Идентификация жиров животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.08, кандидат ветеринарных наук Глебов, Роман Игоревич

• Глебов, Роман Игоревич
• кандидат ветеринарных наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Глебов, Роман Игоревич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гигиеническая характеристика жиров

1.2. Ветеринарно-санитарная экспертиза пищевых животных

жиров

Определение триацилглицеринового состава животных жиров

1.3 Методы анализа триацилглицеринов

1.3.1 Методы выделения и очистки фракции ТАГ

1.3.2 Капиллярная газожидкостная хроматография

1.3.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография

1.3.4 Методы получения "узких" фракций ТАГ из природных жиров

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

2.1.1 Материалы для изучения

2.1.2 Изучение эффективности растворителей и их смесей

для экстракции ТАГ

2.1.3 Определение общей суммы липидов

2.1.4 Выделение фракции триацилглицеринов из общих липидов

2.1.5 Определение жирно-кислотного состава фракций ТАГ

2.1.6 Определение молекулярных видов ТАГ методом ВЭЖХ

2.1.7 Идентификация молекулярных видов ТАГ

2.1.8 Дополнительные расчеты для программы идентификации

ТАГ и оценки хроматографических параметров системы

2.1.9 .Графические методы сравнения молекулярного

спектра ТАГ животных жиров

2.1.10 Определение суммарного пула ТАГ и

степени его очистки

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Эффективность растворителей и их смесей для экстракции ТАГ

3.2 Общее содержание липидов в исследованных образцах

3.3 Определение молекулярных видов ТАГ методом ВЭЖХ

3.4 Молекулярный спектр триацилглицеринов животных жиров

3.5 Анализ триацилглицеринового спектра

животных жиров графическим способом

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6. ВЫВОДЫ

7 . СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

ТАГ - триацилглицерины

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЖХ - газожидкостная хроматография ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты ПСК - показатели состава и качества

ТН ВЭД СНГ - товарная номенклатура внешнеэкономической деятельности Содружества независимых государств ЖК - жирная кислота

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация жиров животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии»

ВВЕДЕНИЕ

Качество и ветеринарное, состояние продуктов животноводства при их производстве в хозяйствах, на предприятиях по переработке, в местах хранения и реализации контролируют ветеринарные специалисты. Правильная организация и обязательный ветеринарно-санитарный контроль обеспечивают выпуск экологически чистых продуктов высокого санитарно-гигиенического качества.

Статистическая информация об объемах мировой торговли жирами и маслами животного и растительного происхождения наглядно показывает, что данный сектор мировой экономики проявляет стабильную тенденцию к росту продажи. По данным бюллетеня "Таможенная статистика внешней торговли Российской Федерации" за 1997г., экспорт в Россию масел и жиров в этот период составил 1.140.200 т на общую сумму 652.033,3 тыс. долл. США, из них на долю животных жиров пришлось 11.27 6 т на общую сумму 6.144,2 тыс. долл. США.

Значительный и постоянно увеличивающийся объем потребления масел, жиров и родственных им продуктов и, как следствие, большие возможности для получения стабильной и долговременной прибыли, агрессивная конкурентная борьба - косвенные причины, приведшие к появлению на рынке фальсифицированных жировых продуктов.

Действующие в настоящее время в России нормативные документы и применяемые аналитические методы идентификации, основанные на определении физико-химических характеристик исследуемых объектов, не позволяют достаточно точно классифицировать жировые продукты, оценить их пищевую ценность и выявить случаи фальсификации. Поэтому возникла необходимость

разработать методы достоверной идентификации природы и характеристического компонентного состава жировых продуктов, основанные на результатах определения состава жирных кислот и анализа молекулярных форм триацилглицеринов.

Вопреки традиционному мнению, роль жиров в питании не ограничивается их энергетической ценностью. Животные жиры содержат биологически активные вещества: витамины А и Е, антиоксиданты, незаменимые жирные кислоты, стерины,

углеводороды. Химический состав многих компонентов важнейших пищевых жиров до настоящего времени изучен недостаточно полно. Это в первую очередь касается триацилглицеринов, что связано с несовершенством существующих методов их разделения и идентификации. Имеющиеся многочисленные данные о жирно-кислотном составе жиров (известны видовые особенности состава жирных кислот большинства пищевых жиров) не могут отражать структуры индивидуальных ТАГ, так как сочетание жирных кислот в них весьма разнообразно. Основные и минорные виды ТАГ в животных жирах определяют ряд физиолого-биохимических характеристик, связанных с утилизацией жиров в организме: скоростью всасывания, формирование определенных эндогенно-образованных видов ТАГ, их метаболизм и др. С биологической и медицинской точек зрения небезразлично, в какие молекулярные виды ТАГ потребляемых жиров входят, например, коротко- и среднецепочечные жирные кислоты, являющиеся энергетически важными, особенно для детей раннего возраста, для больных, страдающих тучностью, и спортсменов; жирные кислоты, являющиеся предшественниками простагландинов (20:4ю6, 20:5соЗ и др.); миристиновая, обладающая наибольшей способностью индуцировать гиперхолестеринемию, что является

фактором риска для лиц, предрасположенных к атеросклерозу; докозагексаеновая (22:бсоЗ), являющаяся эссенциальной для детей раннего возраста и входящая в липидные структуры мозга. Понимание биохимических основ метаболизма индивидуальных ТАГ необходимо для разработки научно обоснованной диетотерапии болезней, при которых нарушается обмен липидов. В промышленных жирах (маргарины, саломасы, кулинарные жиры и др.)г для изготовления которых используют гидрирование или

переэтерификацию определенных исходных продуктов, изучение ТАГ состава также является необходимым для сравнения образующихся ТАГ с индивидуальными ТАГ в нативных "традиционных" маслах и жирах.

Для анализа индивидуальных ТАГ в жирах разработаны физико-химические и биохимические методы. Все они включают этап хроматографического разделения [58, 67, 69, 70, 82, 83, 96, 97, 104, 118] с последующей идентификацией. Рассматривая современное состояние проблемы анализа индивидуальных ТАГ, представлялось целесообразным модифицировать и усовершенствовать, главным образом, процесс их идентификации [8, 14-28]. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлась разработка метода идентификации (определения видовой принадлежности) жиров животного происхождения, основанного на применении

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для достижения поставленной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Дать оценку точности методов определения видовой принадлежности жира путем изучения физико-химических свойств и состава жирных кислот триацилглицеринов.

2. Изучить эффективность и экстрагирующую способность растворителей и их смесей для экстракции фракции триацилглицеринов.

3. Разработать программу идентификации индивидуальных ТАГ с помощью ЭВМ.

4. Изучить триацилглицериновый состав гусиного, куриного, утиного, свиного, говяжьего, бараньего жиров и жира кролика методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с многоканальным УФ-детектированием.

5. Разработать основные критерии, позволяющие проводить идентификацию и ветеринарно-санитарную оценку качества жиров, импортируемых на таможенную территорию России.

6. Разработать методические рекомендации по анализу мультикомпонентного состава жиров, включающего в себя определение видовой принадлежности, определение наличия гидроперекисей и сопряженных двойных связей, определение содержания витаминов и стеролов.

7. Внедрить в Центральной таможенной лаборатории ГТК России, и региональных таможенных лабораториях ГТК России разработанные методические рекомендации.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Условия подготовки жиров, масел и родственных им продуктов для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

2. Идентификация и определение показателей пищевой и биологической ценности жиров животного происхождения;

3. Создание коллекции хроматограмм жиров различных животных и птицы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гигиеническая характеристика жиров

Общие свойства жиров

Жиры растительного и животного происхождения не являются однородными и химически чистыми веществами, а представляют собой смесь сложного состава, в которой наряду с основным компонентом-сложными эфирами жирных кислот и глицерина (собственно жирами) присутствуют различные минорные компоненты, рассматриваемые как примеси к жиру. К числу примесей относятся воски, стеролы (стерины) и их эфиры, фосфолипиды, свободные жирные кислоты, пигменты, жирорастворимые витамины, смолы, слизистые и белковые вещества и пр. Восками называют соединения типа сложных эфиров, образуемых жирными кислотами и одноатомными высокомолекулярными спиртами. К воскоподобным веществам относят также и высшие алифатические углеводороды (парафины). Стеролы (стерины) являются алициклическими спиртами, относящимся к замещенным циклопентанопергидрофенантрена. Фосфолипиды (фосфатиды)

представляют собой сложные эфиры глицеридов и фосфорной кислоты (свободной или этерифицированной азотистым основанием). В числе пигментов встречаются хлорофилл, каротин, ксантофилл и госсипол. Все жиры обладают рядом общих свойств, а именно: они легче воды, имеют удельный вес в пределах от 0,9 до 0,98 (за исключением жира, именуемого японским воском, удельный вес которого при температуре 15 °С составляет 0,963—1,006); на бумаге оставляют жирное пятно, не исчезающее при нагревании, обладают значительной вязкостью, вызывающей ощущение жирности на ощупь. В

воде жиры не растворимы, в присутствии же белковых, слизистых веществ или щелочей образуют с водой эмульсию. Жиры легко растворимы в органических растворителях, например в этиловом эфире, сероуглероде, бензине, хлороформе, четыреххлористом углероде, трихлорэтилене, дихлорэтане и пр. Жиры имеют низкую летучесть и при повышенной температуре разлагаются.

Температура, при которой начинается разложение, для разных жиров неодинакова и находится в пределах 250—300°С. Жиры загораются с трудом, но с фитилем горят легко, образуя светящееся пламя. Температура воспламенения для большинства жиров выше 300 °С [15] .

Значение жиров для животных организмов

Жир животных отлагается в жировой ткани, стенки клеток которой образованы коллагеном. Жиросодержащие ткани в животном организме располагаются в самых разнообразных местах: в подкожной клетчатке, между мышцами, вокруг некоторых внутренних органов. Жир входит в состав костного мозга и участвует в образовании нервной ткани. Обладая высокой энергетической ценностью, жир имеет большое значение для животного организма. Жир, расположенный в подкожной клетчатке и покрывающий достаточно толстым слоем все тело хорошо упитанных животных, в особенности полярных, имеющих постоянную температуру крови (тюлень, морж, белый медведь, китообразные), является хорошим изолятором, предохраняющим организм от потери тепла. Этим объясняется способность упомянутых животных сохранять высокую температуру тела (+38, +40°С) при низкой температуре

окружающего воздуха (-40, -50°С). Кроме того, жир, находящийся

в соединительной ткани, заполняющей в брюшной полости

пространства между отдельными органами (около почек и др.), благодаря своей упругости и эластичности механически защищает (амортизирует) их от сотрясений и смещений. Как подкожный, так и внутренний жир являются основными резервами энергии, используемыми в момент наибольшего расхода ее организмом, поэтому они называются "жир-депо" [15] . Жир, входящий в состав костного мозга и нервной ткани, обычно не является запасом энергии, а непосредственно участвует в построении этих тканей. Этот вид жира по своему физиологическому назначению отличается от "жира-депо" и может быть назван "конституционным жиром". Конституционный жир расходуется только в исключительных случаях — в период усиленного голодания организма. Жиры разных видов животных организмов отличаются друг от друга по своему качественному составу. Например, жиры человека, кролика и зайца отличаются температурами плавления, которые обусловливаются свойствами входящих в них жирных кислот. Температура плавления жира взрослого человека 21°С, кролика 40°С, зайца 42°С. Жиры одного вида животных по своим физико-химическим свойствам более или менее постоянны. Однако свойства эти варьируют в зависимости от места отложения жира в организме животного, его возраста, а также условий питания. Многочисленные наблюдения показали, что жиры, отложенные в разных тканях животного или участвующие в строении их клеток, различны «по своему химическому составу, который зависит от физиологических функций органов и тканей, а также от температурных условий той области, где они отложены.

Классификация жиров

Все жироподобные вещества (липиды) подразделяются на следующие три группы: собственно жиры, являющиеся сложными эфирами жирных кислот и глицерина; воски — тоже сложные эфиры, но образуемые жирными кислотами с одноатомными и двухатомными высокомолекулярными спиртами, и липоиды — также сложные эфиры. Группу липоидов составляют фосфатиды и стерины. Каждая из указанных групп, в свою очередь, делится на подгруппы в зависимости от природы их происхождения. Установившиеся наименования некоторых жироподобных веществ иногда не соответствуют их химической природе. Это порождает неясность в определении их принадлежности к тому или иному классу. Например, японский воск представляет собой сложный эфир жирных кислот и глицерина, т.е. настоящий жир, а именуется воском. Шерстяной жир и спермацетовое масло по химической природе являются восками. Наряду с принятыми для этой группы органических соединений наименованиями некоторые из них, в частности жиры растительного происхождения и молочный жир, имеют и другое название — масла. В основу классификации жиров положен признак их происхождения; каждую группу подразделяют на подгруппы в зависимости от консистенции жиров; и, наконец, каждая из этих подгрупп в зависимости от физико-химических особенностей ее представителей распадается на ряд более мелких. По происхождению жиры разделяют на две основные группы: растительные и животные. И в тех и в других в качестве примеси находятся незначительные количества высокомолекулярных спиртов, именуемых стеролами (стеринами), причем в жирах растительного происхождения

присутствует от 0,1 до 0,3% фитостеролов (бета-ситостерины, стигмастерины и др.), имеющих определенную кристаллическую структуру и плавящихся при температуре 135—14 0°С. В животных жирах стерины представлены в основном холестерином в количествах, не превышающих долей процента, с температурой плавления 14 7,5°С. Поэтому примесь животного жира в растительном, а также растительного в животном легко может быть обнаружена по структуре кристаллов стеринов при микроскопировании неомыляемой части жира. По содержанию твердых ацилглицеринов жиры растительного и животного происхождения подразделяют на жидкие и твердые. Жидкие жиры в свою очередь делятся на подгруппы в зависимости от степени ненасыщенности жирных кислот, участвующих в их образовании, или от наличия в их составе оксикислот. Твердые жиры также распадаются на подгруппы в зависимости от присутствия в их составе летучих жирных кислот. Жидкие растительные жиры (масла) делятся на невысыхающие, полувысыхающие, высыхающие и масла рицинолевой кислоты. Животные жидкие жиры подразделяют на жидкие жиры наземных животных и жидкие жиры морских животных и рыб. Жидкие жиры наземных животных содержат большое количество олеиновой кислоты.

Представителем этой подгруппы является копытный жир. В состав жидких жиров морских животных (ворвань) и рыб входят высоконенасыщенные жирные кислоты, например клупанадоновая. Последнюю подгруппу, в свою очередь, подразделяют на следующие: а) - печеночные жиры, содержащие в своем составе значительное количество холестерина; примером печеночного жира может служить тресковый жир; б) жиры морских млекопитающих и целых рыб, содержащие холестерин в меньших размерах, чем печеночные:

китовый, дельфиний и другие жиры. Животные твердые жиры встречаются только у наземных животных. Они подразделяются на жиры, не содержащие ацилглицеринов летучих жирных кислот, и жиры, содержащие, кроме ацилглицеринов высших жирных кислот, и ацилглицерины летучих жирных кислот. К жирам, не содержащим ацилглицерины летучих жирных кислот и имеющим в своем составе главным образом ацилглицерины стеариновой и пальмитиновой кислот, относится большинство твердых жиров. Жиры этой подгруппы часто именуют салом. В эту подгруппу входит говяжье, баранье и свиное сало. К жирам, содержащим в своем составе, кроме ацилглицеринов высших жирных кислот, также ацилглицерины летучих жирных кислот, относят молочный жир [15].

Составные части жиров

Все жиры растительного и животного происхождения, как твердые, так и жидкие, представляют собой смеси сложных эфиров (ацилглицеринов). Таким образом, основными составными частями жиров являются жирные кислоты и глицерин, этерифицированный первыми в сложный эфир. Так как на долю общей составной части жиров — глицерина — приходится в среднем около 10%, то, очевидно, все разнообразие в свойствах ацилглицеринов зависит от химического состава образующих их жирных кислот.

Ацилглицерины

Долгое время жиры рассматривались как смеси простых однокислотных ацилглицеринов, т. е. таких, в молекулах которых глицерин связан с одной какой-либо жирной кислотой, например с стеариновой в тристеарине, с олеиновой в триолеине. Согласно такому представлению содержание триацилглицеринов в смеси

должно быть пропорционально количеству отдельных жирных кислот, входящих в состав данного жира. Такой взгляд на природу жиров долгое время господствовал, но затем был опровергнут, так как в природных жирах были найдены не только однокислотные, но и смешанные (многокислотные) триацилглицерины, в которых молекула глицерина соединена с различными жирными кислотами. Общая формула триацилглицеринов приведена на схеме 1.

О

II

О СН2—О—С—

Кг С ° (!И °!

СН2—О—С—Кз

Схема 1. Общая формула ТАГ,

где К, Ы' и К" - возможные радикалы

Учитывая только нативные жирные кислоты (ЖК), возможных вариантов ТАГ могут быть тысячи.

Молекулярные типы ТАГ характеризуются определенными ацильными остатками у каждого атома углерода в эп -1, 2, 3 положении, а ЖК в эп-2 положении. В зависимости от длины углеродной цепи ЖК, ТАГ делятся на длинно-, средне- и короткоцепочечные (согласно международной аббревиатуре соответственно МСТ, БСТ) . Такое деление обусловлено

различием в путях метаболизма и биологической роли каждого из указанных видов ТАГ. Жиры, выделенные из зрелых семян и плодов или из свежедобытых жиросодержащих тканей животного

происхождения, обычно являются нейтральными, т.е. полными эфирами, не имеющими продуктов распада, ди- и

моноацилглицеринов, глицерина и свободных жирных кислот. Но так как во всех тканях животного и растительного происхождения всегда присутствуют ферменты и в том числе липаза, то в

известных условиях он может вызвать расщепление жира, в результате чего в нем окажутся продукты распада. Наибольшее значение имеют свойства ацилглицеринов пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, линоленовой и рицинолевой кислот. Так как первые две при обычной температуре являются твердыми кислотами, а остальные жидкими, то от количественного соотношения входящих в триацилглицерины кислот, а также от порядка сочетания их в молекуле ацилглицерина, будут зависеть температуры плавления последних и самих жиров. Установлено, что однокислотные триацилглицерины имеют температуру плавления более высокую, чем кислоты, их образующие. Смеси ацилглицеринов плавятся при более низкой температуре, чем высокоплавкий компонент смеси, а в ряде случаев даже при более низкой, чем температура плавления низкоплавкого компонента. Наличие гидроксильных групп в молекуле повышает температуру плавления. Так, моноацилглицеринам свойственна более высокая температура, чем диацилглицеринам той же кислоты, а у диацилглицеринов она несколько выше, чем у триацилглицеринов соответствующей кислоты. Для многих ацилглицеринов характерным признаком является существование двух точек плавления. Например, тристеарин,

выделенный из растворителя или полученный медленным охлаждением из расплавленного состояния, имеет температуру плавления 71,6—73,2°С. При быстром охлаждении расплавленного тристеарина и вторичного определения температуры плавления у этого образца наблюдается следующее: вначале он плавится при 55,5 °С, затем в нем наступает помутнение вследствие кристаллообразования и, наконец, при температуре 71,6°С он опять переходит в жидкое состояние, становясь прозрачным. Для всех

ацилглицеринов как сложных эфиров характерна реакция омыления. Кроме того, они характеризуются теми же свойствами, которые присущи жирным кислотам, входящим в их состав.

Вещества, сопутствующие жирам

Фосфатиды (фосфолипиды)

Фосфатиды являются веществами, весьма близко стоящими к жирам. Общая формула для глицерофосфолипидов приведена на схеме 2.

О

II

о н2с — а—с—^

II I

Иг С—О—€11 О

I II

Н2С— О— Р —О—Из О

Схема 2. Глицерофосфолипид, где и Я2 - радикалы высших жирных кислот,

К3 - радикал азотистого соединения Молекула фосфатидов построена по следующей схеме: глицерин этерифицирован жирными кислотами и фосфорной кислотой, а последняя соединена с азотистым основанием. Фосфатиды встречаются как в растительных, так и в животных организмах. Из всех известных до сих пор фосфатидов наиболее изучен лецитин. Молекулы лецитина по своему строению имеют большое сходство с ацилглицеринами. В молекуле лецитина две гидроксильных группы глицерина этерифицированы двумя молекулами жирных кислот; одна из них обычно является кислотой непредельной (чаще всего олеиновой). Третий гидрофильный остаток находится в соединении с фосфорной кислотой, которая в свою очередь связана с азотистым

основанием — холином. В зависимости от того, с какой гидроксильной группой глицерина будет связана фосфорная кислота, различают а- и /?-лецитин. Лецитину принадлежит весьма важная физиологическая роль в жизненных процессах, связанная с проницаемостью клеточных мембран. В яичном желтке содержится от 9 до 10% фосфолипидов, в мозговом веществе (быка) — до 6%, в молочном жире — от 1,2 до 1,4%.

Пигменты жиров

Ввиду отсутствия хромофорных групп все ацилглицерины в чистом виде бесцветны. Свойственная природным жирам та или иная окраска обусловливается присутствием в них жирорастворимых пигментов — хлорофилла, каротина и ксантофилла. В процессе извлечения жира сопутствующие пигменты переходят в него путем непосредственного растворения в жире или в экстракционных растворителях. Хлорофилл — наиболее распространенный зеленый пигмент растений, растворимый в спиртах, эфире и жирах. Наряду с хлорофиллом в спиртовых вытяжках из зеленых листьев находятся также такие полиеновые пигменты как каротин, ксантофилл и др. Каротин — оранжевый пигмент, придающий окраску многим жирам как растительного, так и животного происхождения. Каротин легко растворяется в органических растворителях, особенно хорошо в бензоле и хлороформе; также растворяется он в серной кислоте, вызывая индигово-синее окрашивание. Легко окисляется на воздухе, поглощая до 4 0% кислорода от своего веса; в больших концентрациях встречается в корне моркови. Каротину изомерен ликопин, пигмент плодов томата. Каротин является провитамином А. Ксантофилл — желтый пигмент, являющийся продуктом окисления

каротина. Он также сильно поглощает кислород воздуха. Ксантофилл не растворяется в петролейном эфире, вследствие чего легко может быть отделен от каротина.

Воски

Воски представляют собой высшие алифатические сложные эфиры растительного и животного происхождения, по некоторым физико-химическим свойствам напоминающие жиры. В отличие от жиров в образовании восковых эфиров глицерин не участвует. В состав восков также входят свободные жирные кислоты, спирты и в значительных количествах высшие углеводороды (парафины). Общие формулы восков приведены на схеме 3.

О

II

И—О—С—К'; К—СН—СН2—О—С—К'

II I

О О—С—К"

II

о

Схема 3. Общие формулы восков, где К, К.' и К" - возможные радикалы

Воски подразделяются по происхождению на животные и растительные, а по консистенции - на твердые и жидкие. К последним относятся воски только животного происхождения. Некоторые виды животных восков являются продуктами выделения, в частности овечий жиропот. К категории выделяющихся наружу относятся также воски, получаемые от пчел. К воскам животного происхождения, образующим совместно с жиром большие скопления во внутренних полостях организма относится спермацет. Он

представляет собой прозрачную воскообразную массу. Добывается в больших количествах из головы кашалота.

Витамины

Витамины являются веществами, регулирующими сложные

физиологические и биохимические процессы в организме. Отсутствие витаминов или их недостаточность вызывают различные

заболевания. Витамины подразделяются на две подгруппы:

гидровитамины, растворимые в воде, и липовитамины, растворимые в жирах и растворителях жиров. К жирорастворимым витаминам относятся — витамин А — фактор роста и антиксерофтальмический; витамин Б — антирахитический фактор, витамин Е — фактор воспроизводства и витамин К — антигеморрагический фактор. Витамины, сопутствующие жирам: А, В, Е, К. Ветеринарно-санитарная экспертиза пищевых животных жиров

Роль ветеринарно-санитарного контроля при экспертизе животных жиров в первую очередь заключается в идентификации жиров (определение видовой принадлежности жира) и проверке их качества. Для большинства жиров известны предельные величины показателей состава и качества, представляющих собой усредненные характеристики, обусловленные составом ацилглицеринов жиров, жирных кислот и их строением, а также содержанием сопутствующих ацилглицеринам веществ. Сравнение величин показателей состава и качества (ПСК), найденных экспериментально, со стандартными, как правило, дает возможность идентифицировать неизвестный жир и оценить его качество. Показатели, характеризующие качество жиров, и методы их исследования приведены, обычно, в соответствующих нормативных документах (ГОСТах, технических

условиях на продукцию, и т.д.). Ветеринарных специалистов интересуют, в первую очередь, возможность определения на начальных этапах важнейших показателей порчи - гидролиза и окисления. Идентификация жира - более сложная задача. При идентификации жира требуется определение целого ряда физических и химических показателей (констант для данного вида жира), а именно: плотности, рефракции (коэффициента преломления), температур плавления и застывания, титра, числа омыления, йодного числа. Затем по справочным данным находят жиры, у которых ПСК близки к найденным экспериментально для данного образца жира. Если упомянутых показателей недостаточно для достоверной идентификации неизвестного образца жира, продолжают определение других типичных ПСК: состава жирных кислот, содержания трансизомеризованных ненасыщенных жирных кислот, числа Рейхерта-Мейссля, числа Поленске, содержания характерных сопутствующих веществ, состава молекулярных форм триглицеридов (ацилглицеринового состава). Методы анализа триацилглицеринов Методы выделения и очистки фракции ТАГ

Подготовка к анализу образца, содержащего триацилглицерины, может включать различные операции, зависящие от природы объекта, количества в нем триацилглицеринов, используемого метода определения, целей, исследования. Традиционные способы выделения фракции ТАГ, ее очистки изложены во многих оригинальных работах, монографиях и практических руководствах [6, 15, 23, 28, 44, 90, 106] .

Первым шагом в анализе является выделение фракции ТАГ из исходного образца и характеристика жирных кислот, входящих в состав ТАГ.

Полное извлечение ТАГ из тканей, биологических объектов, реакционных смесей или других объектов легко выполнимо с применением стандартных методов экстракции [101].

Экстракция смесью хлороформ-метанол наиболее предпочтительна для извлечения липидов [61] .

Разделение липидной фракции при помощи колоночной хроматографии на флоризиле или ТСХ на силикагеле позволяет получить фракции moho-, ди-, три- ацилглицеринов, а также свободных жирных кислот, эфиров холестерина, фосфолипиды.

Любая из этих операций сопровождается определенными потерями, неодинаковыми для различных ТАГ, так как степень извлечения индивидуальных триацилглицеринов зависит от природы ацильных групп, входящих в их состав (длины углеродных цепей, числа двойных связей, наличия разветвлений и др. ) и может существенно колебаться [14]. В связи с этим наиболее предпочтительными растворителями ТАГ являются хлороформ, пропионитрил, хлористый метилен, гексан и др. или их смеси. При этом ТАГ с насыщенными высшими кислотами плохо растворяются даже в слабо полярных системах [28, 4 9].

Увеличение температуры повышает растворимость ТАГ при использовании всех видов растворителей.

При анализе неочищенных проб следует учитывать возможность переэтерификации moho-, ди- и триацилглицеринов, что может искажать результаты определения [76] .

При непосредственном введении раствора образца в жидкостной хроматограф нужно иметь в виду, что использование неспецифических детекторов может приводить к погрешностям. Так, эфиры холестерина, как правило, содержащиеся в анализируемых объектах в существенных количествах, дают ложные пики ТАГ. Моноацилглицерины в большинстве случаев не мешают определению, так как существенно отличаются от ТАГ по своей хроматографической подвижности. Значительные количества диацилглицеринов могут затруднять идентификацию полученных хроматограмм [115].

Препаративная или полупрепаративная ВЭЖХ с предварительным сбором фракций ТАГ также может служить эффективным методом [137]. При определении состава индивидуальных ТАГ стадия очистки является обязательной не для всех образцов, но во всех случаях улучшает условия хроматографического разделения и упрощает идентификацию [59].

Большинство работ по анализу ТАГ связано с установлением жирно-кислотного состава, основанного на гидролизе ТАГ, получении эфиров образовавшихся жирных кислот и газохроматографическом определении последних. Жирно-кислотный состав является важной характеристикой многих липид-содержащих объектов, однако он не дает представления о том, какие индивидуальные ТАГ присутствуют в них.

Анализ молекулярных форм ТАГ является исключительно трудной проблемой, степень сложности которой возрастает с увеличением числа различных жирных кислот в образце. Даже без учета изомеров количество индивидуальных ТАГ с увеличением набора жирных кислот резко возрастает. Так, например, при наличии пяти кислот

число индивидуальных ТАГ будет равно 35, в случае восьми - 120. До настоящего времени ни для одного природного жира не удалось представить состав ТАГ, который включал бы не только все основные, но и минорные компоненты, а также различные стерео- и позиционные изомеры.

Для определения молекулярных форм ТАГ масел и жиров предложены различные хроматографические методы анализа. Использование ТСХ и различных вариантов колоночной хроматографии, ГЖХ на насадочных колонках в большинстве случаев не обеспечивает разделение индивидуальных ТАГ, содержащихся в природных объектах.

Капиллярная газо-жидкостная хроматография

В последние годы для более достоверной идентификации молекулярных форм ТАГ используют капиллярную ГЖХ, разрешающая способность и эффективность разделения которой по крайней мере на порядок выше, чем при ГЖХ на насадочных колонках. В ГЖХ разделение ТАГ происходит в порядке возрастания суммы углеродных атомов ТАГ (ЕСЫ). С увеличением эффективности колонок возможно также разделение ТАГ с одинаковым ЕСЫ, отличающихся по степени ненасыщенности. Такие разделения осуществлены на капиллярных колонках с неполярными силиконовыми жидкими фазами ОУ-1, БЕ-ЗО, ЭЕ-54 и др.

Ввиду низкой летучести ТАГ для их разделения необходимы высокие температуры колонок (до 350 °С). Прогресс в капиллярной ГЖХ индивидуальных ТАГ стал возможным благодаря применению высокотемпературных неподвижных фаз, представляющих собой полисилоксаны (метил-, метилфенил-, фенилцианометил- и др.), химически привитые к поверхности колонок. Такие колонки могут оставаться стабильными при рабочих температурах до 320-370°С, а в ряде случаев и выше [56]. Разделение индивидуальных ТАГ может быть осуществлено по углеродному числу, по числу ненасыщенных жирных кислот и по числу двойных связей в них.

В качестве колонок применяются кварцевые капилляры длиной от 5 до 25 м, внутренним диаметром около 0.3 мм и толщиной слоя сорбента до 0.25 мкм. Некоторые авторы рекомендуют использование коротких колонок около 5 м, считая, что в таких условиях потери ТАГ меньше из-за сокращения времени анализа при высоких температурах [105]. Следует отметить, что эффективность

укороченных капиллярных колонок снижена, что не позволяет использовать их для расшифровки ТАГ состава сложных природных объектов.

Большинство исследователей применяют в качестве газа-носителя водород, однако имеются сведения о возможности гидрирования двойных связей ТАГ в процессе анализа, в особенности для полиненасыщенных ТАГ с углеродным числом более 54 [105, 134]. Замена водорода на гелий устраняет опасность гидрирования, но по данным работы [75] затрудняет анализ, в частности, приводит к снижению чувствительности и к необходимости повышения температуры колонки. С увеличением температуры возрастают потери ТАГ вследствие их частичной деструкции в испарителе и в колонке [76, 115]. Высоконенасыщенные длинноцепочечные ТАГ могут претерпевать изменения, которые происходят при контакте с активными центрами поверхности испарителя, колонки, а также катализируются некоторыми хроматографическими фазами [56]. Кроме того, некоторые ТАГ даже при высоких температурах не испаряются полностью [76]. Указанные причины искажают картину триацилглицеринового состава анализируемого объекта и осложняют определение индивидуальных ТАГ. В связи с этим в анализе смесей ТАГ часто применяют так называемый "холодный ввод", когда вещество поступает непосредственно в капиллярную колонку или предколонку, выполняющую в этом случае функции испарителя [56]. Это исключает возможность дискриминации ТАГ по молекулярной массе. Однако, при таком варианте введения пробы возможны потери, например, из-за уноса части ТАГ из колонки интенсивно испаряющимися растворителями. Для осуществления "холодного

ввода" используются различные конструкции соответствующих узлов прибора и разные приемы введения образца (некоторое снижение температуры колонки, высокая скорость нагрева предколонки, медленное введение пробы и др.), позволяющие максимально снизить потери и обеспечивающие возможность определения ТАГ [77, 78, 85] . К недостаткам техники "холодного ввода" относят трудности автоматизации этого процесса [56].

Как правило, в ГЖХ триацилглицеринов используют пламенно-ионизационные детекторы (ПИД), реже - масс-спектрометры. Для ТАГ выявлены определенные зависимости между временами удерживания и числом атомов углерода, характерные для гомологических рядов. Полученные хроматограммы представляют собой последовательность семейств близко расположенных пиков ТАГ с одинаковыми числами углерода. В ряде случаев это облегчает идентификацию отдельных ТАГ в образце с учетом его природы и жирнокислотного состава. Вследствие высокой линейности отклика, ПИД удобен для проведения количественных определений индивидуальных ТАГ, однако, отсутствие селективности детектирования создает существенные трудности при установлении ТАГ состава сложных природных объектов [28]. В связи с этим особенно удобно использование в анализе ТАГ хромато-масс-спектрометров.

Изучены масс-спектры многих индивидуальных ТАГ, полученные ионизацией электронным ударом (70 эВ, температура ионного источника 170-250 °С [47, 111]). В них, в большинстве случаев, наблюдается неинтенсивный пик молекулярных ионов М+ (1% от максимального пика), чуть больше оказываются пик ионов (М-18)+ (потеря молекулы воды). Пик ионов, образующихся отщеплением ацилоксигрупп из М , а также пики ионов (13.00+74 ) (1300+115) +

интенсивностью приблизительно 10% от максимальной и серии гомологических ионов общей формулы (RCO+128 + 14п)+, которые соответствуют расщеплению двойных связей в ацильных группах ТАГ; интенсивность пиков ионов М+, (М-18)+ и ионов, включающих ацильные цепочки, падает, а интенсивность пиков осколочных ионов возрастает [47]. Следует отметить, что указанные закономерности хорошо различаются только в масс-спектрах чистых индивидуальных ТАГ. Для ТАГ с числом углеродных атомов более 54 интенсивность ионов М+ недостаточна для анализа [95] . В связи с этим более целесообразно применение масс-спектрометрии с химической ионизацией. При использовании в качестве газа-реагента аммиака [110] основными ионами в масс-спектре ТАГ являются (МН - RC02H)+, которые весьма удобны для идентификации жирных кислот, входящих в состав ТАГ. Достаточно интенсивен и пригоден для анализа также пик квазимолекулярных ионов (М + NH4) + [84] . При регистрации этих ионов удается в хроматографическом пике обнаружить и идентифицировать от 4 до 8 неразделенных ТАГ [95]. В качестве газа-реагента можно использовать метан [47, 98].

В ряде случаев масс-спектрометры применяют для детектирования и идентификации ТАГ, разделенных на насадочных колонках [56, 110, 111] . В этом случае не удается получать пики индивидуальных ТАГ, но, регистрируя ряд характеристических ионов, можно идентифицировать в каждом хроматографическом пике несколько различных ТАГ, имеющих равное углеродное число. Разделение проводят на коротких набивных (длина до 1 м) стеклянных колонках с хромосорбах, импрегнированных OV-1, SE-30 и др., с программированием температуры колонки от 140 до 310 °С или от 2 00 до 330 °С. Газом-носителем обычно служит гелий [56,

110, 111]. Однако, даже используя масс-спектрометры, не удается идентифицировать большинство минорных компонентов ТАГ природных объектов, а также их позиционные изомеры. Если учесть, что в сложных природных объектах, которыми являются, например, жиры рыб, идентифицировано 24 и более жирных кислот, в том числе с циклической и разветвленной структурой, то становится понятно, насколько сложна задача хроматографической идентификации ТАГ. Для ее решения используются любая информация о составе ТАГ исследуемого образца: литературные данные, результаты анализа другими методами, сведения о жирно-кислотном составе и др.

В ряде случаев для идентификации ТАГ их подвергают ферментативному гидролизу с помощью панкреатической липазы и фосфолипазы с последующим газохроматографическим анализом смеси образующихся жирных кислот, диацилглицеринов и

моноацилглицеринов в виде их метиловых, триметилсилиловых или других эфиров [47, 56, 112]. Этим же способом удается получить информацию о позиционном расположении жирных кислот в молекулах ТАГ.

Определение состава ТАГ в образце проводят методом внутренней нормализации, стандартом может являться какой-либо индивидуальный ТАГ, отсутствующий в образце [56] . Данные, характеризующие воспроизводимость анализа, приведенные в отдельных работах [84, 85, 105], свидетельствуют о том, что относительное стандартное отклонение (Sr) получаемых результатов существенно зависит от свойств жирных кислот, образующихся ТАГ (наличие и число двойных связей, длина цепочки и др.), а также от содержания индивидуального ТАГ в образце. Так, при определении ТАГ с большим числом двойных связей Sr может

достигать 0.24, а для насыщенных ТАГ не превышает 0.02 [85]. При содержании индивидуального ТАГ менее 1% Sr возрастает примерно до 0.1 [85]. В среднем при определении триацилглицеринового состава пищевых растительных масел, некоторых пищевых жиров и других биологических объектов Sr колеблется от 0.01 до 0.15 [84, 85, 105] .

Условия анализа смесей ТАГ различных объектов методом капиллярной ГЖХ приведены в таблице 1.

Высокотемпературная капиллярная ГЖХ в определенных условиях позволяет разделить ТАГ растительных масел, жиров и маргаринов и др. на основные и некоторые примесные компоненты. При этом следует иметь в виду возможные искажения, особенно в случае наличия ТАГ высоконасыщенных длинноцепочечных жирных кислот. Не рекомендуется использовать этот метод для установления триацилглицеринового состава жиров рыб. Неудовлетворительные результаты дает применение ГЖХ для определения индивидуальных ТАГ соевого, пальмового некоторых других масел. В то же время ТАГ масло какао и его заменителей, молочного жира и ряда других объектов, содержащих преимущественно насыщенные жирные кислоты, целесообразно определять методом ГЖХ [56].

Из вышесказанного можно сделать вывод, что, несмотря на высокую эффективность капиллярной ГЖХ (более 100000 теоретических тарелок), ограничение в применении при исследовании жиров и масел растительного и животного происхождения связаны с необходимостью использования высоких температур, что приводит к термической деструкции образцов и искажении количественных результатов исследований. Также

разделение, основанное на разнице в температурах кипения, не обеспечивает достаточной селективности.

Таблица 1

Условия анализа смесей триацилглицеринов методом газожидкостной хроматографии

Объект исследования Способ и условия введения пробы Размеры колонки, неподвижная фаза, толщина слоя Детектор, температура, способ ионизации Температурные условия разделения Литература

Смесь стандартных веществ В испаритель: 80-400 °С В испаритель: 350 °С и в колонку: «холодный ввод» 25 м / 0.32 мм, диметилсилоксан, 0.25 мкм 5 м / 0.31 мм, диметисилоксан, 0.17 мкм 25 м / 0.25 мм, метилфенилсилоксан (50% фенильных групп), 0.12 мкм ПИД, 400 °С ПИД Масс-спектрометр с хим. ионизацией 80 °С (1 мин) - 20 град/мин - 200 °С - 8 град/мин- 370 °С, гелий 180 °С - 8 град/мин - 340 °С (2 мин), водород 330 °С - 1.5 град/мин - 350 °С, водород 84 105 98

Соевое масло То же 17 м/ 0.32 мм, метилсилоксан, 0.16 мкм ПИД 340 °С - 2 град/мин - 350 °С, гелий 68

Масла: соевое, ореховое, высокоэруковое рапсовое, пальмовое, какао; жиры: свиной, лошадиный, молочный, говяжий То же 25 м / 0.25 мм, метилфенилсилоксан (50% фенильных групп), 0.12 мкм ПИД 330 °С - 1 град/мин - 355 °С, водород 56

Масла: какао (его заменители и эквиваленты), орехов (миндаля, арахиса, бразильского); смеси масел, шоколад, жир молочный В испаритель: 80-400 °С 25 м / 0.25 мм, метилфенилсилоксан , 0.12 мкм ПИД 330 °С - 2 град/мин - 355 °С, водород 85, 70, 69

Масла: орехов (миндаля, арахиса, кунжута, кокоса), сафлоровое, пальмовое, сои В испаритель: 50-400 °С 15 м/ 0.25 мм, метилсилоксан, 0.1 мкм, или 25 м / 0.25 мм, фенилсилоксан (65% фенильных групп) в смеси с полиимидом, 0.1 мкм ПИД, 425 °С 200 °С - 4 град/мин - 360 °С, водород 85

Масла: пальмовое, В колонку 25 м / 0.25 мм, метилфенилсилоксан ПИД 340 °С - 1 град/мин - 355 °С; 330 130

хлопковое, соевое, кукурузное, оливковое, кофе, рапсовое, кокосовое; жиры: цыплят, яичный, сливочный, маргарины (50% фенильных групп), 0.12 мкм °С - 1.5 град/мин - 350 °С и др. режимы, водород

Масла: сливочное, оливковое, соевое То же 25 м / 0.25 мм, метилфенилсилоксан (65% фенильных групп), 0.1 мкм пид 330 °С - 2 град/мин - 360 °С, азот 71

Молочный жир В испаритель: 40-290 °С 25 м / 0.25 мм, метилфенилсилоксан (50% фенильных групп) Масс-спектрометр с хим. ионизацией или электронным ударом 290 °С - 10 град/мин - 330 °С - 2 град/мин- 350 °С, водород 98

Молочный жир В колонку Юм/ 0.32 мм, силикон-5СВ пид 90 °С - 30 град/мин - 250 °С - 4 град/мин- 320 °С, гелий •104

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Учитывая вышеперечисленные недостатки капиллярной ГЖХ, одним из распространенных методов разделения триацилглицеринов стал метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это связано, прежде всего, со щадящими условиями анализа, что очень важно при изучении ТАГ состава природных объектов. Кроме того, используя различные варианты подвижных фаз, удается достичь высокой селективности при разделении, в значительной степени компенсирующей относительно низкую эффективность ВЭЖХ в сравнении с капиллярной ГЖХ [4 9] . Предпринимались попытки применения нормальнофазовой

адсорбционной ВЭЖХ для анализа ТАГ. Адсорбционная жидкостная хроматография дает хорошие результаты при разделении веществ с различными функциональными группами, однако, малопригодна для разделения гомологичных соединений. Ввиду недостаточной селективности нормальнофазовой адсорбционной ВЭЖХ в настоящее время для разделения ТАГ используется распределительная обращенно-фазовая ВЭЖХ.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ показала себя наиболее перспективным вариантом анализа молекулярных форм ТАГ природных объектов. Деление ТАГ происходит по эквивалентным углеродным числам (ЕС1Я), которые рассчитывают по формуле ЕСМ = С - 2пК, где С - суммарное число углеродных атомов (углеродное число); п - количество двойных связей в жирных кислотах; К - экспериментальный коэффициент, учитывающий условия разделения и состав элюента, величину и свойства частиц сорбента [64, 122]. Очевидно, что чем выше разрешающая способность хроматографической системы, тем при меньшей разнице в значениях ЕСЫ можно разделить индивидуальные ТАГ.

Как правило, используются колонки длиной 250 мм и диаметром 4.6 мм, заполненные силикагелем с привитыми алкилсиланами С8 -С18 [49, 58, 64, 71, 81, 82, 133]. Описано применение более коротких 80-100 мм [133] и более длинных колонок до 1 м [118], а также последовательное соединение двух одинаковых или различных колонок [64]. В последнем случае значительно возрастает продолжительность анализа, но увеличивается число разделенных компонентов. Эффективность разделения и емкость колонок возрастает при уменьшении размеров частиц сорбента. Лучшие результаты получают при среднем размере частиц 5 мкм. При использовании более дорогих колонок с размером частиц сорбента 3 мкм сокращается время анализа и повышается эффективность разделения. Использование колонок, заполненных сорбентом, с диаметром частиц более 10 мкм для анализа смесей индивидуальных ТАГ малоэффективно [133].

Эффективность разделения ТАГ на колонках, заполненных сорбентами с привитыми алкильными группами С18, выше, чем на сорбентах с группами С8. Однако в ряде случаев применение последних более целесообразно в связи со значительным сокращением продолжительности анализа, особенно для ТАГ с ECN более 48 [49] . В то же время использование С18-силикагеля для ион-парной хроматографии дает лучшие результаты ввиду более полного связывания активных центров силикагеля октадецилсиланами в таких колонках.

Применение детекторов различных видов имеет свои положительные стороны и недостатки. Использование УФ-детекторов обеспечивает высокую чувствительность анализа, однако, для выполнения определения необходимо введение поправочных

коэффициентов, учитывающих разную степень ненасыщенности ТАГ, так как при используемых в анализе длинах волн 203 - 237 нм вклад двойных связей в оптическую плотность в сравнении с эфирными связями является превалирующим [29, 32, 58, 67, 71]. При использовании УФ-детектора в дальней УФ области (200-220 нм) необходимо предварительное отделение возможных

хромофорсодержащих компонентов.

Для анализа смесей ТАГ используют детектор по поглощению ИК-излучения [114, 121, 135, 137]. Такой детектор отличается высокой чувствительностью, позволяет проводить градиентное элюирование, имеет универсальный молекулярный отклик для всех ТАГ и рекомендуется для полупрепаративных целей в ВЭЖХ триацилглицеринов [137].

Одним из наиболее часто применяемых универсальных детекторов ВЭЖХ является рефрактометр. Чувствительность рефрактометра ниже, чем УФ-детектора, однако он наиболее удобен для определения основных молекулярных видов ТАГ в маслах и жирах [64, 81, 123]. Имеются сведения, что рефрактометрический детектор уступает ИК-детектору по метрологическим характеристикам отклика ТАГ [137]. Недостатками рефрактометрического детектора являются

невозможность деления примесных компонентов и использования градиентного элюирования, а также значительная зависимость сигнала от температуры, колебаний состава подвижной фазы и скорости потока [50, 133]. Достоинством рефрактометра является малая зависимость сигнала от структуры (концентрационный детектор) и низкая чувствительность к микропримесям, что значительно снижает требования к предварительной очистке образца.

К универсальным детекторам относится и так называемый транспортный пламенно-ионизационный детектор, принцип действия которого аналогичен газохроматографическому [50, 115, 119, 128] . Сигнал транспортного ПИД слабо зависит от вида ТАГ, но несколько падает с увеличением ECN [115]. С помощью транспортного ПИД выполнены анализы различных искусственных смесей ТАГ: ООО, ООЕ, ОЕЕ и ЕЕЕ, в частности, разделены изомеры ТАГ ООЕ и ОЕЕ (О -олеиновая, Е - эллаидиновая кислоты). Кроме того, разделены 22 молекулярных вида ТАГ оливкового масла и других объектов [115]. Отмечается высокая чувствительность транспортных ПИД к ТАГ, позволяющая регистрировать эти соединения на уровне нанограммов [128] . К недостаткам транспортного ПИД следует отнести зависимость сигнала от скорости потока, плохую воспроизводимость результатов определения вследствие неполного сгорания вещества [50, 71]. Из-за возникающих при испарении потерь ТАГ линейность отклика такого ПИД соблюдается в интервале от 5 до 200 мкг (для трикаприна) и от 5 до 150 мкг (для триолеина) . Верхняя граница этого интервала определяется растворимостью ТАГ в элюенте и может быть увеличена при повышении температуры колонки [115].

Для разделения индивидуальных ТАГ предложены разнообразные системы растворителей [31, 60, 64, 67, 105, 115, 123]. Наиболее распространенными компонентами подвижных фаз являются нитрилы. Чистый ацетонитрил слишком полярен для элюирования ТАГ [115]. Наилучшие результаты достигаются при использовании пропионитрила [60, 64, 67, 123], хотя он не достаточно хорошо растворяет ненасыщенные длинноцепочечные ТАГ. Используют также смеси пропионитрила с эфиром [64], ацетонитрила с ацетоном [19-21, 31, 95, 120], тетрагидрофураном [49], этанолом и гексаном [81, 83],

изооктаном и изопропанолом [67], метилтретбутиловым эфиром [58] и др. Применение элюентов на основе метанола и хлороформа, метанола и воды приводит к значительно худшим результатам разделения, как правило, обеспечивая разделение только по целочисленным значениям ECN. Применяют как изократический [58, 95-97, 114, 132, 133], так и градиентный режимы элюирования [64, 83] . Последний прием оказывается полезным для отделения моно- и диацилглицеринов от ТАГ [94]. Используют различные скорости потока элюента от 0.5 до 2 мл/мин в зависимости от вязкости системы растворителей, размеров частиц сорбента и других факторов [49, 60, 92, 120, 123] . Оптимальная скорость потока элюента, состоящего из ацетонитрила, ацетона и тетрагидрофурана, для частиц сорбента размером 5 мкм близка к 1.5 мл/мин [49]. При ее увеличении до 2.2 мл/мин существенного снижения эффективности разделения индивидуальных ТАГ не происходит. При работе с тетрагидрофураном для предотвращения образования пероксидов необходимо использовать антиоксиданты, например бутилоксианизол [58], что значительно повышает оптическую плотность элюента и затрудняет использование УФ-детектора.

При разделении ТАГ существует опасность их неполного вымывания из колонки [49, 64, 133]. Это в первую очередь, связано с ограниченной растворимостью насыщенных ТАГ с длинноцепочечными жирными кислотами в большинстве применяемых подвижных фаз [99].

Существует два подхода к устранению этого явления: подбор оптимальных смесей растворителей или оптимальной температуры анализа. Введение в элюент более эффективных растворителей, таких как хлористый метилен или хлороформ [64], приводит к

ухудшению селективности. Подробно исследовано влияние добавок тетрагидрофурана на селективность разделения в случае применения в качестве элюента смеси ацетонитрил-ацетон [49] . Установлено, что с увеличением доли тетрагидрофурана (х) в системе ацетонитрил-ацетон-тетрагидрофуран [(62-х): 38:х] уменьшается время удерживания, особенно для ТАГ с высокими значениями ЕСЫ. При этом, однако, ухудшается разделение пиков ТАГ на хроматограмме. Авторы считают оптимальной концентрацию тетрагидрофурана - 4%. Для увеличения селективности разделения в случае применения системы ацетонитрил-тетрагидрофуран (60:40) те же исследователи вводили небольшие порции воды. Наилучший эффект для ТАГ с ЕСМ меньше 48 достигается при добавлении одной части воды. С увеличением потери их в колонке определение становится невозможным. Предложено также использовать влияние температуры на полноту элюирования ТАГ из колонки [64]. Значения температуры, считающиеся оптимальными для разделения индивидуальных ТАГ, в разных работах различны [49, 105]. Вероятно, это связано с различием растворимости ТАГ, условий анализа объектов исследования и др. Повышение температуры приводит к увеличению, ускорению выхода и улучшению формы пиков ТАГ, однако следствием этого является снижение селективности разделения [49, 64, 67, 133]. Оптимизируя температуру во время анализа путем ее программирования, можно подобрать наилучшие условия для вымывания насыщенных ТАГ с колонки и достаточно эффективного их разделения [64].

Большое влияние на разделение ТАГ оказывает объем и природа растворителя или смеси растворителей, в которых растворяется проба перед вводом в хроматограф. Предпринятое специальное

исследование доказало, что использование в качестве растворителя тетрагидрофурана обеспечивает хорошую форму пиков и достаточно полное разделение при введении не более 5 мкм пробы для колонок размером 250 / 4.6 мм. При анализе тугоплавких жиров не рекомендуется использовать ацетон, хотя для ТАГ с ЕСЫ менее 36 этот растворитель способствует образованию пиков наилучшей формы даже при больших объемах пробы (порядка 20 мкл) . Считается, что наилучшим растворителем пробы при определении ТАГ методом обращенно-фазовой ВЭЖХ является хлороформ [132].

Созданные в последние годы жидкостные хромато-масс-спектрометры нашли применение и в анализе смесей ТАГ. Использование в качестве детекторов масс-спектрометров при определении ТАГ более эффективно в жидкостной хроматографии, чем в ГЖХ [95]. Химическая ионизация в значительной степени облегчает структурную идентификацию ТАГ, позволяя регистрировать достаточно интенсивные квазимолекулярные ионы [95, 96, 107]. Для установления наличия позиционных изомеров ТАГ применяют хромато-масс-спектрометрический анализ продуктов энзиматического гидролиза, часто в форме их тетрабутилметилсилильных производных [96]. Жидкостные хромато-масс-спектрометры в настоящее время редки и их использование для рутинных анализов не вполне оправданно.

Одним из способов, позволяющих идентифицировать ТАГ при условии их полного разделения и достаточно высокого содержания, является их полупрепаративное выделение методом ВЭЖХ с последующим гидролизом, метилированием жирных кислот и определением методом ГЖХ [31, 19-21, 30]. Таким способом установлен, например, ТАГ состав ряда растительных масел:

оливкового, кукурузного, подсолнечного и др., в которых идентифицировано 11, 12 и 13 индивидуальных ТАГ соответственно [31]. Применяется также и избирательное ферментативное расщепление ТАГ в разделенных фракциях, получение производных -метиловых эфиров жирных кислот и тетрабутилдиметилсилильных производных соответствующих диацилглицеринов, определяемых далее с помощью ГЖХ [60] . Все эти способы весьма трудоемки и, как правило, пригодны для идентификации только основных ТАГ. Перспективным направлением в анализе ТАГ является разработка методов идентификации индивидуальных ТАГ на основе зависимости между их временем удерживания и структурой [19, 20, 27, 29, 30, 107]. Такие закономерности устанавливают с помощью определенного набора стандартов, рассчитывая ECN и логарифм относительного приведенного времени удерживания. Предполагая гомологичность ТАГ, считают, что каждая точка построенной кривой соответствует индивидуальному ТАГ с полученным значением ECN.

Предел обнаружения при анализе смесей индивидуальных ТАГ методом ВЭЖХ составляет от 250 нг до 3 мкг, а относительное стандартное отклонение колеблется в пределах 0.02 - 0.25 в зависимости от выбранных условий и от объекта анализа [27, 94, 115, 137].

Таким образом, обращенно-фазовая ВЭЖХ применяется для разделения и идентификации индивидуальных ТАГ природных объектов.

Одним из новых направлений в хроматографии, перспективным в плане разделения индивидуальных ТАГ, является сверхкритическая флюидная хроматография, основанная на одновременном

использовании высоких температур и давлений [124]. Подвижная

фаза (чаще суперкритическая двуокись углерода) при температуре более 170 °С и давлении выше 190 Па приобретает свойства сверхкритической жидкости, промежуточные между свойствами газа и жидкости. Основными преимуществами указанного вида хроматографии являются на порядок более высокий коэффициент массопереноса и более низкая вязкость сверхкритической жидкости. Преимуществом является также возможность широко варьировать полярность и растворяющую способность элюента изменением давления и температуры. Использование такой сверхкритической подвижной фазы в сочетании с капиллярными колонками с неполярными или слабополярными фазами обеспечивает быстрое и надежное разделение многих смесей ТАГ.

Условия анализа смесей ТАГ различных объектов методами ВЭЖХ приведены в таблице 2.

Таблица 2

Условия анализа смесей триацилглицеринов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Объект исследования Растворитель ТАГ-фракции Неподвижная фаза, размер частиц, размеры колонки Элюент, скорость потока (мл/мин) и температура колонки Детектор Литература

Смесь стандартных веществ Гексан- изопропанол (1:1) Хлороформ или метанол и их смеси Ацетон или тетрагидрофуран Нуклеосил С18, 5 мкм, 250 / 4.6 мм То же Вайдук RP, 3544 мкм, 1000/2 мм Хитачи-гель 3057, 3 мкм, 250/4 мм Ацетонитрил-ацетон (1:1), 1.78; 23 °С или метанол-ацетон (3:2); 2.5 Ацетонитрил-этанол-гексан (40:35:25), 22 °С Метанол-вода (90:10), 60 °С Этанол-ацетонитрил-вода (градиент), 0.8, 30 °С Рефрактометр УФ (220 нм) или рефрактометр Рефрактометр Послеколоноч-ный реакционный 82 81 118 137, 94

Смесь стандартных веществ, оливковое масло Зорбакс ODS, 5 мкм, 250 / 4.6 мм (2 колонки) или Зорбакс ODS, 3 мкм, 60 / 6.2 мм Ацетонитрил-хлористый метилен (градиент), 0.8 пид 115

Смесь стандартных веществ, масла: пальмовое, оливковое, подсолнечное, льняное, рапсовое, коровье, лошадиный жир Лихосфер 1000 СН-18/3, 5 мкм, 250 / 4.6 мм (1 или 2 колонки) Ацетонитрил-хлороформ (51:49 или градиент), 0.7-1 или Ацетонитрил-хлористый метилен (градиент) Лазерный или пид 115

Смесь стандартных веществ, масла: соевое и в смеси с кокосовым Гексан- изопропанол (1:1) Лихосфер RP-100, 5 мкм, 250/4.6 мм Ацетонитрил-этанол-гексан (градиент), 1.0 То же 83

Масла: какао, кукурузное, хлопковое, рапсовое, соевое, подсолнечное, сафлоровое, лесного ореха RSÜC18HL, 5 мкм, 250/ 4.6 мм Пропионитрил, 14 °С УФ (215 нм) 67

Смесь стандартных веществ, коровье масло Хлороформ Лихосфер 100 СН-18/2, 5 мкм, 250 / 4 мм + RP-18/7 мкм, 150/3.2 мм Ацетонитрил-ацетон (градиент), 40 °С Рефрактометр, ПИД или УФ (210 нм) 115

Смесь стандартных веществ; масла: соевое, Хлороформ или ацетон и их смеси Лихосорб RP-18, 5 мкм, 250/4.6 мм Ацетон-ацетонитрил (1:1) или (2:1), 1.5, 20 °С Рефрактометр 72, 73

льняное и др.

Смесь стандартных веществ; масла: оливковое, соевое, коровье Тетрагидрофуран, смеси гексан-изопропанол Ультрасфер ОББ, 5 мкм, 250/4.6 мм Ацетонитрил-изопропанол-гексан (градиент), 1.8, 25 °С УФ 220/225 71

Смесь стандартных веществ; масло семян винограда Хлороформ или смесь хлороформа и ацетона (1:1) или (3:1) Сферисорб ОЭБ, 5 мкм, 200 / 4.6 мм или Ультрасфер 1оп ра1г, 5 мкм, 150 / 4.6 мм или Ультрасфер СЮ8 , 5 мкм, 250 / 4.6 мм или Новопак СЮБ, 5 мкм, 150/4/6мм Ацетонитрил-ацетон-тетрагидрофуран (62-58):38:0-4), 0.5-2.2, 25-40 °С или ацетонитрил-тетрагидрофуран-вода 60: 40: (1-6) Рефрактометр 48, 49

Смесь стандартных веществ, животные жиры Хлороформ Лихосорб ЯР-18, 5 мкм, 250 / 4.6 мм (2шт) или ГиперсилСЮБ, 250/3.2 мм (1шт) Пропионитрил 0.5-2.0 То же 50, 59, 91

Смесь стандартных веществ; масла: пальмовое, ореховое, какао, бутербродное Ы8ПС18НЬ, 5 мкм, 250/ 4.6 мм Ацетонитрил-изооктан-изопропанол (5:2:3), 20 °С УФ (215 нм) 114

Масла: ореховое, кокосовое Хлороформ, ацетон, гексан МСН-10 С18, 300/4 мм Ацетонитрил-этанол, (4:1), 1.5 или ацетонитрил-этанол-вода (77:20:3) с добавкой противоионов УФ (210 нм) 132

Масло какао и его эквиваленты и заменители Тетрагидрофуран Суперкосил ЯР-18, 5 мкм, 250/4.6 мм Ацетонитрил-ацетон (36.6:64.6) Рефрактометр 92

Соевое масло Хлороформ Зорбакс ОББ, 250 / 4.6 мм или м-Бондапак С18, 10 мкм, или 300 /3.8 мм; Партисил-10 ОББ-г, 250 / 4.6 мм Ацетонитрил-тетрагидрафуран-хлористый метилен (60:20:20) с добавкой нитрата серебра (0.15-0.2М) Рефрактометр 121

Масла: пальмовое, кукурузное Хлористый метилен- ацетонитрил Зорбакс (ЮБ, 6 мкм, 250 / 4.6 мм Хлористый метилен-ацетонитрил (40:60) или (50:50), 1.0, 35 °С ИК (5.75 мкм) 116

Масла: подсолнечное, кукурузное, оливковое, эруковое рапсовое Гексан Ультрасфер СШБ, 5 мкм, 250/4.6 мм Ацетонитрил-ацетон (34:66), 2.0, 20 °С УФ (203-205 нм) или рефрактометр 27

Масла: кокосовое, подсолнечное, льняное, соевое, касторовое и др. Хлороформ м-Бондпак С18, 5 мкм, 300 / 6.2 мм Ацетонитрил-ацетон или ацетонитрил, 1.0 Рефрактометр 27

Масла: подсолнечное, Гексан Ультрасфер СЮБ, 5 мкм, Метанол-гексан-ацетон (30:10:3), 2.0, УФ (207 нм) 29

кукурузное, жир сардины 250 / 4.6 мм ацетонитрил-ацетон (1:2) или (1:1), 2.0,20 °С

Масла: оливковое, подсолнечное, маргарины и др. Гексан Силика, 10 мкм, 300/7.8 мм, (полупрепаративная колонка), затем Силикасфер, 5 мкм, 250 / 4.6 мм Ацетонитрил-гексан, насыщенный водой на 50%, 0.7:99.3, 2.0 Уф (200 нм) 29

Различные масла и их смеси Хлористый метилен-ацетонитрил (2:1) Новопак С18, 5 мкм, 250 / 4.6 мм или Сферосорб ODS-2, 3 мкм Ацетонитрил-ацетон-тетрагидрофуран (хлороформ или хлористый метилен), 0.7 Рефрактометр 74

Молочный жир Нуклеосил С18, 5 мкм, 150 / 4 мм + микросфер С18, 3 мкм, 100 / 4.6 мм Ацетон-ацетонитрил (65:35), 0.8, 30 °С или 39 °С Рефрактометр 65

Говяжий жир Трихлортрифтор-этан М-Бондапак С18, 5 мкм, 250/4.6 мм метанол-хлороформ (9:1), 1.3, 27 °С Рефрактометр 136

Методы получения "узких" фракций ТАГ из природных жиров

Методы получения и предварительного фракционного разделения масел (жиров) с 'целью получения или обогащения «узкими» фракциями определенного состава имеет первостепенное значение. Существует болыно'е количество способов переработки

/л"

выделения фракций с заданными свойствами из различных масел и жиров.

Одним из них является фракционная кристаллизация. Это процесс, который способен изменить характеристики жиров и масел. Известны различные способы разделения жиров:

• кристаллизация жира при температуре, обеспечивающей выделение высокоплавкой фракции в виде кристаллического осадка, определяемого от жидкой фракции прессованием, вакуумфильтрацией, центрифугированием или декантацией [4, 42, 46];

• кристаллизация высокоплавких компонентов смеси жиров или жирных кислот из летучих растворителей (метанол, гексан, ацетон и др.) [17, 42, 46];

• выделение из эмульсий (метод основан на диспергировании жира в воде при соответствующей температуре) [116];

• фракционная дистилляция [42]; ■

• карбамидный метод фракционирования смеси жирных кислот [14];

Во все методы входят этапы получения кристаллов при охлаждении расплава или раствора масел (жиров) и разделение жидкой и твердой фаз, что и позволяет получить фракции с заданными характеристиками: температура плавления, йодное число, состав ТАГ, жирно-кислотный состав.

Таким образом, наиболее перспективным для классификации и идентификации различных жиров и масел является комплексное использование обращенно-фазовой ВЭЖХ ТАГ с капиллярной ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот в сочетании с результатами математической идентификации молекулярных форм ТАГ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования проводились в период с 1996 по 1999 гг. на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, санитарии и товароведения МГУПБ, в лаборатории аналитических методов исследований Института питания РАМН, а также в Центральной таможенной лаборатории ГТК России.

Тема работы входила в план научных исследований МГУПБ, код 68.41.31 - «Разработать ветеринарно-санитарные нормативы и критерии безопасности сырья и продуктов животного происхождения».

Материалы для изучения

Материалами исследований служили жиры: говяжьи, бараньи, свиные, куриные, гусиные, утиные и жир кролика. Образцы получали от фирм-производителей (для импортируемых товаров), из частных фермерских хозяйств Московской и Тверской областей. Было исследовано 74 образца жира различных видов животных.

На рисунке 1 представлена схема проведения исследований.

Схема проведения исследований по идентификации животных жиров различной природы

Заключение диссертации по теме «Гигиена животных, продуктов животноводства и ветеринарно-санитарная экспертиза», Глебов, Роман Игоревич

ВЫВОДЫ:

1. Действующие в настоящее время в России нормативные документы и применяемые аналитические методы идентификации и определения основных видов порчи жиров, основанные на определении физико-химических характеристик и состава жирных кислот исследуемых объектов, не позволяют достаточно точно классифицировать жировые продукты, оценить их пищевую ценность и выявить случаи фальсификации.

2. Разработан метод, позволяющий в одном анализе проводить достоверное определение видовой принадлежности жиров и проверку их качества путем определения и идентификации молекулярных форм триацилглицеринов; определения наличия гидроперекисей и сопряженных двойных связей; определения содержания витаминов и стеролов.

3. Метод имеет следующие преимущества: за счет использования многоканального УФ-детектирования (диодная матрица) осуществляется мультикомпонентный анализ масел и жиров, включая и анализ ТАГ с перекисными кислотами в качестве ацильных радикалов; более достоверна идентификация определяемых пиков, основанная на изучении их спектров и времен удерживания. При использовании диодной матрицы в качестве детектора это осуществляется за счет параллельной регистрации пиков на нескольких специфических длинах волн с одновременной записью спектров.

4. Предел обнаружения разработанного метода составляет 10 нг для ненасыщенных ТАГ - жирные кислоты с тремя двойными связями, 25 нг для ненасыщенных ТАГ - жирные кислоты с двумя двойными связями, 150 нг для ненасыщенных ТАГ жирные кислоты с одной двойной связью и 10,0 мкг для насыщенных ТАГ.

5. Изучена эффективность растворителей для экстракции фракций триацилглицеринов. Для экстракции ТАГ из природных масел наиболее пригодна смесь диоксан-этанол или изопропанол. Из маргаринов хорошо экстрагируют ТАГ и диацилглицерины ацетон, в меньшей степени ацетон-этанол и диоксан-этанол.

6. Определен полный спектр триацилглицеринов говяжьего, свиного, бараньего, куриного, гусиного, утиного жиров и жира кролика.

7. Разработана и применена оригинальная программа идентификации индивидуальных ТАГ помощью ЭВМ после хроматографического разделения их методом ВЭЖХ с многоканальным УФ-детектированием.

8. Выявлено качественное и количественное различие состава триацилглицеринов указанных жиров, что может служить критерием их идентификации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе был детально изучен состав ТАГ наиболее распространенных пищевых животных жиров (говяжьего, свиного, бараньего, куриного, гусиного, утиного и жира кролика) с целью разработки критериев их идентификации и подлинности, выявления фальсификации, а также новых подходов к оценке пищевой ценности.

Для решения этой задачи был разработан метод определения ТАГ-состава жиров, масел и родственных им продуктов, основанный на комбинации следующих этапов:

• выделение фракции ТАГ из исходного образца;

• определение состава жирных кислот, входящих в состав ТАГ методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием;

• разделение молекулярных видов ТАГ с помощью модифицированного метода обращенно-фазовой ВЭЖХ с многоканальным УФ-детектированием (детектор - диодная матица, длины волн 215, 240, 280 нм);

• идентификация и количественная оценка содержащихся ТАГ с помощью существенно модифицированной авторами специальной компьютерной программы.

Комбинация разработанных и модифицированных авторами современных научных подходов позволила решить трудную проблему анализа ТАГ-состава, степень сложности которой возрастает с увеличением числа различных жирных кислот в ацильных остатках ТАГ образца.

Примененная авторами программа идентификации, основанная на компьютерной обработке данных, полученных при исследовании жиров и масел методом ВЭЖХ с многоканальным УФ-детектированием, позволяет достоверно идентифицировать основные индикаторные ТАГ-компоненты исследованных жиров.

Применение компьютерного анализа позволило создать вероятностный состав молекулярного спектра ТАГ пищевых жиров, максимально приближающегося к действительному и резко снизить время анализа.

Идентификация основана на зависимости между относительным приведенным временем удерживания К' и эквивалентным углеродным числом (ЕС1\1) индивидуальных ТАГ. Такие закономерности устанавливают с помощью определенного набора стандартов триацилглицеринов, рассчитывая ЕСЫ и К' . Предполагая гомологичность ТАГ, считают, что каждая точка построенной кривой соответствует индивидуальному ТАГ с полученным значением ЕС1М. Далее методом итерации с применением ЭВМ можно подобрать все возможные ТАГ с учетом определенного жирно-кислотного состава исследуемого образца, рассчитанные эквивалентные углеродные числа которых попадают в интервал вблизи данного значения, протяженность которого равна удвоенной погрешности эксперимента.

С помощью описанного метода были идентифицированы индивидуальные триацилглицерины говяжьего, свиного, бараньего, куриного, гусиного, утиного жиров и жира кроликов.

Основной спектр во всех образцах исследованных жиров содержал 12 видов ТАГ, из них 7 видов были представлены в количествах, превышающих 3% каждый от общего весового соотношения, а остальные менее 1%. До настоящей работы не было данных, касающихся детального и достоверного состава молекулярных форм ТАГ животных жиров, исследованных в работе.

Результаты отдельных публикаций по ряду макрокомпонентов исследованных жиров в основном не расходятся с нашими данными.

Сравнительный анализ молекулярного спектра ТАГ позволил выявить характеристический качественный и количественный состав ТАГ для всех жиров.

Наряду со специфичными ТАГ, для отдельных жиров обнаружен ряд общих триацилглицеринов, которые могут служить в качестве характерного родового признака и признака локализации жира в организме. Такими примерами являются триацилглицерин РаОО, характерный для всех видов птицы и триацилглицерины MOS и LSS, характерные для подкожного жира лопаточной области и подкожного жира тазовой области свиньи.

Важным фактором для оценки пищевой ценности исследованных жиров явилось установление факта сниженного содержания в ацильных радикалах фракций ТАГ ю 3 ПНЖК. Эти данные расходятся с данными общего ЖК состава липидной фракции указанных жиров и, по-видимому, свидетельствуют, что источником ПНЖК серии ю 3 в животных жирах являются полярные липиды (фосфолипиды).

Разработанный нами метод анализа мультикомпонентного состава жиров был внедрен в Центральной таможенной лаборатории ГТК РФ и двенадцати региональных таможенных лабораториях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1. Разработа'н и внедрен в Центральной таможенной лаборатории ГТК РФ и двенадцати региональных таможенных лабораториях метод анализа мультикомпонентного состава жиров, основанный на градиентном элюировании в сочетании с диодной матрицей в качестве детектора.

2. Выработаны основные критерии, позволяющие идентифицировать- и оценить качество животных жиров, в том числе и при исследовании жиров, импортируемых на территорию Российской Федерации.

3. Разработанные критерии идентификации научно обосновывают правильную классификацию жиров и масел, позволяют предотвратить снижение качества питания населения и попадания на товарный рынок недоброкачественных и потенциально опасных для здоровья жировых продуктов, позволяют оценить пищевую ценность указанных продуктов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Глебов, Роман Игоревич, 1999 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Алимова Е.К. Биосинтез ацилглицеринов в различных тканях животного организма// Липиды. Структура, биосинтез, превращения и функции. М.: Наука, -1977, -С. 5-15.

2. Алимова У. К., Аствацатурьян А. Т., Жаров Л. В. В кн. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний. Биохимические аспекты переваривания, всасывания и транспорта липидов//М.: Медицина, -1975, -С.6-16.

3. Айвазян С. А. и др. Прикладная статистика// М.: Финансы и статистика, -1989, -С. 144-148, -С. 332-382.

4. Ауст Л., Брюкнер Ю., Левачев М.М. и др. Влияние триацилглицеринов жирных кислот плазмы, жировой ткани и мембран эритроцитов у крыс//Вопросы питания, -197 8, -№4, -С. 18 .

5. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов// М.: Наука,-1981,-С. 259.

6. Венгерова Н.В., Загонова Э.В. Фракционирование жирных кислот растительных масел и китового жира карбамидным методом// Л.: Труды ВНИИЖ, Химия и технология жиров и моющих средств. -1963, -вып. 24, -С. 143.

7. Верещагин А. Г. Биохимия триацилглицеринов//М.: Наука, -1972, - С. 308.

8. Глебов Р.И., Рекомендации по идентификации молекулярных форм триацилглицеринов в маслах, жирах и прочих жиросодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием// М., 1998 (Для таможенных целей).

9. Глебов Р.И., Климов С.А., Новикова Г.А. Рекомендации по определению состава жирных кислот триацилглицеринов жиров, масел и прочих жиросодержащих продуктов методом капиллярной газовой хроматографии с масс-селективным детектированием// М., 1997 (Для таможенных целей).

10. Глебов Р.И., Эллер К.И. Исследование триглицеридного состава оливковых масел с целью определения их качества и натуральности. Тез. докл. Всероссийский симпозиум по теории и практике хроматографии и электорофореза. - М. : РАМН, Научный совет по хроматографии, 1998. - С. 101.

11. Глебов Р.И., Родин В.И., Эллер К.И. Исследование состава молекулярных форм триацилглицеринов животных жиров. //Мясная индустрия, -1998.-№7.-С.33-36.

12. Глебов Р.И., Родин В. И. Идентификация масло-жировых продуктов, поступающих на товарный рынок России. Материалы международной научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России. СПб.,1998. - С. 62.

13. Глебов Р. И. Определение состава жирных кислот триглицеридов жиров, масел и родственных им продуктов методом капиллярной газовой хроматографии с масс-селективным детектированием Материалы международной научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России. СПб.,1998. - С. 63.

14. Гольберт К. А., Вигдергауз М.С. Курс газовой хроматографии//М.: Химия. -1974. -С. 55.

15. Зиновьев A.A. Химия жиров// М.: -1962. -С. 308.

16. Кейтс М. Техника липидологии// М.: Мир. -1975. -С. 74-75.

17. Киселева Т. В., Ляпков Б. Г.. Воинов Д.И., Сравнительный анализ состава триацилглицеринов в маргаринах, полученных с

использованием различных технологий// Сб. научных трудов: Теоретические и клинические аспекты науки. -1989. -Т. IX. -С. 117-127.

18. Клиорин А.И. Атеросклероз в детском возрасте// М. : Медицина.-1981. С. 102.

19. Кученев П. В. Молоко и молочные продукты// М. : Россельхозиздат.-1985. -С.9.

20. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам//М.: Мир. -1982. -Т. 1. 11. -С. 783.

21. Либерман С. Г. Способы фракционирования жиров и их кислот// М. ЦНИИТЭИ мясопром. -1965.

22. Левачев М.М. Роль липидов пищи в обеспечении процессов жизнедеятельности организма// Вопросы питания. -1980. -№2. -С. 3-11.

23. Ляпков Б.Г., Воинов Д.И., Меламед Д.Б. Определение молекулярных типов ТАГ в растительных маслах ВЭЖХ с использованием ЭВМ// IV Всесоюзн. симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. -Алма-Ата.: Изд-во АН КазССР. -1987. -С. 93.

24. Ляпков Б. Г., Воинов Д.И., Меламед Д. Б. Состав ТАГ пищевых жиров// Мед. реф. жур. -1988. VII разд. -№4. -С. 34.

25. Ляпков Б. Г., Воинов Д.И. и др. Сравнительный анализ состава молекулярных форм ТАГ жира сардины Иваси и некоторых растительных масел// Вопросы питания. -1988. -№2. -С. 56-60.

26. Ляпков Б. Г., Киселева Т. В. Использование молекулярной жидкостной хроматографии ТАГ в оценке пищевых и кормовых жиров// Мат-лы V Всесоюзн. симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. -Рига. -1990. -С. 193.

27. Ляпков Б. Г., Киселева Т. В. Контроль качества пищевых и кормовых жиров по составу индивидуальных триацилглицеринов// Мат-лы Всесоюзной научно-технической конф-ции. -Киев. -1991. -4.1. -С. 263.

28. Ляпков Б. Г., Меламед Д.В., Воинов Д. И. Сравнительный анализ по ТАГ составу// Пищ. и перераб. пром-сть. -1988. -№8. -С. 42.

29. Ляпков Б. Г., Меламед Д.Б., Воинов Д. И. Идентификация пищевых растительных масел по ТАГ составу// Вопросы питания. -

1988. -№3. -С. 61-66.

30. Ляпков Б. Г., Меламед Д.Б. Хроматографические методы анализа смесей индивидуальных ТАГ// Ж. аналит. химии. -1990. -Т. 45. -Вып. 3. -С. 434-452.

31. Математическая статистика Под ред. А. М. Длина. М. : Высшая школа. -1975. -С. 145.

32. Пецев Н., Коцев Н. Справочник по газовой хроматографии// М.: Мир. -1987. -С. 93. 43. Поляков И. И. Докл-д Моск. Ин-та инж.с-х производства// М. -1971. -С. 336.

33. Редько Т.С., Смирнова Л.Т., Трауэрман Л.А. Производство заменителя масла какао за рубежом// М.: ЦНИИТЭИпищепром. -1974. -С. 16.

34. Хроматография. Практическое приложение метода// М. : Мир. -

1989. -Т.1. -С. 327.

35. Родин В.И., Глебов Р. И. Изучение жирно-кислотного состава жировых пищевых продуктов. Тез. докл. Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции. Вторая международная научно-практическая конференция. М.: МГУПБ, 1997. - С. 36.

36. Шаршунова M.: Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии// М.: Мир. -1980. -Т. 2. -С. 536-541.

37. Analysis of oil and fats// London, N.Y.: Elsevier Sci. Pabl. -1986. P. 324.

38. Barron L., Cesaa M. , Santa-Maria G., Gorro N. Determination of the triglycerides Composition of grapes by HPLC// Chromatographia. -1988. -V. 25. -№7. -P. 609.

39. Barron L., Santa-Maria G., Diez.Masa J. Influence of bonded-phase Column type, mobile phase Composition, temperature and flow-rate in the analysis of triglycerides by reverse-phase high performance liquid Chromatography// J. Liq. Chrom.-1987. -V. 10. -№14. -P. 3193-3212.

40. Barth H., Barber W., Lochmuller Ch., Majors R. Column liquid Chromatography// Anal. Chem. -1986. -V. 58. -№5. -P.211-239.

41. Bracco U., Hidalgo J. and Bohren H. Lipid Composition of the fat globule membrane of human and bovine milk// J. Dairy Sci.-1972. V. 55. -P. 165-175.

42. Brockerhoff H., Hoyle R. On the structure of the depot fast of marine fish and mammals// Arch.Biochem. and Biophys. 1963.-V. 102. -№3. -P. 452-455.

43. Brunnekreeft J., Leijnse B.// J.chin. Chem. Clin. Biochem.-1986a. -V. 24. -№7. -P. 445.

44. Buning-Pfaue H., Eggers R. , BartschA.// Fat Sci. Technol.-1989. -V. 91. -№3. -P. 92.

45. Christie W. Biosynthesis of triglycerides in freshly secreted milk from goats// Lipids. -1974. -V.9. -№ll. -P.876-882 .

46. Chromatography of lipid in biomedical research and clinical diagnosis// Amsterdam: Elsevier J. chromatogr. library. 1987.-V. 37. -P. 441.

47. Daae L.N. The mitochondrial acylation of glycerophosphate in rat liver: fatty acid and positional specificity// Biochim. et biophys. acta. -1972. -V. 270. -P. 23

48. Edwards W. // J. Liq.chromatogr. -1985. -V. 8. -14. P. 2625.

49. Farines M., Soulier R., Soulier J. Analysis of the triglycerides of some vegetable oils// J. chem. Ed. -1988.-V. 65.-№5. -P. 464-466.

50. Fiebig H. HPLC - trennung von triglyceriden// Fette, Seifen, Anstrichmittel. -1985. -V. 87. -№2. -P. 53-57.

51. Folch J., Lees M., Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues// J. Biol. chem. -1957. -V. 226. -P. 497-510.

52. Food chemicals codex// National Academy press. Washington. DC. -1986.

53. Fox P.F. Developments in dairy Chemistry-2, Lipids// Applied science publishes, London and New York. -1983. -P. 1-37.

54. Frede E. Improved HPLC of triglycerides by special tempering procedures// Chromatographia. -1986. -V.21. -№1. -P. 29-36.

55. Frede E.. Thiele H. Analysis of milk fat by HPLC// J. Amer. Chem. Soc. -1987. -V. 64. -№4. -P. 521-528.

56. Gargouri Y., Moreau H., Veget R. Gastric lipases: biochemical and physiological studies// BBA. -1989. -V. 1006. -№3. -P.255-271.

57. Geeraert E., De Schepper D. Structure of triglycerides by chromatographic techniques// J. High Resol. chrom. 1983. -V. 6. -№3. -P. 123.

58. Geeraert E., Sandra P. On the potential of CGC in triglyceride analysis// J. High Resol chrom. -1984. -V. 7. -P. 431-432.

59. Geeraert E. Possibilities of gas chromatography on polar capillary columns in the triglyceride analysis of fats and oils, with special reference to chocolate fats// J. Amer. Oil chem. Soc. -1985. -V. 62. -№4. -P. 629.

60. Geeraert E. Sandra P. capillary GC of triglycerides in fats and oils using a high temperature phenylmethylsilicone stationary phase// J. High Resol. chromatogr. -1985. -V. 8. -№8. -P. 415-422.

61. Geeraert E., Sandra-P. Capillary GC of triglycerides in fat and oils using a high temperature phenylmethylsilicon stationary phase// J. Amer. Oil chem. Soc. -1987. -V. 64. -№1. -P. 100-106.

62. Gilkson 1. Quantitative and qualitative analysis of triglycerides using gradient elution with UV detection// Chromatographia. -1988. -V. 26. -№1. -P. 181.

63. Goiffon J., Reminiac C., 011e M.11 Rev.Fr.Corps.Gras. -1981. -V. 28. -№4. -P. 167.

64. Goiffon J., Reminiac C. Olle M.// Rev.Fr.corps.Gras. -1981. -V. 28. -№5. -P. 199.

65. Graciani Constante E., Delgado Noriega L. Caracterizacon del aceite de oliva virgen español. I.Estudio de las variables que intervienen en la separación de sus triaciigliceroles por cromatografía liquida de alta eficacia// Grasas Aceites. 1987. -V. 38. —№5. -P. 286-293.

66. Grob K., Grob G.// J.High Resol.Chromatogr. -1979. -V.2. -№2. -P. 109

67. Grob K. Degradation of triglycerides- in gas chromatographic capillaries: studies by reversing the column// J.Chromatogr. -1981. -V. 25. -№2. -283-289.

68. Grob K. , LaubliT. High oven temperature on - Column injection in capillary gas chromatography. I sample introduction// J. chromatogr. -1986. -V. 357. -№3. -P. 345.

69. Grob K. , Laubli T. High oven temperature on - column injection in capillary gas Chromatography. Avoidance of peak distortion// J. chromatogr. -1986. -V. 357. -№3. -P. 357.

70. Hamosh M.A. Fat digestion, in the newborn role of lingual ligase and preduiodenal digestion// Pediat.Res. -1979. -V. 13. -№5. -P615-622.

71. Hernquist L.AHerslof B., Herslof M. Polymorphism of interes-terified triglycerides and triglycerides mixture// Fette, Seifen, Anstrichmittel. -1984. -V. 86. -№10. -P. 393.

72. Herslof B., Podlaha C., Toregart B. HPLC of triglycerides// J.Amer.Oil chem.Soc. -1979. -V. 56. -№9. -P. 864-866.

73. Herslof B., Kindmark G. HPLC of triglycerides with gradient elution and mass detection// Lipids. -1985. -V. 20. -№11. -P. 783.

74. Hinshaw J., Seferovic W. Programmed-temperature split-split-less injection of triglycerides: comparison to cold on column injection// J. High ResoLchromatogr. -1986. -V. 89. -№2. -P. 69-72.

75. Jandacek K.J., Whiteside J.A., Holcombe B.N. et. al. The rapid hydrolysis and efficient absorption of triglycerides with octanoic acid in the 1 and 3 positions and long-chain fatty acid in the 2 position// Am.J.clin. Nutr. -1987. -V.45.

P.940-945.

76. Jansson L., Akesson B., Hoimberg L. Identification of tocopherols//Am.J.clin.Nutr. -1981. -№34. -P.8-14.

77. Janness R. and Sloan R. Lipid composition of human milk// Dairy Sci. Abstr. -1970. -№32. -P. 599-608.

78. Jensen G. Improved separation of triglycerides at low temperatures by reversed - phase liguid chromatography// J. chromatogr. -1981. -V. 204. -№2. -P. 407-432.

79. Kates M. Technigues of lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids// Amsterdam: Elsevier. -1986. - P. 321.

80. Kcenper K. , Melchert H., Rabach K.// Lebensmittel-chem. Gerichtl.chem. -1988. -V.B.42. -P. 105.

81. Kimmey R. , Perkins E. Confectionery fat analysis with high performance liguid chromatography// J.Amer.Oil chem.Soc. -1984. -V.61. -№7. -P. 1209-1211.

82. Kobayashi H., Kanno C., Yamauchi K. et.al. Identification of a, p, x_ and 5-tocopherols and their contents in human milk// BBA -1975. -N380. -№2. -P. 282-290.

83. Kondon Y., Takano S. Analysis of acyiglycerols by high -performance liquid chromatography with post-column derivatization// J. chromatogr. -1987. -V. 393. -№2. -P. 427435.

84. Kuksis A., Myher J., Marai L. Lipid methodology chromatography and beyond. Part I.GC/MS and LC/MC of glycerolipids// J.Amer. Oil.chenkSoc. -1984. -V.6L -№10. -P. 1582-1589.

85. Kuksis A., Maher J., Marai L. Lipid methodology-chromatograph and beyond. Part II. GC/MS, LC/MS and specific enzymatic hydrolysis of glycerolipids// J.Amer.Oil chem.Soc. -1985. -V. 62. -№4. -P. 762-767. ,

86. Kuksis A., Meher J., Marai L. Analyses of nattural and H-labe led glycerolipids by GC/MS and LC/MS with specific enzymic hydrolyses // J.Amer.Oil chem.Soc. -1985. -V. 62. -№4. -P. 767-773.

87. Kuksis J., Marai L., Sandra P. Identification of the more complex triacyiglycerols in bovine milk fat by gas chromatograph-by-mass spectrometry using polar capillary columns// J.chromatogr. -1988. -V. 452. -№1. -P. 93-105.

88. Lie Ken Jie M. Fatty asids. XIX A quantitative treatment of saturated triglycerides by reversed-phase high-performance liquid chromatograhy// J.chromatogr. -1980. -V. 192. -№2.

P.457-472.

89. Lin D.S., Connor W.E. Are the n-3 fatty acids from dietary fish oil deposited in the triglyceride stores of adipose tissue// Am.J.clin.Nutr. -1990. -V. 51. -№4. -P. 535-539.

90. Lichfield C. Analysis of triglycerides// N.Y.and L.: Academic Press. -1972. P -355.

91. Lloyd-Davied K.A., Brindley D.N. Palmitat-co-enzyme A ligase and sn-glycerol 3-phosphate aceltransferase in the microsomal fraction of rat liver//Biochim.Soc.Trans. -1973. -V.l. -№2. -P.436-445.

92. Lohninger A., Linhart L., Laudau M., Glogar D.// Anal.Biochem. -1988. -V. 171. -№2. -P. 366.

93. Lund P. Analysis of butterfat triglycerides by capillary gas chromatograhy//Mi Ichwissenschaft. -1988. -V. 43. -№3. -P. 159-163.

94. Mares P., Husek P. Quantitative capillary gas-liquid chromatography of triglycerides on a fused-silica column with a chemically bonded stationary phase// J.chromatogr. -185. -V.350. -№1. -P. 87-98.

95. Methods in membran biology// N.Y.London: Plenum Press. 1977. -V. 8. 218 P.

96. Merritt C., Vajdi Jr., Kayser S. et.al. Validation of computational methods for triglycerides composition of fats and oils by liquid chromatography and mass spectrometry// J.Amer.Oil chem. Soc. -1982. -V. 59. -№10. -P. 422-432.

97. Moilanen T., Viikari J., Rasanen L. et.al. Three year tracking of serum fatty acids in Finnish boys and girls// Atherosclerosis -1987. -V.67. -P. 191-197.

98. Moore J.H. Industrial aspects of biochemistry// Amsterdam: North Holland Publ. co. -1974. -234P.

99. Murata T. Analysis of triglycerides by gas chromatography (chemical ionization mass spectrometry)// Anal. chem. -1977. -V. 49. -№12. -P. 2209-2213.

100. Murata T., Takahashi S. Analysis of triglycerides mixtures by gas chromatography - mass spectrometry// Anal. chem. -1973. -V. 45. -№11.-P. 1816-1823.

101. Myher J., Kuksis A., Breckenridge W. comparative studies of triacyiglycerols structure of very low density lipoproteins and chylomicrons of normolipemic subjects and patients with type II hyper-lipoproteinemia// Lipids. -1985. -V. 20. -№2. -P. 90-95.

102. Nanderkar A.K., Schirmer E., Kumar S. Biosynthesis of fatty acids in mammary tissue// Arch.Biochem. and Biophys. -1969. -V. 134.-№2. -P. 554-562.

103. Nordby H., Yelenosky G. Análisis of triacyiglycerols in leaves of citrus by HPLC// J.Amer.Oil chem.Soc. -1984. -V.61.-P. 1028-1031.

104. Nurmela K., Satama L. Quantitative analysis of triglycerides by high-performance liquid non-linear gradient elution and flame ionization detection// J.Chromatogr. -1988. -V. 435. -№1. -P. 139-148.

105. Ong A.S.H. Fractionation studies of palm oil by density gradient// J.Oil chem. -1983. -V. 60. -№10. -P. 1755.

106. Parris N. Non-aqueous reversed phase chromatography of glycerides using inforared detection// J.Chromatogr. -1978. -V. 149. —№2. -P. 615-620.

107. Patton S.// J.Amer.Oil chem. Soc. -1973. -V. 50. P. 178.

108. Pel P., Henly R., Ramachandran S. New application of high pressure reversed-phase liquid chromatography in lipids// Lipids. -V. 10. -№3. -P. 152-156.

109. Phillips F., Erdahl W., Nadenicek J. et.al. Analysis of triglyceride species by high-performance liquid chromatography via a flame ionization detector// Lipids. -1984. -V. 19. -№2. -P. 142-150.

110. Pillips F., Erdahl W., Schmit J. et.al. Quantitative analysis of triglycerides species of vegetable oil by high performance liquid chromatography via a flame ionization detector// Lipids. -1984. -V. 19. -№11. -P. 880-887.

111. Plattner R. , Spencer G., Kleiman R. Triglyceride separation by reverse phase high performance liquid chromatography// J.Amer. Oil chem.Soc. -1977. -V54. -№ll. -P.511-515.-

112. Plattner R. , Payne-Wane K. Separation of triglycerides by chain length and degree of unsaturation on silica HPLC colums// Lipids. -1979. -V. 14. -№2. -P. 152-153.

113. Plattner R.// J.Amer.Oil Chem.Soc. -1981. -V.58. -№5. P.638

114. Podlaha C.. Toregard B.// J.High Resol.chrom. -1982. -V. 5. -№10. P. 553.

115. Podlaha C., Toregard B. HPLC - trennung mono-ungesattigter triglyceride hinschtlich der a-oder ß-position der olsaure in einigen vegetabilischen fetten// Fette, Saifen, Anstrichmittel.-1984. -V. 86. -№6. -P. 243-256.

116. Proot M. , Sandra P., Geeraert E.// J.High Resol. chromatog. -1986. -V. 9. -№3. -P. 189.

117. Report of the joint FAG/WHO expert consultation on the role of dietary fat and oil in human nutrition// FAO Papers №3. Rome (FAO) -1978.

118. Rhodes S., Netting A. Normal-phase high-performance liquid chromatography of triacylglycerols// J.Chromatogr. -1988. -V. 448. -№1. -P. 135-138.

119. Satama T., Nurmela K. The use of flame ionization detection in liquid chromatography// Kemia-Kemi. -1987. -V.14. -№106. -P.1001-1007.

120. Schwabe A., Bennett L., Bowman L. Octanoic acid absorption and oxidation in humans// J.Appl.Physiol. -1967. -V. 19. -P. 335-342 .

121. Singleton J., Pattee H. Optimization of parameters for the analysis of triglycerides by reverse phase HPLC using a UV detector at 210 nm// J.Amer. Oil Chem.Soc. -1984. -V.61. -№4. -P.761-766.

122. Singleton J., Pattee H. Retention behavior of triglycerides on reverse phase columns using pseudophase liquid chromatography// J.Amer. Oil Chem.Soc. -1985. -V. 62. -№4. -P. 739-742.

123. Singleton J., Pattee H. Characterization of peanut oil triacyiglycerols by HPLC. GLC and EIMS// J.Amer. Oil Chem.Soc. -1987. -V. 84. -№4. -P. 534-538.

124. Smith N. Hydrogénation of cholesterol esters during gas chromatography on a polar fused-silica capillary column// J.Chromatogr. -1982. -V. 249. -№1. -P. 57-63.

125. Stolk C., Purdy W.//Anal. Lett. -1988. -V.21. -№1. -P.l.

126. Stolyhwo A., Colin H., Guiochon G. Use of light scattering as a detector principle in liquid chromatography// J.Chromatogr. -1983. -V. 265. -№1. P. 1-12.

127. Stplyhwo A., Colin H., Guiochon G. Analysis of triglycerides in oils and fats by liquid chromatography with the laser light scattering detector// Anal. Chem. -1985. -V. 57. -№7. -P. 1342-1354.

128. Takano S., Kondoh Y. Triglyceride analysis by combined argentite Ion/nonaqueous reversed phase HPLC// J.Amer.Oil Chem. Soc. -1987. -V. 64. -N3. -P. 380-383.

129. Triacyiglyctrols: influence of structure on metabolism in the rat//Nutr.Rev. -1989. -V.47. -N7. -P.221-223.

130. Trimidou M. , Macrae R.// J.chromatogr.Sci. -1985. -V.23.-№1. -P. 155.

131. Van Der Streege G., Muskiet E., Martini 1. et.al. Simultaneous quantification of medium- and long-chain fatty acids in human milk by capillary gas chromatography with split injection// J.Chromatogr. -1987. -V. 415. -P. 1-11.

132. Vasconselos A., Gonsalves M. , Azevedo G et.al. Use of computerized patten recognition of triglyceride profiles in monitoring SCF - C02 extraction of fatty oil// J.High Resol.chrom. -1989.-V. 12. -№4. -P. 244-253.

133. Wada S., Nonaka J.// J.Japan Oil chem.Soc. -1977. -V. 26. -№2. -P. 35.

134. Wada S., Koizumi ch., Takiquchi A. A study on triglycerides composition of lipid from commercial beef by HPLC// J. Japan Oil chem. -1978. -V. 27. -№9. P.579.

135. Weber Von K., Schulte E., Thier H.// Fat Sci.Technol. -1988. -V.B.90. -P.341.

136. White c., Houck R. Analysis of mono-, di-, and triglycerides by capillary supercritical fluid chromatography// J.High Resol. chromatogr. -1985. -V. 8. - №6. -P. 293-296.

137. Wojtusik M., Brown P,., Turcotte J.//Biochromatogr. -1988. -V. 3. -№2. -P. 76.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТАМОЖЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЦЕНТРАЛЬНАЯ ТАМОЖЕННАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

"УТВЕРЖДАЮ

Методические рекомендации по идентификации молекулярных форм триацилглицеринов

в маслах, жирах и прочих жиросодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ - детектированием

Согласовано:

Начальник экспертно-исследовательского отдела товаров органического происхождения, леса, текстиля и изделий из них

Ответственные исполнители:

Ведущий инспектор

Л.М. Фомина

•г

Р.И. Глебов

Москва - 1998 г.

Содержание

Область применения и сущность метода................................................2

Аппаратура, материалы и реактивы.....................................................3

Подготовка пробы............................................................................ 4

Проведение измерений.......................................................................4

Требования безопасности.....................................................................9

Литература...............................................................................................9

1. Область применения и сущность метода.

Настоящие методические рекомендации распространяются на масло-жировую продукцию, классифицируемую в группах 04, 12, 15, 18, 21, 23 ТН ВЭД СНГ и основываются на идентификации состава молекулярных форм триацилглицеринов (ТАГ) жиров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ -детектированием. Данные о жирно-кислотном составе индивидуальных жиров не всегда позволяют . правильно интерпретировать полученные результаты. В издаваемом совместной комиссией ФАО/ВОЗ «CODEX ALIMENTARIUS», том 8, 1992г. приведены интервалы для содержания жирных кислот в индивидуальных маслах и жирах. Границы интервалов настолько велики (в силу видовых и географических особенностей растений), что в спорных случаях при наложении границ интервалов содержания жирных кислот необходимы исследования молекулярных форм триацилглицеринов.

Знание процентного соотношения основных триацилглицеринов позволяет определять страну происхождения определенных видов масел и жиров, что представляет значительный интерес для таможенных целей. (Susan М. Dyszel. Determination of the Country of Origin of Pistachio Nuts by DSC and HPLC. U.S. Customs Service. JAOCS, Vol. 67, no. 12, 1990).

Предложенный нами метод позволяет осуществить мультикомпонентный анализ масел и жиров: анализ триацилглицеринового состава (вопросы идентификации), определение наличия гидроперекисей и сопряженных двойных связей (вопросы качества), анализ триацилглицеринов в сочетании с определением содержания витаминов и стеролов (вопросы пищевой и биологической ценности);

Пробоподготовка жиросодержащих пищевых продуктов включает в себя три этапа: расплавление жировой фракции, растворение жировой фракции в тетрагидрофуране и последующее фильтрование получаемого раствора от возможно попавших нежировых примесей.

Полученный раствор подвергают хроматографическому разделению методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии на колонке с твердым сорбентом, -химически модифицированным силикагелем.

Разделение ТАГ происходит по эквивалентным углеродным числам - ECN, являющимся топологическим индексом, характеризующим молекулу ТАГ,

рассчитывается по формуле: ECN = С - 2пК, где С - углеродное число (суммарное число углеродных атомов в ацильных цепочках), п - количество двойных связей в жирно-кислотных цепочках, К - коэффициент, учитывающий условия разделения (состав элюента, величину и свойства частиц сорбента).

Детектирование анализируемых компонентов осуществляют при длинах волн, отвечающих области их максимального поглощения в УФ - спектрах.

Идентификация обнаруживаемых пиков осуществляется с помощью ЭВМ по разработанной Воиновым Д.И. (Институт питания РАМН) программе, существенно модифицированной Глебовым Р.И. для целей данных исследований. Идентификация основана на зависимости между относительным приведенным временем удерживания RT (К') ТАГ и ECN индивидуальных ТАГ.

2. Аппаратура, материалы и реактивы.

Хроматограф жидкостной HP 1090 Series II с диодной матрицей в качестве детектора (DAD HP 1090), термостатом колонки, устройством для автоматической подачи образцов, автоматическим дозатором объема вводимой пробы и устройством для градиентного элюирования производства Хьюлетт Паккард, США;

Колонка хроматографическая Hypersil MOS, длиной 200 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм и размером зерна 5 мкм производства Хьюлетт Паккард, США (№ в каталоге фирмы Хьюлетт Паккард: 79916МО-572);

Дозаторы пипеточные с постоянным и изменяемыми объемами доз 0,500-0,2000,050-0,025 с суммарной погрешностью + 1,5% отн.;

Одноразовые пластиковые наконечники для пипеток-дозаторов с вышеуказанными объемами доз;

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

Ацетонитрил для хроматографии «LiChrosolv» фирмы Merck, номер по каталогу № 1.14291.2500;

Тетрагидрофуран, х.ч., (№ в каталоге Aldrich 29,310-5);

Одноразовые химически стойкие фильтры ЗОЮ,45 мкм фирмы «Schleicher & Schuell» (№ в каталоге фирмы Хьюлетт Паккард: 3150-0754);

Стандартная смесь ТАГ: трикаприлин (Tri С8:0), трикаприн (Tri С10:0), трилаурин (Tri С12:0), тримиристин (Tri С14:0), трипальмитин (Tri 016:0), и

трилиноленин (Tri С18:3), трилинолеин (Tri С18:2), триолеин (Tri C18:lcis), тристеарин (Tri С18:0), фирмы «SIGMA-ALDRICH CHEMIE Gmbb> (Германия); Фен бытовой;

Гелий очищенный марки А по ТУ 51-940-80; Воздух класса 0 по ГОСТ 17433.

Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов по качеству не ниже указанных.

3. Подготовка пробы.

Для расплавления жиров и масло-маргариновой продукции оптимальный результат достигается при использовании бытового фена. Для расплавления берут навеску образца массой приблизительно 1 г.

Растворяют 25 мкл жировой фракции образца в 0,75 мл тетрагидрофурана. При проведении экспертных исследований нерафинированных масел и жиров, масло-маргариновой продукции, шоколадов после растворения необходимо фильтрование с целью освобождения от нежировых примесей.

Полученный раствор подвергают хроматографическому разделению.

4. Проведение измерений.

4.1. Подготовка прибора к выполнению измерений.

Жидкостной хроматограф HP 1090 с диодной матрицей в качестве детектора (DAD HP 1090) эксплуатируют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

4.1.1 Определение молекулярных форм триацилглицеринов жировой фракции образцов.

Исследуемый образец подвергают пробоподготовке в соответствии с п. 3 настоящих методических рекомендаций.

Разделение проводят на хроматографической колонке Hypersil MOS С8, длиной 200 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм и размером зерна 5 мкм.

В качестве элюентов используют смесь дистиллированной воды (А) и ацетонитрила (Б).

Условия хроматографического разделения:

■ температура колонки 60 С;

■ скорость потока 0,8 мл\мин;

■ объем анализируемой пробы - 3 мкл.;

■ Параметры работы диодной матрицы: длины используемых волн - 215 нм, ширина полосы 20 нм; 240 нм, ширина полосы 20 нм; 280 нм, ширина полосы 20 нм; контрольная длина волн - 450 нм, ширина полосы 80 нм.

■ Программа градиентного элюирования:

- начало анализа - 87% Б;

- увеличение концентрации Б с 87% до 100%, 25 мин.;

- концентрация Б -100% - без градиента 10 мин. анализа;

■ продолжительность анализа - 45 мин.;

Проводят два последовательных ввода пробы в хроматограф.

До и после введения образца проводят анализ стандартной смеси ТАГ: трикаприлин (Tri С8:0), трикаприн (Tri С10:0), трилаурин (Tri С12:0), тримиристин (Tri С14.0), трипальмитин (Tri С16:0), и трилиноленин (Tri С18:3), трилинолеин (Tri С18:2), триолеин (Tri C18:lcis), тристеарин (Tri С18:0), фирмы «SIGMA-ALDRICH CHEMIE Gmbh» (Германия).

Предел обнаружения метода составляет 10 нг для ненасыщенных ТАГ - жирные кислоты с тремя двойными связями, 25 нг для ненасыщенных ТАГ - жирные кислоты с двумя двойными связями, 150 нг для ненасыщенных ТАГ - жирные кислоты с одной двойной связью и 10,0 мкг для насыщенных ТАГ.

Повторяемость времени удерживания (RT) триацилглицеринов стандартной смеси - < 0,7%.

Повторяемость площадей пиков триацилглицеринов стандартной смеси - < 8%. Область измерения - триацилглицерины с ECN от 22 до 56.

4.1.2 Идентификация молекулярных форм триацилглицеринов жировых фракций.

Идентификация обнаруживаемых пиков осуществляется с помощью ЭВМ. Идентификация основана на зависимости между относительным приведенным временем удерживания ИТ (К') и ЕСМ индивидуальных ТАГ.

В программе идентификации используются следующие данные: состав жирных кислот триацилглицеринов, времена удерживания стандартов ТАГ, времена удерживания пиков на полученной хроматограмме, время «мертвого объема» для данной хроматографической системы.

Программа автоматически определяет соответствующий ТАГ для каждого пика хроматограммы, учитывая состав жирных кислот триацилглицеринов в исследуемом жире.

Полученные данные о качественном составе ТАГ сравниваются с литературными для каждого вида масел и жиров.

Одновременно возможно сравнение получаемой хроматограммы с хроматограммами стандартных образцов масел и жиров из библиотеки прибора .

На Рис. 1 и Рис. 1а приведены хроматограммы стандартных смесей триацилглицеринов.

Рис. 1 Хроматограмма стандартной смеси ТАГ (ТпС18:3, ТпС18:2, ТпС18:1) *-Гидроперекись(ТпС 18:3) ** - Гидроперекись (ТпС18:2)

Рис. 1а Хроматограмма стандартной смеси ТАГ (ТпС8, ТпС 10, ТпС 12, ТпС 14, ТпС 16)

Соответствующие указанным пикам спектральные данные приведены на Рис. 2, 2а, 26 и 2в. Отчетливо просматривается разница в спектрах триацилглицеринов, содержащих насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты. По мере уменьшения количества двойных связей в ацильных радикалах ТАГ, снижается оптическая плотность соответствующих ТАГ.

В стандарте, содержащем триацижлицерины с ненасыщенными кислотами в качестве радикалов (ЬЬЬ и ЬпЬпЬп) обнаруживаются дополнительные пики для каждого го указанных триацилглицеринов. Спектры этих соединений приведены на Рис. 3 и Рис За.

С18:3

Данные спектрального анализа (максимум поглощения при 235 нм) и времена удерживания позволили идентифицировать эти соединения как гидроперекиси, образующиеся при самоокислении ТАГ с ненасыщенными жирными кислотами в качестве радикалов. Когда происходит самоокисление триацилглицеринов Tri С18:2

или Tri С18:3 изолированные двойные связи в жирно-кислотных радикалах трансформируются в сопряженные двойные связи, например 9,12-линолевая кислота преобразуется в гидроперекись 9,11-изоленолевой кислоты. Так как используются длины волн 215 нм и 240 нм одновременно при исследовании всех образцов жиров, то наличие гидроперекисных соединений в низкокачественных жирах легко обнаруживается (поглощение при 240 нм > выше, чем при 215 нм).

При исследовании оливковых масел для идентификации масел «первого холодного прессования» в отличии от масел, подвергшихся дополнительной технологической обработке решающее значение принадлежит хроматографическим данным, полученным при использовании длины волны 280 нм. Для оливковых масел, подвергшихся дополнительной технологической обработке характерно наличие пиков ТАГ, содержащих три сопряженные двойные связи. Хроматограмма, иллюстрирующая данные отличия приведена ниже.

Для идентификации молекулярных форм триацилглицеринов (ТАГ) жиров необходимы сведения о составе жирных кислот ТАГ,, получаемые методом капиллярной газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. Полное описание методики приведено в «Методических рекомендациях по определению состава жирных кислот триацилглицеринов жиров, масел и прочих жиросодержащих продуктов методом капиллярной газовой хроматографии с масс-селективным детектированием» (Р.И. Глебов, С.А Климов, Г.А Новикова), принятых 01 декабря 1997 года в Центральной таможенной лаборатории «Для таможенных целей» и рекомендованных к применению в региональных таможенных лабораториях.

280 nm

5. Требования безопасности.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа с диодной матрицей в качестве детектора следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и с инструкцией по эксплуатации прибора.

Необходимо выполнять требования безопасности при использовании баллонов для газов по ГОСТ 949-73 и сжатого газа (гелия) по ТУ 51-940-80.

При работе с метанолом следует соблюдать правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 6995-77.

6. Литература.

1. Rothaupt Michael. Food analysis. A collection of analysis for food and beverages performed on modern analytical instrumentation. Hewlett Packard European Center, Waldbronn, 1994.

2. Susan M. Dyszel. Determination of the Country of Origin of Pistachio Nuts by DSC and HPLC. U.S. Customs Service. JAOCS, Vol. 67, no. 12, 1990.

3. J. Gresti, M. Bugaut. Composition of Molecular Species of Triacylglycerols in Bovine Milk Fat. J. of Dairy Science, no. 76, 1993, pp. 1850-1869.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТАМОЖЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЦЕНТРАЛЬНАЯ ТАМОЖЕННАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

Методические рекомендации по определению состава жирных кислот триацилглицеринов жиров, масел и прочих жиросодержащих продуктов методом капиллярной газовой хроматографии с масс-селективным детектированием

Согласовано:

Начальник экспертно-исследовательского отдела товаров органического происхождения, леса, текстиля и изделий из них

Л.М. Фомина

Ответственные исполнители:

Главный инспектор Ведущий инспектор Ведущий инспектор

С.А. Климов Р.И. Глебов Г.А. Новикова

Москва -1997 г.

Содержание

1. Область применения и сущность метода..............................................3

2. Аппаратура, материалы и реактивы....................................................3

3. Подготовка пробы......................................................................... 5

4. Проведение измерений.....................................................................6

5. Обработка результатов....................................................................8

6. Требования безопасности..................................................................9

7. Литература..........................................................................................10

1. Область применения и сущность метода.

Настоящие методические рекомендации распространяются на масло-жировую продукцию, классифицируемую в группах 04, 12, 15, 18, 21, 23 ТН ВЭД СНГ и основываются на хромато-масс-спектрометрическом методе определения жирнокислотного состава растительных масел, маргариновой продукции и другой жиросодержащей продукции.

Метод состоит из трех основных стадий: подготовка пробы, проведение измерений и обработки результатов.

Подготовка пробы представляет собой щелочной метанолиз триглицеридов жирных кислот с последующей этерификацией полученных кислот раствором BF3 в метаноле и экстракцией образующихся метиловых эфиров гексаном.

Проведение измерений включает в себя газохроматографические и масс-спектр ометрические условия проведения анализа жирных кислот с числом атомов углерода от 4 до 24 в любом жир о содержащем продукте, от 8 до 24 атомов углерода в растительных маслах и на присутствие маслянной кислоты в жировых смесях на основе растительных жиров с низким содержанием молочного жира.

В результате обработки результатов, произведенной методом внутренней нормализации, определяется жирнокислотный состав продукции, который сравнивается со справочным.

Метод пригоден для идентификации и определения фальсификации продукции.

2. Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф газовый HP 5890 с квадрупольным масс-селективным детектором НР5972А (Хьюлетт-Паккард, США) и системой обработки данных на базе персонального компьютера с использованием библиотеки масс-спектров MST 1992 года выпуска (75000 спектров) или любой аналогичный прибор.

Колонка хроматографическая HP-5MS (неполярная фаза - 95% диметилполисилоксан- 5% дифенилполисилоксан), длиной 30 м, с внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Допускается использование любых аналогичных колонок с высоким температурным пределом для неподвижной фазы: SE-54&AT-5 (Alltech), Rtx-5 (Restek), DB-5 (J&W), OV-5 (Ohio Valley), BR-5 (SGE), SPB-5 (Supelco).

Микрошприц HP 9301-0246 вместимостью 10 мм3, ценой деления 0.2 мм3 или МШ-10М по ТУ 5Е 2-833-106;

Весы лабораторные по ГОСТ 24104-88 2-го класса до 200 г;

Мешалка магнитная с подогревом ММ-5;

Секундомер по ГОСТ 5072-79 или аналогичного типа;

Колба коническая Кн-2-25 вместимостью 25 см3 по ГОСТ 25336-82;

Холодильник ХШ-1-200-ХС по ГОСТ 25336-82, обратный;

Пипетки 6-2-5, 3-2-10 по ГОСТ 25336-82;

Пробирка с делениями до 10 см3 с пришлифованной пробкой по ГОСТ 1770-74;

Воронка делительная вместимостью 250 см3 с пришлифованной пробкой по ГОСТ 25336-82;

Воронка коническая В-56 по ГОСТ 25336-82;

Вата медицинская хлопковая;

Метанол, х.ч. по ГОСТ 6995-77;

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

14%-ный раствор BF3 в метаноле (d=0,883 г/см3), фирмы Merck, номер по каталогу- 8.01663.0500 или комплекс трехфтористого бора с метанолом (BF3*2CH3OH); мол.вес 131.89; Т.кип.- 5974mm; d= 1.203 г/см3; (Boron trifuoride methanol complex); ALDRICH Chemical Company, Inc., USA, номер по каталогу-13.482-1;

Натрия хлорид по ГОСТ 4233-66.

Калий гидроокись по ГОСТ 4203-65;

Натрий сернокислый безводный ч.д.а. по ГОСТ 1166-76;

н-Гексан ч.д.а. по МРТУ 6-09-6518-70 или гексан для хроматографии "LiChrosolv" фирмы Merck, номер по каталогу № 1.04391.2500.

Газ-носитель - гелий очищенный марки А по ТУ 51-940-80.

Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов по качеству не ниже указанных.

3. Подготовка пробы.

0.10 г исследуемого образца жира, масла или жиросодержащего продукта и 5 см3 0.5 М раствора калия гидроксида в метиловом спирте помещают в термостойкую коническую колбу вместимостью 25 см3 и нагревают при перемешивании с обратным холодильником до 80 °С. Реакционную смесь выдерживают при 80 °С в течение 30 мин. Затем к полученному раствору осторожно (пипеткой через обратный холодильник) прибавляют 5 см3 14%-ш раствора ВР3 в метаноле , перемешивают еще 5 мин. при 80 °С. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры.

В делительную воронку на 250 см3 помещают 20 см3 насыщенного раствора натрия хлорида, 3 см3 гексана и приготовленную пробу; воронку встряхивают в течение 7 мин. Воронку оставляют до полного разделения фракций.

В коническую воронку помещают ватный тампон, сверху насыпают свежепрокаленный натрий сернокислый (около 0,5 г.) и пропитывают 2.5 см3 гексана. Нижнюю фракцию из делительной воронки сливают в коническую колбу, в которой готовилась проба. Гексановый слой отфильтровывают через приготовленный фильтр в воронке в пробирку вместимостью 10 см3.

Экстракцию гексаном повторяют еще два раза, сливая гексановый слой в ту же пробирку. Доводят объем органических экстрактов в пробирке гексаном до метки 10 мл.

4. Проведение измерений. 4.1. Подготовка прибора к выполнению измерений.

Газовый хроматограф НР 5890 с масс-селективным детектором НР 5972А эксплуатируют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

л

4.2 Условия определения жирных кислот С4-С24 в жиросодержащем продукте. Устанавливают следующие параметры хроматографирования:

- температура испарителя 250 °С ;

- газ-носитель - гелий, объемная скорость 1 мл/мин.

- деление потока газа-носителя на входе в капиллярную колонку 1:301:50,

- хроматографический анализ проводят в режиме линейного программирования температуры: изотерма 50 °С в течение 3 мин., подъем температуры со скоростью 20 град/мин. до 180 °С, выдержка 2 мин. , затем со скоростью 3 град./.мин. до 270 °С, выдержка 2 мин.

- объем анализируемой пробы 2 мм3;

Устанавливают следующие параметры работы масс-селективного детектора:

- температура интерфейса 280 °С (рекомендованная для НР 5972)

- время включения нити накала : 2,5 мин.

- режим сканирования положительных ионов в диапазоне масс от 50 до 400 ш/е;

- порог детектирования -200.

Пробу объемом 2 мм3 отбирают микрошприцем вместимостью 10 мм3 и вводят в инжектор хроматографа.

Вместе с вводом образца необходимо обеспечить синхронный старт температурной программы и сбор хроматографических данных компьютером. Проводят два последовательных ввода пробы в хроматограф.

4.3. Определение жирных кислот Cs-C24 (растительные масла и др.): Устанавливают следующие условия разделения на хроматографе:

Газ-носитель - гелий, поток 1 мл/мин.

Температура инжектора - 250 °С;

Температура колонки - начальная - 140 °С , выдержка 4 мин.

Градиент - 10 град/мин до 210 °С, выдержка 4 мин.

Градиент - 3 град/мин до 270 °С, выдержка 2 мин.

Время включения нити накала : 2,5 мин.

Остальные параметры хроматографирования, а также работы масс-селективного детектора аналогично указанным в п.4.2.

4.4. Условия определения присутствия масляной кислоты С4 в жировых смесях на основе растительных жиров с низким содержанием сливочного масла.

Хроматографический анализ проводят в режиме нелинейного программирования температуры: изотерма 50 °С , выдержка 3 мин, подъем температуры со скоростью 20 град/мин. до до 270 °С, выдержка 2 мин.; Остальные параметры хроматографирования, а также работы масс-селективного детектора аналогично указанным в п.4.2.и 4.3.

Устанавливают режим сканирования селективно выбранных ионов (SIM): для регистрации пика метилового эфира масляной кислоты выбирают ионы т/е 87[М-СН3]+, 74, 102[М]+.

Остальные необходимые для анализа параметры работы масс-селективного детектора аналогичны указанным в п.п. 4.2 и 4.3.

4.5 Идентификация метиловых эфиров жирных кислот.

Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводят путем сравнения полученных масс-спектров с библиотечными масс-спектрами органических соединений.

Порядок выхода метиловых эфиров жирных кислот из хроматографической колонки и регистрация их по значениям времен удерживания в условиях анализа по п.4.2 представлены в таблице 1.

Таблица 1

Значение времен удерживания для метиловых эфиров жирных кислот

Метиловые эфиры жирных кислот с числом атомов углерода Ci и двойных связей (n) (Ci:n) Значение времени удерживания

Масляной С 4:0 2,7

Капроновой С 6:0 5,6

Каприловой С 8:0 9,2

Каприновой С 10:0 10,6

Лауриновой С 12:0 12,9

Миристиновой С 14:0 13,8

Пальмитиновой С 16:0 17,9

Пальмитолеиновой С 16:1 17,4

Стеариновой С 18:0 22,0

Олеиновой С 18:1 21,6

Линолевой С 18:2 21,4

ЛиноленовойС 18:3 21,2

Арахиновой С 20:0 28,6

Бегеновой С 22:0 34,7

Лигноцериновой С 24:0 38,9

5. Обработка результатов

5.1 Расчет относительного процентного содержания жирных кислот

После идентификации пиков метиловых эфиров жирных кислот, входящих в состав исследуемой пробы, проводят расчет относительного процентного содержания кислот методом внутренней нормализации.

Относительное процентное содержание (X;) каждой ьтой кислоты, пропорциональное относительному процентному содержанию соответствующего метилового эфира, вычисляют по формуле:

f

9

Si* 100

Xi=-,

X Si

i

где Si - площадь пика метилового эфира i-той кислоты;

Z Si - сумма площадей всех пиков на хроматограмме

i

Расчет относительного процентного содержания методом внутренней нормализации производится програмным обеспечение масс.-селективного детектора HP 5972А автоматически.

Вычисления проводят до второго десятичного знака с последующим округлением результата до первого десятичного знака.

За окончательный результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов двух последовательных измерений.

Отнесение жиров и масел к определенному виду базируется на данных о жирнокислотном составе указанных продуктов в: . Codex Alimentarius, Vol. 8, Rome, 1992, (Приложение 1);

. Справочнике "Химический состав пищевых продуктов" под ред. И.М.

Скурихина, книга 2, М., ВО "Агропромиздат", 1987; . Химической энциклопедии, т.4, М., НИ "Большая Советская Энциклопедия", 1995.

В Приложении 2 приведены сведения о результатах исследований образцов жировой продукции, проведенных в ЦТЛ за период с ноября 1996 г по июнь 1997 г.

6. Требования безопасности.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа с масс-сел ективным детектором следует соблюдать. правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и с инструкцией по эксплуатации прибора.

f

10

Необходимо выполнять требования безопасности при использовании баллонов для газов по ГОСТ 949-73 и сжатого газа (гелия) по ТУ 51-940-80.

При работе с метанолом следует соблюдать правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 6995-77.

7. Литература.

1. Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова Л.М. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. М., "Агропромиздат", 1985.

2. Rothaupt Michael. Food analysis. A collection of analysis for food and beverages performed on modern analytical instrumentation. Hewlett Packard European Center, Waldbronn, 1994.

3. Schuster R., "Multicomponent analyses of fats and oils using diode-array detection", Application Note HP 228-207 Pub. Nr.: 12-5954-6229.

4. Schuster R., "Determination of fatty acids in Margarine and butter by on column derivatization", Application Note HP 228-207 Pub. Nr.: 12-5954-0826.

5. ГОСТ 30418-96 (Межгосударственный стандарт) Масла растительные; Метод определения жирнокислотного состава (дата внедрения 1998-01-01).