOV (чувствительными к свету, кислороду и напряжению), BLUF (связывающими флавинадениндинуклеотид) и криптохромы [33]. Другой класс фоторецепторов, называемый ксантопсинами, также реагируют на УФ и синий свет, но эти белки включают 4-гидроксикоричную кислоту в качестве хромофора. Ксантопсины, однако, не использовались широко для создания оптических зондов, потому что они не включают хромофор автокаталитически. Разнообразное семейство рецепторов, называемых опсинами, поглощают синий, зеленый и красный свет и в качестве хромофора используют ретиналь. Светочувствительные фоторецепторы дальнего и ближнего инфракрасного спектра, называемые фитохромами, используют в качестве хромофоров различные линейные тетрапирролбилины [32,34].

При разработке флуоресцентных зондов важна природа хромофора, так как он определяет диапазон длин волн поглощаемого и излучаемого света, а также свойства самих флуоресцентных белков и требования к их применению. Если эти хромофоры продуцируются клеткой естественным образом и эффективно связываются со

сконструированными флуоресцентными белками, то приложения этого белка, подобно семейству GFP, требуют доставки только одного гена, кодирующего этот белок. В других случаях хромофоры нужно добавлять экзогенно, или должны быть включены дополнительные гены для синтеза хромофоров в клетках. Общая стратегия создания постоянно флуоресцирующих белков из фоторецепторов заключается в блокировании фотоцикла для преобразования энергии возбуждающего света в флуоресцентное излучение [32].

1.3. Флавин-связывающие флуоресцентные белки (FbFPs)

Домены LOV изначально были обнаружены в фототропинах растений [9], которые важны для открытия устьиц, движения хлоропластов и изгиба органов растений от или в направлении источника света, а затем и в других фоторецепторах растений, бактерий, водорослей и грибов. Там они выполняют киназные, фосфодиэстеразные, ДНК-связывающие и другие функции [33]. Они обычно связывают флавинмононуклеотид (FMN) в качестве хромофора, которому для созревания не нужен кислород, а при блокировке фотоцикла они имеют постоянную флуоресценцию. Малый размер (~12-16 кДа) и присутствие флавиновых хромофоров в большинстве, если не во всех, типах клеток являются ключевыми преимуществами этих доменов для разработки оптических зондов. По этой причине на основе LOV-доменов были разработаны так называемые флавин-связывающие флуоресцентные белки (Flavin-binding Fluorescent Proteins, FbFPs) как альтернативные репортерные белки in vivo. FbFPs являются перспективными кандидатами для решения многолетней задачи по разработке генетически кодируемых флуоресцентных меток для визуализации в условиях низкого содержания кислорода.

1.3.1. Разнообразие LOV-домен-содержащих белков

Фототропин, белок, участвующий в фототропизме, кодирует фоторецепторную серин / треонинкиназу с двумя близко расположенными доменами LOV (LOV1 и LOV2) в N-концевой части [9]. С момента их обнаружения произошел скачок в исследованиях клеточных и молекулярных процессов светозависимой передачи сигналов, опосредованных LOV-доменами. Вскоре были обнаружены гены, кодирующие LOV-домены, связанные с отличными от киназ эффекторными доменами (Рис. 5) [35] в растениях [36,37], водорослях [38] и грибах [39,40] и, как было показано, регулирующие ряд циркадных процессов [36,39-41]. Также LOV-домены были идентифицированы в бактериальных геномах [42], в

которых они связаны с различными сигнальными доменами (Рис. 5) и регулируют процессы, включающие общую реакцию на стресс [43] и вирулентность [44] [41]. Наиболее частые эффекторные модули прокариотических рецепторов LOV представляют собой гистидинкиназы [45] (около 50% бактериальных LOV-белков), другие распространенные эффекторы включают ДНК-связывающие домены и ферменты GGDEF, которые предположительно регулируют синтез и гидролиз циклического дигуанилата (с^^МР) и составляют ~ 20% бактериальных LOV-белков [41,46]. За редким исключением [38,47], LOV фотосенсор является ^концевым элементом эффектора, обычно разделенным коротким, в основном, а-спиральным линкерным элементом [46].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Назаренко Вера Вадимовна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Prasher D.C. et al. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. 1992. Vol. 111, № 2. P. 229-233.

2. Chalfie M. et al. Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression // Science. 1994. Vol. 263, № 5148. P. 802-805.

3. Day R.N., Davidson M.W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38, № 10. P. 2887.

4. Tsien R.Y. Constructing and Exploiting the Fluorescent Protein Paintbox (Nobel Lecture) // Angew. Chem. Int. Ed. 2009. Vol. 48, № 31. P. 5612-5626.

5. Wachter R.M. Chromogenic Cross-Link Formation in Green Fluorescent Protein // Acc. Chem. Res. 2007. Vol. 40, № 2. P. 120-127.

6. Balleza E., Kim J.M., Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells // Nat Methods. 2018. Vol. 15, № 1. P. 47-51.

7. Drepper T. et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen // Nat Biotechnol. 2007. Vol. 25, № 4. P. 443-445.

8. Wingen M. et al. The photophysics of LOV-based fluorescent proteins - new tools for cell biology // Photochem. Photobiol. Sci. 2014. Vol. 13, № 6. P. 875-883.

9. Christie J.M. et al. LOV (light, oxygen, or voltage) domains of the blue-light photoreceptor phototropin (nph1): Binding sites for the chromophore flavin mononucleotide // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. Vol. 96, № 15. P. 8779-8783.

10. Salomon M. et al. Photochemical and Mutational Analysis of the FMN-Binding Domains of the Plant Blue Light Receptor, Phototropin • // Biochemistry. 2000. Vol. 39, № 31. P. 94019410.

11. Chapman S. et al. The photoreversible fluorescent protein iLOV outperforms GFP as a reporter of plant virus infection // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. Vol. 105, № 50. P. 20038-20043.

12. Tielker D. et al. Flavin Mononucleotide-Based Fluorescent Protein as an Oxygen-Independent Reporter in Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae // Eukaryot Cell. 2009. Vol. 8, № 6. P. 913-915.

13. Lobo L.A., Smith C.J., Rocha E.R. Flavin mononucleotide (FMN)-based fluorescent protein (FbFP) as reporter for gene expression in the anaerobe Bacteroides fragilis: Bacteroides fragilis expressing fluorescent protein BS2 // FEMS Microbiology Letters. 2011. Vol. 317, № 1. P. 67-74.

14. Drepper T. et al. Flavin Mononucleotide-Based Fluorescent Reporter Proteins Outperform

Green Fluorescent Protein-Like Proteins as Quantitative In Vivo Real-Time Reporters // Appl Environ Microbiol. 2010. Vol. 76, № 17. P. 5990-5994.

15. Mukherjee A. et al. Characterization of Flavin-Based Fluorescent Proteins: An Emerging Class of Fluorescent Reporters // PLoS ONE / ed. Wang Y. 2013. Vol. 8, № 5. P. e64753.

16. Song X. et al. Engineering a More Thermostable Blue Light Photo Receptor Bacillus subtilis YtvA LOV Domain by a Computer Aided Rational Design Method // PLoS Comput Biol / ed. Nilges M. 2013. Vol. 9, № 7. P. e1003129.

17. Mukherjee A. et al. Engineering and Characterization of New LOV-Based Fluorescent Proteins from Chlamydomonas reinhardtii and Vaucheria frigida // ACS Synth. Biol. 2015. Vol. 4, № 4. P. 371-377.

18. Wingen M. et al. Novel Thermostable Flavin-binding Fluorescent Proteins from Thermophilic Organisms // Photochem Photobiol. 2017. Vol. 93, № 3. P. 849-856.

19. Zayner J.P., Sosnick T.R. Factors That Control the Chemistry of the LOV Domain Photocycle // PLoS ONE / ed. Lebedev N. 2014. Vol. 9, № 1. P. e87074.

20. Nash A.I. et al. A Conserved Glutamine Plays a Central Role in LOV Domain Signal Transmission and Its Duration // Biochemistry. 2008. Vol. 47, № 52. P. 13842-13849.

21. Nozaki D. et al. Role of Gln1029 in the Photoactivation Processes of the LOV2 Domain in Adiantum Phytochrome3 t // Biochemistry. 2004. Vol. 43, № 26. P. 8373-8379.

22. Mathes T. et al. In Vivo Generation of Flavoproteins with Modified Cofactors // Journal of Molecular Biology. 2009. Vol. 385, № 5. P. 1511-1518.

23. Silva-Junior M.R. et al. Photophysics of Structurally Modified Flavin Derivatives in the Blue-Light Photoreceptor YtvA: A Combined Experimental and Theoretical Study // ChemBioChem. 2013. Vol. 14, № 13. P. 1648-1661.

24. Kalvaitis M.E. et al. A Noncanonical Chromophore Reveals Structural Rearrangements of the Light-Oxygen-Voltage Domain upon Photoactivation // Biochemistry. 2019. Vol. 58, № 22. P. 2608-2616.

25. Arinkin V. et al. Structure of a LOV protein in apo-state and implications for construction of LOV-based optical tools // Sci Rep. 2017. Vol. 7, № 1. P. 42971.

26. Lichtman J.W., Conchello J.-A. Fluorescence microscopy // Nat Methods. 2005. Vol. 2, № 12. P. 910-919.

27. Principles of Fluorescence Spectroscopy / ed. Lakowicz J.R. Boston, MA: Springer US, 2006.

28. Kremers G.-J. et al. Fluorescent proteins at a glance // Journal of Cell Science. 2011. Vol. 124, № 15. P. 2676-2676.

29. Shaner N.C., Patterson G.H., Davidson M.W. Advances in fluorescent protein technology

// Journal of Cell Science. 2007. Vol. 120, № 24. P. 4247-4260.

30. Coralli C. et al. Limitations of the Reporter Green Fluorescent Protein under Simulated Tumor Conditions. 2001. Vol. 61. P. 4784-4790.

31. Rodriguez E.A. et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins // Trends in Biochemical Sciences. 2017. Vol. 42, № 2. P. 111-129.

32. Shcherbakova D.M. et al. Natural Photoreceptors as a Source of Fluorescent Proteins, Biosensors, and Optogenetic Tools // Annu. Rev. Biochem. 2015. Vol. 84, № 1. P. 519-550.

33. Losi A., Gärtner W. The Evolution of Flavin-Binding Photoreceptors: An Ancient Chromophore Serving Trendy Blue-Light Sensors // Annu. Rev. Plant Biol. 2012. Vol. 63, № 1. P. 49-72.

34. Seong J., Lin M.Z. Optobiochemistry: Genetically Encoded Control of Protein Activity by Light // Annu. Rev. Biochem. 2021. Vol. 90, № 1. P. 475-501.

35. Crosson S., Rajagopal S., Moffat K. The LOV Domain Family: Photoresponsive Signaling Modules Coupled to Diverse Output Domains // Biochemistry. 2003. Vol. 42, № 1. P. 2-10.

36. Somers D.E. et al. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis // Cell. 2000. Vol. 101, № 3. P. 319-329.

37. Nelson D.C. et al. FKF1, a Clock-Controlled Gene that Regulates the Transition to Flowering in Arabidopsis // Cell. 2000. Vol. 101, № 3. P. 331-340.

38. Takahashi F. et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007. Vol. 104, № 49. P. 19625-19630.

39. Heintzen C., Loros J.J., Dunlap J.C. The PAS Protein VIVID Defines a Clock-Associated Feedback Loop that Represses Light Input, Modulates Gating, and Regulates Clock Resetting // Cell. 2001. Vol. 104, № 3. P. 453-464.

40. Froehlich A.C. et al. White Collar-1, a Circadian Blue Light Photoreceptor, Binding to the frequency Promoter // Science. 2002. Vol. 297, № 5582. P. 815-819.

41. Herrou J., Crosson S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins // Nat Rev Microbiol. 2011. Vol. 9, № 10. P. 713-723.

42. Losi A. et al. First Evidence for Phototropin-Related Blue-Light Receptors in Prokaryotes // Biophysical Journal. 2002. Vol. 82, № 5. P. 2627-2634.

43. Ávila-Pérez M., Hellingwerf K.J., Kort R. Blue Light Activates the g b -Dependent Stress Response of Bacillus subtilis via YtvA // J Bacteriol. 2006. Vol. 188, № 17. P. 6411-6414.

44. Swartz T.E. et al. Blue-Light-Activated Histidine Kinases: Two-Component Sensors in Bacteria // Science. 2007. Vol. 317, № 5841. P. 1090-1093.

45. Glantz S.T. et al. Functional and topological diversity of LOV domain photoreceptors // Proc Natl Acad Sci USA. 2016. Vol. 113, № 11. P. E1442-E1451.

46. Möglich A. Signal transduction in photoreceptor histidine kinases // Protein Science. 2019. Vol. 28, № 11. P. 1923-1946.

47. Weber A.M. et al. A blue light receptor that mediates RNA binding and translational regulation // Nat Chem Biol. 2019. Vol. 15, № 11. P. 1085-1092.

48. Losi A., Gärtner W. Solving Blue Light Riddles: New Lessons from Flavin-binding LOV Photoreceptors // Photochem Photobiol. 2017. Vol. 93, № 1. P. 141-158.

49. Zhulin I. PAS domain S-boxes in archaea, bacteria and sensors for oxygen and redox // Trends in Biochemical Sciences. 1997. Vol. 22, № 9. P. 331-333.

50. Henry J.T., Crosson S. Ligand-Binding PAS Domains in a Genomic, Cellular, and Structural Context // Annu. Rev. Microbiol. 2011. Vol. 65, № 1. P. 261-286.

51. Circolone F. et al. Structural Basis for the Slow Dark Recovery of a Full-Length LOV Protein from Pseudomonas putida // Journal of Molecular Biology. 2012. Vol. 417, № 4. P. 362374.

52. Wada M., Shimazaki K., Iino M. Light sensing in plants. Tokyo New York, NY: Springer Botanical Society of Japan, 2005.

53. Christie J.M. et al. Steric Interactions Stabilize the Signaling State of the LOV2 Domain of Phototropin 1 t // Biochemistry. 2007. Vol. 46, № 32. P. 9310-9319.

54. Swartz T.E. et al. The photocycle of a flavin-binding domain of the blue light photoreceptor phototropin // J Biol Chem. 2001. Vol. 276, № 39. P. 36493-36500.

55. Mukherjee A., Schroeder C.M. Flavin-based fluorescent proteins: emerging paradigms in biological imaging // Curr Opin Biotechnol. 2015. Vol. 31. P. 16-23.

56. Conrad K.S., Bilwes A.M., Crane B.R. Light-induced subunit dissociation by a light-oxygen-voltage domain photoreceptor from Rhodobacter sphaeroides // Biochemistry. 2013. Vol. 52, № 2. P. 378-391.

57. Losi A., Gärtner W. Old Chromophores, New Photoactivation Paradigms, Trendy Applications: Flavins in Blue Light-Sensing Photoreceptors! // Photochemistry and Photobiology. 2011. Vol. 87, № 3. P. 491-510.

58. Rinaldi J. et al. The ß-Scaffold of the LOV Domain of the Brucella Light-Activated Histidine Kinase Is a Key Element for Signal Transduction // Journal of Molecular Biology. 2012. Vol. 420, № 1-2. P. 112-127.

59. Möglich A., Moffat K. Structural Basis for Light-dependent Signaling in the Dimeric LOV Domain of the Photosensor YtvA // Journal of Molecular Biology. 2007. Vol. 373, № 1. P. 112126.

60. Lee J. et al. Changes at the KinA PAS-A dimerization interface influence histidine kinase function // Biochemistry. 2008. Vol. 47, № 13. P. 4051-4064.

61. Nakasako M. et al. Structural Basis of the LOV1 Dimerization of Arabidopsis Phototropins 1 and 2 // Journal of Molecular Biology. 2008. Vol. 381, № 3. P. 718-733.

62. Key J. et al. Structure of the Redox Sensor Domain of Azotobacter vinelandii NifL at Atomic Resolution: Signaling, Dimerization, and Mechanism ' // Biochemistry. 2007. Vol. 46, № 12. P.3614-3623.

63. Vaidya A.T. et al. Structure of a Light-Activated LOV Protein Dimer That Regulates Transcription // Sci. Signal. 2011. Vol. 4, № 184.

64. Kopka B. et al. Electron transfer pathways in a light, oxygen, voltage (LOV) protein devoid of the photoactive cysteine // Sci Rep. 2017. Vol. 7, № 1. P. 13346.

65. Conrad K.S., Manahan C.C., Crane B.R. Photochemistry of flavoprotein light sensors // Nat Chem Biol. 2014. Vol. 10, № 10. P. 801-809.

66. Losi A. Flavin-based Blue-light Photosensors: A Photobiophysics Update // Photochem Photobiol. 2007. Vol. 83, № 6. P. 1283-1300.

67. Pudasaini A., El-Arab K.K., Zoltowski B.D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling // Front. Mol. Biosci. 2015. Vol. 2.

68. Schleicher E. et al. On the Reaction Mechanism of Adduct Formation in LOV Domains of the Plant Blue-Light Receptor Phototropin // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126, № 35. P. 1106711076.

69. Bauer C. et al. Indication for a Radical Intermediate Preceding the Signaling State in the LOV Domain Photocyclej: Photochemistry and Photobiology // Photochemistry and Photobiology. 2011. Vol. 87, № 3. P. 548-553.

70. Zayner J.P. et al. Investigating Models of Protein Function and Allostery With a Widespread Mutational Analysis of a Light-Activated Protein // Biophysical Journal. 2013. Vol. 105, № 4. P. 1027-1036.

71. Zoltowski B.D., Vaccaro B., Crane B.R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor // Nat Chem Biol. 2009. Vol. 5, № 11. P. 827-834.

72. Zayner J.P., Antoniou C., Sosnick T.R. The amino-terminal helix modulates light-activated conformational changes in AsLOV2 // J Mol Biol. 2012. Vol. 419, № 1-2. P. 61-74.

73. Christie J.M. et al. Steric Interactions Stabilize the Signaling State of the LOV2 Domain of Phototropin 1 // Biochemistry. 2007. Vol. 46, № 32. P. 9310-9319.

74. Yee E.F. et al. Signal transduction in light-oxygen-voltage receptors lacking the adduct-forming cysteine residue // Nat Commun. 2015. Vol. 6, № 1. P. 10079.

75. Bocola M. et al. Light-induced structural changes in a short light, oxygen, voltage (LOV) protein revealed by molecular dynamics simulations—implications for the understanding of LOV photoactivation // Front. Mol. Biosci. 2015. Vol. 2.

76. Peter E., Dick B., Baeurle S.A. Mechanism of signal transduction of the LOV2-Ja photosensor from Avena sativa // Nat Commun. 2010. Vol. 1, № 1. P. 122.

77. Crosson S., Moffat K. Photoexcited Structure of a Plant Photoreceptor Domain Reveals a Light-Driven Molecular Switch // Plant Cell. 2002. Vol. 14, № 5. P. 1067-1075.

78. Zoltowski B.D. et al. Conformational Switching in the Fungal Light Sensor Vivid // Science. 2007. Vol. 316, № 5827. P. 1054-1057.

79. Jones M.A. et al. Mutational Analysis of Phototropin 1 Provides Insights into the Mechanism Underlying LOV2 Signal Transmission // Journal of Biological Chemistry. 2007. Vol. 282, № 9. P. 6405-6414.

80. Diensthuber R.P. et al. Biophysical, Mutational, and Functional Investigation of the Chromophore-Binding Pocket of Light-Oxygen-Voltage Photoreceptors // ACS Synth. Biol. 2014. Vol. 3, № 11. P. 811-819.

81. Glantz S.T. et al. Directly light-regulated binding of RGS-LOV photoreceptors to anionic membrane phospholipids // Proc Natl Acad Sci U S A. 2018. Vol. 115, № 33. P. E7720-E7727.

82. Raffelberg S. et al. Modulation of the Photocycle of a LOV Domain Photoreceptor by the Hydrogen-Bonding Network // J. Am. Chem. Soc. 2011. Vol. 133, № 14. P. 5346-5356.

83. Zoltowski B.D., Gardner K.H. Tripping the Light Fantastic: Blue-Light Photoreceptors as Examples of Environmentally Modulated Protein-Protein Interactions // Biochemistry. 2011. Vol. 50, № 1. P. 4-16.

84. Losi A. LOV Proteins: Photobiophysics // Encyclopedia of Biophysics / ed. Roberts G.C.K. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2013. P. 1312-1316.

85. Akbar S. et al. New Family of Regulators in the Environmental Signaling Pathway Which Activates the General Stress Transcription Factor q B of Bacillus subtilis // J Bacteriol. 2001. Vol. 183, № 4. P. 1329-1338.

86. Nash A.I. et al. Structural basis of photosensitivity in a bacterial light-oxygen-voltage/helix-turn-helix (LOV-HTH) DNA-binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011. Vol. 108, № 23. P. 9449-9454.

87. Seifert S., Brakmann S. LOV Domains in the Design of Photoresponsive Enzymes // ACS Chem. Biol. 2018. Vol. 13, № 8. P. 1914-1920.

88. Harper S.M., Neil L.C., Gardner K.H. Structural Basis of a Phototropin Light Switch // Science. 2003. Vol. 301, № 5639. P. 1541-1544.

89. Halavaty A.S., Moffat K. N- and C-Terminal Flanking Regions Modulate Light-Induced Signal Transduction in the LOV2 Domain of the Blue Light Sensor Phototropin 1 from Avena sativa ' // Biochemistry. 2007. Vol. 46, № 49. P. 14001-14009.

90. Freddolino P.L., Gardner K.H., Schulten K. Signaling mechanisms of LOV domains: new

insights from molecular dynamics studies // Photochem. Photobiol. Sci. 2013. Vol. 12, № 7. P. 1158.

91. Zoltowski B.D., Crane B.R. Light Activation of the LOV Protein Vivid Generates a Rapidly Exchanging Dimer // Biochemistry. 2008. Vol. 47, № 27. P. 7012-7019.

92. Avila-Pérez M. et al. In Vivo Mutational Analysis of YtvA from Bacillus subtilis // Journal of Biological Chemistry. 2009. Vol. 284, № 37. P. 24958-24964.

93. Buckley A.M. et al. LOV-based reporters for fluorescence imaging // Current Opinion in Chemical Biology. 2015. Vol. 27. P. 39-45.

94. Nakasako M. et al. Light-Induced Structural Changes of LOV Domain-Containing Polypeptides from Arabidopsis Phototropin 1 and 2 Studied by Small-Angle X-ray Scattering // Biochemistry. 2004. Vol. 43, № 47. P. 14881-14890.

95. Kremers G.-J. et al. Fluorescent proteins at a glance // Journal of Cell Science. 2011. Vol. 124, № 15. P. 2676-2676.

96. Mukherjee A. et al. Directed evolution of bright mutants of an oxygen-independent flavin-binding fluorescent protein from Pseudomonas putida // J Biol Eng. 2012. Vol. 6, № 1. P. 20.

97. Christie J.M. et al. Structural Tuning of the Fluorescent Protein iLOV for Improved Photostability // Journal of Biological Chemistry. 2012. Vol. 287, № 26. P. 22295-22304.

98. Landete J.M. et al. Anaerobic green fluorescent protein as a marker of Bifidobacterium strains // International Journal of Food Microbiology. 2014. Vol. 175. P. 6-13.

99. Walter J. et al. Flavin Mononucleotide-Based Fluorescent Proteins Function in Mammalian Cells without Oxygen Requirement // PLoS ONE / ed. Isalan M. 2012. Vol. 7, № 9. P. e43921.

100. Gawthorne J.A. et al. Express Your LOV: An Engineered Flavoprotein as a Reporter for Protein Expression and Purification // PLoS ONE / ed. Sobol R.W. 2012. Vol. 7, № 12. P. e52962.

101. Shu X. et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms // PLoS Biol / ed. McIntosh JR. 2011. Vol. 9, № 4. P. e1001041.

102. Boassa D. et al. Mapping the Subcellular Distribution of -Synuclein in Neurons using Genetically Encoded Probes for Correlated Light and Electron Microscopy: Implications for Parkinson's Disease Pathogenesis // Journal of Neuroscience. 2013. Vol. 33, № 6. P. 2605-2615.

103. Ludwig A. et al. Molecular Composition and Ultrastructure of the Caveolar Coat Complex // PLoS Biol / ed. Hughson F. 2013. Vol. 11, № 8. P. e1001640.

104. Ryumina A.P. et al. Flavoprotein miniSOG as a genetically encoded photosensitizer for cancer cells // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 2013. Vol. 1830, № 11. P. 5059-5067.

105. Mironova K.E. et al. Genetically Encoded Immunophotosensitizer 4D5scFv-miniSOG is a

Highly Selective Agent for Targeted Photokilling of Tumor Cells in Vitro // Theranostics. 2013. Vol. 3, № 11. P. 831-840.

106. Qi Y.B. et al. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012. Vol. 109, № 19. P. 7499-7504.

107. Xu S., Chisholm A.D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG // Sci Rep. 2016. Vol. 6, № 1. P. 21271.

108. Makhijani K. et al. Precision Optogenetic Tool for Selective Single- and Multiple-Cell Ablation in a Live Animal Model System // Cell Chemical Biology. 2017. Vol. 24, № 1. P. 110119.

109. Endres S. et al. An optogenetic toolbox of LOV-based photosensitizers for light-driven killing of bacteria // Sci Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 15021.

110. Westberg M. et al. No Photon Wasted: An Efficient and Selective Singlet Oxygen Photosensitizing Protein // J. Phys. Chem. B. 2017. Vol. 121, № 40. P. 9366-9371.

111. Hilgers F. et al. Genetically Encoded Photosensitizers as Light-Triggered Antimicrobial Agents // IJMS. 2019. Vol. 20, № 18. P. 4608.

112. Shcherbakova D.M., Subach O.M., Verkhusha V.V. Red Fluorescent Proteins: Advanced Imaging Applications and Future Design // Angew. Chem. Int. Ed. 2012. Vol. 51, № 43. P. 1072410738.

113. Potzkei J. et al. Real-time determination of intracellular oxygen in bacteria using a genetically encoded FRET-based biosensor // BMC Biol. 2012. Vol. 10, № 1. P. 28.

114. Péresse T., Gautier A. Next-Generation Fluorogen-Based Reporters and Biosensors for Advanced Bioimaging // IJMS. 2019. Vol. 20, № 24. P. 6142.

115. Rupprecht C. et al. A novel FbFP-based biosensor toolbox for sensitive in vivo determination of intracellular pH // Journal of Biotechnology. 2017. Vol. 258. P. 25-32.

116. Llopis J. et al. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998. Vol. 95, № 12. P. 6803-6808.

117. Wilks J.C., Slonczewski J.L. pH of the Cytoplasm and Periplasm of Escherichia coli : Rapid Measurement by Green Fluorescent Protein Fluorimetry // J Bacteriol. 2007. Vol. 189, № 15. P. 5601-5607.

118. Romei M.G., Boxer S.G. Split Green Fluorescent Proteins: Scope, Limitations, and Outlook // Annu. Rev. Biophys. 2019. Vol. 48, № 1. P. 19-44.

119. Tchekanda E., Sivanesan D., Michnick S.W. An infrared reporter to detect spatiotemporal dynamics of protein-protein interactions // Nat Methods. 2014. Vol. 11, № 6. P. 641-644.

120. Yudenko A. et al. Rational Design of a Split Flavin-Based Fluorescent Reporter // ACS Synth. Biol. 2021. Vol. 10, № 1. P. 72-83.

121. Wiens M.D., Campbell R.E. Surveying the landscape of optogenetic methods for detection of protein-protein interactions // WIREs Syst Biol Med. 2018. Vol. 10, № 3. P. e1415.

122. Boassa D. et al. Split-miniSOG for Spatially Detecting Intracellular Protein-Protein Interactions by Correlated Light and Electron Microscopy // Cell Chemical Biology. 2019. Vol. 26, № 10. P. 1407-1416.e5.

123. Nazarenko V.V. et al. A thermostable flavin-based fluorescent protein from Chloroflexus aggregans : a framework for ultra-high resolution structural studies // Photochem. Photobiol. Sci. 2019. Vol. 18, № 7. P. 1793-1805.

124. Christie J.M. et al. LOV to BLUF: Flavoprotein Contributions to the Optogenetic Toolkit // Molecular Plant. 2012. Vol. 5, № 3. P. 533-544.

125. Wu Y.I. et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells // Nature. 2009. Vol. 461, № 7260. P. 104-108.

126. Mills E. et al. Engineering a Photoactivated Caspase-7 for Rapid Induction of Apoptosis // ACS Synth. Biol. 2012. Vol. 1, № 3. P. 75-82.

127. Möglich A., Ayers R.A., Moffat K. Design and Signaling Mechanism of Light-Regulated Histidine Kinases // Journal of Molecular Biology. 2009. Vol. 385, № 5. P. 1433-1444.

128. Wang X., Chen X., Yang Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system // Nat Methods. 2012. Vol. 9, № 3. P. 266-269.

129. Yazawa M. et al. Induction of protein-protein interactions in live cells using light // Nat Biotechnol. 2009. Vol. 27, № 10. P. 941-945.

130. Polstein L.R., Gersbach C.A. Light-Inducible Spatiotemporal Control of Gene Activation by Customizable Zinc Finger Transcription Factors // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134, № 40. P. 16480-16483.

131. Sawa M. et al. FKF1 and GIGANTEA Complex Formation Is Required for Day-Length Measurement in Arabidopsis // Science. 2007. Vol. 318, № 5848. P. 261-265.

132. Goldenzweig A., Fleishman S.J. Principles of Protein Stability and Their Application in Computational Design // Annu. Rev. Biochem. 2018. Vol. 87, № 1. P. 105-129.

133. Kazlauskas R. Engineering more stable proteins // Chem. Soc. Rev. 2018. Vol. 47, № 24. P. 9026-9045.

134. Modarres H.P., Mofrad M.R., Sanati-Nezhad A. Protein thermostability engineering // RSC Adv. 2016. Vol. 6, № 116. P. 115252-115270.

135. Prajapati R.S. et al. Thermodynamic effects of proline introduction on protein stability // Proteins. 2006. Vol. 66, № 2. P. 480-491.

136. Higgins S.A., Ouonkap S.V.Y., Savage D.F. Rapid and Programmable Protein Mutagenesis Using Plasmid Recombineering // ACS Synth. Biol. 2017. Vol. 6, № 10. P. 18251833.

137. Ko S. et al. Engineered Arabidopsis Blue Light Receptor LOV Domain Variants with Improved Quantum Yield, Brightness, and Thermostability // J. Agric. Food Chem. 2019. Vol. 67, № 43. P.12037-12043.

138. Lin J.Y. et al. Optogenetic Inhibition of Synaptic Release with Chromophore-Assisted Light Inactivation (CALI) // Neuron. 2013. Vol. 79, № 2. P. 241-253.

139. Gushchin I., Gordeliy V. Microbial Rhodopsins // Membrane Protein Complexes: Structure and Function / ed. Harris J.R., Boekema E.J. Singapore: Springer Singapore, 2018. Vol. 87. P. 1956.

140. Ernst O.P. et al. Microbial and Animal Rhodopsins: Structures, Functions, and Molecular Mechanisms // Chem. Rev. 2014. Vol. 114, № 1. P. 126-163.

141. Chudakov D.M. et al. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues // Physiological Reviews. 2010. Vol. 90, № 3. P. 1103-1163.

142. Lambert T.J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database // Nat Methods. 2019. Vol. 16, № 4. P. 277-278.

143. Nienhaus G.U., Wiedenmann J. Structure, dynamics and optical properties of fluorescent proteins: perspectives for marker development // Chemphyschem. 2009. Vol. 10, № 9-10. P. 1369-1379.

144. Orozco-Gonzalez Y., Kabir M.P., Gozem S. Electrostatic Spectral Tuning Maps for Biological Chromophores // J. Phys. Chem. B. 2019. Vol. 123, № 23. P. 4813-4824.

145. Khrenova M.G., Nemukhin A.V., Domratcheva T. Theoretical Characterization of the Flavin-Based Fluorescent Protein iLOV and its Q489K Mutant // J. Phys. Chem. B. 2015. Vol. 119, № 16. P. 5176-5183.

146. Davari M.D. et al. Photophysics of the LOV-Based Fluorescent Protein Variant iLOV-Q489K Determined by Simulation and Experiment // J. Phys. Chem. B. 2016. Vol. 120, № 13. P. 3344-3352.

147. Khrenova M.G., Meteleshko Y.I., Nemukhin A.V. Mutants of the Flavoprotein iLOV as Prospective Red-Shifted Fluorescent Markers // J. Phys. Chem. B. 2017. Vol. 121, № 43. P. 10018-10025.

148. Mansurova M. et al. Spectroscopic and Theoretical Study on Electronically Modified Chromophores in LOV Domains: 8-Bromo- and 8-Trifluoromethyl-Substituted Flavins // ChemBioChem. 2013. Vol. 14, № 5. P. 645-654.

149. Bracker M. et al. Impact of fluorination on the photophysics of the flavin chromophore: a

quantum chemical perspective // Phys. Chem. Chem. Phys. 2019. Vol. 21, № 19. P. 9912-9923.

150. Marian C.M. et al. Photophysics of Flavin Derivatives Absorbing in the Blue-Green Region: Thioflavins As Potential Cofactors of Photoswitches // J. Phys. Chem. B. 2014. Vol. 118, № 7. P. 1743-1753.

151. Meteleshko Y.I., Nemukhin A.V., Khrenova M.G. Novel flavin-based fluorescent proteins with red-shifted emission bands: a computational study // Photochem. Photobiol. Sci. 2019. Vol. 18, № 1. P. 177-189.

152. Hoover D.M. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis // Nucleic Acids Research. 2002. Vol. 30, № 10. P. 43e-443.

153. Davis M.W., Jorgensen E.M. ApE, A Plasmid Editor: A Freely Available DNA Manipulation and Visualization Program // Front. Bioinform. 2022. Vol. 2. P. 818619.

154. Vagin A., Teplyakov A. Molecular replacement with MOLREP // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010. Vol. 66, № 1. P. 22-25.

155. Källberg M. et al. Template-based protein structure modeling using the RaptorX web server // Nat Protoc. 2012. Vol. 7, № 8. P. 1511-1522.

156. Emsley P. et al. Features and development of Coot // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010. Vol. 66, № 4. P. 486-501.

157. Murshudov G.N. et al. REFMAC 5 for the refinement of macromolecular crystal structures // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2011. Vol. 67, № 4. P. 355-367.

158. Finn R.D. et al. InterPro in 2017—beyond protein family and domain annotations // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № D1. P. D190-D199.

159. Matasci N. et al. Data access for the 1,000 Plants (1KP) project // GigaSci. 2014. Vol. 3, № 1. P. 17.

160. Hanada S. et al. Chloroflexus aggregans sp. nov., a Filamentous Phototrophic Bacterium Which Forms Dense Cell Aggregates by Active Gliding Movement // International Journal of Systematic Bacteriology. 1995. Vol. 45, № 4. P. 676-681.

161. Bhate M.P. et al. Signal Transduction in Histidine Kinases: Insights from New Structures // Structure. 2015. Vol. 23, № 6. P. 981-994.

162. Gushchin I., Gordeliy V. Transmembrane Signal Transduction in Two-Component Systems: Piston, Scissoring, or Helical Rotation? // BioEssays. 2018. Vol. 40, № 2. P. 1700197.

163. Larkin M.A. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. 2007. Vol. 23, № 21. P. 2947-2948.

164. Waterhouse A.M. et al. Jalview Version 2--a multiple sequence alignment editor and analysis workbench // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, № 9. P. 1189-1191.

165. Gleichmann T., Diensthuber R.P., Möglich A. Charting the Signal Trajectory in a Light-

Oxygen-Voltage Photoreceptor by Random Mutagenesis and Covariance Analysis // Journal of Biological Chemistry. 2013. Vol. 288, № 41. P. 29345-29355.

166. Lamb J.S. et al. Time-Resolved Dimerization of a PAS-LOV Protein Measured with Photocoupled Small Angle X-ray Scattering // J. Am. Chem. Soc. 2008. Vol. 130, № 37. P. 1222612227.

167. Röllen K. et al. Small-angle X-ray scattering study of the kinetics of light-dark transition in a LOV protein // PLoS ONE / ed. Kursula P. 2018. Vol. 13, № 7. P. e0200746.

168. Smolentseva A. et al. Extreme dependence of Chloroflexus aggregans LOV domain thermo- and photostability on the bound flavin species // Photochem Photobiol Sci. 2021. Vol. 20, № 12. P.1645-1656.

169. Pudasaini A. et al. Kinetics of the LOV domain of ZEITLUPE determine its circadian function in Arabidopsis // eLife. 2017. Vol. 6. P. e21646.

170. Liebschner D. et al. Polder maps: improving OMIT maps by excluding bulk solvent // Acta Crystallogr D Struct Biol. 2017. Vol. 73, № 2. P. 148-157.

171. Rivera-Cancel G. et al. Full-length structure of a monomeric histidine kinase reveals basis for sensory regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014. Vol. 111, № 50. P. 17839-17844.

172. Lokhandwala J. et al. Structural Biochemistry of a Fungal LOV Domain Photoreceptor Reveals an Evolutionarily Conserved Pathway Integrating Light and Oxidative Stress // Structure. 2015. Vol. 23, № 1. P. 116-125.

173. Rinaldi J. et al. The ß-Scaffold of the LOV Domain of the Brucella Light-Activated Histidine Kinase Is a Key Element for Signal Transduction // Journal of Molecular Biology. 2012. Vol. 420, № 1-2. P. 112-127.

174. Porebski B.T., Buckle A.M. Consensus protein design // Protein Engineering, Design and Selection. 2016. Vol. 29, № 7. P. 245-251.

175. Tang K.-H. et al. Complete genome sequence of the filamentous anoxygenic phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus // BMC Genomics. 2011. Vol. 12, № 1. P. 334.

176. Gaisin V.A. et al. Chloroflexus islandicus sp. nov., a thermophilic filamentous anoxygenic phototrophic bacterium from a geyser // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017. Vol. 67, № 5. P. 1381-1386.

177. Goncharov I.M. et al. High-resolution structure of a naturally red-shifted LOV domain // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2021. Vol. 567. P. 143-147.

178. Remeeva A. et al. Effects of Proline Substitutions on the Thermostable LOV Domain from Chloroflexus aggregans // Crystals. 2020. Vol. 10, № 4. P. 256.

179. Song X. et al. Engineering a More Thermostable Blue Light Photo Receptor Bacillus subtilis YtvA LOV Domain by a Computer Aided Rational Design Method // PLoS Comput Biol

/ ed. Nilges M. 2013. Vol. 9, № 7. P. e1003129.

180. Remeeva A. et al. Insights into the mechanisms of light-oxygen-voltage domain color tuning from a set of high-resolution X-ray structures // Proteins. 2021. Vol. 89, № 8. P. 10051016.

181. Sooriyaarachchi S. et al. Targeting an Aromatic Hotspot in Plasmodium falciparum 1-Deoxy- D -xylulose-5-phosphate Reductoisomerase with ß-Arylpropyl Analogues of Fosmidomycin // ChemMedChem. 2016. Vol. 11, № 18. P. 2024-2036.

182. Röllen K. et al. The molecular basis of spectral tuning in blue- and red-shifted flavin-binding fluorescent proteins // Journal of Biological Chemistry. 2021. Vol. 296. P. 100662.

183. Li S., Hong M. Protonation, Tautomerization, and Rotameric Structure of Histidine: A Comprehensive Study by Magic-Angle-Spinning Solid-State NMR // J. Am. Chem. Soc. 2011. Vol. 133, № 5. P. 1534-1544.

184. Polverini E., Schackert F.K., Losi A. Interplay among the "flipping" glutamine, a conserved phenylalanine, water and hydrogen bonds within a blue-light sensing LOV domain // Photochem. Photobiol. Sci. 2020. Vol. 19, № 7. P. 892-904.

185. Kabir M.P., Orozco-Gonzalez Y., Gozem S. Electronic spectra of flavin in different redox and protonation states: a computational perspective on the effect of the electrostatic environment // Phys. Chem. Chem. Phys. 2019. Vol. 21, № 30. P. 16526-16537.

186. Nemukhin A.V. et al. Computational Challenges in Modeling of Representative Bioimaging Proteins: GFP-Like Proteins, Flavoproteins, and Phytochromes // J. Phys. Chem. B. 2019. Vol. 123, № 29. P. 6133-6149.

187. Stephenson R.C., Clarke S. Succinimide formation from aspartyl and asparaginyl peptides as a model for the spontaneous degradation of proteins // J Biol Chem. 1989. Vol. 264, № 11. P. 6164-6170.