Злокачественные эпителиальные опухоли тела матки: оптимизация диагностики и индивидуального прогнозирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Коваленко Надежда Витальевна

• Коваленко Надежда Витальевна
• доктор наук
• 2024

Оглавление диссертации доктор наук Коваленко Надежда Витальевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРАХ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ РАКА ТЕЛА МАТКИ И ЛЕТАЛЬНЫХ ИСХОДАХ ЗАБОЛЕВАНИЯ (литературный обзор)

1.1 Распространенность рака тела матки в России и факторы риска развития заболевания

1.2 Регионарные особенности заболеваемости и смертности от рака тела матки в Российской Федерации

1.3 Молекулярно-генетическая классификация рака тела матки

1.4 Диагностические и прогностические возможности анализа белкового спектра мочи при раке тела матки

1.5 Современные системы стратификации риска прогрессирования рака тела матки и возможности ее оптимизации путем учета результатов генетических исследований

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общий дизайн исследования

2.2 Общая характеристика пациентов

2.3 Методы исследования

Глава 3. АНАЛИЗ ВЫЖИВАЕМОСТИ ПАЦИЕНТОК СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ ОПУХОЛЯМИ ТЕЛА МАТКИ

Глава 4. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ИХ ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНЕВОЙ ЭКСПРЕССИИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТЕЛА МАТКИ

4.1 Диагностическая и дифференциальная информативность определения молекулярных маркеров сыворотки крови у больных с эндометриальной карциномой и редкими формами рака тела матки

4.2 Прогностическая информативность исходного определения молекулярных маркеров сыворотки крови у больных с эндометриальной карциномой и редкими формами рака тела матки

4.3 Прогностическая информативность мониторинга молекулярных маркеров сыворотки крови у больных с эндометриальной карциномой и редкими формами рака тела матки

4.4 Дифференциальное различие и влияние опухолевой экспрессии онкомаркеров на прогрессирование заболевания у больных с эндометриальной карциномой и редкими формами рака тела матки

Глава 5. ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ И

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АСПИРАЦИОННОЙ

БИОПСИИ ЭНДОМЕТРИЯ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТЕЛА МАТКИ

5.1 Особенности протеомного профиля маточного аспирата у больных с эндометриальной карциномой и редкими формами рака тела матки

5.2 Диагностическая информативность количественного определения концентрации DJ-1 в маточном аспирате при диагностике рака тела матки

5.3 Диагностическая информативность количественного определения концентрации белка минихромосомной защиты МСМ5 в маточном аспирате при диагностике рака тела матки

Глава 6. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ИНФОРМАТИВНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ В МОЧЕ И ВЛАГАЛИЩНО-

ЦЕРВИКАЛЬНОМ СЕКРЕТЕ ПРИ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА

ТЕЛА МАТКИ

Глава 7. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТЕЛА МАТКИ

РАЗЛИЧНОГО ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ТИПА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Злокачественные эпителиальные опухоли тела матки: оптимизация диагностики и индивидуального прогнозирования»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Рак тела матки (РТМ) относится к распространенным злокачественным гинекологическим заболеваниям, занимая 6 место по распространенности среди женщин, страдающих онкологической патологией (Клинышкова Т., 2020; Важенин А.В. и соавт., 2021; Tzur T. et al., 2017). Ежегодно в мире рак тела матки диагностируется с частотой 300 000 новых случаев, что составляет 8,2% от первичной заболеваемости раком среди женщин (Bray F. et al., 2018). При выявлении заболевания на I стадии пациентки с диагнозом рака тела матки имеют высокие показатели 5-летней выживаемости (95,3%) (Хохлова С.В. и соавт., 2017; Крейнина Ю.М. и соавт., 2020; Чернобровкина А.Е., 2021), что накладывает обязательство на совершенствование диагностических мероприятий.

В России частота случаев рака эндометрия неуклонно растет (около 1% каждый год) и в 2019 году составляла 187,3 на 100 000 женского населения (Каприн А.Д. и соавт., 2020; Сабанцев М.А. и соавт., 2023). По гистологическому строению различают два типа эндометриальной карциномы (ЭК). Для I типа ЭК характерно благоприятное течение и преимущественно выявление на ранних стадиях. Карциномы II типа или редкие формы рака тела матки составляют менее 10% от общего числа случаев ЭК (Паршоева Л.Ш. и соавт., 2023) и отличаются высокой степенью злокачественности с инвазией в миометрий, кровеносные и лимфатические сосуды, агрессивным клиническим течением (Нечушкина В.М. и соавт., 2018; Ульрих Е.А. и соавт., 2020; Lakhwani P., 2019).

Информацию о степени дифференцировки и о гистологическом типе рака тела матки онкологи получают в основном при морфологическом исследовании биоптатов эндометрия перед операцией при диагностическом выскабливании стенок полости матки (Карпова А.Е. и соавт., 2021, 2022; Румянцева А.В. и соавт., 2021). Однако, результаты гистологического исследования предоперационных биоптатов эндометрия и хирургических образцов опухоли у пациентов с раком тела матки при высоком риске (низкодифференцированная ЭК либо неэндометриальные формы рака тела матки) не совпадают в трети случаев

(Di Cello A. et al., 2015; Matsuo K. et al., 2015). Такое несовпадение может повлечь за собой неправильную хирургическую тактику. В связи с этим, врачи-онкологи нуждаются в лабораторной предоперационной поддержке дифференциальной диагностики, оценки риска течения рака тела матки посредством определения концентрации молекулярных маркеров в различных системных (периферическая кровь, моча) и местных биологических средах, граничащих с опухолью. При неинвазивной либо малоинвазивной диагностике в качестве исследуемого биологического материала могут выступать кровь, моча, аспирационный биоптат полости матки, влагалищно-шеечный секрет. Между тем, ограниченное число онкомаркеров, как правило, определяют только в сыворотке крови (Мимун Н. и соавт., 2021). Использование местных биологических сред расширит возможности выявления пациенток с неблагоприятным прогнозом в отношении течения заболевания.

Кроме того, при послеоперационном наблюдении за больными в условиях стандартизации всех значимых факторов для контроля прогрессирования онкологического заболевания клиницисты нуждаются в экспресс-методах неинвазивного мониторинга биологических маркеров (Морхов К.Ю. и соавт., 2022). Оценка сывороточных биомаркеров в динамике может определить индивидуальный риск неблагоприятного исхода заболевания, изменить тактику лечения и повысит его эффективность. При этом, определение биомаркеров в крови можно реализовать многократно ввиду доступности и безопасности для пациента, легкости и быстроты исполнения (Coll-de la Rubia E., 2021).

После окончания первичного лечения рака тела матки каждые три месяца в первые два года в алгоритм наблюдения входят гинекологический осмотр, ультразвуковое исследование, цитология соскобов со слизистой влагалища, определение концентрации опухолевого антигена СА-125 в крови (Санджиева Л. и соавт., 2020; Шахсуварян С.Б. и соавт., 2021; Чекалова М.А. и соавт., 2022). Особое внимание уделяется больным, у которых исходно уровень СА-125 повышен (Quan Q. et al., 2021). В последнее время для ранней диагностики рака тела матки рекомендовано определение содержания в крови маркера HE4 (Human epididymis

protein 4) (Espiau Romera A. et al., 2020). В качестве перспективных, но не изученных по эффективности маркеров можно назвать белок DJ-1 семейства пептидазы C56 (белковая дегликаза) (Hutt S. et al., 2019; Bednarikova M. et al., 2021), а также молекулу клеточной адгезии L1CAM (Лебедева А.А. и соавт., 2022). Определение комбинации онкомаркеров в динамике может оптимизировать мониторинг пациенток с раком тела матки для своевременного выявления высокого риска и развития рецидивов злокачественного заболевания, индивидуального изменения активности и спектра лечения, достижения благоприятных исходов болезни.

Индикатором успешности лечения рака тела матки является отсутствие ранних рецидивов заболевания (Трипак И.Е. и соавт., 2022). Частота развития рецидивов после лечения при раке тела матки высокая и достигает при I стадии 15,9%, II стадии 30,1%, III—IV стадиях 40% (Нечушкина В.М. и соавт., 2018; Блинов Д.В. и соавт., 2023). На большом количестве пациенток (n=1322) с диагнозом рака тела матки выявлено, что в первые пять лет после операции регионарные и отдаленные метастазы встречались в 59,5%, локорегионарные рецидивы в 21,5%, продолженный рост в 10,7% (Kim T.N. et al., 2016). При наличии локорегионарных рецидивов пятилетняя выживаемость резко снижалась и составляла 34% (Берген Т.А. и соавт., 2021; Kim T.N. et al., 2016).

Таким образом, расширение спектра исследования различных биологических материалов за счет подключения к цитологическим и гистологическим методам молекулярно-биологических, лабораторных, современных протеомных технологий, может повысить эффективность своевременной диагностики и индивидуализировать прогноз течения злокачественных эпителиальных опухолей тела матки.

Степень разработанности темы

За последние годы с помощью биоинформатического мета-анализа результатов генетических исследований установлены дифференциально экспрессируемые гены, ассоциированные с развитием злокачественного процесса в эндометрии (Кутилин Д.С. и соавт., 2019; Грязнов С.А., 2021; Ung M.H. et al.,

2016; Talhouk A. et al., 2017). Систематизация и анализ генетической информации имеет цель определения молекулярных основ биологических процессов, сочетанных с развитием заболевания и его течением (Гаджиева Л.Т. и соавт., 2021; Тюляндина А.С. и соавт., 2022; Pereginya O.V. et al., 2020).

Идентификация генов и анализ межгенных и межбелковых взаимоотношений при онкологической патологии позволили выявить приоритетные молекулярно-генетические механизмы возникновения и прогрессирования злокачественных заболеваний, определить спектр потенциально информативных белковых онкомаркеров (Нухбала Ф.Р., 2022; Pereginya O.V. et al., 2020).

Для злокачественных опухолей эндометрия в Атласе ракового генома (The Cancer Genome Atlas, TCGA) представлены критерии прогноза с учетом клинических, гистологических и молекулярно-генетических характеристик (Association between differential gene expression... 2016). Дальнейшее углубленное изучение молекулярно-генетического профиля при раке тела матки позволит использовать методы молекулярной диагностики для выявления рака тела матки со смешанным типом, эффективно проводить дифференциальную диагностику, выделять пациентов с высокой степенью злокачественности в особую когорту для организации более активного противоопухолевого лечения (Нечушкина В.М. и соавт., 2021; Кедрова А.Г. и соавт., 2022).

Не до конца разработанной при редких формах рака тела матки остается система прогноза (Ульрих У.А. и соавт., 2020). При получении гистологического заключения о выявлении неэндометриоидного рака типа II риск прогрессирования справедливо ранжируется как очень высокий без учета каких-либо еще индивидуальных факторов (McDonald M.E. et al., 2019). В научных работах прогноз течения редких форм рака тела матки в основном строится после летального исхода больных посредством проведения ретроспективных популяционных исследований и не подкреплен проспективными молекулярно-биологическими исследованиями. Реализация научных исследований такого направления возможна за счет

подключения многоцентровых популяционных исследований в крупных национальных медицинских исследовательских центрах и онкологических диспансерах с развитой лабораторно-диагностической службой и наличием высокого научного потенциала.

Цель исследования

Оптимизация диагностики и прогноза течения болезни у пациентов со злокачественными эпителиальными опухолями тела матки за счет комплексирования клинических и морфологических методик с молекулярно-биологическим исследованием системных и местных биологических сред.

Задачи исследования

1. Дать характеристику морфологических типов злокачественных эпителиальных опухолей тела матки по сплошным данным онкорегистра Ростовской области за 2000-2019 гг. и установить особенности выживаемости пациенток в зависимости от одновременного учета гистотипа опухолей и степени дифференцировки опухолевых клеток.

2. Установить клиническую значимость исходного серологического определения онкомаркеров CA-125, ИБ4, DJ-1, L1CAM до операции при эндометриальном и неэндометриальном раке тела матки.

3. Выявить оптимальные сроки динамической послеоперационной оценки и спектр серологических биомаркеров, эффективно прогнозирующих ранние рецидивы при различных гистологических типах рака тела матки.

4. Разработать алгоритм молекулярно-лабораторного исследования системных и местных биологических жидкостей для повышения возможностей дифференциальной диагностики эндометриальной карциномы и редких форм рака тела матки на дооперационном этапе.

5. Изучить особенности протеома аспирационного биоптата эндометрия при различных гистотипах рака тела матки и идентифицировать онкомаркеры, повышающие диагностическую эффективность аспирационной биопсии эндометрия по Пайпелю.

6. Определить дифференциально экспрессированные гены в опухолевых клетках при эндометриальной карциноме и редких формах рака тела матки.

7. Разработать эффективный способ раннего выявления рака тела матки путем оценки маркеров пролиферации в местных средах, контактирующих с опухолью (маточном аспирате, осадке мочи и вагинально-цервикальном секрете).

8. Оценить эффективность оптимизации диагностики рака тела матки при диспансеризации женщин постменопаузального периода.

Научная новизна исследования

В работе впервые проведено сплошное популяционное исследование выживаемости больных раком тела матки с включением базы данных из регионального онкорегистра за длительный срок с одновременным двухфакторным учетом как гистотипа опухоли, так и степени дифференцировки опухолевых клеток. Разработанная модель стратификации риска летального исхода пациенток с диагнозом рака тела матки доказывает необходимость градации степени дифференцировки опухоли независимо от ее гистотипа.

При выполнении работы впервые установлено, что серологическое определение концентрации онкомаркеров СА-125, Ж4, DJ-1 и L1CAM до операции отражает клинические характеристики заболевания только при эндометриальном раке тела матки. Клиническая значимость биомаркеров при этом различна. Прогноз ранних рецидивов заболевания и смерти больных строится на основе оценки концентрации DJ-1, а резистентности к ХЛТ - по уровню НЕ4. При редких формах рака тела матки для оценки риска рецидивов и летального исхода больных необходимо определять экспрессию L1CAM и НЕ4 непосредственно в опухолевых клетках.

Динамическое проведение лабораторных исследований впервые позволило установить, что при эндометриальном и светлоклеточном раке тела матки оптимальным сроком сывороточного определения маркеров для оценки риска ранних рецидивов является 6 месяцев после операции, а комплекс маркеров включает при эндометриальном раке DJ-1, ИБ4 и СА-125, а светлоклеточном раке -

только ИБ4. При серозном раке тела матки серийное сывороточное определение маркеров для этой цели неинформативно.

Фундаментальной основой расширения спектра онкомаркеров при раке тела матки от стандартно рекомендуемого СА-125 до комплекса CA-125, ИБ4, DJ-1, L1CAM и МСМ5 явился установленный факт дифференциально экспрессированных соответствующих генов в опухолевых клетках.

Впервые при раке тела матки доказана перспективность определения концентрации нового маркера пролиферации МСМ5 в местных биологических средах, контактирующих с опухолью (аспират полости матки, осадок мочи, влагалищно-шеечный секрет).

Впервые доказано, что при раке тела матки сыворотка крови в качестве биологической среды исследования должна быть дополнена исследованием аспирата полости матки, осадка мочи и влагалищно-шеечного секрета с целью ранней диагностики и рецидивирования РТМ, а также диагностики редких гистотипов РТМ.

Впервые разработана система дифференциально-диагностических критериев эндометриального рака тела матки и редких форм РТМ на дооперационном этапе.

Теоретическая и практическая значимость исследования

В работе расширены теоретические представления о новых диагностических и прогностических возможностях при раке тела матки, включая редкие формы.

Проведение генетических и иммуногистохимических исследований позволило выявить, что в опухолевых клетках гиперэкспрессия белка DJ-1 и соответствующего гена является независимым предиктором ранних рецидивов.

В диссертационном исследовании разработана система дифференциальной диагностики между эндометриальным и неэндометриальным раком тела матки по концентрации DJ-1 и L1CAM в крови до операции.

Предложены модели прогнозирования развития ранних рецидивов, летального исхода, резистентности к химиолучевой терапии при эндометриальном, серозном и светлоклеточном раке тела матки как по дооперационным уровням

концентрации в сыворотке крови, так и при мониторинге через 6 месяцев после операции.

Использование современных протеомных и иммунологических исследований позволило оптимизировать стандартную аспирационную биопсию по Пайпелю. Даны рекомендации для определения концентрации белковой дегликазы DJ-1 и протеина МСМ5 в гомогенате маточного аспирата.

Предложена оптимизация ранней диагностики рака тела матки с помощью лабораторного исследования крови, аспирата полости матки, осадка мочи, доказана эффективность использования разработанной системы выявления и дифференциальной диагностики злокачественных эпителиальных опухолей тела матки.

По итогам работы получены два патента на изобретение Российской Федерации: «Способ прогноза прогрессирования заболевания после химиолучевой терапии светлоклеточного рака тела матки» (Патент №2782104) и «Способ прогнозирования ранних рецидивов светлоклеточной карциномы тела матки» (Патент №2784775).

Методология и методы исследования

В работе использован системный, междисциплинарный, комплексный подход к разработке системы ранней диагностики и прогнозирования течения онкологического заболевания. Естественнонаучная методология подразумевала следованию принципа объективности, воспроизводимости, доказательности результатов исследования.

В работе использованы следующие методы: клинический, биоинформатический анализ, генетический (ПЦР в реальном времени), иммуноферментный анализ, иммуногистохимический, масс-спектрометрический анализ, методы математической статистики и моделирования.

Диссертационная работа выполнена на базе Национального медицинского исследовательского центра онкологии (ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России) г. Ростова-на-Дону, ГБУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер», кафедры онкологии, гематологии и трансплантологии

Института непрерывного медицинского и фармацевтического образования ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разнообразие клинического течения и выживаемости больных со злокачественными эпителиальными опухолями тела матки связано с их морфологической гетерогенностью. У пациентов с редкими формами рака тела матки определение риска летального исхода требует индивидуальной стратификации и внесения дополнительных градаций рангов кроме «очень высокий».

2. При раке тела матки доказана высокая дифференциально диагностическая и прогностическая информативность сывороточного определения концентрации онкомаркеров DJ-1 и L1CAM до операции.

3. Эффективность прогноза ранних рецидивов рака тела матки повышается при оценке динамики маркеров CA-125, ИБ4, DJ-1 в сыворотке крови через 6 месяцев после операции.

4. Аспират полости матки при биопсии по Пайпелю, осадок мочи, сыворотка крови, влагалищно-шеечный секрет являются перспективными биологическими средами для определения концентрации онкомаркеров при раннем выявлении рака тела матки.

Степень достоверности результатов работы

Высокая степень достоверности полученных результатов обеспечивалась адекватным цели объемом выборки, формированием необходимого количества групп исследования. Все первичные данные были оформлены в виде индивидуальных регистрационных карт и интегрированы в единую базу данных. После проведения молекулярно-генетических и лабораторных исследований медико-биологические данные анализировали с помощью статистических методов. По итогам исследования разработаны модели оценки риска смерти больных раком тела матки.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации и результаты работы были представлены и доложены на XIII Съезде онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии (Нурсултан, Казахстан, 27-29 апреля 2022), Международной конференции «Scientific Research of the SCO countries: Synergy and Integration» (Beijing, Китай, 31 марта 2022), XXX Юбилейной ежегодной конференции ДИАМА с международным участием (Ростов-на Дону, 16-17 сентября 2022), IV Национальном конгрессе с международным участием ЛАБРИН 2022 (Москва, 28-30 сентября 2022), XXIII Всероссийском научно-образовательном форуме «Мать и дитя» (Москва, 28-30 сентября 2022).

Апробация диссертации проведена 30 марта 2023 г. на заседании Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанные прогностические и диагностические модели внедрены в клиническую и диагностическую практику следующих лечебных учреждений: консультативную поликлинику и отделение онкогинекологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, хирургическое отделение №2 ГБУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер».

Материалы диссертации по дифференциальной диагностике редких форм рака тела матки внедрены в учебный процесс кафедры онкологии ФГБОУ ВО «РостГМУ» Минздрава России, кафедры онкологии, гематологии и трансплантологии Института непрерывного медицинского и фармацевтического образования ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Публикации результатов работы

По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве науки и высшего

образования Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, из которых 5 -индексируемых в международных базах цитирования, получено 2 патента на изобретение Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 255 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалу и методам исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы состоит из 129 ссылок на исследования российских авторов и 179 зарубежных, всего 308 источников. Результаты работы иллюстрированы 80 таблицами и 47 рисунками.

Глава 1

СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРАХ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ РАКА ТЕЛА МАТКИ И ЛЕТАЛЬНЫХ ИСХОДАХ ЗАБОЛЕВАНИЯ

(литературный обзор) 1.1 Распространенность рака тела матки в России и факторы риска развития заболевания

Злокачественные новообразования органов репродуктивной системы в общей структуре онкологической патологии имеют максимальный удельный вес среди женского населения РФ (38,9%). Рак молочной железы на первом месте (20,9%). На третьем месте находится рак тела матки (7,7% - 2017 г., 8% - 2018 г.) (Каприн А.Д. и соавт., 2014; Мерабишвили В.М. и соавт. 2014; Клинышкова Т.В., 2020). В 2015 году злокачественные новообразования репродуктивной системы (рак шейки и тела матки) стали причиной смерти у 13475 женщин. Это составило 1,43% от общего числа умерших в стране от онкологических заболеваний. Если брать всю онкологическую патологию, у женщин рак тела матки (РТМ) стоит на седьмом месте среди причин смерти от злокачественных опухолей (Аксель Е.М., 2015; Костенко И.В. и соавт., 2019, Чернобровкина А.Е., 2022).

За период 2010-2020 гг. прирост заболеваемости раком тела матки в Российской Федерации составил 23,83%. Среднегодовой темп прироста (СГТП) равнялся 2,11%. Летальность колебалась в пределах 5 на 100 000 населения (Лактионов К.П. и соавт., 2010; Гавриш Ю.Е. и соавт., 2017). Это заметно ниже, чем в Мексике (Joehlm-Price A.S. et al., 2014) но выше, чем в Финляндии (McAlpine J.N. et al., 2016). В странах ЕС заболеваемость РТМ составляет от 13 до 24 случаев на 100 000 женщин. Летальность - 4-5 на 100 000. За период 2010-2020 гг. общемировой прирост смертности от РТМ составил 7,22% (William M. et al., 2014). Среднегодовой прирост равнялся 0,69%. Около 30% новых случаев заболевания выявляется на последних стадиях. Данное обстоятельство во многом объясняет неутешительные цифры летальности на первом году после постановки диагноза (Jemal A. et al., 2009).

Ежегодно в мире выявляют примерно 500 000 новых случаев РТМ. Вклад России при этом составляет около 15 000 случаев. На долю заболевания в среднем приходится 4,4 % в развитых странах. В развивающихся государствах - 15%, в РФ -5,2% (Ульрих Е.А. и соавт., 2012; World cancer report, 2014). Ориентировочный показатель заболеваемости населения РТМ в РФ с 2014 по 2018 гг. увеличился с 30,05 до 34,23 на 100 тыс. населения. Показатель абсолютного прироста заболеваемости населения РТМ за анализируемый период составил в РФ +2,52%. Среднегодовой темп прироста достиг +0,62% (Armstrong A.J. et al., 2012). Стандартизированные показатели впервые установленного диагноза РТМ увеличились за анализируемый период по РФ с 17,18 в 2014 году до 18,79 в 2018 году. Показатель абсолютного прироста стандартизированных показателей за период с 2014 г. по 2018 г. составил в РФ +1,72%, при значениях среднегодового темпа прироста +0,42% (Канторова А.А. и соавт., 2007, Пшукова Е.М. и соавт., 2021).

Количество больных РТМ, активно выявленных при проведении профилактических осмотров увеличилось в РФ с 18,1% до 29,1% (СГТП +2,19%, абсолютный прирост +9,18%) за анализируемый период. Удельный вес больных с I стадией злокачественных новообразований тела матки в Российской Федерации увеличился с 62% в 2014 г. до 68% в 2018 г. (СГТП +0,43%, абсолютный прирост +1,76%). Со II стадией - уменьшился, соответственно, c 19% до 15,7% (СГТП -0,86%, абсолютный прирост -3,38%). Процент больных с III стадией РТМ за анализируемый период в Российской Федерации незначительно уменьшился с 10,7% до 9% (СГТП - 0,9%, абсолютный прирост -3,53%). С IV стадией увеличился с 5,6% до 5,9% (СГТП +0,17%, абсолютный прирост +0,68%).

К 2018 г. удельный вес морфологически подтвержденных диагнозов рака тела матки достиг в РФ 98,2% против 97,8% в 2014 году, соответственно. Доля больных, состоящих на учете в онкологических учреждениях 5 лет и более с момента установления диагноза РТМ, от числа состоящих на учете на конец года увеличилась в РФ за анализируемый период времени - с 60,7% до 62,9% (СГТП +0,17%, абсолютный прирост +0,68%). С 2014 по 2018 гг. отмечалось снижение

показателя летальности больных от рака тела матки в течение года с момента установления диагноза в РФ с 9,8% до 8,9% (СГТП - 0,6%, абсолютный прирост -2,38%).

Округленный показатель смертности населения от РТМ в РФ несколько увеличился с 8,59 в 2014 г. до 8,67 в 2018 г. на 100 тыс. населения. Показатель абсолютного прироста смертности населения от злокачественных новообразований тела матки за анализируемый период составил в Российской Федерации -0,08%. Среднегодовой темп прироста в РФ достиг -0,02%. Стандартизированные показатели смертности от ЗНО тела матки уменьшились по Российской Федерации - с 4,25 до 3,98. Показатели абсолютного прироста стандартизированных показателей за анализируемый период составил по РФ, при значениях среднегодового темпа прироста - 0,36% (Налбандян А.В. и соавт., 2006). Важным показателем является отношение одногодичной летальности к запущенности (IV стадии) предыдущего года. Это значение свидетельствует о частоте ошибок при оценивании распространенности опухолевого процесса у больного и недостатках учета. Данный показатель уменьшился по стране с 1,75 в 2014 г. до 1,67 в 2018 г. (СГТП - 0,44%, абсолютный прирост - 1,74%) (Каприн А.Д. и соавт., 2019).

В объемной работе была проанализирована статистика заболеваемости раком тела матки в РФ. Данные брались с 2006 по 2016 гг. Информация изымалась из официальной отчетности МНИОИ им. П. А. Герцена. В основной структуре заболеваемости рак тела матки в 2006 году составил 6,9%, в 2016 году - 7,7%. Средний возраст выявления рака тела матки увеличился на 0,9 лет с 61,6 лет в 2006 году, до 62,6 лет в 2016 году. По данным статистики в 2016 году в Российской Федерации было выявлено 25 096 новых случаев. Это на 28,7% больше, чем в 2006 году (17 885 случаев). Распространенность заболевания на 100 тыс. населения в 2016 году выросла на 43,9% и составила 166,3 (в 2006 г. - 115,6 на 100 тыс. населения).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Коваленко Надежда Витальевна, 2024 год

- гГ

-

- г

АиС = 0,775 Р < 0,001

20 40 60 80

100%-специфичность%

100

Рисунок 6.3 ROC-кривая соотношения диагностической чувствительности и специфичности при раннем выявлении рака тела матки по концентрации МСМ5 в осадке мочи

0

0

Таблица 6.4 - Соотношение чувствительности и специфичности раннего выявления рака тела матки ранних стадий по концентрации МСМ5 в осадке мочи

МСМ5 пг/мл Чувствительность Специфичность Отношение шансов

Величина Доверительный интервал Величина Доверительный интервал

>1,38 100,00 96,3 - 100,0 0,00 0,0 - 9,3 1,00

>1,41 100,00 96,3 - 100,0 2,63 0,07 - 13,8 1,03

>1,52 98,98 94,4 - 100,0 2,63 0,07 - 13,8 1,02

>1,69 98,98 94,4 - 100,0 7,89 1,7 - 21,4 1,07

>1,74 97,96 92,8 - 99,8 7,89 1,7 - 21,4 1,06

>1,87 97,96 92,8 - 99,8 10,53 2,9 - 24,8 1,09

>1,90 96,94 91,3 - 99,4 10,53 2,9 - 24,8 1,08

>1,97 96,94 91,3 - 99,4 15,79 6,0 - 31,3 1,15

>2,11 90,82 83,3 - 95,7 15,79 6,0 - 31,3 1,08

>2,24 90,82 83,3 - 95,7 26,32 13,4 - 43,1 1,23

>2,35 89,80 82,0 - 95,0 26,32 13,4 - 43,1 1,22

>2,44 89,80 82,0 - 95,0 34,21 19,6 - 51,4 1,36

>2,49 88,78 80,8 - 94,3 34,21 19,6 - 51,4 1,35

>2,99 88,78 80,8 - 94,3 57,89 40,8 - 73,7 2,11

>3,06 87,76 79,6 - 93,5 57,89 40,8 - 73,7 2,08

>3,55* 87,76 79,6 - 93,5 73,68 56,9 - 86,6 3,33

>10,84 78,57 69,1 - 86,2 73,68 56,9 - 86,6 2,99

>11,51 78,57 69,1 - 86,2 76,32 59,8 - 88,6 3,32

>11,69 74,49 64,7 - 82,8 76,32 59,8 - 88,6 3,15

>11,74 74,49 64,7 - 82,8 78,95 62,7 - 90,4 3,54

>11,98 72,45 62,5 - 81,0 78,95 62,7 - 90,4 3,44

>12,04 72,45 62,5 - 81,0 81,58 65,7 - 92,3 3,93

>13,36 45,92 35,8 - 56,3 81,58 65,7 - 92,3 2,49

>13,53 45,92 35,8 - 56,3 84,21 68,7 - 94,0 2,91

>13,76 38,78 29,1 - 49,2 84,21 68,7 - 94,0 2,46

>13,81 38,78 29,1 - 49,2 86,84 71,9 - 95,6 2,95

>14,05 32,65 23,5 - 42,9 86,84 71,9 - 95,6 2,48

>14,21 32,65 23,5 - 42,9 92,11 78,6 - 98,3 4,14

>15,19 15,31 8,8 - 24,0 92,11 78,6 - 98,3 1,94

>15,31 15,31 8,8 - 24,0 94,74 82,3 - 99,4 2,91

>16,19 3,06 0,6 - 8,7 94,74 82,3 - 99,4 0,58

>16,40 3,06 0,6 - 8,7 97,37 86,2 - 99,9 1,16

>17,04 2,04 0,2 - 7,2 97,37 86,2 - 99,9 0,78

>17,22 2,04 0,2 - 7,2 100,00 90,7 - 100,0

>18,42 0,00 0,0 - 3,7 100,00 90,7 - 100,0

Примечание: * - точка cut-off

Таким образом, для раннего выявления рака тела матки оценка концентрации МСМ5 в моче является эффективной. Несложный неинвазивный тест, основанный на определении уровня MCM5 в моче путем иммуноферментного анализа, имеет клиническое значение для ранней диагностики злокачественного поражения эндометрия у женщин.

Генетический анализ вагинально-цервикальной жидкости, полученной с помощью вагинальных тампонов, позволил установить наличие эпителиальных клеток эндометрия, шейки матки и влагалища в биологическом секрете (Zegels G. et al., 2010). Эта жидкость содержит белки, преимущественно синтезируемые эндоцервиксом и вагинальными клетками, но также содержит белки из выделений эндометрия, маточных труб, перитонеальной жидкости (Shaw J.L. et al., 2007; Pereira L. et al., 2007).

Результаты определения концентрации МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете, полученном с помощью вагинальных тампонов, у больных раком тела матки по сравнению с контрольной группой, представлены в таблице 6.5.

Таблица 6.5 - Результаты определения концентрации МСМ5 (пг/мл) в вагинально-цервикальном секрете, полученном с помощью вагинальных тампонов, у больных раком тела матки по сравнению с контрольной группой

Статистическая величина Больные РТМ, n=104 Контрольная группа, n=32

M±SD 21,1±3,9 18,6±2,5

Медиана 20,7 18,6

Межквартильный диапазон 18,2-23,8 16,9-20,6

Доверительный интервал 95% 20,3-21,8 17,7-19,5

Размах (минимум-максимум 11,9-30,9 13,6-24,5

р* p*=0,39

Примечание: р* - различие между группами определяли по критерию Манна-Уитни

Содержание МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете у больных раком тела матки у здоровых пациенток статистически значимо не различалось (рисунок 6.4).

МСМ5 вл

32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10

РТМ

Зд

■ Медиана □ 25%-75% Мин.-Макс.

Рисунок 6.4. Медиана, межквартильный диапазон и размах концентрации МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете, полученном с помощью вагинальных тампонов, у больных раком тела

матки и в группе контроля

Концентрация МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете у больных раком тела матки не зависела от гистотипа опухоли. Содержание маркера при светлоклеточном раке тела матки (23,2±3,1 пг/мл), серозном раке (26,2±2,4 пг/мл) и эндометриальной карциноме (19,8±3,3 пг/мл) не имело статистически значимых отличий ф>0,05) (таблица 6.6). По сравнению с контрольной группой отличие концентрации МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете наблюдалось только у больных серозным раком тела матки (рисунок 6.5). Уровень МСМ в вагинальном секрете у пациентов при серозном раке (26,2±2,4 пг/мл) был выше по сравнению с контрольной группой (18,6±2,5 пг/мл) на 41% (р=0,048).

Таблица 6.6 - Результаты определения концентрации МСМ5 (пг/мл) в вагинально-цервикальном секрете, полученном с помощью вагинальных тампонов у больных раком тела матки с учетом гистотипа по сравнению с контрольной группой

Величина ЭК, п=79 СР, п=16 СКР, п=9 Контрольная группа, п=32

M±SD 19,8±3,3 26,2±2,4 23,2±3,1 18,6±2,5

Ме 20,0 25,8 22,6 18,6

[25-75] 17,4-22,2 23,9-27,3 21,1-24,9 16,9-20,6

ДИ 95% 19,1-20,5 24,9-27,4 20,8-25,6 17,7-19,5

Мт-шах 11,9-27,3 23,1-30,9 18,7-29,2 13,6-24,5

р* р*=0,68

рэк-к=0,27, рср-к=0,048, рскр-к=0,09, рэк-ср=0,11, рэк-скр=0,17, рср-скр=0,75

Примечание: р* - доверительная вероятность при множественном сравнении между группами при дисперсионном анализе с помощью критерия Краскела-Уоллиса, рэк-к — между больными с ЭК и контрольной группой, рср-к — между больными с СР и контрольной группой, рскр-к - между больными с СКР и контрольной группой, рэк-ср - между больными с ЭК и СР, рэк-скр- между больными с ЭК и СКР, рср-скр - между больными с СР и СКР. Ме - медиана, [25-75] - межквартильный диапазон, ДИ 95% - доверительный интервал 95%, Мт-шах - Размах (минимум-максимум)

Рисунок 6.5. Медиана, межквартильный диапазон и размах концентрации МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете, полученном с помощью вагинальных тампонов, у больных раком тела

матки с учетом гистотипа и и в группе контроля

Высокая концентрация МСМ5 в вагинальном секрете у пациенток контрольной группы может быть связана с травматизацией слизистой оболочки влагалища при ношении тампона и с обнажением базальных эпителиоцитов, которые активно экспрессируют МСМ5. Следовательно, определение МСМ5 в вагинально-цервикальном секрете для проведения ранней диагностики рака тела матки является непродуктивным.

Таким образом, полученные результаты позволили выявить, что протеомика мочи является перспективным инструментом в поиске молекулярных маркеров рака эндометрия. В результате использования протеомных технологий, иммуноферментного анализа была доказана эффективность определения концентрации МСМ5 как маркера пролиферативной активности в осадке мочи при реализации ранней неинвазивной диагностики злокачественных новообразований эндометрия.

Глава 7

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТЕЛА МАТКИ РАЗЛИЧНОГО ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ТИПА

Внедрение в клинику таких высокопроизводительных технологий как секвенирование нового поколения, микрочипирования, ДНК-чипирования с мониторингом генной экспрессии сопровождается формированием огромного массива данных на уровне генома, транскриптома, интерактома человека. Биоинформатический анализ позволяет обобщить накапливаемые сведения и обеспечивает понимание взаимосвязи генотипов и фенотипов, сопряжение результатов генетических исследований с клиническими характеристиками онкологического заболевания (Глухов А.И. и соавт., 2018; Спринджук М.В. и соавт., 2021; Демидова А.А. и соавт., 2022). Внедрение молекулярно-генетических классификаций, выделение генетических профилей позволило онкологам разработать индивидуальные схемы лечения и более эффективно определять прогноз заболевания. Примером могут служить молекулярно-генетические подтипы рака молочной железы, желудка, пищевода, поджелудочной железы, шейки матки и др. (Кит О. И., 2020, 2020а; Ung M.H. et al., 2016).

Для злокачественных опухолей эндометрия в Атласе ракового генома (The Cancer Genome Atlas, TCGA) представленные критерии прогноза с учетом клинических, гистологических и молекулярно-генетических характеристик в основном касаются эндометриальной карциномы (Talhouk A. et al., 2017). Редкие формы рака тела матки, классифицируемые как неэндометриоидный рак типа II, не имеют отдельной молекулярно-генетической классификации. Создание молекулярно-генетической классификации для различных по гистопатологическому типу опухолей эндометрия позволит использовать методы молекулярной диагностики для выявления рака тела матки со смешанным типом, выделять пациентов с высокой степенью злокачественности в особую когорту для организации более активного противоопухолевого лечения (Кит О.И., Коваленко Н.В., Максимов А.Ю., Вереникина Е.В., 2023).

Задачей раздела работы явилось осуществить анализ сведений о дифференциальной экспрессии генов с выделением основных сигнальных путей при эндометриальной карциноме и редких формах рака тела матки с помощью технологий биоинформатики, генетических исследований и определить влияние генетического профиля на выживаемость больных.

На первом этапе выделяли сеты для проведения биоинформатического анализа. В результате были обобщены сведения 575 исследований по изучению карциномы тела матки (Uterine Corpus Endometrial Carcinoma, UCEC) из официального сайта Атласа генома рака (TCGA) (543 образца карциномы эндометрия различного типа и 23 образца нормальной ткани эндометрия).

Кроме того, из базы данных GEO (Gene Expression Omnibus, GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gds) использовали сеты:

- GSE63678 (7 образцов ткани рака эндометрия и 5 образцов нормального эндометрия),

- GSE17025 (91 образец ткани рака эндометрия различного морфологического типа и 12 образцов из доброкачественных опухолей),

- GSE39099 (20 образцов нормальной ткани эндометрия, 20 биоптатов атипичной гиперплазии эндометрия и 169 образцов эндометриального рака),

- GSE115810 (3 образца нормальной ткани эндометрия и 24 образца опухолевой ткани).

Все данные были нормализованы перед проведением мета-анализа с помощью программных пакетов R basic (version 3.6.0, https://www.rproject.org/) и Bioconductor packages (available online: http://www.bioconductor.org/).

Обобщение биологических функций идентифицированных генов и анализ межгенных взаимодействий осуществляли с помощью генной онтологии (ГО) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). При этом применяли онлайн программное обеспечение базы данных DAVID (версия 6.8) (The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID) (https: //david.ncifcrf. gov/home .j sp).

Интерактом межбелковых связей формировали с помощью программного обеспечения Cytoscape 3.5 и базы данных STRING 10.0 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins, (https://string-db.org/). Web-ресурс базы данных STRING позволил не только анализировать литературные данные, но и выделить значимые межбелковые взаимодействия и обобщить принадлежность генов сигнальным путям. При этом использовали термины функциональных систем классификации GO и KEGG.

По результатам анализа пяти сетов методом Венна идентифицировано в общей сложности 344 гена с дифференциальной экспрессией (ДЭГ) в раковых клетках при злокачественных опухолях эндометрия по сравнению с нормальной тканью. Из общего количества 170 генов имели повышенную экспрессию, а 174 гена сниженную экспрессию относительно уровня в клетках нормального эндометрия. Идентифицированные гены с повышенной экспрессией участвовали в регуляции трех функций: деление митотического ядра (GO: биологические процессы), организация веретена деления (GO: клеточные компоненты) и связывания микротрубочек веретен (GO: молекулярные функции) клеток. Гены со сниженной экспрессией участвовали в регуляции активности ростовых факторов (GO: биологические процессы), структуры внеклеточного матрикса (GO: клеточные компоненты) и активности кальциевых каналов (GO: молекулярные функции). Кроме того, отмечено участие выделенных ДЭГ в регуляции дифференциации эпителиальных клеток, апоптоза, клеточного деления, пролиферации клеток, проницаемости внеклеточного матрикса, ангиогенеза.

К хаб-генам, ассоциированным с развитием рака эндометрия и имеющих наибольшую плотность межгенных взаимоотношений, были отнесены 20 генов, представленных в таблице 7.1. Поскольку сведения о мутациях генов PTEN, POLE, PIK3CA, KRAS, ARID1A, CTNNB1 и белка ß-катенина, характерные для эндометриальных карцином, а также изменениях экспрессии генов p53, HER2/neu, p16 и E-кадгерина, сопряженных с развитием редких форм рака тела матки, уже вошли в Атлас ракового генома, широко изучены и учитываются в молекулярно-

генетических классификациях (ТаШоик A. et а1., 2017), то в нашем исследовании они не подвергались анализу.

Таблица 7.1 - Результаты биоинформатического анализа отличия экспрессионной активности ДЭГ в ткани злокачественных эпителиальных опухолях тела матки по сравнению с нормальным эндометрием

Ген Название гена log2K ЭА/УЗТ

Me р

CDKN2A Cyclindependent Kinase Inhibitor 2A (ингибитор циклинзависимой киназы А2) 101,9 0,0027

L1CAM L1 Cell Adhesion Molecule (молекула клеточной адгезии L1) 25,6 0,0196

CLDN4 Claudin-4 (клаудин-4) 12,7 0,0027

ERBB2 Receptor tyrosine-protein kinase В2 (тирозин-протеин-киназный рецептор В2) 14,5 0,0136

UBE2C Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 C (убиквитин-конъюгирован-ный фермент E2 C) 12,9 0,0027

CDK1 Cyclin Dependent Kinase 1 (циклин-зависимая киназа 1) 11,3 0,0136

TFF3 Intestinal Trefoil Factor (кишечный фактор трилистника 3) 8,2 0,0063

AURKB Aurora Kinase B (киназа Aurora B ) 12,0 0,0196

CCNB1 Cyclin B1 (циклин В1) 7,9 0,0063

CCNB2 Cyclin B2 (циклин В1) 7,6 0,0063

TNNT1 Troponin T1, Skeletal, Slow (тропонин Т медленных скелетных мышц) 11,9 0,0027

PAX8 Paired Box gene 8 (парный бокс ген 8) 13,8 0,0016

FOXM1 Forkhead Box M1 (белок М1, кодируемый геном семейства FOX) 7,7 0,0027

CDC45 Cell Division Cycle 45 (белок цикла клеточного деления 45) 11,6 0,0027

MKI67 Marker of Proliferation Ki-67 (маркер пролиферации Ki-67) 9,4 0,0041

CDCA8 Cell Division Cycle Associated 8 (белок, ассоциированный с циклом клеточного деления 8) 6,5 0,0041

TPX2 Microtubule Nucleation Factor (фактор нуклеации микротрубочек) 11,3 0,0027

KIF2C Kinesin Family Member 2С (кинезиноподобный белок 2С) 12,1 0,0027

STK15 Serine/threonine kinase 11 (серин/треонин киназа 15) 11,5 0,0027

BUB1 BUB1 Mitotic Checkpoint Serine/ Threonine Kinase B (митотическая контрольная точка серин/треонин-протеинкиназы BUB1) 8,2 0,0027

Примечание: log2K ЭА/УЗТ - нормализованное значение (по log2) кратности изменения экспрессии гена в раковых клетках эндометриальной аденокарциномы (ЭА) относительно условно здоровой ткани (УЗТ) эндометрия, ОШ - отношение шансов, р - доверительная вероятность, Me - медиана.

В раковых клетках по отношению к нормальному эндометрию наибольшая выраженность дифференциальной экспрессии была отмечена для CDKN2A, L1CAM,, ERBB2, PAX8, UBE2C и CLDN4. Медиана нормализованного значения кратности повышения экспрессии гена в раковых клетках эндометриальной аденокарциномы относительно условно здоровой ткани эндометрия для гена CDKN2A составила 101,9 (р=0,0027), гена L1CAM - 25,6 (р=0,0196), гена ERBB2 -14,5 (р=0,0136), PAX8 - 13,8 (р=0,0016), UBE2C - 12,9 (р=0,0027) и CLDN4 - 12,7 (р=0,0027).

Оценку выраженности экспрессионной активности идентифицированных генов в ткани эндометриальных карцином проводили методом SAM (significance analysis of microarrays). Величину SAM рассчитывали в среде R basic с помощью онлайн технологий. Критическое значение SAM, выше которого формировали заключение о статистической значимости гена, соответствовало 1,4. Чем выше величина, тем выше значимость гена как дифференциально экспрессированного в опухолевых клетках для развития рака эндометрия. При проверке статистической значимости параметра и расчете доверительной вероятности проводили коррекцию с учетом FDR (false discovery rate, частота ошибок первого рода) (таблица 7.2).

В наибольшей степени экспрессионная активность в опухолевых клетках при раке тела матки возрастала для генов CDKN2A, L1CAM, ERBB2, PAX8, UBE2C, CLDN4, KIF2C, A URKB и TNNT1.

По результатам регрессионного анализа Кокса экспрессия 17 генов из 20 (CDKN2A, L1CAM, CLDN4, ERBB2, UBE2C, AURKB, CCNB2, TNNT1, PAX8, FOXM1, CDC45, MKI67, CDCA8, TPX2, KIF2C, STK15, BUB1) статистически значимо влияла на развитие неблагоприятного течения заболевания (таблица 7.3).

С летальным исходом больных эндометриальным раком в наибольшей мере была ассоциирована гиперэкспрессия генов CDKN2A (отношение шансов=2,1, р<0,0001), STK15 (отношение шансов=2,0, р<0,0001), L1CAM (отношение шансов=1,9, р<0,0001), TNNT1 (отношение шансов=1,8, р<0,0001), CLDN4 (отношение шансов=1,7, р<0,0001), PAX8 (отношение шансов=1,7, р<0,0001). Риск

развития летального исхода больных при повышенной экспрессии в ткани эндометрия гена ERBB2 статистически значимо повышался в 1,4 раза (р=0,038), гена UBE2C - в 1,3 раза (р=0,0027).

Таблица 7.2 - Выраженность и значимость дифференциальной экспрессии генов в опухолевых клетках эндометриальной аденокарциномы по сравнению с нормальным эндометрием

Ген SAM ркор. по FDR

CDKN2A 10,592 0,0013

L1CAM 3,115 0,0196

ERBB2 2,566 0,0136

PAX8 3,271 0,0062

UBE2C 5,554 0,0031

CLDN4 6,381 0,0027

KIF2C 6,13 0,0027

AURKB 4,291 0,0073

TNNT1 4,072 0,0086

CDC45 7,317 0,0048

STK15 8,289 0,0056

CDK1 5,027 0,0037

TPX2 6,162 0,0019

MKI67 5,028 0,0085

TFF3 3,927 0,0093

BUB1 4,883 0,0183

CCNB1 5,078 0,0063

FOXM1 5,318 0,0159

CCNB2 4,246 0,0087

CDCA8 3,904 0,0241

Примечание: SAM (significance analysis of microarrays) - метод анализа значимости микрочипов, ркор. по FDR - доверительная вероятность SAM, скорректированная по FDR (частота ошибок первого рода)

Таблица 7.3 - Отношение шансов летального исхода у больных с эндометриальной аденокарциномой по результатам регрессионного анализа Кокса при гиперэкспрессии генов

Ген Отношение шансов

Me р

CDKN2A 2,1 <0,0001

L1CAM 1,9 <0,0001

CLDN4 1,7 <0,0001

ERBB2 1,4 0,038

UBE2C 1,3 <0,0001

CDK1 - -

TFF3 - -

AURKB 1,4 0,018

CCNB1 - -

CCNB2 1,4 0,045

TNNT1 1,8 <0,0001

PAX8 1,7 <0,0001

FOXM1 1,3 0,009

CDC45 1,5 0,009

MKI67 1,3 0,019

CDCA8 1,4 0,019

TPX2 1,5 <0,001

KIF2C 1,4 0,019

STK15 2,0 0,009

BUB1 1,3 0,028

Таким образом, проведение биоинформатического анализа позволило сузить спектр генов для последующего изучения их информативности относительно прогноза у больных со злокачественными эпителиальными опухолями тела матки.

На следующем этапе в ходе генетического исследования проведена оценка дифференциальной экспрессии 17 генов с учетом типа эндометриального рака (эндометриальная аденокарцинома, светлоклеточный рак, серозный рак). В ФГБУ

«НМИЦ онкологии» Минздрава России и ГБУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер» была собрана коллекция образцов тканей редких форм рака тела матки, залитых в парафиновые блоки, что позволило их использовать в работе. В ходе генетического исследования оценивали экспрессию 17 генов, идентифицированных на этапе биоинформатического анализа как высокозначимых для развития неблагоприятного исхода заболевания. При этом учитывали гистологический тип злокачественных опухолей рака тела матки. Экспрессию генов в ткани опухоли, полученной при операции, оценивали у 306 пациенток раком тела матки: 249 пациенток с эндометриальной карциномой, 33 - с серозным раком и 24 - со светлоклеточным раком тела матки. Стадии рака тела матки по классификации FIGO в подгруппах больных с эндометриальным и неэндометриальным раком тела матки не отличались (р=0,82). У больных с эндометриальной аденокарциномой II стадия встречалась у 134 (53,8%), III -75 (30,1%), IV - 40 (16,1%) пациенток. При серозном раке II стадия выявлена у 16 (48,5%), III - 12 (36,4%), IV - 5 (15,1%) человек. У пациенток со светлоклеточным раком II стадия имела место у 9 (37,5%), III - 10 (41,7%), IV -5 (20,8%) больных.

У больных с эндометриальной аденокарциномой в опухолевых клетках с большей выраженностью относительно нормального эндометрия повышалась экспрессионная активность для генов CDKN2A (КЭА/Узт=5,7; р=0,0008), L1CAM (Кэа/узт=3,8; р=0,005), PAX8 (Кэа/узт=3,0; р=0,007), ERBB2 (Кэа/узт=2,9; р=0,02) и KIF2C (Кэа/узт=2,7; р=0,02) (таблица 7.4).

Для опухолевых клеток при светлоклеточном раке тела матки относительно нормального эндометрия экспрессионная активность повышалась, прежде всего, для генов CDKN2A (Кскр/узт=45,3; р<0,001), PAX8 (Кскр/узт=32,7; р<0,001), CLDN4 (Кскр/узт=30,7; р<0,001), L1CAM (Кскр/узт=17,6; р<0,001) и STK15 (Кскр/узт=14,3; р<0,001). Для серозного рака спектр генов с высокой экспрессионной активностью относительно Узт был широко представленным и включал гены CDKN2A (Кср/узт=81,9; р<0,001), L1CAM (Кср/узт=24,6; р<0,001), STK15 (Кср/узт=23,6; р<0,001), CLDN4 (Кср/узт=22,6; р<0,001), PAX8 (Кср/узт=21,8;

р<0,001), ЕЯВВ2 (Кср/узт=20,4; р<0,001), иВЕ2С (Кср/узт=17,1; р<0,001), ТЫЫТ1 (Кср/узт=16,8; р<0,001).

Таблица 7.4 - Относительный коэффициент изменения экспрессии генов в раковых клетках эндометриальной аденокарциномы (ЭА), серозного (СР) и светлоклеточного (СКР) рака тела матки по сравнению с условно здоровой тканью (УЗТ) эндометрия

Ген Критерий Краскела-Уоллиса, рмн К СР/УЗТ К СКР/УЗТ К ЭА/УЗТ

Ме р Ме р Ме р

СБктл 26,267, рмн рмн<0,0001 81,9 <0,001 45,3 <0,001 5,7 0,0008

ЫСЛМ 20,918, рмн<0,0001 24,6 <0,001 17,6 <0,001 3,8 0,005

СЬБЫ4 13,295, рмн <0,0001 22,6 <0,001 30,7 <0,001 2,5 0,03

ЕЯВВ2 9,720, рмн <0,001 20,4 <0,001 8,6 <0,001 2,9 0,02

иВЕ2С 15,628, рмн<0,0001 17,1 <0,001 8,4 <0,001 2,6 0,03

лиякВ 2,192, рмн=0,278 5,9 0,003 4,7 0,002 2,4 0,05

ССЫВ2 2,391, рмн=0,182 3,6 0,03 2,9 0,03 1,7 0,09

ТЖТ1 11,926, рмн<0,0001 16,8 <0,001 10,1 0,0002 2,5 0,03

РЛХ8 14,291, рмн<0,0001 21,8 <0,001 32,7 <0,001 3,0 0,007

РОХМ1 1,927, рмн=0,410 3,9 0,006 2,7 0,04 1,4 0,12

СВС45 2,016, рмн=0,718 3,7 0,02 5,4 0,008 2,3 0,04

МК167 1,932, рмн=0,195 4,2 0,01 3,6 0,009 2,3 0,03

СВСЛ8 1,374, рмн=0,527 2,3 0,04 2,0 0,05 1,6 0,16

ТРХ2 2,928, рмн=0,629 3,4 0,007 3,0 0,009 2,2 0,07

К1Р2С 2,015, рмн=0,629 4,5 0,002 4,9 0,001 2,7 0,02

8ТК15 17,291, рмн<0,0001 23,6 <0,001 14,3 <0,001 2,5 0,03

ВиВ1 15,029, рмн<0,0001 13,2 <0,001 9,8 <0,001 1,6 0,11

Примечание: К - относительный коэффициент экспрессии, ЭА - эндометриальная аденокарцинома, СР - серозный рак, СКР - светлоклеточный рак, Ме - медиана, рмн-доверительная вероятность при множественном сравнении трех групп с помощью дисперсионного анализа и критерия Краскела-Уоллиса

Сравнительный анализ изменения экспрессионной активности генов в опухолевых клетках в зависимости от гистологического типа опухоли показал, что более выраженное усиление экспрессионной активности изученных генов наблюдалось для серозного рака (рисунок 7.1).

Относительный коэффициент экспрессии генов в опухолевых клетках по отношению к нормальному эндометрию

■ К СР/УЗТ ■ К СКР/УЗТ ■ К ЭА/УЗТ

Рисунок 7.1. Относительный коэффициент экспрессии генов в опухолевых клетках эндометриальной аденокарциномы (ЭА), светлоклеточного (СКР) и серозного (СР) рака тела матки по отношению к нормальному эндометрию (Узт)

При серозном раке по сравнению с двумя другими изучаемыми морфологическими типами экспрессия генов CDKN2A, L1CAM, ERBB2, UBE2C, TNNT1, STK15 и BUB1 была выше. Для светлоклеточного рака преимущественный рост экспрессии в опухолевых клетках отмечен для генов CLDN4 и PAX8.

Далее с помощью непараметрического анализа выявляли гены с отличающейся по величине экспрессией в опухолевых клетках при редких формах рака тела матки по сравнению с эндометриальной аденокарциномой (таблица 7.5).

У пациенток с серозным раком тела матки по сравнению со светлоклеточной карциномой экспрессия генов CDKN2A, L1CAM, ERBB2, UBE2C, TNNT1, STK15 и BUB1 в опухолевых клетках была выше. При светлоклеточном раке экспрессионная активность генов CLDN4, PAX8 и CDC45 повышалась в большей мере в отличие от серозного рака.

Экспрессия генов AURKB, CCNB2, FOXM1, MKI67, CDCA8, TPX2 и KIF2C в опухолевых клетках была выше при раке тела матки по сравнению с нормальным эндометрием независимо от гистологического типа.

Таблица 7.5 - Результаты дисперсионного анализа различия экспрессионной активности генов раковых клеток у пациенток с эндометриальной аденокарциномой (ЭА), серозным (СР) и светлоклеточным раком (СКР) тела матки

Ген р* К СР/ЭА К СКР/ЭА

Ме р Ме р

CDKN2A <0,001 14,37 <0,0001 7,95 0,002

L1CAM 0,01 6,48 0,0004 4,62 0,003

CLDN4 0,02 9,02 <0,0001 12,28 <0,0001

ERBB2 0,001 7,05 0,0005 2,98 0,07

UBE2C 0,01 6,58 0,0003 3,24 0,047

AURKB 0,46 2,47 0,083 1,96 0,275

CCЖ2 0,27 2,14 0,173 1,58 0,192

тт1 0,04 6,72 0,0007 4,04 0,021

PAX8 0,03 7,281 <0,0001 10,91 <0,0001

FOXM1 0,13 2,83 0,428 1,92 0,382

CDC45 0,02 1,62 0,376 2,37 0,184

MKI67 0,52 1,83 0,483 1,57 0,289

CDCA8 0,37 1,44 0,270 1,27 0,725

TPX2 0,25 1,57 0,384 1,38 0,627

KIF2C 0,44 1,68 0,529 1,83 0,526

8Ж15 <0,001 9,46 <0,0001 5,71 0,004

BUB1 0,01 8,28 <0,0001 6,12 0,0008

Примечание: К - относительный коэффициент экспрессии, ЭА - эндометриальная аденокарцинома, СР - серозный рак, СКР - светлоклеточный рак, Ме - медиана, р* -доверительная вероятность межгруппового сравнения с помощью критерия Манна-Уитни

Итак, по результатам статистического анализа был выделен комплекс генов, экспрессионная активность которых различалась во всех трех группах: CDKN2A, L1CAM, CLDN4, ERBB2, UBE2C, TNNT1, PAX8, STK15, БиЫ. Учитывая величину критерия Краскела-Уоллиса и соответствующее значение доверительной вероятности, наиболее выраженное различие экспрессии наблюдалось для генов CDKN2A, L1CAM, STK15, UBE2C, BUB1.

Ген CDKN2A регулирует синтез белков р16 и p14ARF, а также по механизму отрицательной обратной связи протеина Rb и р53. При гиперэкспрессии гена CDKN2A нарушаются сигнальные пути p16-CDK4/ циклин D1-pRb и p14ARF-MDM2-p53, что ведет к нарушениям клеточного цикла и потере онкосупрессорных свойств протеинов (Wujcicka W. et al., 2020). Коэффициенты соотношения уровня экспрессии гена CDKN2A в опухолевой ткани и нормальном эндометрии при различных морфологических типах опухоли отличались. Экспрессия гена CDKN2A в раковых клетках при эндометриальной аденокарциноме была выше по сравнению с условно здоровой тканью, соответственно, в 5,7 раза (р<0,001), при серозном раке - в 81,9 раза ф<0,001), светлоклеточном раке в 45,3 раза ф<0,001). Следовательно, экспрессионная активность гена CDKN2A в первую очередь резко повышалась при серозном раке, а затем светлоклеточном раке тела матки и была выше по сравнению с эндометриальной аденокарциномой, соответственно, в 14,37ф<0,001) и 7,95 раз ф<0,001).

Ген L1CAM кодирует нейрональную белковую молекулу клеточной адгезии L1. Этот белок принимает участие в процессах клеточной миграции, адгезии, миелинизации и нейрональной дифференцировки. Однако, L1CAM, представляющий клеточный поверхностный гликопротеин, обнаружен и в эпителиальных клетках кишечника (Tang H. et al., 2019). Биологическая значимость его экспрессии на эпителиальных клетках эндометрия неизвестна.

Гены STK15, BUB1 участвуют в регуляции веретена деления клеток (Talhouk A. et al., 2017).

Ген UBE2C регулирует синтез белков убиквитин-протеасомной системы и интенсивность аутофагии как двух основных внутриклеточных путей деградации протеинов (Guo J. et al., 2018). Ген UBE2C, содействуя дупликации ДНК, оказывает влияние на пролиферативную и апоптическую активность опухолевых клеток, регулирует клеточный цикл (Zhang H-Q. et al., 2018). Убиквитин-протеасомной комплекс способствует разрушению белков ядра и цитоплазмы, изменяет транскрипционные процессы, синтез регуляторных пептидов, определяет презентацию антигенов гистосовместимости I типа (Guo J. et al., 2018). Активность

протеасомного комплекса постоянно изменяется в соответствии с потребностями клетки (Zhang H-Q. et al., 2018).

Экспрессия генов CDKN2A, L1CAM, ERBB2, UBE2C, TNNT1, STK15, BUB1 была выше (p<0,05) при серозном раке по сравнению со светлоклеточным раком.

Ген ERBB2 определяет синтез мембранного белка с тирозинкиназной активностью HER-2 (рецептор эпидермального фактора роста). Активация этого рецептора сопровождается усилением пролиферативных процессов и угнетением апоптоза раковых клеток (Da Cruz Paula A. et al., 2021).

Ген TNNT1 кодирует белковую субъединицу тропонина, которая участвует в сокращении поперечно-полосатой мышцы. Неясно, как этот ген может быть задействован в развитии рака эндометрия любого гистологического типа. Однако, имеются сообщения, что ген TNNT1 гиперэкспрессируется при метастатической лейомиосаркоме матки, что предполагает, что TNNT1 связан с агрессивными фенотипами опухолевых клеток (Hao Y. H. et al., 2020).

Экспрессионная активность генов CLDN4 и PAX8 была выше в опухолевых клетках светлоклеточного рака в сравнении с серозным раком. Ген CLDN4 кодирует синтез белка плотного контакта клаудина-4 между эпителиальными клетками на апикальной поверхности, что сказывается на осмотическом обмене ионов между цитоплазмой и внеклеточным матриксом, дифференцировке и пролиферативной активности клеток (Koumarianou P. et al., 2017).

Гены PAX семейства отличаются наличием консервативного в эволюционном отношении ДНК-связывающего домена Paired domain. Указанный ген экспрессируется по ходу эмбриогенеза, определяя развитие зачатков органов, регулирует активность транскрипционных процессов (Koumarianou P. et al., 2017). Ген PAX8 гиперэкспрессирован при высоко злокачественном серозном и светлоклеточном раке яичников (Shan W. et al., 2012).

Связь повышения экспрессионной активности генов с развития летального исхода оценивали с помощью регрессионного анализа Кокса. При этом определяли риск летального исхода как при одиночном влиянии генетического показателя, так и при одновременном учете стадии заболевания как коварианты. Если

доверительная вероятность при учете стадии заболевания была ниже критического значения 0,05, как и при оценке статистической значимости предиктора в условиях одиночного влияния, то это обстоятельство подчеркивало независимость изучаемого фактора не только для развития опухоли, но и ее прогноза. Результаты регрессионного анализа Кокса по оценке влияния транскрипционной активности генов на общую выживаемость больных с эндометриальной аденокарциномой представлены в таблице 7.6.

Таблица 7.6 - Результаты регрессионного анализа Кокса по оценке влияния транскрипционной активности генов на общую выживаемость больных с эндометриальной аденокарциномой

Ген Р (т) Отношение шансов Статистика Р Коррекция р с учетом стадии

СБктл 2,38 (0,45) 7,91 8,17 <0,0001* 0,09

ЫСЛМ 2,05 (0,53) 3,74 4,58 0,001* 0,03*

СЬБЫ4 1,54 (0,84) 2,18 2,61 0,09 0,35

ЕЯВВ2 1,85 (0,19) 2,92 3,81 0,003* 0,02*

иВЕ2С 1,91 (0,39) 1,89 2,01 0,18 0,27

Лиякв 1,37 (0,62) 1,56 1,74 0,29 0,36

ССЫВ2 0,13 (0,21) 1,02 1,38 0,47 0,59

тжп 0,47 (0,26) 0,98 1,12 0,35 0,44

РЛХ8 1,89 (0,12) 3,51 4,05 0,004* 0,18

РОХМ1 0,25 (0,19) 1,24 1,16 0,35 0,87

СВС45 0,83 (0,55) 1,11 1,37 0,27 0,39

МК167 0,72 (0,51) 0,97 1,05 0,46 0,55

СВСЛ8 0,47 (0,43) 1,27 1,42 0,25 0,49

ТРХ2 0,30 (0,25) 1,32 1,29 0,27 0,43

К1Р2С 0,56 (0,44) 1,17 1,37 0,28 0,58

8ТК15 0,64 (0,32) 1,15 1,54 0,40 0,59

вив1 0,26 (0,19) 1,18 1,35 0,18 0,61

Примечание: * - статистически значимое влияние предиктора

Риск летального исхода пациенток с эндометриальной аденокарциномой возрастал при гиперэкспрессии генов СБКШЛ (в 7,91 раз), ЫСЛМ (в 3,74 раза),

ЕШБ2 (в 2,92 раза) и РАХ8 (в 3,51 раза), но независимое от стадии влияние генетических факторов отмечено только для генов ЫСАМ и ЕЯББ2. Сопряжение гиперэкспрессии генов СОКЫ2А, РАХ8 и риска летального исхода было опосредовано изменением транскрипционной активности генов при различных стадиях заболевания.

У пациентов с серозным раком тела матки высокий риск летального исхода статистически значимо был ассоциирован с гиперэкспрессией генов СОКЫ2А (отношение шансов 94,26, р<0,0001), ЫСАМ (отношение шансов 58,25, р<0,0001), ЕШБ2 (отношение шансов 27,31, р<0,0001), ПБЕ2С (отношение шансов 23,92, р<0,0001), ТЫЫТ1 (отношение шансов 11,25, р=0,001), БТК15 (отношение шансов 7,87, р=0,004), БПБ1 (отношение шансов 8,82, р=0,006) (таблица 7.7).

Таблица 7.7 - Результаты регрессионного анализа Кокса по оценке влияния транскрипционной активности генов на общую выживаемость больных с серозным раком тела матки

Ген Р (т) Отношение шансов Статистика Р Коррекция р с учетом стадии

СБКША 3,82 (0,76) 94,26 12,59 <0,0001* <0,0001*

ЫСАМ 3,11 (0,96) 58,25 11,36 <0,0001* <0,0001*

СЬБЫ4 1,79 (0,75) 2,11 2,59 0,07 0,12

ЕЯББ2 2,99 (0,34) 27,31 19,53 <0,0001* <0,0001*

иБЕ2С 2,78 (0,53) 23,92 17,38 <0,0001* <0,0001*

АиЯКБ 1,23 (0,95) 1,76 1,89 0,47 0,58

ССЫБ2 0,26 (0,19) 1,15 1,26 0,54 0,62

ТЖТ1 2,14 (0,51) 11,25 10,79 0,001* 0,13

РАХ8 0,89 (0,68) 1,46 2,17 0,38 0,44

РОХМ1 0,29 (0,38) 1,03 1,25 0,49 0,61

СВС45 0,58 (0,43) 1,38 1,24 0,33 0,73

МК167 0,61 (0,47) 0,90 0,97 0,65 0,84

СВСА8 0,55 (0,50) 0,89 1,04 0,33 0,42

ТРХ2 0,45 (0,41) 1,06 1,13 0,48 0,57

К1Г2С 0,74 (0,69) 0,94 1,09 0,54 0,64

8ТК15 2,57 (0,52) 7,87 8,79 0,004* 0,26

БиБ1 2,45 (0,41) 8,82 8,15 0,006* 0,19

Однако, только для генов СБКШЛ, ЫСЛМ, ЕЯВВ2 и иВЕ2С это влияние было независимым от стадии заболевания.

Для пациенток со светлоклеточным раком комплекс генов, активность которых имела независимое предикторное значение для прогноза летального исхода, был шире и представлен генами СОКШЛ (отношение шансов 71,63, р<0,0001), ЫСЛМ (отношение шансов 42,11, р<0,0001), СЬОЫ4 (отношение шансов 35,29, р<0,0001), ЕЯВВ2 (отношение шансов 21,47, р<0,0001), иВЕ2С (отношение шансов 16,95, р<0,0001) и РЛХ8 (отношение шансов 30,49, р<0,0001) (таблица 7.8). Гены БТК15 и ВиВ1 оказывали опосредованное через стадию заболевания влияние на риск летального исхода.

Таблица 7.8 - Результаты регрессионного анализа Кокса по оценке влияния транскрипционной активности генов на общую выживаемость больных со светлоклеточным раком тела матки

Ген Р (т) Отношение шансов Статистика Р Коррекция р с учетом стадии

СБКШЛ 3,14 (0,92) 71,63 9,12 <0,0001* <0,0001*

ЫСЛМ 3,07 (0,86) 42,11 10,09 <0,0001* <0,0001*

СЬБЫ4 4,15 (0,81) 35,29 12,84 <0,0001* <0,0001*

ЕЯВВ2 2,36 (0,69) 21,47 11,09 <0,0001* <0,0001*

иВЕ2С 2,04 (0,66) 16,95 9,67 <0,0001* <0,0001*

ЛиЯКВ 1,16 (0,93) 1,85 1,64 0,52 0,71

ССЫВ2 0,29 (0,20) 1,01 1,13 0,67 0,85

ТЖТ1 1,38 (0,96) 3,17 2,83 0,08 0,26

РЛХ8 4,16 (0,75) 30,49 15,28 <0,0001* <0,0001*

ЕОХМ1 0,35 (0,41) 1,11 1,34 0,58 0,64

СВС45 0,68 (0,37) 1,25 1,19 0,46 0,55

МК167 0,59 (0,43) 0,93 0,96 0,75 0,79

СВСЛ8 0,68 (0,59) 0,89 1,27 0,54 0,64

ТРХ2 0,55 (0,49) 1,13 1,35 0,62 0,75

К1Г2С 0,92 (0,63) 0,97 1,15 0,66 0,83

8ТК15 1,81 (0,70) 4,13 6,51 0,0005* 0,16

ВиВ1 1,67 (0,52) 3,37 5,26 0,0008* 0,09

Таким образом, высокая экспрессионная активность генов СОКЫ2А, ЫСАМ, СШ№, ЕЯББ2, иБЕ2С, ТЖГТ1, РАХ8, БТК15, БиБ1 в опухолевых клетках при злокачественных эпителиальных опухолях была ассоциирована с агрессивным фенотипом течения болезни и редкими формами рака (серозным и светлоклеточным). Идентификация высокой экспрессии генов СОКЫ2А, ЫСАМ, СШ№, ЕЯББ2, иБЕ2С, ТЫЫТ1, РАХ8, БТК15, БиБ1 при генетическом исследовании операционных образцов эндометриальной аденокарциномы может свидетельствовать о смешанном характере опухоли и неблагоприятном прогнозе, что требует использования интенсивных схем лечения и наблюдения за больными. Внедрение классификации редких форм рака тела матки, основанной на гистологических и молекулярных характеристиках опухолей, позволит врачам повысить эффективность прогноза и персонифицировать лечение онкологической патологии.

Независимое предикторное значение для неблагоприятного течения болезни с летальным исходом у больных с эндометриальной карциномой имела гиперэкспрессия генов ЫСАМ и ЕЯББ2, при серозном раке тела матки -повышение транскрипционной активности генов СОКЫ2А, ЫСАМ, ЕКББ2 и иБЕ2С и при светлоклеточном раке - генов СОКЯ2А, ЫСАМ, СЬОЫ4, ЕЯББ2, иБЕ2С и РАХ8. Таким образом, в случае редких форм рака тела матки для пациенток с серозным раком прогностическую информативность при формировании группы высокого риска летального исхода имели гены СОКЫ2А, иБЕ2С, а при светлоклеточном раке кроме указанных - дополнительно гены СЬОЫ4 и РАХ8. Таким образом, была определена диагностическая и прогностическая информативность генов с высокой экспрессионной активностью для эндометриальной карциномы и редких форм рака тела матки из числа ДЭГ, предварительно идентифицированных с помощью биоинформатического анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние годы накоплены результаты исследований дифференциально экспрессируемых генов в эндометрии при раке тела матки и их роли в сигнальных путях, ассоциированных со злокачественным процессом в эндометрии (Ц^ М.Н. е1 а1., 2016; ТаШоик А. е1 а1., 2017). С помощью технологий биоинформатики происходит систематизация и анализ генетической информации с целью определения молекулярных основ биологических процессов, ассоциированных с заболеванием, его течением, с последующим использованием этих знаний на практике (Реге§туа О.У. е1 а1., 2020). На современном этапе развития онкогинекологии на основе полученного багажа знаний по молекулярной онкологии сформировалась практическая потребность в определении спектра эффективных онкомаркеров для решения диагностических и прогностических задач при ведении пациентов с раком тела матки. Актуальным является также расширение для исследования числа местных биологических сред, содержащих эпителиальные клетки эндометрия, что может повысить результативность диагностических исследований.

Прогноз онкологического заболевания любой локализации строится с учетом стадии, степени дифференцировки опухоли, типа гистологического строения, глубины инвазии и поражения регионарных лимфатических узлов (Гуцу Л., 2017). При стандартизации всех значимых факторов для контроля течения онкологического заболевания клиницисты нуждаются в экспресс-методах неинвазивного мониторинга биологических маркеров. Оценка онкомаркеров в различных биологических средах до операции и в динамике после операции способна обеспечить эффективную поддержку гистологическим и цитологическим методам исследования биоптатов и операционных образцов тканей, способам визуальной диагностики.

В связи с вышеизложенным, работа, целью которой явилась оптимизация системы ранней диагностической помощи и оценки риска неблагоприятного течения болезни у пациентов со злокачественными эпителиальными опухолями тела матки путем сочетания клинических, морфологических и молекулярно-

генетических методов исследования системных и местных биологических сред, является актуальной.

Дизайн исследования включал три этапа: эпидемиологический, научно -исследовательский и рационализаторский по оптимизации ранней диагностики рака тела матки. 1 этап - эпидемиологическая часть исследования, направленная на выяснение частоты злокачественных эпителиальных опухолей тела матки различного гистотипа в Ростовской области в целом за два десятилетия. 2 этап -фундаментальные молекулярно-генетические исследования маркеров в различных биологических субстратах (сыворотка крови, аспират полости матки, осадок мочи, влагалищно-цервикальный секрет, опухолевая ткань) в основной клинической (343 пациентки с раком тела матки) и контрольной (32 здоровые пациентки) группах. 3 этап - разработка эффективных способов раннего выявления рака тела матки

На I этапе за период 2000-2019 гг. проанализированы сведения о 5148 пациентках с диагнозом рака тела матки (С54 по МКБ10), проживающих в Ростовской области. Структура рака тела матки отличалась морфологической гетерогенностью и преимущественно была представлена эндометриальной карциномой (93,9%). Среди 4836 случаев эндометриоидной формы заболевания аденокарцинома в железистом полипе по результатам морфологического исследования была установлена у 87 пациенток (1,7%). Редкие формы рака тела матки гистологически идентифицированы у 312 женщин (6,1%) и представлены серозным (3,8%), светлоклеточным (1,3%), муцинозным (0,06%), недифференцированным раком (0,06%), вариантом с плоскоклеточной метаплазией (0,5%).

Возраст пациенток при постановке на учет составил в среднем 59,6±0,14 лет, медиана соответствовала 60 годам, а диапазон между нижним (25%) и верхним (75%) квартилем соответствовал 53-66 лет.

В общей клинической группе высоко- (01) и низкодифференцированная карцинома (03) была выявлена в 15% каждая, а умеренно-дифференцированная (02) - в 70%.

Среди больных с эндометриальным и неэндометриальным раком тела матки в зависимости от гистологического типа опухоли чаще всего наблюдалась умеренная дифференцировка раковых клеток. Однако, при редких формах рака тела матки по сравнению с эндометриальными аденокарциномами высокодифференцированные опухоли встречались реже (5,5% против 15,7%, p<0,001), а низкодифференцированные чаще (29,8% против 14%, p<0,001).

При редких формах рака тела матки высокая частота низкодифференцированной градации G3 является известным фактом (Association between differential gene expression..., 2016). В классификации молекулярно-генетических типов рака эндометрия при ранжировании риска неблагоприятного исхода заболевания рассматривается только сочетание неэндометриальной опухоли и градации G3 (Association between differential gene expression., 2016). Между тем, эти два признака, как показало наше наблюдение, предусматривают и другие комбинации. Так, преимущественно в регионе встречалась умеренная дифференцировка опухоли у больных с неэндометриальной аденокарциномой (64,7%). В связи с вышеуказанным, на следующем этапе анализа была изучена выживаемость больных раком тела матки с учетом степени дифференцировки и гистологического типа.

Для анализа выживаемости по 2818 пациенткам (когортная группа) из 5148 больных в территориальном фонде ОМС были получены точные сведения о дате смерти либо к концу 2019 г. подтвержден статус «жива» по факту активного использования действующего страхового полиса в системе ОМС. В отношении оставшейся доли больных эпидемиологической группы, по указанным персональным данным активности в системе ОМС обнаружено не было.

За 20 лет общая кумулятивная выживаемость пациенток с раком тела матки снижалась до 61%. Трехлетняя кумулятивная выживаемость больных составила 87,8%, пятилетняя - 83,6%, десятилетняя - 76%. Среди представленных по числу пациентов различных гистологических типах рака тела матки наиболее высокие величины летальности за 20-летний срок наблюдения были при серозном раке (43%), светлоклеточном раке (30%) и эндометриальной аденокарциноме (19,3%).

По результатам регрессионного анализа Кокса отношение шансов летального исхода у больных с редкими формами рака тела матки по сравнению с эндометриальной карциномой повышалось в 3 раза (р=0,001), а при градации 03 по сравнению с 02 - в 10,7 раз (р<0,0001).

При эндометриальной аденокарциноме риск летального исхода в течение 10 лет от начала специализированного лечения при изменении градации от 01 до 03 повышался с 0,1 до 0,34, а при редких формах рака с 0,18 до 0,52. То есть, при эндометриальной аденокарциноме и низкодифференцированном раке 03 через 10 лет умирает каждый третий больной, а при редкой форме рака и той же дифференцировке - каждый второй.

Итак, детализирована зависимость выживаемости больных раком тела матки на популяционном уровне за 2000-2019 гг. от гистологического строения карциномы, степени дифференцировки опухоли. Обнаружен факт сравнительно высокой частоты умеренной дифференцировки раковых клеток при редких формах рака тела матки (64,7%). Дальнейшее совершенствование системы прогноза неблагоприятных исходов болезни видится в разработке молекулярно-генетической классификации со стратификацией риска смерти больных с неэндометриальными карциномами и умеренной дифференцировкой опухолевых клеток 02.

По результатам биоинформатического анализа 170 идентифицированных генов с повышенной экспрессией в ткани опухоли при раке тела матки относительно нормального эндометрия участвовали в регуляции трех функций: деление митотического ядра (0О: биологические процессы), организация веретена деления (0О: клеточные компоненты) и связывания микротрубочек веретен (00: молекулярные функции) клеток. Кроме того, отмечено участие выделенных ДЭГ в регуляции дифференциации эпителиальных клеток, апоптоза, клеточного деления, пролиферации клеток, проницаемости внеклеточного матрикса, ангиогенеза.

К хаб-генам, ассоциированным с развитием рака эндометрия и имеющих наибольшую плотность межгенных взаимоотношений, были отнесены 20 генов.

Наибольшая выраженность дифференциальной экспрессии была отмечена для СОШ2А, ЫСАМ, ЕЯББ2, РАХ8, иБЕ2С, СЬОЫ4, КШС, АиЯКБ и ТМГТ1.

По результатам регрессионного анализа Кокса с летальным исходом больных эндометриальным раком в наибольшей мере была ассоциирована гиперэкспрессия генов СОКЫ2А (отношение шансов=2,1, р<0,0001), БТК15 (отношение шансов=2,0, р<0,0001), ПСАМ (отношение шансов=1,9, р<0,0001), ТЫЫТ1 (отношение шансов=1,8, р<0,0001), СЬОМ4 (отношение шансов=1,7, р<0,0001), РАХ8 (отношение шансов=1,7, р<0,0001). Риск развития летального исхода больных при повышенной экспрессии в ткани эндометрия гена ЕЯББ2 статистически значимо повышался в 1,4 раза (р=0,038), гена иБЕ2С - в 1,3 раза (р=0,0027).

Таким образом, проведение биоинформатического анализа позволило сузить спектр генов для последующего изучения их информативности относительно прогноза у больных со злокачественными эпителиальными опухолями тела матки.

Сравнительный анализ изменения экспрессионной активности генов в опухолевых клетках в зависимости от гистологического типа опухоли показал, что более выраженное усиление экспрессионной активности изученных генов наблюдалось для серозного рака.

При серозном раке по сравнению с двумя другими изучаемыми морфологическими типами экспрессия генов СОКЫ2А, ЫСАМ, ЕЕББ2, иБЕ2С, ТЫЫТ1, БТК15 и БиБ1 была выше. Для светлоклеточного рака преимущественный рост экспрессии в опухолевых клетках отмечен для генов СЬОЫ4 и РАХ8.

Итак, по результатам статистического анализа был выделен комплекс генов, экспрессионная активность которых различалась во всех трех группах с учетом гистотипа: СОКЫ2А, ЫСАМ, СЬОЫ4, иБЕ2С, БТК15, БЧБ1.

Ген СОКЫ2А регулирует синтез белков р16 и p14ARF, а также по механизму отрицательной обратной связи протеина Rb и р53. При гиперэкспрессии гена СОКЫ2А нарушаются сигнальные пути p16-CDK4/ циклин D1-pRb и р14АРГ-МОМ2-р53, что ведет к нарушениям клеточного цикла и потере онкосупрессорных свойств протеинов ^иусюка W. е1 а1., 2020). Ген ЫСАМ кодирует белковую молекулу клеточной адгезии L1. Этот белок принимает участие в процессах

клеточной миграции, адгезии, миелинизации и нейрональной дифференцировки. L1CAM, представляющий клеточный поверхностный гликопротеин, обнаружен и в эпителиальных клетках кишечника (Tang H. et al., 2019). Гены STK15, BUB1 участвуют в регуляции веретена деления клеток (Talhouk A. et al., 2017). Ген UBE2C регулирует синтез белков убиквитин-протеасомной системы и интенсивность аутофагии как двух основных внутриклеточных путей деградации протеинов (Guo J. et al., 2018). Ген UBE2C, содействуя дупликации ДНК, оказывает влияние на пролиферативную и апоптическую активность опухолевых клеток, регулирует клеточный цикл (Zhang H-Q. et al., 2018). Ген CLDN4 кодирует синтез белка плотного контакта клаудина-4 между эпителиальными клетками на апикальной поверхности, что сказывается на осмотическом обмене ионов между цитоплазмой и внеклеточным матриксом, дифференцировке и пролиферативной активности клеток (Koumarianou P. et al., 2017).

Независимую от стадии предикторную роль в отношении неблагоприятного течения болезни с летальным исходом у больных с эндометриальной карциномой имела гиперэкспрессия генов L1CAM и ERBB2, при серозном раке тела матки -повышение транскрипционной активности генов CDKN2A, L1CAM, ERBB2 и UBE2C и при светлоклеточном раке - генов CDKN2A, L1CAM, CLDN4, ERBB2, UBE2C и PAX8. Таким образом, в случае редких форм рака тела матки для пациенток с серозным раком прогностическую информативность при формировании группы высокого риска летального исхода имели гены CDKN2A, UBE2C, а при светлоклеточном раке кроме указанных - дополнительно гены CLDN4 и PAX8. Таким образом, была определена диагностическая и прогностическая информативность генов с высокой экспрессионной активностью для эндометриальной карциномы и редких форм рака тела матки из числа ДЭГ, предварительно идентифицированных с помощью биоинформатического анализа.

На следующем этапе исследования у больных раком тела матки с помощью иммуногистохимического метода в опухолевой ткани оценивали экспрессию белков, участвующих в сигнальных путях, контролируемых ДЭГ.

Для сравнительного анализа профиля экспрессии белков в опухоли при различном гистологическом типе, в исследование включали 249 больных ЭК II-IV стадий, 33 больных серозным и 24 пациентки со светлоклеточным раком тела матки. Больных с 1 стадией заболевания при ЭК не включали, поскольку при серозном и светлоклеточном раке тела матки пациентки с I стадией отсутствовали.

В результате было выявлено, что высокая тканевая экспрессия белка СА-125 выявлена у большинства пациентов независимо от гистологического типа опухоли: эндометриальный рак - 76,7%, серозный рак - 90,9% и светлоклеточный рак -91,7%. Гиперэкспрессия НЕ4 в отличие от белка СА-125 в операционных образцах опухоли встречалась реже: эндометриальный рак - 51%, серозный рак - 50% и светлоклеточный рак - 51,5%. Различия экспрессии белка СА-125 и НЕ4 в ткани опухоли при эндометриальном и редких формах рака тела матки отсутствовали (р>0,05).

Гиперэкспрессия белка DJ-1 в операционных образцах опухоли чаще (р<0,001) наблюдалась при серозном (63,7%) и светлоклеточном раке (41,6%) по сравнению с больными с диагнозом ЭК (14,9%). Высокая тканевая экспрессия белка ЫСАМ также чаще (р<0,001) наблюдалась при серозном (94%) и светлоклеточном раке (95,8%) по сравнению с ЭК (31,7%). Таким образом, при редких формах рака тела матки тканевая экспрессия белков и ЫСАМ в опухоли была выше по сравнению с эндометриальным раком.

При эндометриальной карциноме без учета стадии заболевания гиперэкспрессия всех четырех онкомаркеров коррелировала с развитием рецидивов рака тела матки. Однако, независимость влияния была установлена только для одного онкомаркера Э1-1. Оверэкспрессия белка Э1-1 при эндометриальной аденокарциноме сопровождалась повышением риска рецидивов в 4,3 раза без учета стадии заболевания и в 3,8 с учета стадии болезни. При серозном раке тела матки независимая от стадии прогностическая информативность в отношении развития рецидивов заболевания была установлена для двух маркеров - Э1-1 и ЫСАМ. При светлоклеточном раке тела матки спектр

морфологических предикторов рецидивирования был расширен до НЕ4, Э1-1 и Ь1СЛМ.

Проведенное генетическое и иммуногистохимическое исследование при различных гистотипах РТМ явилось обоснованием для изучения информативности определения концентрации в сыворотке крови кроме стандартно используемого маркера СА125 и все чаще определяемого протеина НЕ4, еще и дополнительной оценки уровня белковой дегликазы Э1-1 и молекулы адгезии Ь1СЛМ.

При эндометриальном раке концентрация всех изучаемых маркеров в крови отличалась от аналогичных показателей здоровых лиц: СА-125 в 3,8 раз (р<0,001), НЕ4 в 2,6 раз (р<0,001), Ш-1 в 3,0 раз (р<0,001) и Ь1СЛМ в 1,7 раза (р<0,001). Повышение сывороточной концентрации биомаркеров было сопряженно с изменением основных клинических характеристик заболевания - стадии, глубины инвазии, распространения опухоли на лимфатические узлы, наличием лимфососудистой инвазии, высокого риска рецидивов. Наиболее выраженные изменения отмечены относительно НЕ4 и DJ-1.

У больных серозным раком тела матки концентрация онкомаркеров также многократно возрастала относительно показателей у здоровых пациентов: СА-125 в 4,2 раза (р<0,001), НЕ4 в 2,8 раза (р<0,001), БМ в 5,8 раз (р<0,001) и L1CAM в 2,9 раз (р<0,001). Однако, со стадией болезни, степенью дифференцировки, поражением лимфатических узлов концентрация всех изучаемых белков в крови не коррелировала. Изменение концентрации биомаркеров отмечалось только при наличии лимфососудистой инвазии. Таким образом, у больных серозным раком тела матки многократное повышение концентрации биомаркеров в крови сопровождалось потерей информативности относительно стадии, дифференцировки и распространенности опухолевого процесса.

При светлоклеточном раке тела матки относительно контрольных величин у здоровых людей установлено повышение концентрации СА-125 в 4 раза (р<0,001), НЕ4 в 2,8 раза (р<0,001), БМ в 5,7 раз (р=0,004) и L1CAM в 2,7 раз (р<0,001). Содержание изучаемых сывороточных белков не зависело от стадии заболевания и

степени дифференцировки опухоли, но было сопряжено лимфососудистой инвазией.

Итак, в работе был установлен факт преимущественного роста в сыворотке крови при редких формах рака тела матки предоперацционных уровней белков DJ-1 и L1CAM. При многократном превышении концентрации DJ-1 и L1CAM в крови у больных раком тела матки относительно референтного диапазона, риск выявления редких или смешанных форм рака тела матки с высоким злокачественным потенциалом повышался.

Применение ROC анализа позволило уточнить, что до операции у больных раком тела матки при превышении концентрации DJ-1 в крови выше дифференциально разделительного уровня 85,2 нг/мл, риск выявления редкой формы рака при последующем гистологическом исследовании операционных образцов эндометрия был высоким (диагностическая чувствительность 86,7%, диагностическая специфичность 81,3%, р=0,001). Дифференциально-разделительным уровнем L1CAM до операции была концентрация в сыворотке крови 1758 пг/мл (диагностическая чувствительность 83,9%, диагностическая специфичность 80,5%, р=0,004). Дифференциальная информативность предоперационной оценки уровня DJ-1 и L1CAM в крови до операции в отношении выявления редких форм рака тела матки с высокой степенью злокачественности дополняет диагностические возможности биопсии эндометрия до начала специализированного лечения и позволяет рационально определить тактику хирургического вмешательства до получения окончательного заключения о гистологическом типе опухоли.

У больных раком тела матки с развитием рецидива болезни связывают повышенный уровень СА-125 в крови, установленный на предоперационном этапе (Reijnen C. et al., 2019). В настоящее время во многих клиниках кроме СА-125 перед операцией оценивают концентрацию в крови маркера HE4 (Human epididymis protein 4). Установлено, что на ранних стадиях рака тела матки диагностическая информативность HE4 выше, чем у СА-125 (Behrouzi R. et al., 2021). HE4 представляет собой человеческий эпидидимальный секреторный белок 4 и

принадлежит к семейству ингибиторов протеаз. Его прогностическое значение для определения риска рецидивов рака тела матки установлено только для низкой степени дифференцировки опухоли (Espiau Romera A. et al., 2020). В последнее время в качестве прогностических маркеров при раке тела матки рассматривают белковую дегликазу DJ-1 (Hutt S. et al., 2019) и белок межклеточного взаимодействия L1CAM. DJ-1 способствует пролиферации опухолевых клеток и играет важную роль в патогенезе и прогрессировании рака тела матки путем модуляции супрессора опухолей PTEN (Benati M. et al., 2018). Перспективность определения DJ-1 в крови в комплексе с HE4 установлена при проведении дифференциальной диагностики эндометриальных и неэндометриальных аденокарцином, низко- и высокодифференцированного рака тела матки (Кит О.И., Коваленко Н.В., Максимов А.Ю. и соавт., 2022; Di Cello A. et al., 2017). Белок L1CAM посредством реорганизации межклеточного вещества может повышать инвазивные и миграционные свойства опухолевых клеток (Kommoss F.K. et al., 2018).

Оценка прогноза рецидивов у больных раком тела матки по исходным дооперационным параметрам сыворотки крови остается непростым вопросом для клиницистов.

За два года наблюдения среди больных с эндометриальной аденокарциномой были выявлены пациентки с рецидивами рака тела матки: 64 (18,7%) локорегионарных рецидивов и 11 (3,2%) отдаленных рецидивов. У пациенток с серозным раком ранние рецидивы наблюдались в 39,4%, а при светлоклеточном раке тела матки в 37,5%.

У больных с рецидивами и ремиссией заболевания ретроспективно оценивали исходную дооперационную концентрацию биомаркеров в крови. Для CA-125 точка ^t-oír составила 29,3 МЕ/мл (p<0,001). При превышении исходной концентрации CA-125 выше этого уровня с диагностической чувствительностью 76,2% и специфичностью 77,2% прогнозируется рецидив заболевания в ближайшие два года после операции. Для маркера HE4 дифференциально-разделительный уровень составил 79,3 пмоль/л (p<0,001), DJ-1 - 90 нг/мл (p<0,001) и L1CAM -

1483 пг/мл (p<0,001). Сравнительный анализ показал, что наиболее эффективным онкомаркером для прогнозирования рецидивов ЭК по исходной концентрации веществ в крови до операции была белковая дегликаза DJ-1 (р=0,0001).

У пациенток с серозным раком ретроспективный анализ не выявил различия исходной концентрации онкомаркеров CA-125, HE4 и DJ-1 в сыворотке крови в зависимости от развития рецидивов заболевания. Только относительно белка L1CAM установлено повышение (p<0,001) исходного содержания маркера в крови у пациентов при развитии ранних рецидивов. При превышении исходной концентрации L1CAM выше 1879 пг/мл с диагностической чувствительностью 81% и специфичностью 82,6% прогнозируется развитие рецидива болезни (p<0,001).

У больных светлоклеточным раком тела матки с развитием ранних рецидивов было сопряжено только повышение HE4 и L1CAM. Дифференциально-разделительный уровень концентрации для оценки риска рецидивов онкомаркера HE4 составил 96,3 пмоль/л (p<0,001), а L1CAM - 1735 пг/мл (p<0,001). Превышение установленных уровней данных онкомаркеров сопровождалось достоверным повышением риска развития рецидивов.

За два года наблюдения среди больных с ЭК умерла 21 женщина (6,1%), а из 33 пациенток с серозным раком умерли 5 пациенток (15,2%). У больных светлоклеточным раком летальный исход в первые два года после операции развился у 5 больных (20,8%). Дифференциально-разделительные точки для оценки риска летального исхода по дооперационной концентрации маркеров крови при ЭК составили: для CA-125 48,6 МЕ/мл, HE4 - 214,3 пмоль/л, DJ-1 - 98,7 нг/мл и L1CAM - 1972 пг/мл. Наиболее эффективными онкомаркерами для прогнозирования летального исхода у больных ЭК по исходной концентрации веществ в крови до операции была белковая дегликаза DJ-1 (р=0,003) и белок L1CAM (р=0,002). При серозном раке тела матки точка cut-off для DJ-1 составила 126 нг/мл (p<0,001), а L1CAM - 1972 пг/мл (p<0,001). Превышение установленных уровней данных онкомаркеров сопровождалось достоверным повышением риска летального исхода. У пациентов со светлоклеточным раком тела матки

прогностическая информативность для оценки риска летального исхода установлена для широкого круга онкомаркеров - НЕ4, Ш1-1 и Ь1СЛМ. Для маркера НЕ4 дифференциально-разделительный уровень для оценки риска смерти составил 106,4 пмоль/л (р<0,001), Ш-1 - 121 нг/мл (р<0,001) и Ь1СЛМ - 1783 пг/мл (р<0,001).

Оценку ответа опухоли на лучевое и химиолучевое лечение проводили по критериям эффективности терапии солидных опухолей по шкале ЯЕС^Т 1.1. Прогрессирование заболевания после ХЛТ у больных ЭК отмечали в 10,2%, при серозном раке в 33,3% и светлоклеточном раке также в 33,3%. У больных ЭК риск развития резистентности к ХЛТ можно определить только при измерении в крови концентрации НЕ4 (сut-off 96,7 пмоль/л), при серозном раке тела матки по концентрации Ш1-1 в крови (сut-off 105,6 нг/мл) и при светлоклеточном раке - по сывороточному уровню НЕ4 (сut-off 101,5 пмоль/л) и Ш1-1 (сut-off 104,8 нг/мл).

Двухкратное тестирование маркеров СА-125, НЕ4, Ш1-1 и Ь1СЛМ в крови каждые 3 месяца после операции может раскрыть возможности для выделения группы больных с асимптомным течением рецидивов для осуществления их углубленного обследования и проведения адекватных лечебных мероприятий. У больных с наличием и отсутствием рецидивов эндометриального и неэндометриального рака ретроспективно двухкратно оценивали динамику изменений в крови в течение 6 месяцев после операции для оценки риска развития ранних рецидивов. В результате было установлено, что при эндометриальной карциноме кроме стандартного определения концентрации СА-125 эффективным является мониторинг Ш1-1 и НЕ4 в сыворотке крови через 6 месяцев после операции. У больных серозным раком тела матки серийное определение сывороточных маркеров для оценки риска рецидивов было неэффективным. При светлоклеточном раке тела матки для прогноза рецидива заболевания перспективным являлся мониторинг НЕ4 через 6 месяцев после операции.

Итак, по результатам определения онкомаркеров в крови можно заключить, что при эндометриальной карциноме стандартно используемые маркеры СА125 и НЕ4 имеют как диагностическую, так и прогностическую информативность. При

дифференциальной дооперационной диагностике эндометриальной карциномы и редких форм рака тела матки необходимо определять в крови исходную концентрацию дегликазы Э1-1. При серозном и светлоклеточном раке тела матки онкомаркеры в крови резко повышены и не отражают стадию заболевания и степень дифференцировки опухоли, прогностическая информативность резко ограничена. Оптимизация лабораторных тестов заключается в необходимости мониторинга маркеров в крови в первые 6 месяцев после операции, а также в оценке экспрессии белков в ткани опухоли операционных образцов при ИГХ исследовании. Обращает на себя внимание, что при всех изучаемых гистологических типах рака тела матки выраженность экспрессии дегликазы коррелирует с риском рецидивирования болезни. При редких формах рака тела матки для оценки риска рецидивов также рекомендуется определение экспрессионной активности в ткани опухоли ЫСАМ, а при светлоклеточном раке еще и НЕ4. Следовательно, при редких формах рака тела матки большую эффективность имеет не определение онкомаркеров в сыворотке, а ИГХ исследование с оценкой экспрессии Э1-1, ЫСАМ и НЕ4 в ткани опухоли.

Разработка и изучение эффективности методов раннего выявления рака тела матки представляет собой актуальную проблему современной онкогинекологии. Существующие методы диагностики рака тела матки включают трансвагинальное ультразвуковое сканирование, диагностическое выскабливание эндометрия либо гистероскопию с прицельной биопсией эндометрия с последующим гистологическим исследованием соскоба, аспирационную биопсию эндометрия по Пайпелю. Каждый из методов имеет свою диагностическую информативность, но и недостатки, требующие оптимизации. Безусловно, при выявлении внутриматочной патологии прицельное диагностическое выскабливание эндометрия под контролем гистероскопии с последующим гистологическим исследованием соскоба характеризуется наиболее высокими параметрами чувствительности и специфичности, но данный метод не может выступать как скрининговый. Его реализация требует участия профессионально подготовленных кадров и специального оборудования, анестезиологического сопровождения.

Аспирационная биопсия эндометрия по Пайпелю относится к относительно низкозатратным, малоинвазивным, быстрым по реализации и неболезненным для пациенток манипуляциям. Реализация Пайпель-биопсии происходит амбулаторно. При этом, в аспират полости матки попадают эпителиальные клетки эндометрия, что является прямой биологической средой для выявления злокачественных заболеваний (Коваленко Н.В., Жаворонкова В.В. и соавт., 2022). Расширение спектра исследования биологического материала, полученного при Пайпель-биопсии, за счет подключения к гистологическим методам молекулярно-генетических, современных протеомных технологий, может повысить диагностическую информативность и открыть новые перспективы в развитии метода (Коваленко Н.В., Жаворонкова В.В. и соавт., 2022). Учитывая вышеизложенное, одной из задач работы явилось оптимизировать аспирационную биопсию эндометрия по Пайпелю для раннего выявления рака тела матки за счет комплексирования с протеомными и молекулярно-лабораторными технологиями.

Поскольку аспирационная биопсия эндометрия проводится в основном для диагностики ранних стадий рака тела матки, то на данном этапе исследования анализ информативности оптимизированного метода за счет изучения протеома аспирата проводили в сравнительном аспекте у 79 больных с эндометриальной аденокарциномой (I (п=53) и II (п=26) стадий), 16 пациентов с серозным раком II стадии и 9 больных со светлоклеточным раком II стадии с контрольной группой здоровых пациенток (п=32).

В маточном аспирате у больных эндометриальным раком тела матки идентифицированы 109 белков. Белки были представлены ферментами, участвующими в основных метаболических процессах (например, гликолитические ферменты енолаза и фосфоглицераткиназа), белками-регуляторами процессинга мРНК и изменения цитоскелета, шаперонами, а также белками, обладающими связывающими функциями. Наибольшее количество белков было связано с ферментативной каталитической активностью.

У больных с ЭК к первым десяти мажорным белкам в масс-спектрах относили фибриноген бета-полипептид (р=0,0273), белок семейства АБЯАСЬ

(р=0,005), предшественник альфа-1-антитрипсина (р=0,0031),

фосфоглицератмутаза 2 (р=0,0431), альфа-енолаза (р=0,0430), шаперонин 10 (р=0,0192), аннексин A3 (р=0,0273), пероксиредоксин 2, изоформа CRA_a (р=0,0431), белковая дегликаза DJ-1 (р=0,0329), глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (р=0,0422). При этом пять белков имели наивысшие оценки SCORE - белок семейства ABRACL, альфа-енолаза, аннексин A3, белковая дегликаза DJ-1, фосфоглицератмутаза 2.

У пациентов с серозным раком тела матки по сравнению с протеомным профилем маточного аспирата больных эндометриальным раком в масс-спектре повысилась удельная значимость белков молекулы клеточной адгезии L1, убиквитин-конъюгирующего фермента E2 наряду со снижением площади E-кадгерина-1 при ЭК. У больных со светлоклеточным раком тела матки в электрофореграммах аспирата полости матки в отличие от других гистотипов отмечено высокое содержание клаудина 4, белковой дегликазы DJ-1, белка семейства ABRACL, фибриногена бета-полипептида, шаперонина 10, аннексина 4, аннексина 1,2.

При сравнительном анализе качественного состава мажорных белков наше внимание было обращено на тот факт, что при редких формах рака тела (серозном и светлоклеточном раке), как и при эндометриальной аденокарциноме, в аспирационном биоптате эндометрия идентифицировали белки DJ-1 и МСМ5.

В образцах эндометрия здоровых женщин контрольной группы протеин DJ-1 при окраске Кумасси голубым R-250 не идентифицировали. Данный белок подвергался детекции только при более чувствительной на порядок окраске азотнокислым серебром. Следовательно, факт идентификации DJ-1 при масс-спектрометрии аспирационного биоптата эндометрия имел важное диагностическое значение.

Дальнейшая перспектива оптимизации аспирационной биопсии эндометрия по Пайпелю при диагностике рака тела матки видится в прямом количественном определении методом твердофазного иммуноферментного анализа белковой дегликазы DJ-1 и протеина МСМ5 в гомогенате маточного аспирата после

солюбилизации белков. Учитывая, что данные белки присутствовали в масс -спектрах как при эндометриальной аденокарциноме, так и при редких формах рака тела, количественная оценка маркеров может играть также и дифференциальное значение.

У больных эндометриальной карциномой при прямом количественном определении концентрации DJ-1 в клеточном гомогенате маточного аспирата установлено, что содержание маркера при ЭК составило 53,36±14,9 УЕ/мг белка в лунке, а в контрольной группе здоровых людей 11,98±1,7 УЕ/мг белка в лунке. У пациентов с серозным раком тела матки концентрация DJ-1 в клеточном гомогенате маточного аспирата составила 123,12±15,89 УЕ/мг белка в лунке, а при светлоклеточном раке тела матки 111,73±15,5 УЕ/мг белка в лунке.

К настоящему времени установлен факт опухолевой экспрессии белка DJ-1 в двух десятках различных злокачественных опухолей, главным образом, эпителиального происхождения (Wang H. et al., 2016). DJ-1 способствует пролиферации опухолевых клеток и играет важную роль в патогенезе рака тела матки путем модуляции супрессора опухолей PTEN, активации сигнального пути через рецептор ростового фактора фибробластов-1 (FGFR1), изучаемый протеин регулирует проницаемость эндотелия сосудов (Zhu X.L. et al., 2012), повышает устойчивость раковых клеток к апоптозу (Arnouk H. et al., 2009).

Поскольку концентрация белковой дегликазы DJ-1 в маточном аспирате у больных раком тела матки зависела от гистотипа, то диагностическая информативность ее определения в субстрате определялась этапами. На первом этапе находили разделительный уровень для ранней диагностики рака тела матки при проведении Пайпель-биопсии, а на следующем этапе определяли дифференциальную точку cut-off между эндометриальной карциномой и редкими формами рака тела матки.

Методом ROC анализа определена разделительная точка концентрации, составившая 4,9 УЕ/мг белка в лунке и позволяющая разграничить пациенток с наличием и отсутствием рака тела матки ранних стадий (I—II) с диагностической чувствительностью 93,7% и специфичностью 95,7% (p<0,001). При превышении

уровня белковой дегликазы DJ-1 в клеточном гомогенате маточного аспирата выше 14,9 УЕ/мг белка в лунке, относительный риск выявления злокачественной эпителиальной опухоли тела матки повышался в 7,84 раз.

Далее была определена дифференциальная разделительная точка концентрации, позволяющая разграничить пациенток с эндометриальным раком и редкими формами рака тела матки, которая составила 79,3 УЕ/мг белка в лунке. При превышении данного уровня относительный риск выявления редких форм рака тела матки повышался в 76,7 раз (p<0,0001).

На следующем этапе определяли концентрацию хроматинсвязывающего белка МСМ5 в клеточном гомогенате маточного аспирата. Слущенные эпителиальные клетки, попавшие в биологические жидкости (маточный аспират, влагалищные выделения, моча), в норме не экспрессируют MCM5. Однако, в случае злокачественного новообразования, при котором опухолевые клетки неконтролируемо делятся, увеличивается число незрелых недифференцированных клеток, экспрессия белка возрастает, протеин может идентифицироваться в контактных биологических средах. Таким образом, белок семейства минихромосомной защиты MCM5, можно рассматривать как маркер пролиферации клеток (Snyder M. et al., 2005). При прямом количественном определении МСМ5 в клеточном гомогенате маточного аспирата установлено, что при ЭК уровень маркера составил 42,2±6,7 пг/мл, в контрольной группе здоровых людей 9,1±1,1 пг/мл. У пациентов с серозным раком тела матки концентрация МСМ5 соответствовала 76,9±4,6 пг/мл, а при светлоклеточном раке тела матки -59,8±7,4 пг/мл. Разделительная точка концентрации МСМ5 в маточном аспирате, позволяющая разграничить пациенток с наличием и отсутствием рака тела матки составила 11,38 пг/мл (диагностическая чувствительность 96,12%, специфичностью 78,79%).

Дифференциальная разделительная точка концентрации МСМ5 в маточном аспирате для разграничения эндометриальной карциномы и редких форм рака тела матки соответствовала 56,9 пг/мл (диагностическая чувствительность 78,57%, специфичностью 98,68%).

По результатам исследования определение концентрации дегликазы DJ-1 и МСМ5 в тканевом экстракте эндометрия с помощью иммуноферментного анализа было предложено в качестве оптимизации стандартной аспирационной биопсии по Пайпелю у пациенток в постменопаузе с целью раннего выявления злокачественных заболеваний тела матки.

При стандартной аспирационной биопсии эндометрия по Пайпелю среди пациенток с раком тела матки и здоровыми женщинами контрольной группы установлено, что диагностическая чувствительность составила 81% (п=84 к 104), специфичность метода по сравнению с золотым стандартом 90,6% (п=29 к 32), количество ложноположительных наблюдений было 3 (9,4%), ложноотрицательных 20 (19%), диагностическая точность составила 83,1%.

На следующем этапе определяли информативность оптимизации аспирационной биопсии эндометрия по Пайпелю в комплексе с оценкой концентрации в тканевом экстракте маточного аспирата онкомаркера 1. Среди 20 ложноотрицательных наблюдений у 13 пациенток отсутствие информации о злокачественной патологии эндометрия после морфологического исследования биоптата сопровождалось повышением концентрации DJ-1 в маточном аспирате выше 14,9 УЕ/мг белка в лунке. Среди двух ранее установленных ложноположительных наблюдений в одном случае концентрация DJ-1 в маточном аспирате была ниже 14,9 УЕ/мг белка в лунке. В результате диагностическая чувствительность оптимизированной методики Пайпель-биопсии составила 93,3% (п=97), а диагностическая специфичность метода достигала 96,9% (п=31). Количество ложноположительных наблюдений было 1 (3,1%), ложноотрицательных 7 (6,7%). Диагностическая точность метода возросла с 83,1% до 94,1%.

Информативность оптимизации аспирационной биопсии эндометрия по Пайпелю в комплексе с оценкой концентрации в тканевом экстракте маточного аспирата онкомаркера МСМ5 была следующей: среди 20 ложноотрицательных наблюдений у 8 пациенток отсутствие информации о злокачественной патологии эндометрия после морфологического исследования биоптата сопровождалось

повышением концентрации МСМ5 в маточном аспирате выше 11,38 пг/мл. Среди двух ранее установленных ложноположительных наблюдений в одном случае концентрация МСМ5 в маточном аспирате была ниже 11,38 пг/мл. В результате диагностическая чувствительность оптимизированной методики Пайпель-биопсии по онкомаркеру МСМ5 составила 91,3% (n=95), а диагностическая специфичность метода достигала 96,9% (n=31). Количество ложноположительных наблюдений было 1 (3,1%), ложноотрицательных 9 (8,7%). Диагностическая точность метода возросла с 83,1% до 92,6%.

Поскольку при раздельном определении концентрации дегликазы DJ-1 или МСМ5 в тканевом экстракте эндометрия диагностическая информативность стандартной Пайпель-биопсии повышалась до сходных высоких величин, то выполнение сразу двух лабораторных тестов для оптимизации раннего выявления рака тела матки является экономически неоправданным (Коваленко Н.В., 2023). С целью раннего выявления злокачественных заболеваний тела матки возможно выполнение одного из двух лабораторных тестов.

Доказано, что опухолевые клетки эндометрия обнаруживаются в моче и вагинально-шеечном секрете (Fiegl H. et al., 2004; Kinde I. et al., 2013; Bakkum-Gamez J.N. et al., 2015). Следовательно, молекулярные маркеры, экспрессирующиеся опухолевыми клетками, могут быть обнаружены при раннем выявлении рака эндометрия путем лабораторного исследования осадка мочи или вагинально-шеечного секрета, полученного с помощью вагинальных тампонов.

Моча и вагинально-шеечный секрет являются удобной биологической жидкостью для исследования при проведении диагностических мероприятий. Эпителиальные клетки эндометрия у здоровых женщин, а также опухолевые клетки при раке тела матки, слущиваясь, могут спонтанно попадать в вагинально-шеечный секрет, мочу.

На первом этапе проводили масс-спектрометрическую идентификацию белков мочи у больных раком тела матки в сравнительном аспекте с контрольной группой. Среди мажорных белков протеомного профиля осадка мочи у больных раком тела матки был идентифицирован белок МСМ5, который присутствовал

также в протеомной сигнатуре маточного аспирата. В ранее проведенных научных исследованиях была доказана диагностическая значимость МСМ5 как маркера активности пролиферации опухолевых клеток при раке мочевого пузыря, простаты, шейки матки, пищеводе Баррета (Dudderidge Т. et а1., 2010; 2010а). Определение концентрации МСМ5 методом ИФА в биологических жидкостях является несложной диагностической процедурой, подходящей по экономическим затратам для раннего выявления рака тела матки.

В осадке мочи у больных раком тела матки концентрация МСМ5 колебалась от 9,1 до 18,4 пг/мл и в среднем составила 13,83±1,87 пг/мл. В контрольной группе размах показателя составил 1,4-3,95 пг/мл, а средняя выборочная величина соответствовала 2,65±0,62 пг/мл. Концентрация МСМ5 в осадке мочи у больных раком тела матки не зависела от гистотипа опухоли. Содержание маркера в моче при светлоклеточном раке тела матки (14,19±1,06 пг/мл), серозном раке (14,24±1,16 пг/мл) и эндометриальной карциноме (13,71±1,03 пг/мл) не имело статистически значимых отличий (р>0,05).