Динамика белков пострепликативной репарации ДНК Poln и hRad18 в клетках млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Никифоров, Андрей Анатольевич

• Никифоров, Андрей Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Никифоров, Андрей Анатольевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Пострепликативная репарация ДНК. Основные понятия и определения

2.2. Пострепликативная репарация ДНК у дрожжей З'.сегеушае

2.2.1. /¿40б-эпистатическая группа

2.2.2. Роль убиквитинирования в пострепликативной репарации ДНК

2.2.3. 8гб2 и связь пострепликативной репарации ДНК с рекомбинацией

2.3. Пострепликативная репарация ДНК путем синтеза с обходом повреждений

2.3.1. Пигментная ксеродерма вариантной формы, ХР-У

2.3.2. ДНК-полимераза т|

2.3.2.1. Данные биохимического анализа

2.3.2.2. Данные структурного анализа

2.3.3. Другие ДНК-полимеразы, способные осуществлять синтез с обходом повреждений

2.3.3.1. ДНК-полимераза I

2.3.3.2. ДНК-полимераза к

2.3.3.3. ДНК-полимераза С

2.3.3.4. hRevl

2.3.4. Двухполимеразная модель синтеза с обходом повреждений

2.3.5. Внутриядерная локализация Ро1ц в клетках человека

2.4. Пострепликативная репарация ДНК путем генной конверсии

2.5. Белок hRadl

2.6. Связь репликации поврежденной ДНК с контролем прохождения клеточного цикла

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Клеточные линии

3.2. Пептиды

3.3. Клонирование

3.4. Трансформация бактериальных штаммов и выделение плазмидной ДНК

3.5. Трансфекция и отбор стабильных трансфектантов

3.6. Обработка клеток метилметансульфонатом, стауроспорином и вортманнином

3.7. Анализ пострепликативной репарации ДНК

3.8. Иммуноблоттинг

3.9. Приготовление ядерных экстрактов клеток HeLa

3.10. Фосфорилирование in vitro

3.11. Фосфорилирование in vivo

3.12. Иммунофлуоресцентный анализ PCNA в фиксированных клетках

3.13. Микроскопия и анализ изображений

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин подавляет пострепликативную репарацию ДНК в клетках ХР-А

4.2. Исследование фосфорилирования ДНК-полимеразы т| в ответ на повреждение ДНК

4.2.1. С - концевой пептид Ро1г| не фосфорилируется in vitro

4.2.2. Ро1т] не фосфорилируется in vivo в ответ на повреждение ДНК

4.3. Исследование внутриядерной локализации белка пострепликативной репарация ДНК hRadl8 в клетках млекопитающих и характера ее изменения в ответ на повреждение ДНК

4.3.1. Создание вектора, кодирующего гибридный белок GFP-hRadl

4.3.2. Экспрессия и визуализация белка GFP-hRadl8 в клетках китайского хомячка (линии V79-4)

4.3.3. После действия ДНК-повреждающего агента ММС наблюдается накопление белка hRadl8 и его транслокация к местам заблокированных репликативных вилок

4.3.4. Стауроспорин ингибирует ММС-индуцированное накопление и транслокацию hRadl

4.3.5. Вортманнин ингибирует ММС-индуцированное накопление и транслокацию hRadl

4.4. Исследование фосфорилирования hRadl8 in vivo

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Динамика белков пострепликативной репарации ДНК Poln и hRad18 в клетках млекопитающих»

1.1. Актуальность проблемы.

Повреждения ДНК, возникающие в клетках эукариот под воздействием УФ-облучения и ряда химических агентов, эффективно удаляются при помощи эксцизионной репарации (ЭР) (Friedberg et al., 1995). Однако некоторые повреждения могут оставаться в ДНК к моменту вхождения клетки в S-фазу. Основные репликативные ДНК-полимеразы не способны осуществлять синтез на поврежденной матрице, поэтому при прохождении репликативной вилки через дефектный участок происходит ее блокировка, что ведет к появлению однонитевых пробелов в дочерней нити напротив поврежденного участка ДНК. Толерантность клетки к такого рода повреждениям, препятствующим завершению раунда репликации, обеспечивается пострепликативной репарацией ДНК (ПРР), посредством прямого обхода поврежденных нуклеотидов в матричной нити ДНК или за счет генной конверсии, при которой в качестве матрицы временно используется неповрежденная дочерняя нить сестринского дуплекса ДНК (Lehmann, 2002; McGowan, 2003).

На протяжении последних лет был открыт ряд новых ДНК-полимераз, способных осуществлять синтез с обходом повреждений в матричных нитях ДНК (Woodgate, 1999; Lehmann, 2002). ДНК-полимераза ц (Ро1т|) относится к группе этих полимераз и катализирует эффективное и точное встраивание остатков дАМФ напротив УФ-индуцированных циклобутановых тиминовых димеров (Johnson et al., 19996), тогда как при репликации неповрежденной матрицы ДНК-полимераза высокой точностью не обладает (Matsuda et al., 2000). Мутации гена Polrj приводят к увеличению риска возникновения рака кожи у пациентов, относящихся к вариантной группе Xeroderma pigmentosum (XP-V) (Masutani et al., 19996). Клетки XP-V обладают нормальной ЭР, но имеют дефект ПРР, наблюдаемый после облучения УФ-светом (Lehmann et al., 1975; Cordeiro-Stone et al., 1997). Ро1т| представляет собой дистрибутивный фермент и не может эффективно конкурировать с процессивными полимеразами Pole и Ро15 в процессе нормальной репликации. Обход повреждений с помощью Ро1г| необходим только когда репликативные комплексы останавливаются на повреждениях, блокирующих синтез ДНК. Как было показано, через несколько часов после повреждения ДНК Ро1т| накапливается в фокусах репликации, содержащих заблокированные репликативные вилки (Kannouche et al., 2001). После блокировки репликативных комплексов повреждениями ДНК Polî] замещает основную ДНК-полимеразу и катализирует элонгацию вновь синтезируемой нити ДНК на поврежденном участке матрицы, однако механизм, посредством которого Polrj накапливается в репликативных центрах и взаимодействует с белками репликативного комплекса, неизвестен.

В дрожжах S. cerevisiae оба пути ПРР контролируются белковым комплексом Rad6-Radl8 (Prakash, 1981; Bailly et al., 1994). Rad6 принадлежит к семейству убиквитин-конъюгирующих ферментов (Е2) (Jentsch et al., 1987), которые присоединяют убиквитин к молекуле белка-мишени при участии убиквитин-лигаз (ЕЗ) - еще одного класса ферментов, участвующих в процессе данной посттрансляционной модификации белков (Hershko, Ciechanover, 1998). Предполагается, что белок Rad6 перемещается к местам заблокированных повреждениями репликативных вилок за счет его взаимодействия с белком Radl8 (Ulrich, Jentsch, 2000). Radl8 - это содержащая RING finger-домен АТФ-зависимая убиквитин-лигаза ЕЗ, связывающаяся с однонитевой ДНК (Bailly et al., 1997). Было показано также, что при блоке репликации белковый комплекс Rad6-Radl 8 при участии белков MMS2-UBC13 (Е2) и Rad5 (ЕЗ) убиквитинирует белок PCNA, фактор процессивности ДНК-полимеразы 5. Причем, обнаружено два различных типа индуцированных повреждениями ДНК посттрансляционных модификаций PCNA, которые связаны с участием этого белка в том или другом пути ПРР (Hoege et al., 2002; Stelter, Ulrich, 2003).

Недавно был идентифицирован человеческий гомолог дрожжевого гена RADÏ8. Показано, что белок hRadl8 взаимодействует с человеческими гомологами белка Rad6 (hHR6A и hHR6B) и вовлечен в процесс ПРР (Tateishi et al., 2000; Xin et al., 2000). Инактивация гена mRadl8 у мышей приводит к чувствительности клеток к УФ-свету и ДНК-алкилирующему агенту метилметансульфонату (ММС), а также увеличивает частоту гомологической рекомбинации и индуцирует обмен сестринских хроматид (Tateishi et al., 2003). Однако механизм, посредством которого белок hRadl8 активируется после повреждения ДНК и регулирует ПРР в клетках человека, неизвестен.

Все большее количество данных указывает на тесную взаимосвязь процессов контроля репликации, ПРР и процессов регуляции прохождения клеточного цикла. Активно изучаются механизмы, при помощи которых белки ПРР, а также белки контроля временных точек прохождения клеточного цикла, перемещаются к местам заблокированных повреждениями ДНК репликативных вилок. Известно, что в регуляции активности многих из этих белков ключевую роль играет их фосфорилирование (Rouse, Jackson, 2002; Osborn et al., 2002).

В данной работе мы изучали свойства белков Ро1т] и hRadl8 и их роль в пострепликативной репарации ДНК в клетках млекопитающих.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Никифоров, Андрей Анатольевич

6. выводы

1. Обход поврежденных звеньев в матричной ДНК (пострепликативная репарация) в УФ-облученных клетках человека подавляется ингибитором протеинкиназ стауроспорином.

2. Гипотеза о том, что ДНК-полимераза т] фосфорилируется в ответ на повреждение ДНК, не подтвердилась.

3. Через 4-5 часов после обработки ДНК-повреждающим агентом метил-метансульфонатом в клетках происходит накопление белка ОРР-ЫЫ18.

4. В условиях торможения репликации, вызванного обработкой ММС, белок СРР-Ы1ас118 транслощфуется к местам заблокированных репликативных вилок, причем эта транслокация подавляется стауроспорином.

5. На основании полученных результатов предлагается модель, согласно которой торможение репликации ДНК на поврежденных нуклеотидах включает белковое фосфорилирование, которое индуцирует накопление белка Ы1ас118 в заблокированных центрах репликации и стимулирует обход повреждений.

7. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Svetlova MP., Solovjeva L.V., Nikiforov A.A., Chagin V.O., Lehmann A.R., Tomilin N.V. 1998. Staurosporine-sensitive protein phosphorylation is required for postreplication DNA repair in human cells. FEBS Letters. 428: 23-26.

2. Никифоров A.A., Светлова М.П., Соловьева Л.В., Циглер M., Оеи Ш., Томилин Н.В. 2002. Иммобилизация белков пострепликативной репарации hRadl8 и ДНК полимеразы эта в местах остановки репликативных вилок в клетках млекопитающих. Тезисы докладов и сообщений, представленных на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра". Цитология (Tsitologia). 44(9). стр. 897.

3. Никифоров А.А., Сасина Л.К., Светлова М.П., Соловьева Л.В., Оеи Ш.Л., Бредбери Э.М., Томилин Н.В. 2003. Ранняя иммобилизация нуклеазы FEN1 и накопление белка hRAD18 в заблокированных вилках репликации ДНК в клетках млекопитающих. Доклады Академии Наук. 289(6): 122-126.

4. Nazarov I.B., Smirnova A.N., Krutilina R.I., Svetlova M.P., Solovjeva L.V., Nikiforov A.A., Oei S.-L., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M. and Tomilin N.V. 2003. Dephosphorylation of histone y-H2AX during repair of DNA double-strand breaks in mammalian cells and its inhibition by calyculin A. Radiation Research. 160(3): 309-317.

5. Никифоров А.А., Светлова М.П., Соловьева Л.В., Циглер M., Оеи Ш., Николаишвили-Файнберг Н., Кордейро-Стоун М., Томилин Н.В. 2004. Исследование динамики некоторых белков пострепликативной репарации ДНК в клетках млекопитающих после обработки канцерогенами. Цитология (Tsitologia). 46(1): 43-52.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность д-ру. С. Татеиши (S. Tateishi, Университет Кумамото, Япония) за любезно предоставленную плазмиду pcDNA3-hRadl8; д-ру А. Леману (А. R. Lehmann, Университет Сассекса, Брайтон, Великобритания) за любезно предоставленный клон SV40-трансформированных фибробластов человека XP30RO (XP-V), стабильно экспрессирующий гибридный белок GFP-Polr|; д-ру Ф. Ханавальту (Р. Hanawalt, Стенфордский Университет, США) за любезно предоставленные S V4 О-трансформированные фибробласты больных пигментной ксеродермой группы комплементации А (клеточная линия XP12RO).

Особую признательность и благодарность я хочу выразить своим научным руководителям к.б.н. М. П. Светловой и чл.- корр. РАН, д.б.н. Н. В. Томилину. Хочу поблагодарить всех сотрудников Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии за поддержку, помощь в работе над диссертацией и полезное обсуждение результатов.

Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам М. Циглеру (М. Ziegler), Ш. Оеи (S.L. Oei), Н. Николаишвили-Файнберг (N. Nikolaishvili-Feinberg) и М. Кордейро-Стоун (М. Cordeiro-Stone) за высокий интерес к теме данной работы, полезное обсуждение результатов и содействие в подготовке публикаций.

Исследование поддержано Российским Фондом Фундаментальных исследований, проекты: 01-04-49486 и 02-04-49145; Отделением науки американского министерства энергетики, грант №. DE-FG03-01ER63070; Национальным институтом здоровья США, гранты №. 5R01-HD39830-02 и СА55065; Немецким исследовательским обществом, грант №. 436RUS113/126/0.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Никифоров, Андрей Анатольевич, 2004 год

1. Соловьева Л.В., Светлова М.П. Хэнкок Р., Уиттл Р., Леман А.Р., Боотсма Д., Томилин Н.В. 1996. Двойственная функция ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) в ответе клеток человека на УФ-повреждения. Цитология. 38: 1294-1302.

2. Abraham R.T. 2001. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev. 15(17): 2177-2196.

3. Aguilera A., Klein H.L. 1988. Genetic control of intrachromosomal recombination in Saccharomyces cerevisiae. I. Isolation and genetic characterization of hyper-recombination mutations. Genetics. 119(4): 779-790.

4. Avkin S., Adar S., Blander G., Livneh Z. 2002. Quantitative measurement of translesion replication in human cells: evidence for bypass of abasic sites by a replicative DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(6): 3764-3769.

5. Bailly V., Lamb J., Sung P., Prakash S., Prakash L. 1994. Specific complex formation between yeast RAD6 and RAD 18 proteins: a potential mechanism fortargeting RAD6 ubiquitin-conjugating activity to DNA damage sites. Genes Dev. 8(7): 811-820.

6. Bailly V., Lauder S., Prakash S., Prakash L. 1997. Yeast DNA repair proteins Rad6 and Rad 18 form a heterodimer that has ubiquitin conjugating, DNA binding, and ATP hydrolytic activities. J. Biol. Chem. 272(37): 23360-23365.

7. Bartek J., Lukas J. 2003. Chkl and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer. Cancer Cell. 3(5): 421-429.

8. Bebenek K., Matsuda T., Masutani C., Hanaoka F., Kunkel T.A. 2001. Proofreading of DNA polymerase eta-dependent replication errors. J. Biol. Chem. 276: 2317-2320.

9. Bergoglio V., Bavoux C., Verbiest V., Hoffinann J.S., Cazaux C. 2002. Localisation of human DNA polymerase kappa to replication foci. J. Cell Sei. 115: 4413-4418.

10. Bravo R., MacDonald-Bravo H. 1987. Existence of two populations of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: association with DNA replication sites. J. Cell. Biol. 105: 1549-1554.

11. Bresson A., Fuchs R.P. 2002. Lesion bypass in yeast cells: Pol eta participates in a multi-DNA polymerase process. EMBO J. 21: 3881-3887.

12. Broomfield S., Chow B.L., Xiao W. 1998. MMS2, encoding a ubiquitin-conjugating-enzyme-like protein, is a member of the yeast error-free postreplication repair pathway. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95: 5678-5683.

13. Buhl S.N., Stillman R.M., Setlow RB., Regan J.D. 1972. DNA chain elongation and joining in normal human and xeroderma pigmentosum cells after ultraviolet irradiation. Biophys. J. 12(9): 1183-1191.

14. Buhl S.N., Regan J.D. 1973. Repair endonuclease-sensitive sites in daughter DNA of ultraviolet-irradiated human cells. Nature. 246: 484.

15. Cejka P., Vondrejs V., Storchova Z. 2001. Dissection of the functions of the Saccharomyces cerevisiae RAD6 postreplicative repair group in mutagenesis and UV sensitivity. Genetics. 159(3): 953-963.

16. Chanet R., Heude M., Adjiri A., Maloisel L., Fabre F. 1996. Semidominant mutations in the yeast Rad51 protein and their relationships with the Srs2 helicase. Mol. Cell. Biol. 16(9): 4782-4789.

17. Chini C.C., Chen J. 2003. Human claspin is required for replication checkpoint control. J. Biol. Chem. 278(32): 30057-30062.

18. Cliby W.A., Roberts C.J., Cimprich K.A., Stringer C.M., Lamb J.R., Schreiber S.L., Friend S.H. 1998. Overexpression of a kinase-inactive ATR protein causes sensitivity to DNA-damaging agents and defects in cell cycle checkpoints. EMBO J. 17(1): 159-169.

19. Cordeiro-Stone M., Zaritskaya L.S., Price L.K., Kaufmann W. 1997. Replicationfork bypass of a pyrimidine dimer blocking leading strand DNA synthesis. J. Biol. Chem. 272: 13945-13954.

20. Cordonnier A.M., Fuchs R.P. 1999. Replication of damaged DNA: molecular defect in xeroderma pigmentosum variant cells. Mutat. Res. 435: 111-119.

21. Cordonnier A.M., Lehmann A.R., Fuchs R.P.P. 1999. Impaired translesion synthesis in xeroderma pigmentosum extracts. Mol. Cell. Biol. 19: 2206-2211.

22. Cortez D., Guntuku S., Qin J., Elledge S.J. 2001. ATR and ATRIP: partners in checkpoint signaling. Science. 294: 1713-1716.

23. Dart D.A., Adams K.E., Akerman I., Lakin N.D. 2004. Recruitment of the cell cycle checkpoint kinase ATR to chromatin during S-phase. J. Biol. Chem. 279(16): 16433-16440.

24. Delarue M., Poch O., Tordo N., Moras D., Argos P. 1990. An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng. 3: 461-467.

25. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellenberger T. 1998. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. Nature. 391:251-258.

26. Ensch-Simon I., Burgers P.M., Taylor J.S. 1998. Bypass of a site-specific cis-syn thymine dimer in an SV40 vector during in vitro replication by HeLa and XPV cellfree extracts. Biochemistry. 37: 8218-8226.

27. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W. 1995. DNA repair and mutagenesis. American Society for Microbiology, Washington, DC.

28. Furnari B., Rhind N., Russell P. 1997. Cdc25 mitotic inducer targeted by chkl DNA damage checkpoint kinase. Science. 277: 1495-1497.

29. Gerlach V.L., Aravind L., Gotway G., Schultz R.A., Koonin E.V. 1999. Friedberg E.C., Human and mouse homologues of Escherichia coli DinB (DNA polymerase IV): members of the UmuC/DinB superfamily, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96: 11922-11927.

30. Gerlach V.L., Feaver W.J., Fischhaber P.L., Friedberg E.C. 2001. Purification and characterization of polic: a DNA polymerase encoded by the human DINB1 gene. J. Biol. Chem. 276:92-98.

31. Gibbs P.E.M., McGregor W.G., Maher V.M., Nisson P., Lawrence C.W. 1998. A human homologue of the Saccharomyces cerevisiae REV3 gene, which encodes the catalytic subunit of DNA polymerase £ Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 6876-6880.

32. Guo D., Wu X., Rajpal D.K., Taylor J.S., Wang Z. 2001. Translesion synthesis by yeast DNA polymerase zeta from templates containing lesions of ultraviolet radiation and acetylaminofluorene. Nucleic Acids Res. 29: 2875-2883.

33. Haracska L., Yu S.L., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S. 2000. Efficient and accurate replication in the presence of 7,8-dihydro-8-oxoguanine by DNA polymerase eta. Nat. Genet. 25:458-461.

34. Haracska L., Johnson R.E, Unk I., Phillips B., Hurwitz J., Prakash L., Prakash S. 2001a. Physical and functional interactions of human DNA polymerase eta with PCNA. Mol. Cell. Biol. 21: 7199-7206.

35. Haracska L., Johnson R.E., Unk I., Phillips B.B., Hurwitz J., Prakash L., Prakash S. 20016. Targeting of human DNA polymerase iota to the replication machinery via interaction with PCNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 14256-14261.

36. Haracska L., Kondratick C.M., Unk I., Prakash S., Prakash L. 2001b. Interaction with PCNA is essential for yeast DNA polymerase eta function. Mol. Cell. 8: 407415.

37. Haracska L., Unk I., Johnson R.E., Johansson E., Burgers P.M., Prakash S., Prakash L. 2001r. Roles of yeast DNA polymerases delta and zeta and of Revi in the bypass of abasic sites. Genes Dev. 15(8): 945-954.

38. Haracska L., Prakash L., Prakash S. 2002a. Role of human DNA polymerase kappa as an extender in translesion synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(25): 16000-16005.

39. Haracska L., Prakash S., Prakash L. 20026. Yeast Revi protein is a G template specific DNA polymerase, J. Biol. Chem. 277(18): 15546-15551.

40. Haracska L., Unk I., Johnson R.E., Phillips B.B., Hurwitz J., Prakash L., Prakash S. 2002b. Stimulation of DNA synthesis activity of human DNA polymerase kappa by PCNA. Mol. Cell. Biol. 22: 784-791.

41. Heífernan T.P., Simpson D.A., Frank A.R., Heinloth A.N., Paules R.S., Cordeiro-Stone M., Kaufmann W.K. 2002. An ATR- and Chkl-dependent S checkpoint inhibits replicón initiation following UVC-induced DNA damage. Mol. Cell. Biol. 22(24): 8552-8561.

42. Hershko A., Ciechanover A. 1998. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67: 425-479.

43. Higgins N.P., Kato K., Strauss B. 1976. A model for replication repair in mammalian cells. J. Mol. Biol. 101(3): 417-425.

44. Hochstrasser M. 1996. Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Genet. 30: 405^39.

45. Hoege C., Pfander B., Moldovan G.L., Pyrowolakis G., Jentsch S. 2002. RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO. Nature. 419: 135-141.

46. Hofmann R.M., Pickart C.M. 1999. Noncanonical MMS^-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repair. Cell. 96: 645-653.

47. Hutchins J.R, Hughes M., Clarke P.R 2000. Substrate specificity determinants of the checkpoint protein kinase Chkl. FEBS Lett. 466(1): 91-95.

48. Jackson J.R., Gilmartin A., Imburgia C., Winkler J.D., Marshall L.A., Roshak A. 2000. An indolocarbazole inhibitor of human checkpoint kinase (Chkl) abrogates cell cycle arrest caused by DNA damage. Cancer Res. 60: 566-72.

49. Jentsch S., McGrath J.P., Varshavsky A. 1987. The yeast DNA repair gene RAD6 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Nature. 329: 131-134

50. Johnson R.E., Prakash S., Prakash L. 1994. Yeast DNA repair protein RAD5 that promotes instability of simple repetitive sequences is a DNAdependent ATPase. J. Biol. Chem. 269:28259-28262.

51. Johnson R.E., Kondratick CM., Prakash S., Prakash L. 1999a. hRAD30 mutations in the variant form of xeroderma pigmentosum. Science. 285: 263-265.

52. Johnson RE., Prakash S., Prakash L. 19996. Efficient bypass of a thymine-thymine dimer by yeast DNA polymerase, Pol1). Science. 283: 1001-1004.

53. Johnson R.E., Washington M.T., Haracska L., Prakash S., Prakash L. 2000a. Eukaryotic polymerases iota and zeta act sequentially to bypass DNA lesions. Nature. 406: 1015-1019.

54. Johnson R.E., Washington M.T., Prakash S., Prakash L. 20006. Fidelity of human DNA polymerase eta. J. Biol. Chem. 275: 7447-7450.

55. Johnson R.E., Haracska L., Prakash S., Prakash L. 2001. Role of DNA polymerase zeta in the bypass of a (6-4) TT photoproduct. Mol. Cell Biol. 21: 35583563.

56. Kamiuchi S., Saijo M., Citterio E., de Jager M., Hoeijmakers J.H., Tanaka K. 2002. Translocation of Cockayne syndrome group A protein to the nuclear matrix: possible relevance to transcription-coupled DNA repair. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 99: 201-206.

57. Kannouche P., Broughton B.C., Volker M., Hanaoka F., Mullenders L.H.F., Lehmann A.R. 2001. Domain structure, localization and function of DNA polymerase eta, defective in xeroderma pigmentosum variant cells. Genes Dev. 15: 158-172.

58. Kiefer J.R., Mao C., Braman J.C., Beese L.S. 1998. Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. Nature. 391:304-307.

59. Kim K.I., Baek S.H., Chung C.H. 2002. Versatile protein tag, SUMO: its enzymology and biological function. J. Cell Physiol. 191(3): 257-268.

60. Kondratick C.M., Washington M.T., Prakash S., Prakash L. 2001. Acidic residues critical for the activity and biological function of yeast DNA polymerase eta. Mol. Cell. Biol. 21:2018-2025.

61. Y., Korolev S., Waksman G. 1998. Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: Structural basis for nucleotide incorporation. EMBO J. 17: 75147525.

62. Madsen P., Celis J.E. 1985. S-phase patterns of cyclin (PCNA) antigen staining resemble topographical patterns of DNA synthesis. A role for cyclin in DNA replication? FEBS Lett. 193:5-11.

63. Masutani C., Araki M., Yamada A., Kusumoto R., Nogimori T., Maekawa T., Iwai S., Hanaoka F. 1999a. Xeroderma pigmentosum variant (XP-V) correcting protein from HeLa cells has a thymine dimer bypass DNA polymerase activity. EMBO J. 18: 3491-3501.

64. Masutani C., Kusumoto R, Yamada A., Dohmae N., Yokoi M., Yuasa M., Araki M., Iwai S., Takio K., Hanaoka F. 19996. The human XP-V (xeroderma pigmentosum variant) gene encodes human polymerase eta. Nature. 399: 700-704.

65. Masutani C., Kusumoto R, Iwai S., Hanaoka F. 2000. Mechanisms of accurate translesion synthesis by human DNA polymerase eta. EMBO J. 19: 3100-3109.

66. Matsuda T., Bebenek K., Masutani C., Hanaoka F., Kunkel T. 2000. Low fidelity DNA synthesis by human DNA polymerase-eta. Nature. 404: 1011-1013.

67. McDonald J.P., Rapic-Otrin V., Epstein J.A., Broughton B.C., Wang X., Lehmann A.R., Wolgemuth D.J., Woodgate R. 1999. Novel human and mouse homologues of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase eta. Genomics. 60: 20-30.

68. McGowan C.H. 2003. Running into problems: how cells cope with replicating damaged DNA. Mutat. Res. 532: 75-84. ,

69. Melo J., Toczyski D. 2002. A unified view of the DNA-damage checkpoint. Cutt. Opin. Cell. Biol. 14(2): 237-245.

70. Merrick C.J., Jackson D., Diffley J. 2004. Visualisation of altered replication dynamics after DNA damage in human cells. J. Biol. Chem. (in press)

71. Miao H., Seiler J. A., Burhans W.C. 2003. Regulation of cellular and SV40 virus origins of replication by Chkl-dependent intrinsic and UVC radiation-induced checkpoints. J. Biol. Chem. 278(6): 4295-4304.

72. Nelson J.R., Lawrence C.W., Hinkle D.C. 1996a. Deoxycytidyl transferase activity of yeast REV1 protein. Nature. 382: 729-731.

73. Nelson J.R., Lawrence C.W., Hinkle D.C. 19966. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase zeta. Science. 272: 1646-1649.

74. Nelson J.R., Gibbs P.E., Nowicka A.M., Hinkle D.C., Lawrence C.W. 2000. Evidence for a second function for Saccharomyces cerevisiae Revlp. Mol. Microbiol. 37: 549-554.

75. Ogi T., Kato T., Ohmori H. 1999. Mutation enhancement by DINB1: a mammalian homologue of the Escherichia coli mutagenesis protein dinB. Genes Cells. 4: 607-618.

76. Ohashi E., Bebenek K., Matsuda T., Feaver W.J., Gerlach V.L., Friedberg E.C., Ohmori H.,. Kunkel T.A. 2000a. Fidelity and processivity of DNA synthesis by DNA polymerase Kappa: the product of the human DINB1 gene. J. Biol. Chem. 275: 39678-39684.

77. Ohashi E., Ogi T., Kusumoto R., Iwai S., Masutani C., Hanaoka F., Ohmori H. 20006. Error-prone bypass of certain DNA lesions by the human DNA polymerase Kappa. Genes Dev. 14: 1589-1594.

78. Ohmori H., Friedberg E.C., Fuchs R.P.P., Goodman M.F., Hanaoka F., Hinkle D., Kunkel T.A., Lawrence C.W., Livneh Z., Nohmi T., et al. 2001. The Y-family of DNA polymerases. Mol. Cell. 8: 7-8.

79. Osborn A.J., Elledge S.J., Zou L. 2002. Checking on the fork: the DNA-replication stress-response pathway. Trends Cell Biol. 12(11): 509-516.

80. Pickart C.M. 2000. Ubiquitin in chains. Trends Biochem. Sci. 25: 544-548.

81. Prakash L. 1981. Characterization of postreplication repair in Saccharomyces cerevisiae and effects of rad6, radl8, rev3 and rad52 mutations. Mol. Gen Genet. 184(3): 471-478.

82. Prakash S., Sung P., Prakash L. 1993. DNA repair genes and proteins of Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Genet. 27: 33-70.

83. Prakash S., Prakash L. 2002. Translesion DNA synthesis in eukaryotes: A one- or two-polymerase affair. Genes Dev. 16: 1872-1883.

84. Rong L., Palladino F., Aguilera A., Klein H.L. 1991. The hyper-gene conversion hpr5-l mutation of Saccharomyces cerevisiae is an allele of the SRS2/RADH gene. Genetics. 127(1): 75-85.

85. Rong L., Klein H.L. 1993. Purification and characterization of the SRS2 DNA helicase of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 268(2): 1252-1259.

86. Rouse J., Jackson S.P. 2002. Interfaces between the detection, signaling, and repair of DNA damage. Science. 297: 547-551.

87. Rupp W.D., Howard-Flanders P. 1968. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. J. Mol. Biol. 31(2): 291-304.

88. Rupp W.D., Wilde C.E. 3rd, Reno D.L., Howard-Flanders P. 1971. Exchanges between DNA strands in ultraviolet-irradiated Escherichia coli. J. Mol. Biol. 61(1): 2544.

89. Sarkaria J.N., Tibbetts RS., Busby E.C., Kennedy A.P., Hill D.E., Abraham RT. 1998. Inhibition of phosphoinositide 3-kinase related kinases by the radiosensitizing agent wortmannin. Cancer Res. 58(19): 4375-4382.

90. Schiestl R.H., Gietz R.D., Hastings P. J., Wintersberger U. 1990a. Interchromosomal and intrachromosomal recombination in rad 18 mutants of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Gen. Genet 222(1): 25-32.

91. Schiestl R.H., Prakash S., Prakash L. 19906. The SRS2 suppressor of rad6 mutations of Saccharomyces cerevisiae acts by channeling DNA lesions into the RAD52 DNA repair pathway. Genetics. 124(4): 817-831.

92. Schwartz D.C., Hochstrasser M.A. 2003. Superfamily of protein tags: ubiquitin, SUMO and related modifiers. Trends Biochem. Sei. 28(6): 321-328.

93. Scully R., Chen J., Ochs R.L., Keegan K., Hoekstra M., Feunteun J., Livingston D.M. 1997. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell. 90:425-435.

94. Sogo J.M., Lopes M., Foiani M. 2002. Fork reversal and ssDNA accumulation at stalled replication forks owing to checkpoint defects. Science. 297: 599-602.

95. Spence J., Sadis S., Haas A.L., Finley D.A. 1995. Ubiquitin mutant with specific defects in DNA repair and multiubiquitination. Mol. Cell. Biol. 15(3): 1265-1273.

96. Spivak G., Hanawalt P.C. 1992. Translesion DNA synthesis in the dihydrofolate reductase domain of UV-irradiated CHO cells. Biochemistry. 31(29): 6794-6800.

97. Stelter P., Ulrich H.D. 2003. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation. Nature. 425(6954): 188-191.

98. Stokes M.P., Van Hatten R., Lindsay H.D., Michael W.M. 2002. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell. Biol. 158(5): 863-872.

99. Svetlova M.P., Solovjeva L.V., Nikiforov A.A., Chagin V.O., Lehmann A.R., Tomilin N.V. 1998. Staurosporine-sensitive protein phosphorylation is required for postreplication DNA repair in human cells. FEBS Letters. 428: 23-26.

100. Svetlova M.P., Nikiforov A.A., Solovjeva L.V., Pleskach N.M., Tomilin N.V., Hanawalt P.C. 1999. Reduced extractability of the XPA DNA repair protein in ultraviolet light-irradiated mammalian cells. FEBS Letters. 463: 49-52.

101. Svoboda D.L., Briley L.P., Vos J.M. 1998. Defective bypass replication of a leading strand cyclobutane thymine dimer in xeroderma pigmentosum variant cell extracts. Cancer Res. 58: 2445-2448.

102. Tateishi S., Sakuraba Y., Masuyama S., Inoue H., Yamaizumi M. 2000. Dysfunction of human Radl8 results in defective postreplication repair and hypersensitivity to multiple mutagens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 7927-7932.

103. Tateishi S., Niwa H., Miyazaki J., Fujimoto S., Inoue H., Yamaizumi M. 2003. Enhanced genomic instability and defective postreplication repair in RAD 18 knockout mouse embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 23: 474-481.

104. Tibbetts R.S., Cortez D., Brumbaugh K.M., Scully R., Livingston D., Elledge S.J., Abraham R.T. 2000. Functional interactions between BRCA1 and the checkpoint kinase ATR during genotoxic stress. Genes Dev. 14(23): 2989-3002.

105. Tissier A., Frank E.G., McDonald J.P., Iwai S., Hanaoka F., Woodgate R. 2000a. Mis-insertion and bypass of thymine-thymine dimers by human DNA polymerase iota. EMBO J. 19: 5259-5266.

106. Tissier A., McDonald J.P., Frank E.G., Woodgate R. 20006. Poll, a remarkably error-prone human DNA polymerase. Genes Dev. 14: 1642-1650.

107. Torres-Ramos C.A., Yoder B.L., Burgers P.M., Prakash S., Prakash L. 1996. Requirement of proliferating cell nuclear antigen in RAD6-dependent postreplicational DNA repair. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93(18): 9676-9681.

108. Torres-Ramos C.A., Prakash S., Prakash L. 1997. Requirement of yeast DNA polymerase delta in post-replicational repair of UV-damaged DNA. J. Biol. Chem. 272(41): 25445-25448.

109. Torres-Ramos C.A., Prakash S., Prakash L. 2002. Requirement of RAD5 and MMS2 for postreplication repair of UV-damaged DNA in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 22(7): 2419-2426.

110. Trincao J., Johnson R.E., Escalante C.R., Prakash S., Prakash L., Aggarwal A.K. 2001. Structure of the catalytic core of S. cerevisiae DNA polymerase eta: Implications for translesion DNA synthesis. Mol. Cell. 8:417-426.

111. Ulrich H.D., Jcntsch S. 2000. Two RING finger proteins mediate cooperation between ubiquitin-conjugating enzymes in DNA repair. EMBO J. 19: 3388-3397.

112. Veaute X., Jeussct J., Soustelle C., Kowalczykowski S.C., Le Cam E., Fabre F. 2003. The Srs2 helicase prevents recombination by disrupting Rad51 nucleoprotein filaments. Nature. 423: 309-312.

113. Wang Y., Cortez D., Yazdi P., NeffN., Elledge S. J., Qin J. 2000. BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures. Genes Dev. 14: 927-39.

114. Ward I.M., Chen, J. 2001. Histone H2AX Is Phosphoiylated in an ATR-dependent Manner in Response to Replicational Stress. J. Biol. Chem. 276: 4775947762.

115. Ward I.M., Minn K, Chen J. 2004. UV-induced ATR activation requires replication stress. J. Biol. Chem. 279: 9677-9680.

116. Washington M.T., Johnson RE., Prakash L., Prakash S. 2002. Human DINB1-encoded DNA polymerase kappa is a promiscuous extender of mispaired primer termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(4): 1910-1914.

117. Webb B.L., Cox M.M., Inman RB. 1997. Recombinational DNA repair: the RecF and RecR proteins limit the extension of RecA filaments beyond single-strand DNA gaps. Cell. 91(3): 347-356.

118. Weissman A.M. 2001. Themes and variations on ubiquitylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2(3): 169-178.

119. West S.C., Cassuto E., Howard-Flanders P. 1981. Mechanism of E. coli RecA protein directed strand exchanges in post-replication repair of DNA. Nature. 294: 659662.

120. Woodgate R 1999. A plethora of lesion-replicating DNA polymerases. Genes & Dev. 13: 2191-2195.

121. Xiao W., Chow B.L., Fontanie T., Ma L., Bacchetti S. et al„ 1999. Genetic interactions between error-prone and error-free postreplication repair pathways in Saccharomyces cerevisiae. Mutat. Res. 435: 1-11.

122. Xiao W., Chow B.L., Broomfield S., Hanna M. 2000. The Saccharomyces cerevisiae RAD6 group is composed of an error-prone and two error-free postreplication repair pathways. Genetics. 155(4): 1633-1641.

123. Xiao Z., Chen Z., Gunasekera A.H., Sowin T.J., Rosenberg S.H., Fesik S., Zhang H. 2003. Chkl mediates S and G2 arrests through Cdc25A degradation in response to DNA-damaging agents. J. Biol. Chem. 278: 21767-21773.

124. Xin H., Lin W., Sumanasekera W., Zhang Y., Wu X., Wang Z. 2000. The human RAD 18 gene product interacts with HHR6A and HHR6B. Nucleic Acids Res. 28: 2847-2854.

125. Yamada A., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F. 2000. Complementation of defective translesion synthesis and UV light sensitivity in xeroderma pigmentosum variant cells by human and mouse DNA polymerase eta. Nucleic Acids Res. 28(13): 2473-2480.

126. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Rechkoblit O., Taylor J.S., Geacintov N.E., Wang Z. 2000a. Error-prone lesion bypass by human DNA polymerase eta. Nucleic Acids Res. 28: 4717-4724.

127. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Wang M., Rechkoblit O., Taylor J.S., Geacintov N.E., Wang Z. 20006. Error-free and error-prone lesion bypass by human DNA polymerase kappa in vitro. Nucleic Acids Res. 28: 4138-4146.

128. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Wang Z. 2000b. Preferential incorporation of G opposite template T by the low-fidelity human DNA polymerase iota. Mol. Cell. Biol. 20: 7099-7108.

129. Zhang Y., Yuan F., Xin H., Wu X., Rajpal D.K., Yang D., Wang Z. 2000r. Human DNA polymerase kappa synthesizes DNA with extraordinarily low fidelity. Nucleic Acids Res. 28: 4147-4156.

130. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Taylor J.S., Wang Z. 2001. Response of human DNA polymerase iota to DNA lesions, Nucleic Acids Res. 29: 928-935.

131. Zhang Y., Wu X., Guo D., Rcchkoblit O., Geacintov N.E., Wang Z. 2002a. Two-step error-prone bypass of the (+)- and (-)-trans-anti-BPDE-N2-dG adducts by human DNA polymerases eta and kappa. Mutat. Res. 510(1-2): 23-35.

132. Zhang Y., Wu X., Rechkoblit O., Geacintov N.E., Taylor J.S., Wang Z. 20026. Response of human REV1 to different DNA damage: preferential dCMP insertion opposite the lesion. Nucleic Acids Res. 30: 1630-1638.

133. Zhao H., Piwnica-Worms H. 2001. ATR-mediated checkpoint pathways regulate phosphorylation and activation of human Chkl. Mol. Cell. Biol. 21(13): 4129-4139.

134. Zhao B., Bower M.J., McDevitt P.J., Zhao H., Davis S.T., Johanson K.O., Green S.M., Concha N.O., Zhou, B.B. 2002. Structural basis for Chkl inhibition by UCN-01. J. Biol. Chem. 277:46609-46615.

135. Zou L., Cortez D., Elledge S.J. 2002. Regulation of ATR substrate selection by Radl7-dependent loading of Rad9 complexes onto chromatin. Genes Dev. 16: 198208.

136. Zou L., Elledge S.J. 2003. Sensing DNA damage through ATRIP recognition of RPA-ssDNA complexes. Science. 300: 1542-1548.