ЭФР-зависимая передача сигнала с участием транскрипционного фактора STAT тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Василенко, Константин Петрович

• Василенко, Константин Петрович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Василенко, Константин Петрович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпидермальный фактор роста и его рецептор.

2.2. Статус фосфорилирования и тирозинкиназная активность рецептора ЭФР.

2.3. Модульный принцип организации системы передачи сигнала.

2.4. Основные пути передачи сигнала с рецептора ЭФР.

2.5. STAT-путь передачи сигнала.

2.6. Транскрипционный фактор STAT1.

2.7. Рецептор-опосредованный эндоцитоз ЭФР.

2.8. Транспорт сигнальных белков в ядро.

2.9. Участие цитоскелета в передаче сигнала.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Культивирование клеток.

3.2. Стимуляция клеток ЭФР.

3.3. Получение мембранных везикул клеток А431.

3.4. Исследование ТК активности рецептора ЭФР in vitro.

3.5. Получение ядерной и цитоплазматической фракций.

3.6. Получение иодированного лиганда.

3.7. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности Перколла.

3.8. Антитела.

3.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.

3.10. Иммунопреципитация.

3.11. Электрофорез и иммуноблоттинг.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Реакция фосфорилирования экзогенного субстрата рецептором ЭФР in vitro.

4.2 Оценка тирозинкиназной активности интернализованного рецептора ЭФР.

4.3. Динамика ЭФР-зависимого фосфорилирования STAT1 и его ядерно-цитоплазматическое распределение.

4.4. Влияние удаления мембранно-связанного ЭФР на фосфорилирование STAT1 и его экспорт из ядра.

4.5. Изучение взаимодействия интернализованного рецептора ЭФР и STAT1.

4.6. Влияние обработки клеток нокодазолом и цитохалазином на активацию рецептора ЭФР.

4.7. Исследование влияния деполимеризации цитоскелета на транспорт STAT1 в ядро.

4.8. Влияние обработки клеток нокодазолом на взаимодействие STAT1 с кариоферином а.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ЭФР-зависимая передача сигнала с участием транскрипционного фактора STAT»

Эпидермальный фактор роста (ЭФР) относится к группе полипептидных ростовых факторов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз разных типов клеток. На плазматической мембране ЭФР связывается со специфическим рецептором - крупным трансмембранным белком, обладающим тирозинкиназной (ТК) активностью и 5 сайтами автофосфорилирования, находящимися на цитоплазматическом конце рецептора. Связывание ЭФР с рецептором приводит к димеризации рецепторов, стимуляции ТК, автофосфорилированию и активации сигнальных путей. Одновременно с этим, ЭФР поступает в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. После связывания с лигандом, рецепторы кластеризуются в окаймленных ямках и быстро интернализуются в эндосомы (Pastan, Willingham, 1981), В дальнейшем ЭФР - рецепторные комплексы могут рециклировать на плазматическую мембрану или обнаруживаются в составе мультивезикулярных эндосом в районе транс - Гольджи и затем деградируют в лизосомах. (Beguiriot et al., 1984: Sorkin et al., 1988).

Несмотря на то, что исследования эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов ведутся уже не одно десятилетие, значение этого процесса для передачи сигнала до сих пор является предметом дискуссии. Исходно полагали, что удаление активных рецепторов с плазматической мембраны и последующая их деградация может приводить к снижению сигнала. Но было установлено, что в процессе интернализации рецептор остается связанным с лигандом, автофосфорилированным и имеет ТК активность. Кроме того, на ранних стадиях рецептор остается экспонирован в цитоплазму своим С-концевым участком, содержащим ТК домен и сайты автофосфорилирования, что создает возможность для активации внутриклеточных мишеней. К сожалению, не было проведено количественного сравнения ТК активности интернализованного рецептора ЭФР и рецептора на плазматической мембране, которое принципиально важно для понимания роли интернализации. Необходимо отметить, что процесс интернализации детально изучен на клетках А431, поэтому мы выбрали их в качестве объекта исследования.

В последние годы начали появляться прямые доказательства участия интернализованных рецепторов в проведении сигнала. Была показана важность интернализации рецептора ЭФР для активации фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3-K) и ERK1.2 (Vieira et al., 1996; Xue, Lucocq, 1998). Это демонстрирует актуальность и перспективность таких исследований для широкого спектра мишеней рецептора ЭФР. Складывается картина, согласно которой интернализация рецепторов факторов роста необходима для активации и контроля специфических сигнальных путей.

Подобные исследования пока не проводились в отношении белков семейства STAT (signal transducers and activators of transcription) - группы латентных цитоплазматических транскрипционных факторов, которые активируются рецепторами цитокинов и факторов роста, транспортируются в ядро и активируют транскрипцию ряда генов (Darnell, 1997). ЭФР вызывает активацию двух представителей этого семейства:

STAT1 и STAT3, причем STAT3 вызывает пролиферацию, а STAT1, наоборот, торможение пролиферации и апоптоз.

В общих чертах передача сигнала через STAT1 происходит следующим образом: STAT1 фосфорилируется ТК-ой рецептора ЭФР, гомодимеризуется благодаря наличию тирозинсвязывающего SH2 (Src-homology 2) домена, транспортируется в ядро и активирует транскрипцию генов раннего ответа и гена ингибитора циклин-зависимых киназ p21WAF1. Причем фосфорилированная форма STAT1 обнаруживается в ядре уже через 2 мин после начала стимуляции клеток ЭФР. Транспорт в ядро STAT1 обеспечивается взаимодействием с кариоферином a1 (Sekimoto et al., 1997). Остается недостаточно изученным ряд вопросов, связанных с функционированием STAT белков, и, в частности, STAT1. Так, остается неясной возможность активации STAT1 интернализованным рецептором ЭФР, механизм транспорта активированного STAT1 до ядерной поры, локализация взаимодействия STAT1 и кариоферинов, обеспечивающих транспорт белков в ядро, роль активированного STAT1 в цитоплазме и динамика инактивации STAT1 в ядре.

Особый интерес представляет проблема участия цитоскелета клетки в процессе передачи сигнала. Общеизвестно, что рецептор-опосредованный эндоцитоз зависит от системы микротрубочек. Установлено, что некоторые важные сигналпередающие белки, такие как МАРК, GRB2, PLCyl, РКС связаны с цитоскелетными структурами (Melamed et al., 1995; Ding et al., 1996; Keenan and Kelleher, 1998). Возможно, таким образом не только реализуются ЭФР-зависимые перестройки цитоскелета, но и обеспечивается сложная пространственная организация передачи сигнала по разным путям. Картина существенно усложнилась после открытия Rho-семейства GTP-аз - Rho, Rae и Cdc42, которые не только регулируют перестройки цитоскелета, но и участвуют в активации PI-3-K и MAP киназ (Hall, 1998; Aspenström, 1999). В последнее время также появились данные об участии цитоскелета в транспорте сигнальных молекул в ядро. Было показано, что транспорт в ядро протеинкиназы С и ERK1,2 тормозится при нарушении структуры цитоскелета, в частности его микрофиламентной составляющей (Schmalz et al., 1996; Арнаутов, Никольский, 1998).

В связи со всем сказанным выше, в настоящей работе представлялось актуальным изучить ЭФР-зависимую передачу сигнала через транскрипционный фактор STAT1 и участие в этом процессе интернализованного рецептора ЭФР.

Методом фосфорилирования синтетического субстрата in vitro нам удалось продемонстрировать, что в клетках А431 интернализованный рецептор ЭФР имеет такую же тирозинкиназную активность, как и рецептор, находящийся на плазматической мембране. Это свидетельствует о возможности проведения сигнала через интернализованный рецептор ЭФР.

Используя метод субклеточного фракционирования мы изучили динамику ЭФР-зависимого перераспределения STAT1 между ядерной и цитоплазматической фракциями клеток А431. Показано ' присутствие фосфорилированного STAT1 в цитоплазматической и ядернрй фракциях до 5 ч при постоянной стимуляции клеток ЭФР, что свидетельствует об отсутствии даун-регуляции, препятствующей длительной активации STAT1 и его транспорту в ядро в клетках А431. Удаление ЭФР после стимуляции клеток вызывает дефосфорилирование STAT1 в цитоплазме и ядре в интервале от 30 мин до 1 часа и уменьшение содержания STAT1 в ядре до контрольного уровня.

Мы исследовали возможность активации фактора STAT1 интернализованным рецептором ЭФР. Используя метод субклеточного фракционирования органелл в градиенте Перколла и коиммунопреципитацию нами впервые продемонстрировано ЭФР-зависимое взаимодействие STAT1 и интернализованного рецептора, находящегося в составе ранних эндосом.

Иммунофлуоресцентными и биохимическими методами была изучена зависимость транспорта STAT1 в ядро от целостности цитоскелета клетки. Нами впервые показано, что ЭФР-индуцированный транспорт активированного STAT1 в ядро тормозится при разрушении микротрубочек под действием нокодазола, но не зависит от системы микрофиламентов. При этом обработка нокодазолом не препятствует образованию комплекса между фосфорилированным STAT1 и кариоферином а, и наблюдается накопление этого комплекса в цитоплазме. На основании этого сделано предположение о том, что взаимодействие комплекса STAH-кариоферин а с цитоскелетом может быть существенным элементом функционирования механизма транспорта STAT1 из цитоплазмы в ядро.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Василенко, Константин Петрович

6. ВЫВОДЫ.

1. Рецептор ЭФР в процессе интернализации в клетках А431 полностью сохраняет свою тирозинкиназную активность, что было установлено в ходе изучения фосфорилирования синтетического субстрата in vitro.

2. Изучена динамика ЭФР-зависимого перераспределения STAT1 между ядерной и цитоплазматической фракциями клеток А431. Показано присутствие фосфорилированного STAT1 в цитоплазматической и ядерной фракциях до 5 ч при постоянной стимуляции клеток ЭФР, что свидетельствует об отсутствии даун-регуляции, препятствующей длительной активации STAT1 и его транспорту в ядро. Удаление ЭФР после стимуляции клеток вызывает дефосфорилирование STAT1 в цитоплазме и ядре в интервале от 30 мин до 1 часа и уменьшение содержания STAT1 в ядре до контрольного уровня. Все вышеизложенное свидетельствует о наличии динамического равновесия между импортом STAT1 в ядро и экспортом из ядра.

3. Методом иммунопреципитации рецептора из тотального клеточного лизата и из фракций клеток, разделенных в градиенте плотности Перколла, впервые показано ЭФР-зависимое взаимодействие STAT1 и интернализованного рецептора, находящегося в составе эндосом.

4. Методами субклеточного фракционирования и иммунофлуоресценции на клетках, обработанных нокодазолом и цитохалазином, впервые показана зависимость ЭФР-индуцированного транспорта активированного STAT1 в ядро от системы микротрубочек, но не микрофиламентов.

92

5. Показано, что ЭФР-зависимое взаимодействие STAT1 и кариоферина а в клетках с деполимеризованным тубулиновым цитоскелетом существенно отличается от такого взаимодействия в клетках с интактным цитоскелетом. Обработка нокодазолом не препятствует образованию комплекса между фосфорилированным STAT1 и кариоферином а; при этом наблюдается накопление этого комплекса в цитоплазме.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Василенко, Константин Петрович, 1999 год

1. Арнаутов A.M., Никольский H.H. ЭФР-индуцированный транспорт в ядро р42/р44 МАРК требует наличия интактного актинового цитоскелета. Цитология. 1998. 40: 639-647.

2. Виноградова H.A., Нестеров A.M., Решетникова Г.Ф., Соркин АД, Никольский H.H. Иммунофлуоресцентное выявление фосфорилированных рецепторов ЭФР в процессе их интернализации в клетках А431. Цитология. 1990. 32: 384-387.

3. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский H.H. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 1987. 29: 904-910.

4. Нестеров A.M., Вдовина И.Б., Корнилова Е.С., Никольский H.H. Прямое доказательство фосфорилирования по тирозину рецепторов ЭФР, интернализованных в эндосомах клеток А431. Цитология 1991. 33: 26-31.

5. Никольский H.H., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. Эпидермальный фактор роста. 1987. Л. "Наука". 200 с.

6. Никольский H.H. STAT-путь внутриклеточной сигцализации. Цитология. 1998. 40: 1050-1052.

7. Поспелов В.А., Поспелова Т.В., Савельев А.К. Транскрипционный фактор p91/Stat1 конститутивно активирован и локализуется в ядре эмбриональных фибробластов крысы,трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras. Докл. РАН. 1996. 348: 261-264.

8. Решетникова Г.Ф., Нестеров A.M., Никольский Н.Н. Фосфорилирование и тирозинкиназная активность интернализованного комплекса ЭФР и его рецептора. Цитология. 1990. 32: 140-147.

9. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 1993. 123: 1373-1387.

10. Aragane Y., Kulms D., Luger T.A., Schwarz T. Down-regulation of interferon gamma-activated STAT1 by UV light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94: 11490-11495.

11. Aspenstrom P. The Rho GTPases have multiple effects on the actin cytoskeleton. Exp. Cell Res., 1999. 246: 20-25.

12. BatzerA.G., Blaikie P., Nelson K., Schlessinger J., Margolis B. The phosphotyrosine interaction domain of She binds an LXNPXY motif on the epidermal growth factor receptor. Mol. Cell Biol. 1995.15: 4403-4409.

13. Beguinot L., Lyall R.M., Willingham M.C., Pastan I. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984. 81: 2384-2388.

14. Bertics P.J., Gill G.N. Self-phosphorylation enhances the protein-tyrosine kinase activity of the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 1985. 260: 14642-14647.

15. Bevan A.P., Burgess J.W., Drake P.G., Shaver A., Bergeron J.J., Posner B.I. Selective activation of the rat hepatic endosomal insulin receptor kinase. Role for the endosome in insulin signaling. J. Biol. Chem. 1995. 270:10784-10791.

16. Boonstra J., Rijken P., Humbel B., Cremers F., Verkleij A., van Bergen en Henegouwen P. The epidermal growth. Cell. Biol. Int. 1995.19: 413-430.

17. Braun S., Raymond W.E., Racker E. Synthetic tyrosine polymers as substrates and inhibitors of tyrosine-specific protein kinases. J. Biol. Chem. 1984. 259: 2051-2054.

18. Bucci C., Parton R.G., Mather I.H., Stunnenberg H., Simons K., Hoflack B., Zerial M. The small GTPase rab5 functions as a regulatory factor in the endocytic pathway. Cell. 1992. 70: 715-728.

19. Burgess J.W., Wada I., Ling N., Khan M.N., Bergeron J.J., Posner B.I. Decrease in beta-subunit phosphotyrosine correlates with internalization and activation of the endosomal insulin receptor kinase. J. Biol. Chem. 1992. 267:10077-10086.

20. Carpenter G. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. FASEB J. 1992. 6: 32833289.

21. Carpenter G., King L., Cohen S. Epidermal growth factor stimulates phosphorylation in membrane preparations in vitro. Nature. 1978. 276: 409-410.

22. Carpenter G., King L., Cohen S. Rapid enhancement of protein phosphorylation in A-431 cell membrane preparations by epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 1979. 254: 4884-4891.

23. Carpenter G. Receptor for epidermal growth factor and other polypeptide mitogenes. Ann. Rev. Biochem. 1987. 56: 229-238.

24. Carpentier J.-L., White M., Orci L., Kahn R. Direct visualization of EGF-R. J-Cell Biol. 1987. 105: 2751-2762.

25. Chen W.S., Lazar C.S., Poenie M., Tsien R.Y., Cill G.N., Rosenfeld M.G. Requirement for intrinsic protein tyrosine kinase inthe immediate and late action of the EGF-receptor. Nature. 1987. 328: 820-823.

26. Cheng H.C., Nishio H., Hatase 0., Ralph S., Wang J.H. A synthetic peptide derived from p34cdc2 is a specific and efficient substrate of src-family tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 1992. 267: 9248-9256.

27. Chin Y.E., Kitagawa M„ Su W.C., You Z.H., Iwamoto Y„ Fu X.Y. Cell growth arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor WAF1/CIP1 mediated by STAT1. Science. 1996. 272: 719722.

28. Chin Y.E., Kitagawa M. Kuida K. Flavell R.A., Fu X. Y. Activation of the STAT signaling pathway can cause expression of caspase 1 and apoptosis. Mol. Cell. Biol. 1997. 17: 5328-5337.

29. Chung J., Uchida E., Grammer T.C., Blenis J. STAT3 serine phosphorylation by ERK-dependent and -independent pathways negatively modulates its tyrosine phosphorylation. Mol. Cell. Biol. 1997. 17:6508-6516.

30. Cohen S. Isolation of a mouse submaxillary gland protein acceleration incisor eruption and eyelid opening in the newborn animal. J. Biol. Chem. 1962. 237: 1555-1562.

31. Cohen S., Carpenter G., King L.J. EGF receptor-protein kinase interactions. J. Biol. Chem. 1980. 255: 4834-4843.

32. Cohen S., Ushiro H., Stoscheck C., Chinkers M. A native 170,000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. J. Biol. Chem. 1982. 257: 1523-1531.

33. Cohen S., Fava R.A. Internalization of functional EGF receptor kinase complexes in A431 cells. J. Biol. Chem. 1985. 260: 1235112358.

34. Darnell J.E. STATs and gene regulation. Science. 1997. 277:1630-1635.

35. Darnell J.E. Phosphotyrosine signaling and the single cell: metazoan boundary. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1997b. 94: 1176711769.

36. Davis R.J. Independent mechanism account for the regulation by PKC of the EGFR affinity and tyrosine kinase activity. J. Biol. Chem. 1988. 263: 9462-9469.

37. Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucl. Acids Res. 1983.11.: 1475-1489.

38. Ding A., Chen B., Fuortes M., Blum E. Association of mitogen-activated protein kinases with microtubules in mouse macrophages. J. Exp. Med. 1996. 183: 1899-1904.

39. Downward J., Parker P., Waterfield M.D. Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor receptor. Nature. 1984. 311: 483-485.

40. Durbin J.E., Hackenmiller R., Celeste S.M., Levy D.E. Target disruption of the mouse Statl gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 1996. 84:443-450.

41. Fruman D.A., Meyers R.E., Cantley L.C. Phosphoinositide kinases. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 481-507.

42. Fu X.Y., Schindler C., Improta T., Aebersold R., Darnell J.E. The proteins of ISGF-3, the interferon alpha-induced transcriptional activator, define a gene involved in signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89: 7840-7843.

43. Fu X.-Y., Zhang J.J. Transcription factor p91 interact with the epidermal factor receptor and mediates activation of the c-fos gene promoter. Cell. 1993. 74: 1135-1145.

44. Futter C., Felder S., Schlessinger J., Ullrich A., Hopkins C. Annexin 1 is phosphorylated in the multivesicular body during the processing of the epidermal growth factor receptor. J. Cell Biol. 1993. 120: 77-83.

45. Gatsios P., Terstegen L., Schliess F., Haussinger D., Kerr I.M., Heinrich P.C., Graeve L. Activation of the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription pathway by osmotic shock. J. Biol. Chem. 1998. 273: 22962-22968.

46. Glenney J.R., Chen J.W.S., Lazar C.S., Walton G.M., Zokas L.P., Rosenfeld M.G., Gill G.N. Ligand-induced endocytosis of the EGF receptor is blocked by mutant inactivation and by microinjection of anti-phosphotyrosine antibodies. Cell. 1988. 52: 675-684.

47. Guglielmo G.M., Baass P.C., Ou W.J., Posner B.I., Bergeron J.J. Compartmentalization of SHC, GRB2 and mSOS, and hyperphosphorylation of Raf-1 by EGF but not insulin in liver parenchyma. EMBO J. 1994. 13: 4269-4277.

48. Grandis J.R., Drenning S.D., Chakraborty A., Zhou M.Y., Zeng Q., Pitt A.S., Tweardy D.J. Requirement of Stat3 but not Statl activation for epidermal growth factor receptor- mediated cell growth In vitro. J. Clin. Invest. 1998.102:1385-1392.

49. Gruenberg J., Griffiths G., Howell K.E. Characterization of the early endosome and putative endocytic carrier vesicles in vivo andwith an assay of vesicle function in vitro. J. Cell Biol. 1989. 108: 1301-1316.

50. Haigler H.T., Willingham M.C., Pastan I. Inhibitors of 1251-epidermal growth factor internalization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. 94: 630-637.

51. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science. 1998. 279: 509-514.

52. Haspel R.L., Salditt Georgieff M., Darnell J.E., Jr. The rapid inactivation of nuclear tyrosine phosphorylated Statl depends upon a protein tyrosine phosphatase. EMBO J. 1996. 15: 6262-6268.

53. Hirokawa N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 1998. 279: 519-526.

54. Horvai A.E., Xu L., Korzus E., Brard G., Kalafus D., Mullen T.M. Rose D.W., Rosenfeld M.G., Glass C.K. Nuclear integration of JAK/STAT and Ras/AP-1 signaling by CBP and p300. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94: 1074-1079.

55. Jans D.A., Briggs L.J., Gustin S.E., Jans P., Ford S., Young I.G. The cytokine interleukin-5 (IL-5) effects cotransport of its receptor subunits to the nucleus in vitro. FEBS Lett. 1997. 410: 368-372.

56. Johnson H.M., Torres B.A., Green M.M., Szente B.E., Siler K.I., Larkin J., Subramaniam P.S. Hypothesis: ligand/receptor-assisted nuclear translocation of STATs. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998. 218: 149-155.

57. Kashles O., Szapary D., Bellot F., Ullrich A., Schlessinger J., Schmidt A. Ligand-induced stimulation of EGF-receptor mutants with altered trans-membrane region. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. 85: 9567-9571.

58. Kay D.G., Lai W.H., Uchihashi M., Khan M.N., Posner B.I., Bergeron J.J.M. EGF receptor kinase translocation and activation in vivo. J. Biol. Chem. 1986. 261: 8473-8480.

59. Keenan C; Kelleher D Protein kinase C and the cytoskeleton. Cell. Signal. 1998. 10: 225-232.

60. Khan M.N., Baquiran G., Brule C., Burgess J., Foster B., Bergeron. J.J., Posner B.I. Internalization and activation of the rat liver insulin receptor kinase in vivo. J. Biol. Chem. 1989. 264: 1293112940.

61. Klemm J.D., Schreiber S.L., Crabtree G.R. Dimerization as a regulatory mechanism in signal transduction. Annu. Rev. Immunol. 1998 16:569-592.

62. Koch C.A., Anderson D. Moran M.F., Ellis C. Pawson T. SH2 and SH3 domains: elements that control interactions of cytoplasmic signaling proteins. Science. 1991. 252: 668-674.

63. Margolis В., Rhee S.G., Felder S., Mervic M., Lyall R., Levitzki A., Ullrich A., Zilberstein A., Schlessinger J. EGF induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C-ll: a potential mechanism for EGF receptor signaling. Cell. 1989. 57:1101-1107.

64. Mayo K.H. Epidermal growth factor from the mouse. Biochemistry. 1995. 24: 3783-3794.

65. McCormick. How receptors turn Ras on. Nature. 1993. 363: 1516.

66. Melamed I., Franklin R.A., Gelfand E.W. Microfilament assembly is- required for anti-IgM dependent МАРК and p90rsk activation in human В lymphocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 209: 1102-1110.

67. Mermall V., Post P.L., Mooseker M.S. Unconventional myosins in cell movement, membrane traffic, and signal transduction. Science. 1998. 279: 527-533.

68. Mohammadi M., Honegger A., Sorokin A., Ullrich A., Schlessinger J., Hurwitz D.R. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 1993. 32: 8742-8748.

69. Nesterov A., Reshetnikova G., Vinogradova N., Nikolsky. Funktional state of the EGF receptor complexes duting their internalization in A431 cells. Mol. Cell. Biol. 1990. 10: 5011-5014. .

70. Nesterov A., Lysan S., Vdovina I., Nikolsky N., Fujita D.J. Phosphorylation of the epidermal growth factor receptor during internalization in A-431 cells. Arch. Biochem. Biophys. 1994. 313: 351-359.

71. Nigg E.A. Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanisms and regulation. Nature. 1997. 386: 779-787.

72. Pastan I.H., Willingham M.C. Receptor-mediated endocytosis of hormones in cultured cells. Ann. Rev. Phisiol. 1981. 43: 239-250.

73. Pawson T., Schlessinger J. SH2 and SH3 domains. Current Biol. 1993. 3: 434-441.

74. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal. Biochem. 1977. 83: 346-356.

75. Pfeffer L.M., Mullersman J.E., Pfeffer S.R., Murti A., Shi W.( Yang C.H. STAT3 as an adapter to couple phosphatidylinositol 3-kinase to the IFNAR1 chain of the type I interferon receptor. Science. 1997. 276: 1418-1420.

76. Riese D.J., Stern D.F. Specificity within the EGF family/ErbB receptor family signaling network. Bioessays. 1998. 20: 41-48.

77. Ruff-Jamison S., Chen K., Cohen S. Induction by EGF and interferon-g of tyrosine phosphorylated DNA binding proteins in mouse liver nuclei. Science. 1993. 261:1733-1736.

78. Sadowski H.B., Gilman M.Z. Cell-free activation of a DNA-binding protein by epidermal growth factor. Nature. 1993. 362: 79-83.

79. Sadowski H.B., Shuai K., Darnell J.E., Gilman M.Z. A common nuclear signal transduction pathway activated by growth factor and cytokine receptors. Science. 1993. 261:1739-1744.

80. Savage C.R., Cohen S. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterization. J. Biol. Chem. 1972. 247: 7609-7611.

81. Savage C.R., Cohen S. Proliferation of corneal epithelium induced by epidermal growth factor. Exp. Eye Res. 1973. 15: 361366.

82. Schindler C., Shuai K., Prezioso V.R., Darnell J.E. Interferon-dependent tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor. Science. 1992. 257: 809-813.

83. Schindler C., Fu X.Y., Improta T.( Aebersold R., Darnell J.E. Proteins of transcription factor ISGF-3: one gene encodes the 91-and 84-kDa ISGF-3 proteins that are activated by interferon alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992b. 89: 7836-7839.

84. Schlessinger J., Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 1992. 9: 383-391.

85. Schmalz D., Hucho F., Buchner K. Nuclear import of protein kinase C occurs by a mechanism distinct from the mechanism used by proteins with a classical nuclear localization signal. J. Cell Sci. 1998.111:1823-1830.

86. Sekimoto T., Imamoto N., Nakajima K., Hirano T., Yoneda Y. Extracellular signal-dependent nuclear import of Statl is mediated by nuclear pore-targeting complex formation with NPI-1, but not Rch1. EMBO J. 1997. 16: 7067-7077.

87. Shuai K., Shindler C., Prezioso V.R., Darnell J.E. Activation of transcription by IFN-g: tyrosine phosphorylation of a 91-kD DNA binding protein. Science. 1992. 258: 1808-1812.

88. Shuai K., Stark G.R., Kerr I.M., Darnell J.E. A single phosphotyrosine residue of stat91 required for gene activation by interferon-g. Science. 1993. 261:1744-1746.

89. Shuai K., Horvath C.M., Tsai Huang L.H., Qureshi S.A., Cowburn D., Darnell J.E. Interferon activation of the transcription factor Stat91 involves dimerization through SH2-phosphotyrosyl peptide interactions. Cell. 1994. 76: 821-828.

90. Silvennoinen O., Schindler C., Schlessinger J., Levy D.E. Ras-independent growth factor signaling by transcription factor tyrosine phosphorylation. Science. 1993. 261:1736-1739.

91. Singer W.D., Brown H.A., Sternweis P.C. Regulation of eukaryotic phosphatidylinositol-specific phospholipase C and phospholipase D. Annu. Rev. Biochem. 1997. 66: 475-509.

92. Smith H.M., Raikhel N.V. Nuclear localization signal receptor importin alpha associates with cytoskeleton. Plant Cell. 1998. 10: 1791-1799.

93. Soderquist A.M., Carpenter G. Glycosylation of the epidermal growth factor receptor in A-431 cells. The contribution of carbohydrate to receptor function. J. Biol. Chem. 1984. 259: 1258612594.

94. Sorkin A.D. Teslenko L.V. Nikolsky N.N. The endocytosis of epidermal growth factor in A431 cells: a pH of microenvironment and the dynamics of receptor complex dissociation. Exp. Cell Res. 1988. 175: 192-205.

95. Sorkin A., Carpenter G. Dimerization of internalized EGF receptor. J. Biol. Chem. 1991. 266: 23453-23460.

96. Sorokin A., Lemmon G., Ullrich A., Schlessinger J. Stabilization of an active dimeric form of EGFreceptor by introduction of an interreceptor disulfide bond. J. Biol. Chem. 1994. 269: 9752-9759.

97. Stancato L.F., Yu C.R., Petricoin E.F., 3rd, Larner A.C. Activation of Raf-1 by interferon gamma and oncostatin M requires expression of the Statl transcription factor. J. Biol. Chem. 1998. 273: 18701-18704.

98. Ullrich A., Schlessinger J. Signal transduction by receptor with tyrosine kinase activity. Cell. 1990. 61: 287-307.

99. Vieira A.V., Lamaze C., Schmid S.L., Control of EGF receptor signaling by clathrin-mediated endocytosis. Science. 1996. 274: 2086-2089.

100. Wada I., Lai W.H., Posner B.I., Bergeron J.J. Association of the tyrosine phosphorylated EGF receptor with a 55-kD tyrosine phosphorylated protein at the cell surface and in endosomes. J. Cell Biol. 1992. 116: 321-330.

101. Warren G. Trawling for receptors. Nature. 1990. 346: 318-319.

102. Wen Z., Zhong Z., Darnell J.E., Jr. Maximal activation of transcription by Statl and Stat3 requires both tyrosine and serine phosphorylation. Cell. 1995. 82: 241-250.

103. Wiesmuller L., Wittinghofer F. Signal transduction pathways involving Ras. Cell. Signal. 1994. 6: 247-267.

104. Wiley H.S., Cunningham D.D. The endocytic rate constant. A cellular parameter for quantitative receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 1982. 257: 4222-4229.

105. Xu X., Fu X.Y., Plate J., Chong A.S. IFN-gamma induces cell growth inhibition by Fas-mediated apoptosis: requirement of STAT1 protein for up-regulation of Fas and FasL expression. Cancer Res. 1998. 58: 2832-2837.

106. Xue L., Lucocq J. ERK2 signalling from internalized epidermal growth factor receptor in broken A431 cells. Cell. Signal. 1998. 10: 339-348.

107. Zhang J.J., Vinkemeier U., Gu W., Chakravarti D., Horvath C.M., Darnell J.E., Jr. Two contact regions between Statl and107

108. CBP/p300 in interferon gamma signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93: 15092-15096.

109. Zheng Z.M., Specter S. Delta-9-tetrahydrocannabinol: an inhibitor of STAT1 alpha protein tyrosine phosphorylation. Biochem. Pharmacol. 1996. 51: 967-973.

110. Zhu X., Wen Z., Xu L.Z., Darnell J.E., Jr. Statl serine phosphorylation occurs independently of tyrosine phosphorylation and requires an activated Jak2 kinase. Mol. Cell. Biol. 1997. 17: 6618-6623.