Защитные механизмы картофеля, обработанного культуральной жидкостью бактерий-антагонистов родов Pseudomonas и Mycobacterium в лечебный период и при холодильном хранении тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.14, кандидат технических наук Гудима, Людмила Ратмировна

• Гудима, Людмила Ратмировна
• кандидат технических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат технических наук Гудима, Людмила Ратмировна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА К ФИТОПА-

ТОГЕНАМ ПРИ ВЕГЕТАЦИИ И ХРАНЕНИИ

1.1 Микроорганизмы - продуценты биологически активных соединений, обладающих антагонистической активностью

1.2 Антибиотические вещества, синтезируемые

бактериями рода Pseudomonas и Mycobacterium

1.3 Исследование взаимоотношения патогенных

организмов и растения-хозяина

1.4 Биологическая защита растительной продукции

от фитопатогенов при хранении

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.3 Постановка эксперимента

3 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ЗАЩИТНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ

СОСТОЯНИЕ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ХРАНЕНИИ

3.1 Суберинизация

3.1.1 Синтез суберина в механически поврежденных

клубнях в лечебный период

3.1.2 Динамика суберина при хранении картофеля

3.2 Фенольные соединения

3.2.1 Фенольные соединения в раневой перидерме

клубней в лечебный период

3.2.2 Фенольные соединения клубней при хранении

3.3 Активность ферментов

3.3.1 Активность оксидаз раневой перидермы

клубней в лечебный период

3.3.2, Активность оксидаз при хранении

3.4 Защитная система фенольные соединения + фенолоксидаза

3.5 Пектиновые вещества

3.5.1 Пектиновые вещества в раневой перидерме

клубней в лечебный период

3.5.2 Пектиновые вещества в коре клубней при хранении

3.6 Влияние условий обработки на физиологическое

состояние клубней

3.6.1 Интенсивность дыхания

3.6.2 Прорастание

3.6.3 Убыль массы

3.6.4 Товароведные и фитопатологические показатели качества

3.6.5 Экономическая эффективность

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Защитные механизмы картофеля, обработанного культуральной жидкостью бактерий-антагонистов родов Pseudomonas и Mycobacterium в лечебный период и при холодильном хранении»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одной из причин высоких потерь картофеля при хранении даже с применением искусственного холода являются механические повреждения клубней, неизбежные в процессе механизированной уборки и транспортировки урожая. При этом создаются благоприятные условия не только для развития фитопатогенов, но и снижается естественный иммунитет растительной ткани. Проведение лечебного периода картофеля с глубокими механическими повреждениями при повышенных температурах, как правило, не способствует высококачественному сохранению урожая в течение длительного времени.

Основной путь защиты плодов и овощей от инфекционных заболеваний состоит в селекции наиболее устойчивых сортов и использование разнообразных средств для максимального сохранения присущего им иммунитета.

До настоящего времени наиболее широко используется химический метод защиты растений. Однако, глобальное применение пестицидов привело к загрязнению окружающей среды и ряду нежелательных последствий.

Анализ научно-технической информации показал, что биологический метод защиты растений является наиболее перспективным и экологически безопасным средством защиты сельскохозяйственных культур от различных возбудителей болезней. Этот метод не уступает химическому способу и обладает многими преимуществами.

В настоящее время установлена эффективность применения некоторых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium при длительном холодильном хранении картофеля. Однако, отсутствуют сведения по влиянию бактерий-антагонистов и продуктов их жизнедеятельности на защитные механизмы картофеля в лечебный период и в процессе длительного холодильного хранения в зависимости от физиологического состояния клубней.

Теоретические и экспериментальные исследования защитных механиз-

мов растительной ткани являются актуальными и имеют важное научное и практическое значение, так как позволяют выбрать высокоэффективные штаммы различных родов и видов микроорганизмов в зависимости от сорта, физиологического состояния и технологических параметров хранения картофеля.

Цель работы - исследовать защитные механизмы клубней картофеля, обработанного культуральной жидкостью (КЖ) бактерий-антагонистов родов Pseudomonas и Mycobacterium, в лечебный период и при длительном холодильном хранении.

В основу рабочей гипотезы положено предположение, что бактерии-антагонисты и продукты их жизнедеятельности не только подавляют рост и развитие патогенной микрофлоры, но и способны активизировать защитные реакции клубней картофеля. Для проверки рабочей гипотезы и достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучить влияние рода, вида и штаммов бактерий-антагонистов на накопление суберина в раневой перидерме механически поврежденных клубней в лечебный период и в естественной перидерме неповрежденных клубней в процессе длительного холодильного хранения;

- исследовать влияние биологических средств на защитную систему "фенольные соединения+фенолоксидаза" (ФС+ФО) в раневой перидерме механически поврежденных клубней в лечебный период, в коре клубней, помещенных в условия инфекционного очага и при длительном холодильном хранении;

- выявить влияние обработки механически поврежденных клубней КЖ бактерий-антагонистов на процесс раневой репарации и свойства раневой перидермы;

- исследовать содержание пектиновых веществ в раневой перидерме механически поврежденных клубней в лечебный период и в коре неповрежденных клубней в процессе длительного холодильного хранения под действием

биологических средств защиты;

- изучить влияние обработки картофеля КЖ бактерий-антагонистов на продолжительность физиологического покоя клубней и поражаемость картофеля инфекционными заболеваниями;

- разработать рекомендации по применению бактерий-антагонистов, повышающих устойчивость к инфекционным заболеваниям в лечебный период и при длительном холодильном хранении клубней.

Научная новизна

Установлено, что бактерии-антагонисты влияют на количественный и качественный состав фенольных соединений и активность фермеитов-оксидаз в раневой перидерме клубней картофеля. В зависимости от штамма они активизируют защитную систему ФС+ФО в раневой и в естественной перидерме клубней, помещенных в условия инфекционного очага.

Выявлена зависимость синтеза суберина в раневой и естественной перидерме клубней от температуры лечебного периода и продолжительности хранения картофеля, обработанного КЖ бактерий-антагонистов для различных штаммов.

Установлено, что обработка механически поврежденных клубней КЖ бактерий-антагонистов способствует увеличению клеточных слоев раневой перидермы и накоплению в ней протопектина.

Практическая ценность

Установлена способность исследуемых штаммов бактерий-антагонистов активизировать защитные механизмы механически поврежденных клубней при различных температурах.

Показана целесообразность проведения лечебного периода для клубней с глубокими механическими повреждениями с применением бактерий-антагонистов.

Рекомендовано исключить лечебный период клубней, имеющих неглубокие механические повреждения и обработанных КЖ бактерий-

антагонистов.

Разработаны дополнения к "Технологической инструкции по производству и длительному хранению картофеля на основе применения биологических средств защиты" ТИ 9739-005-02068491-95.

Экономический эффект от применения биологических средств защиты при хранении картофеля составил 142-288 руб./т, в зависимости от штамма бактерий и сорта картофеля.

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены на научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава (СПГАХПТ, 1996, 1997 и 1998 гг.); международной научно-технической конференции "Холод и пищевые производства" (СПГАХПТ, 1996 г.); 2-й Всероссийской научно-теоретической конференции "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и комплексной переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности" (Углич, 1996 г.); международном симпозиуме "Экология человека: пищевые технологии и продукты на пороге XXI века"(Пятигорск, 1997 г.); международной научно-технической конференции "Техника и технология пищевых производств" (Могилев, 1998 г.); международной научно-технической конференции "Ресурсосберегающие технологии пищевых производств" (СПГАХПТ, 1998 г.); международной научно-практической конференции "Безопасность питания - основа жизни человека XXI века" (СПГАХПТ, 1998 г.); международной научно-технической конференции "Advances in the Refrigeration system, Food technologies and Cold сЬат"(София, 1998 г.); международной научно-технической конференции "Холодильная техника России. Состояние и перспективы XXI века" (СПГАХПТ, 1998 г.).

Публикации Основной материал диссертационной работы опубликован в 12 работах.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и приложений.

Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 27 рисунков. Список литературы состоит из 219 наименований работ, 90 из которых - зарубежных авторов.

1 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА К ФИТОПАТОГЕНАМ ПРИ ВЕГЕТАЦИИ

И ХРАНЕНИИ

1.1 Микроорганизмы - продуценты биологически активных соединений, обладающих антагонистической активностью

В последние годы все более актуальным становится изыскание новых активных штаммов микроорганизмов с целью разработки на их основе высокоэффективных и экологически безопасных средств защиты сельскохозяйственных культур от различных возбудителей болезней. Одним из основных направлений таких поисков следует считать селекцию микроорганизмов, способных к регулированию структур биоценоза, направленного на подавление фитопатогенов. Необходимыми условиями успешного использования штаммов и биопрепаратов на их основе является их генетическая стабильность, низкая устойчивость к биоценологическим факторам и способность размножаться,не теряя активности (136).

До недавнего времени поиск активных микробов-антагонистов проводили в основном среди грибов. Наиболее обширные исследования связаны с использованием в защите растений представителей рода Trichoderma (104,105,149), Gliocladium (124, 173) и Trichothecum (127, 165). Лишь недавно в число агентов микробиологического контроля численности возбудителей болезней растений были включены бактерии и актиномицеты (21, 24, 49, 112, 117, 163, 167, 186, 190, 195). Как показали многочисленные исследования, наиболее перспективны для защиты растений не только бактерии родов Bacillus и Pseudomonas ( 167, 186, 189), но не менее перспективны для борьбы с грибными заболеваниями актиномицеты. Биологическая эффективность предпосевной обработки семян и внесение в почву штаммов Streptomyces spp. составила 50-90% при защите от корневых гнилей зерновых, овощных

культур и картофеля ( 154, 189, 202). Обладая высокой антагонистической активностью, штаммы бактерий и актиномицетов в то же время более технологичны: хорошо растут на недефицитных и дешевых промышленных питательных средах, не теряют жизнеспособности при различных режимах сушки и длительном хранении в широком диапазоне температур.

Антагонизм является сложным многокомпонентным биологическим явлением, обусловленным рядом взаимодействующих факторов, способных существенно изменять среду обитания микроорганизмов. Совокупность этих факторов может в значительной степени влиять на количественный и качественный состав микрофлоры почвы, что в свою очередь положительно, воздействует на физиологическое состояние растения.

Явление антагонизма микроорганизмов проявляется различно. В некоторых случаях оно выражается в изменении реакции среды в сторону, неблагоприятную для роста и развития других видов микроорганизмов. Так, например, в процессе дезаминирования мочевины уробактериями создается щелочная среда, препятствующая росту ряда почвенных микроорганизмов, но хорошо переносимая уробактериями. В других случаях угнетающее действие связано с изменениями самой среды, делающими ее неблагоприятной для развития конкурента. Так, неспорообразующие бактерии, обильно развиваясь в почве при ее значительном увлажнении, угнетают жизнедеятельность споровых бактерий и актиномицетов (5). Подавление развития патогенов в некоторых случаях происходит в результате конкуренции за углерод, как источник энергии. Однако, многие работы показали, что существенным элементом конкуренции организмов является железо. Оно необходимо для многих биологических процессов в клетках микробов и его отсутствие тормозит развитие любого фитопатогенного гриба ( 19, 89, 90, 132, 181, 198, 215,). Также подавление роста микроорганизмов может быть связано с продуцированием антагонистами продуктов обмена в виде спирта, перекиси водорода, летучих кислот, эфиров, ферментов, антибиотиков, сидерофоров и

других биологически активных соединений. Именно данные продукты обмена, как предполагают 2,5,13,15, 91, 132, 142 , помогают микробам сохранить преимущество в борьбе за существование. Обладая способностью проникать, распространяться и накапливаться в различных частях растения, активные вещества антагонистов усиливают иммунобиологические свойства растений. Кроме того, антибиотические вещества принимают активное участие в процессах жизнедеятельности бактериальной клетки-продуцента. Описано участие антибиотиков в процессах спорообразования продуцентов Bacillus Licheneformis : усиление образования антибиотика совпадает по времени с началом обильной споруляции. Установлено, что большая часть антибиотика, содержащегося в вегетативных клетках продуцента, переходит в споры; возможно, антибиотик используется бактериями, как источник энергии и конструктивный материал (2).

Большинство исследований касается объяснения возможного механиз-

ч

ма антагонистического действия выделенных штаммов. Исходя из того, что все штаммы- антагонисты активно образуют при росте на искусственных питательных средах зоны подавления роста и развития культур патогенов, естественно было бы предположить, что клетки штаммов выделяют в среду какие-то вещества, осуществляющие химический контроль развития конкурирующих с ними патогенов.

В частности, известно, что штаммы грибов рода Trichoderma spp. образуют 29 соединений, обладающих фунгицидной активностью. К их числу относятся пептиды, метаболиты аминокислот, терпеноиды и т.д.(149). Некоторые из них обладают ростстимулирующей активностью. Ростстимулирующей активностью обладают также некоторые штаммы микробов-антагонистов родов Pseudomonas и Pénicillium (63), Achromobacter (11), Microccocus flavos (128), синтезирующие вещества типа ауксинов, гиббереллинов, цитокининов. Представители рода Bacillus активно синтезируют циклические олигопепти-ды, ингибирующие синтез клеточной стенки ( бацитрацин ), олигопептиды,

нарушающие функции мембран ( грамицидины, полимиксин ), а также ами-ноглюкозиды, нарушающие функции рибосом (190). Кроме того, к числу факторов, определяющих антагонистическую активность Bacillus spp., может относиться комплекс разнообразных экзоферментов ( протеаз, амилаз и т.д.). Pseudomonas putida продуцируют флюоресцирующий пигмент пиловердин, проявляющий высокую антигрибную, антибактериальную и биостимули-рующую активность (49). В значительной степени антагонистическая активность псевдомонад связана с синтезом специфических низкомолекулярных соединений, участвующих в усвоении и транспорте сидерофоров, например, аэробактин и псевдобактин (155). В значительной степени активность псевдомонад обусловлена синтезом антибиотиков ряда феназинов, оомицина А, пилутеорина, пирролнитрина (155, 163).

Высокой фунгицидной активностью обладают метаболиты актиноми-цетов. Например, Streptomyces griseochromogenes образует антибиотик тау-томицетин, подавляющий развитие возбудителей фузариозов (137). Дрожжи Williopsis subsufficiensu, Williopsis beijerincki синтезируют киллерные токсины, обладающие широким спектром действия по отношению к дрожжам, в том числе и патогенным грибам рода Candida (118). Подавление роста патогенных грибов ( Alternaría altura, Alternaría tenuis, Fusarium oxysporium, Colletorichum glocosporioides) штаммом Nocardiopsis spp. A6 связано с выделением внеклеточного токсина (70).

Исследуя природу веществ, вызывающих фунгистатический и фунги-цидный эффект, авторы статьи Pusey P.L. и Wilson C.L (191) пришли к заключению, что клетки Bacillus subtilis выделяют в культуральную среду около шести активных в отношении грибов компонентов, по структуре молекулы и своему действию напоминающих антибиотики. Эта группа антибиотиков, относящихся к шуриновым, обладает широким антигрибным спекфом действия, низкой токсичностью и не вызывает аллергических реакций у людей и теплокровных животных (191). Этот штамм Bacillus subtilis В-3 был

успешно использован для ингибирования роста и развития Monilinaia fructicola на нектаринах, абрикосах и сливах. Перечисленные виды плодов были подвергнуты испытанию в модельных лабораторных опытах, в течение которых искусственно нарушалась оболочка, затем они обрабатывались различными дозами бактериальной суспензии, высушивались и затем искусственно заражались водной суспензией спор и мицелия гриба возбудителя. В результате было установлено, что наиболее эффективной концентрацией клеток антагонистов в суспензии является Ю^коллониеобразующих единиц/мл ( КОЕ/мл), причем эффективность действия суспензии сохраняется после ее нанесения длительное время при температуре от +5 до +30° С.

Значительный интерес для выяснения природы антагонистического действия представляют собой опыты по раздельной обработке клетками и культуральной жидкостью Enterobacter cloacae и Bacillus subtilis - возбудителя гнили плодов персика. Отмытые клетки Е. cloacae в водной суспензии обладали значительной фунгицидной активностью, тогда как культуральная жидкость этого штамма ею не обладала. У Bacillus subtilis эффект противоположный. Приведенные факты показывают разнообразие взаимоотношений между двумя организмами и требуют изучения этих взаимоотношений в каждом конкретном случае (160).

Многие антагонисты,кроме антибиотиков, синтезируют комплексы ли-тических ферментов, разрушающих стенки патогенных микроорганизмов ( 136,203). Хемотрофические реакции играют существенную роль в механизме этого процесса. Известно, что ферменты хемолитического комплекса играют важную роль в защитной реакции растения. Способностью синтезировать эти ферменты, наряду с растениями, обладает чрезвычайно широкий круг микроорганизмов - бактерий, актиномицетов и грибов (115). Одними из наиболее активных продуцентов хитиназы, М-ацетил-В-О-глюкозамминидазы и ß-1-3-глюконазы, являются представители рода Streptomyces (183, 185) и Trichoderma (138).

Сотрудниками центра "Биоинженерия" РАИ (Москва) и института фитопатологии РАСХН (Московская область) (100) изучено образование комплекса хитинолитических ферментов культурой Sreptomyces kurssunovii VKM АС- 1504 D в зависимости от используемых индукторов ( хитин краба, мицелий Fusarium cuimorum, мицелий Fusarium graminearum). Авторами получен ряд препаратов, обладающих фунгицидным действием против возбудителя фузариоза пшеницы Fusarium cuimorum. Наиболее эффективным оказался препарат, полученный при культивировании S.kurssunovii на среде с кристаллическим крабовым хитином. Фунгицидное действие, видимо, связано с ферментативной активностью комплекса хитиназ. Культура S. kurssunovii в зависимости от источника углерода ( индуктора) образовывала ряд литических ферментов: хитинолитические ферменты, К-ацетил-В-О-глюкозамминидазы и ß-1-З-глюконазы. Авторами был приготовлен препарат, состоящий из очищенных хитиназ, действие его на скорость роста и образование спор F.cuimorum при росте на картофельно-глюкозном агаре было эквивалентно действию S.kurssunovii. Очевидно, что именно хитиназный комплекс, содержащийся в полученных препаратах, является основным ингибитором роста F.cuimorum культурой Streptomyces kurssunovii. Были проведены полевые испытания препарата, которые подтвердили эффективность его использования для борьбы с фузариозом пшеницы.

Известно, что структура, состав и соотношение компонентов клеточных стенок фитопатогенных грибов очень разнообразны (133, 148). В связи с этим можно ожидать, что определенная композиция литических ферментов в препаратах определяет их способность лизировать клеточные стенки того или иного гриба. Так, клеточные стенки Aspergillas niger, состоящие в основном из хитина и а- глюкана, очищенной хитиназой Streptomyces cinereoruber практически не лизируются, но при совместном действии хитиназы и глюко-назы S.cinereoruber мицелий разрушается почти полностью (185). Лизис патогенных грибов, в клеточной стенке которых преобладает хитин, возможен

по-видимому, и препаратами, содержащими только хитинолитический комплекс. Следует добавить, что воздействию гликолитических ферментов подвергаются преимущественно растущие гифы патогенных грибов, тогда как сформировавшиеся клеточные стенки, имеющие в своей структуре, помимо хитина и глюкана,маннан, белок, липиды^гидролизуются значительно слабее (197).

Приведенные здесь данные свидетельствуют о необходимости проведения исследований, касающихся влияния природы химических веществ, осуществляющих антагонизм, их выделения и возможных путей синтеза, химической модификации и промышленного производства нетоксичных и не вызывающих аллергические реакции соединений, имеющих природное происхождение, для обработки различных видов сельскохозяйственной продукции при ее выращивании и при закладке ее на длительное хранение.

Однако, следует учитывать, что положительный результат биологической защиты зависит не только от антагонистической активности микроорганизма, но и его конкурентноспособности, приживаемости в почве или корневой сфере растений (87, 179). Конкурентноспособность штамма зависит от его ферментативной активности, обеспечивающей возможность утилизации различных субстратов, в частности, микоцеллюлозы. Возможно, что способность к разложению микоцеллюлозы является важнейшим фактором их выживания в естественной среде и в определенной мере служит гарантией их эффективной интродукции в почву. В работе (39) было исследовано 30 штаммов актиномицетов, выделенных из гниющих растительных остатков, относящихся к родам Nocardia, Atreptomyces, Actinomyces, и Amycolatopsis. Штаммы исследовали на способность утилизировать природную и химически модифицированную микоцеллюлозу ( рост на соломе ) и антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным микроорганизмам. Авторами выделены штаммы актиномицетов, способные разлагать высокополимерные компоненты растительного сырья и продуцировать биологически

активные соединения с разнообразными антимикробными спектрами. Эти особенности выделенных культур в определенной мере способствуют их хорошей приживаемости в почве и эффективному фитозащитному действию, что обусловливает их перспективность для биометода. Actinomyces flavescens ГВ 1 обладает также ростстимулирующими свойствами. Антагонизм исследуемых актиномицетов по отношению к фитопатогенным грибам обусловлен преимущественно нелетучими компонентами, а к большинству фитопатоген-ных бактерий - суммарным действием летучих и нелетучих компонентов.

Значительный интерес вызывают работы, свидетельствующие о способности микробов-антагонистов детоксицировать различные органические вещества, среди которых значительное место занимают пестициды, загрязняющие окружающую среду.

В модельных условиях (11) показана возможность ускорения разложения в почве 2,4,5-Т при внесении штамма Pseudomonas cepacia, пентахлорфе-нола под действием Arthrobacter, паратиона с помощью двух адаптированных к нему бактерий, 3-хлорбензоната при внесении Pseudomonas putida 87. Сконструированный штамм Pseudomonas aeruginosa BS-827 заметно ускоряет разложение кельтана при внесении его в почву. Имеется сообщение (152) об ускорении разложения n-нитрофенола только в стерильной почве при тщательном промывании ее с вносимыми микроорганизмами. Есть сообщение, что некоторые штаммы Pseudomonas разлагают поверхностно-активные вещества, являющиеся опасными загрязнителями воды, к которым относятся сульфонат, циклимид, аминобетаин и сульфоэтоксилат (99). Pseudomonas acidovorans (218, 219), изолированная из торфяного биофильтрата, способна соокислять диметилсульфид до метилсульфоксида в ходе органотрофного роста. Некоторыми учеными (31, 43) получены положительные результаты при использовании бактерий рода Pseudomonas для дезактивации пестицидов.

Необходимо отметить, что в почве, сильно загрязненной пестицидами,

микроорганизмы способны синтезировать вещества, не характерные для данного вида. Козловским А.Г. и др. (38), была изучена способность к алко-лоидообразованию у 31 штамма грибов рода Aspergillus и Pénicillium, выделенных из почв, подвергшихся длительной обработке пестицидами. Авторами выявлено, что 12 штаммов могут быть отнесены к продуцентам индоль-ных алкалоидов, что вело к отклонению по некоторым свойствам от типовых штаммов, сужению спектра бактериальных видов. Было установлено, что эти грибы могли синтезировать и характерные для данного вида алкалоиды и микотоксины, и новые, ранее неизвестные метаболиты. В частности, A. flavus синтезировал как афлатоксин В1, койевую кислоту и дитринтофеналин, описанные ранее для этого вида, так и новый алкалоид, производное триптофана и фенилаланина — цикло - N - метил - фенилаланилтриптофан. Другой вид A. ochraceus синтезировал известный для него 4 - гидроксимеллеин и не характерный полувиоксантин. Эти соединения могут обладать ярко выраженным антимикробным действием, как индивидуального ( например, афлатоксин В1 и полувиоксантин ), так и проявлять синергидный эффект ( афлатоксин В1 и койевая кислота ). Особенно важно то, что синергидное действие некоторых микотоксинов может проявляться в присутствии пестицидов (144), значительно усиливая воздействие последних на целевые и нецелевые организмы.

Таким образом, микробы-антагонисты являются продуцентами биологически- активных веществ широкого спектра действия. Промышленное применение высокоэффективных штаммов микробов-антагонистов и препаратов на их основе позволит значительно снизить загрязнение почв как различными веществами органического происхождения, так и фитопатогенны-ми микроорганизмами, увеличить урожаи растительной продукции и снизить микробиальную порчу в процессе вегетации и хранения.

1.2 Антибиотические вещества, синтезируемые бактериями рода Pseudomonas и Mycobacterium

Бактерии рода Pseudomonas характеризуются высокой биологической активностью, способностью синтезировать многие соединения, представляющие большой научный интерес. Среди псевдомонад выявлены продуценты аминокислот, нуклеиновых и органических кислот, витаминов, поверхностно-активных веществ, многочисленных гидролаз, разнообразных антибиотиков.

Антагонистическая активность бактерий рода Pseudomonas привлекла внимание бактериологов еще на начальных этапах развития микробиологии. Литическое действие псевдомонад на почвенные грибы описано Я.П. Худяковым в 1935 году (110). Микроорганизмы, вызывающие это явление, названы миколитическими. Исследования миколитических бактерий, в первую очередь Р. aeruginosa и P. fluorescens, в борьбе с фузариозом различных сельскохозяйственных растений в лабораторных и вегетативных опытах дали положительные результаты.

В.В. Смирновым и Е.А. Киприяновой (91) установлено, что среди бактерий рода Pseudomonas широко распространена способность к синтезу ан-тифунгальных соединений. Как отмечают авторы, наиболее активные в отношении грибов виды обнаруживаются среди микроорганизмов флюоресцирующей группы. Это прежде всего, P. acrugenosa, штаммы которого угнетают все испытанные тест-культуры грибов, P. aureofaciens и близкий ему Р. chloraraphis, P. aurantiaca. Слабее действуют на грибы штаммы P. putida: биовары А и В, входящие в состав этого вида, не отличаются по своей анти-фунгальной активности.

Иная картина наблюдается у Р. fluorescens. Его различные биовары ( около 600 штаммов ) различались по степени интенсивности антифунгально-го действия. Высокоэффективными были штаммы биовара III, среди которых

20 % культур угнетали не только микроскопические грибы, но и дрожжи рода Candida.

Среди нефлюоресцирующих псевдомонад также обнаружены активные продуценты антифунгальных веществ, в том числе Comamonas acidovorans, Р. cepacia — антагонист широкого спектра действия и Xanthomonas maltophilia.

Важную роль в ограничении численности патогенов играют сидерофо-ры — соединения, осуществляющие транспорт железа, некоторые из них обладают антагонистической активностью (90, 102), либо являются факторами роста для отдельных бактерий. Сидерофоры синтезируются бактериями рода Pseudomonas, а также различными группами аэробных бактерий.

К сидерофорам принадлежат псевдобактин — желто - зеленый флюоресцирующий пигмент бактерий рода Pseudomonas. Обладая высоким сродством к железу и образуя с ним стабильные комплексы, псевдобактин успешно конкурирует за этот элемент с сидерофорами патогенных грибов, которые обладают более низкой константой связывания железа. Таким образом, его фунгистатическое действие связано с созданием дефицита железа для патогенных грибов (142, 143, 170).

Препараты флюоресцирующих пигментов из сапрофитных и фитопато-генных бактерий рода Pseudomonas тормозили рост грибов Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophtora megasperma и др. Антифунгальное действие наблюдалось не только при внесении в почву пигмента бактерий, но и при обработке семян растений живыми культурами микроорганизмов, синтезирующих этот пигмент. Связывание железа сидерофорами, образуемыми флюоресцирующими бактериями рода Pseudomonas, приводило также к угнетению ряда других вредных обитателей ризосферы, например, Erwinia caratovora и др. Дефицит железа, создаваемый синтезом или внесением сиде-рофоров, ограничивал численность этих организмов, стимулируя тем самым рост сельскохозяйственных растений (177, 199, 21 1).

Наиболее часто защиту пшеницы от корневой гнили, вызываемой Fusarium oxysporum, и вытекающий отсюда ростстимулирующий эффект, обеспечивали штаммы бактерий рода Pseudomonas — продуценты псевдо-бактина. В полевых испытаниях бактерии-антагонисты способствовали повышению полевой всхожести семян, снижали в 2-5 раз поражаемость пшеницы гнилью на всех стадиях развития растений, увеличивали продуктивность растений на 11,5-15,6 % (17).

Бактерии рода Pseudomonas по своей антибиотической активности занимают второе место среди бактерий, разделяя его с бациллами и уступая лишь актиномицетам. При этом биосинтетические способности псевдомонад крайне разнообразны. Примером тому может служить Р. aeruginosa, из которой к настоящему времени выделено более 30 антибиотических веществ, различного химического строения (2, 108).

Антибиотики, продуцируемые псевдомонадами флюоресцирующей группы, изучены достаточно хорошо (35, 91), в то же время антибиотические и антифунгальные свойства других видов рода Pseudomonas изучены значительно хуже.

Janisiewiez и Roitman (160) предприняли попытку выделить действующее вещество культуральной жидкости Pseudomonas cepacia с помощью различных методов очистки и фракционирования, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию. В результате исследователи получили ряд фракций, которые были испытаны на антагонистическую активность. Установлено, что только одна из рассмотренных фракций, содержащая гетероциклическое соединении — пирролнитрин, обладала ярко выраженный фун-гицидным действием. Впоследствие пирролнитрин и штамм Р. cepacia применялись для контроля возбудителя как in vitro, так и in vivo, причем действие пирролнитрина проявлялось даже в ничтожных концентрациях, гораздо меньших, чем в культуральной жидкости. Наименьшая концентрация пирролнитрина, дающая зоны подавления, -0,001 мг/мл. Все испытанные

концентрации , - от 0,01 до 0,1 мг/мл привели к полному подавлению возбудителей серой и голубой гнили при испытании препарата на яблоках и грушах.

Теми же авторами продемонстрирована антагонистическая активность P. cepacia в отношении Mucor spp., вызывающего гнили при хранении яблок. Применение антагониста приводит к существенному уменьшению зон поражения на плодах, уменьшению числа самих зон. С помощью различных способов очистки и фракционирования, включающих в себя очистку на Амбер-лите АД 7, Сефадексе - 20 и высокоэффективной жидкостной хроматографии из культуральной жидкости экстракта клеток - антагонистов было выделено вещество, обладающее ярковыраженными фунгицидными свойствами, растворимое в метиловом спирте — диазотированная сульфониловая кислота (159).

Howell и Stipanovic (155, 156) использовали для защиты хлопка штамм P. fluoresceins Pf 5, который синтезирует два антибиотика пирролнитрин, угнетающий рост фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani и пиолютеорин, ингибирующий рост Pythium ultimum - патогена сеянцев хлопка. Обработка семян штаммом - антагонистом либо образуемыми им антибиотиками увеличивала выживаемость растений на 28 - 71%.

Вообще, пирролнитрин - самый мощный антифунгальный агент, выделенный из бактерий рода Pseudomonas (35). Антибиотик подавляет сапрофитные и паразитические грибы и дрожжи в концентрациях 0,19 - 6,25 мкг/мл.

Антибиотики, выделенные из культур рода Pseudomonas, разнообразны по своей химической природе ( антибиотики ациклического, гетероциклического, ароматического строения ); антибиотическими свойствами в отношении фитопатогенов обладают также некоторые пигменты, синтезируемые псевдомонадами.

К антибиотикам ароматического ряда относится 2,4 - диацетилфлоро-

глюцин — производное флороглюцина, синтезируемый Р. aurantiaca. Его фунгистатические дозы, в отношении ряда грибов, колеблются в пределах 0,5 - 200 мкг/мл (91).

Одним из ациклических антибиотиков, синтезируемых бактериями рода Pseudomonas, является антифунгин, выделенный Я.П. Худяковым с соавторами (111) из культуральной жидкости "Р. mycophaga".

Антифунгин - сырец активен по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям в концентрации 10 мкг/мл. Он действует на возбудителя вилта хлопчатника Verticillium dahliae, в связи с чем высказывалось мнение о перспективности его применения в борьбе с грибными заболеваниями растений. В дальнейшем было доказано (74), что антифунгин представляет собой комплексный препарат, содержащий смесь уксусной, пропио-новой, масляной, валериановой, капроновой и салициловой кислот. Наиболее активный компонент смеси — п - капроновая кислота — угнетающая рост V. dahliae в разведении 1: 40960.

Штамм Р. species 19 (идентифицированный затем как Р. fluorescens ) — продуцент феназин - 1 - карбоновой кислоты — был с успехом использован А.Д. Гарагулей для защиты пшеницы от корневой гнили, вызываемой Fusarium oxysporum (16). Позднее Томашов и Уэллер сообщили о выделении из ризосферы пшеницы штамма Р. fluorescens 2 - 79, эффективного в качестве средства борьбы с заболеванием ячменя и пшеницы, вызванным грибом Gaeumannomyces graminis var. tritici. Антифунгальный эффект был обусловлен синтезом феназин - 1 - карбоновой кислоты; мутанты, не образующие феназиновый желто - зеленый пигмент, не обеспечивали защитного действия (208).

Феназин - 1 - карбоновая кислота входит также в состав пигментного комплекса Р. fluorescens (34). В состав комплекса входят: желто - зеленый пигмент — феназин - карбоновая кислота, красный — 2 - оксифеназин - 1 -карбоновая кислота, оранжевый — 2 - оксифеназин. Все эти соединения об-

ладают антимикробной и фунгицидной активностью, что обуславливает антагонистические свойства, образующего их вида P. aureofaciens.

Исследовано действие на фитопатогенные бактерии феназиновых пигментов P. aeruginosa (91). В состав пигментов P. aeruginosa входят: синий пигмент — пиоцианин, желтые — гемипиоцианин ( 1 - оксифеназин ) и ок-сихлорорафин. Штаммы P. aeruginosa, способны к синтезу значительных количеств пиоцианина, оказывают угнетающее действие на фитопатогенные грибы и бактерии — Fusarium avenaceum, Mucor plumbeum, Rhizopus arrhizus, R. solani, Alternaria species и др. Штаммы, образующие гемипиоцианин и оксихлорафин, обладают более высокой антифунгальной активностью. Ахромогенные штаммы P. aeruginosa были антагонистически неактивны (91).

Способность к синтезу гетероциклического феназинового ядра является одной из отличительных особенностей метаболизма бактерий рода Pseudomonas. Образование веществ, близких по структуре ( 2 - оксифенази-нов ) может служить одним из хемотаксономических критериев при идентификации культур данного рода. Это свойство может оказаться полезным при изыскании среди микроорганизмов рода Pseudomonas продуцентов антибиотиков, действующих на фитопатогенные грибы и бактерии.

Кроме того, имеется ряд сообщений (10, 79), что бактерии рода Pseudomonas, являясь постоянными обитателями ризосферы разнообразных растений, способны проводить как денитрификацию, так и азотфиксацию в чистых культурах. При развитии в ризосфере, осуществляют преимущественно один из процессов, что необходимо учитывать при отборе культур для практического применения. Инокуляция штаммами, максимально активизирующими азотфиксацию в ризосфере, существенно и достоверно ( до 40% ) увеличивает урожайность небобовых растений.

Антибиотические свойства грамотрицательных неспорообразующих бактерий рода Mycobacterium изучены очень мало. Немногочисленные исследования антагонизма микобактерий касаются лишь единичных штаммов (

2, 68). Бактерии рода Mycobacterium как антагонисты и продуценты биологически активных веществ, проявляющих активность в отношении фитопа-тогенов, не использовались в практике, сведения об антифунгальной активности этих культур практически отсутствуют. Однако, возможность получения из отдельных видов рода Mycobacterium антибиотических веществ известна.

Из культуры М. tuberiulosis был выделен антибиотик широкого спектра действия — N - ацетилтирамин, вещество, идентичное соединению, синтезируемому Streptomyces griseus, и представляет собой фенольное производное (36). И.О. Обгорелей (65) выделен непатогенный штамм М. smegmatis — продуцент антибиотика смегмамицина, обладающего широким спектром действия против культур родов Pseudomonas и Proteus.

Японские исследователи (131, 170) сообщили, что только на микобак-терии действует смегматоцин, выделенный из М. smegmatis штамм АТСС 14 468, представляющий собой бактериоцин — низкомолекулярный белок.

Сидерохромный антибиотик микобактин, действующий только на грамположительные бактерии, продуцирует культура М. phlei(36).

Л.Ф. Орищук и К.П. Милюченко (67) выделили из культуры сапрофитного штамма М. species концентрат антибиотика N 226, обладающий активностью в отношении фитопатогенов. Действующее начало препарата, видимо, полипептидной природы. Антибиотик обладает выраженной избирательностью антимикробного действия, подавляя отдельные виды грамогри-цательных фитопатогеннных бактерий, единичные виды дерматофилов, некоторые виды дрожжей. Учитывая высокую антагонистическую активность различных видов микобактерий, при более тщательном изучении возможно обнаружение среди них высокоэффективных в отношении фитопатогенов штаммов, синтезирующих антибиотики.

Таким образом, видна перспективность дальнейшего изучения и применения микробов - антагонистов родов Pseudomonas и Mycobacterium, а

также препаратов на их основе для подавления роста и развития фитопато-генных микроорганизмов, поражающих растительную продукцию.

1.3 Исследование взаимоотношения патогенных организмов и растения - хозяина

Высококачественное сохранение растительной продукции при ее длительном хранении является завершающим этапом сельскохозяйственного производства. Однако, в процессе длительного хранения от микробиальной порчи погибает значительная часть урожая. Основной путь защиты плодов и овощей от инфекционных болезней состоит в отборе наиболее устойчивых сортов с использованием разнообразных средств для максимального сохранения присущего им иммунитета в течение возможно более длительного срока.

Иммунитет растений, по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, основан на многих взаимно дополняющих друг друга защитных реакциях. К основным защитным механизмам растений относятся - реакция сверхчувствительности, наличие фитонцидов, система фенольные соедине-ния+фенолоксидаза, продуцирование фитоалексинов и т.д.(50).

Главная функция иммунитета - распознание "своего" и "несвоего". Под "несвоим" имеются в виду не только микробы, но и другие субстанции - чужеродные белки и клетки, включая генетически изменившиеся собственные клетки, например, раковые. Только благодаря иммунитету, организм может распознать чужеродную клетку, которая отличается от всех остальных даже только одним геном, и защитить себя от ее губительного воздействия (50).

Согласно современным представлениям^ лектин цитоплазматической мембраны играет роль рецептора, участвующего в межклеточном узнавании растением-хозяином патогенных микроорганизмов (48, 194, 217). Следствием такого узнавания, по-видимому, является изменение структуры ( или ) кон-

фигурации молекулы лектина, а это, в свою очередь, может влиять на интенсивность ответной реакции растения на инфицирование патогеном и на его устойчивость к заболеваниям.

Антигены, общие для растения-хозяина и фитопатогенного гриба, обнаруживаются при многих болезнях (76,146), в том числе при фитофторозе картофеля (129, 187). Возбудитель фитофтороза Phytophthora infestans ( Mont) De Вагу внедряется в клетку растения и вступает в непосредственный контакт с ее цитоплазматической мембраной (46). При этом в результате процесса узнавания определяется исход взаимоотношений гриба и растения -гибель клетки растения в результате реакции сверхчувствительности ( раса гриба и растение несовместимы ) или дальнейший рост гриба ( раса и растение совместимы). Очевидно, этот процесс осуществляется при взаимодействии экстрацеллюлярных,или входящих в состав клеточной стенки метаболитов гриба,и компонентов цитоплазматической мембраны растения.

Проценко М.А. и соавторами (77) исследована возможность наличия общего антигена среди экстрацеллюлярных метаболитов Ph. infestans и компонентов цитоплазматической мембраны картофеля. В результате исследований установлено, что в изучаемых препаратах возможно наличие не только специфических для каждого организма, но и общих для гриба и растения-хозяина антигенов. При этом общий антиген выявлен в несовместимой расе гриба и растения.

Общие антигены, несомненно, играют важную роль в развитии взаимоотношений фитопатогенного гриба и растения-хозяина. При этом возможно участие белков растения - лектинов (129). Авторами (77) получены экспериментальные данные об участии лектинов в осуществлении контакта эндоби-онта и растения-хозяина при исследовании клубеньковых бактерий. Показано, что контакт цитоплазматической мембраны растения с гифой гриба необходим для развития защитной реакции сверхчувствительности, выявлено участие лектинов при взаимодействии препарата цитоплазматической мем-

браны картофеля со стенкой гифы РЬ. тГез1ап8. Возможно, общий антиген из гриба может взаимодействовать с растением через лектин, вероятно его участие в реакции сверхчувствительности. Лектин картофеля осаждает индуктор реакции сверхчувствительности, выделенный из гриба, поэтому, не исключено, что общий антиген обладает свойствами индуктора. Индуктор, как правило, не обладает расовой специфичностью. В работе (77) общий антиген был выявлен только у несовместимой расы т.е. имел расовую специфичность. Поскольку исследовали суммарный препарат экстрацеллюлярных метаболитов РИ. Ы^апБ, то авторы полагают, что общий антиген представляет собой сложный комплекс, содержащий как антигенную детерминанту, обладающую расовой специфичностью, так и участок, несущий свойства индуктора защитных реакций (77).

Несмотря на существование защитных реакций растений, патогенные микроорганизмы, в свою очередь, имеют весьма сильные средства поражения растений. Основными орудиями агрессии фитопатогенных микроорганизмов являются выделяемые ими токсины ( например, ликомаразмин, фузариновая кислота, вазифускурин) и ферменты (пектинметилэстиразы и полигалактуро-назы).

Кроме того, в работах проводимых в Институте биохимии им. А.Н. Баха, исследователями выделены из мицелия фитопатогенов картофеля вещества, способные как подавлять, так и активизировать защитные реакции клубней.

Леонтьевой Г.В., Чаленко Г.И. и др. (46) исследовано подавление устойчивости картофеля иммуносупрессорами возбудителя фитофтороза. В мицелии, совместимом с исследуемыми сортами картофеля рас возбудителя фитофтороза, присутствуют водорастворимые низкомолекулярные глюканы-супрессоры, которые специфически подавляют три типа защитных реакций картофеля: расосортовую устойчивость, механизм видового иммунитета и реакцию на механические поражения. Глюканы-иммуносупрессоры усили-

вают распространение по тканям клубней картофеля, как несовместимой, так и совместимой рас возбудителя фитофтороза. Глюканы-супрессоры, повреждая иммунные системы растения- хозяина, индуцируют в тканях картофеля восприимчивость к возбудителям тех болезней, которые до сих пор картофель не поражали. При обработке дисков картофеля глюканами, выделенными из совместимых с исследуемыми сортами картофеля рас возбудителя РИ. 1пГев1ап5, тормозилось накопление решитина. Под влиянием глюканов-супрессоров ослаблялось формирование перидермы и происходило значительно глубже от поверхности клубня картофеля.

Таким образом, глюканы-супрессоры возбудителя фитофтороза подавляют защитные реакции и ответственны за расовую специфичность этого патогена к картофелю. Возможно, что глюканы-супрессоры возбудителя фитофтороза занимают некие рецепторные места в плазмаллеме клеток картофеля, что препятствует распознаванию растениями сигналов, возникающих при инфицировании или механическом поражении и приводит к неспецифическому ингибированию иммунного ответа (46).

В работе Озерецковской О.Л. и соавторов (66), экспериментально подтвержден факт о временной задержке образования фитоалексинов при совместимом взаимодействии расы возбудителя фитофтороза и сорта картофеля, что и определяет возможность распространения инфекции по тканям растения-хозяина. У возбудителя фитофтороза существует нетоксичный и малотоксичный супрессор, который не подавляет необратимо, а лишь задерживает иммунный ответ, возможно, блокируя его на этапе распознавания паразита рецепторными системами хозяина. По-видимому, роль такого су-прессора, как было установлено ранее (46), выполняют низкомолекулярные & - 1,3-/3-1,6- глюканы.

Наличие веществ, активизирующих защитные реакции картофеля, в мицелии возбудителя фитофтороза было установлено Чаловой Л.И., Авдюшко С.А. и д.р.(ПЗ). Авторами было исследовано взаимоотношение кар-

тофеля и возбудителя фитофтороза. Из мицелия гриба был выделен липогли-копротеидный комплекс, обладающий свойством иммунизировать растения. Действие индуктора основано на активации в тканях растений естественных защитных реакций. Обработка липогликопротеидным комплексом в концентрации 0,01% и выше приводила к накоплению в тканях картофеля фун-гитоксичных соединений - фитоалексинов, способных угнетать распространение и развитие болезней. При обработке клубней картофеля липогликопротеидным комплексом из РИ. шГе81аш в концентрации 0,0005 - 0,001% фи-тоалексины не накапливались. Однако, в обработанных растениях возрастал фитоиммунный потенциал, их ткань становилась способной быстрее и интенсивнее отвечать на инфицирование возбудителем фитофтороза, в результате чего в 2 раза уменьшалось распространение инфекции - картофель становился иммунифицированным. Авторами (113) было выделено активное начало, т.е. вещество, активизирующее фитоиммунные реакции, липоглико-протеидного комплекса - полиеновые жирные кислоты. Скрйнинг жирных кислот по принципу стимуляции фитоиммунного потенциала привел к обнаружению наиболее активных - арахидоновой и эйкозапенШбНС&Йкислот, которые являются детерминантами активности липогликопротеидного комплекса.

Кроме того, при обработке тканей клубней картофеля биогенными индукторами защитных реакций, Очеретиной О.Ю. и соавторами (69), установлено их влияние на содержание в тканях клубней циклических нуклеотидов ( цАМФ и цГМФ ) и на активность фосфодиэстеразы ( цФДЭ). В качестве индукторов использовали липогликопротеидный комплекс, выделенный из возбудителя фитофтороза, и арахидоновую кислоту. При применении иммунизирующих концентраций индукторов в первые часы после обработки клубней картофеля происходило увеличение содержания цАМФ и ингибиро-вание активности цФДЭ. Высокие некрозообразующие концентрации вызывали снижение содержания цАМФ по сравнению с контролем. В то же время

на уровне цГМФ обе концентрации индукторов оказывали ингибирующее действие. По мере развития устойчивости содержание обоих циклических нуклеотидов приближалось к их количеству в контроле, хотя активность цФДЭ оставалась подавленной. Авторы полагают, что система цАМФ в большей степени причастна к феномену иммунизации, чем система цГМФ, и функционирует на ранних стадиях индуцирования защитных реакций картофеля.

Авдюшко С.А. (1) удалось получить фракцию, обогащенную просто-гландиноподобными соединениями, из мицелия возбудителя фитофтороза и выделенного из него индуктора защитных реакций растения после предварительной очистки. В индукторе обнаружены соединения, близкие по хрома-тографической подвижности к синтетическим простогландинам. Как эндогенные, так и синтетические простогландины повышали устойчивость тканей картофеля к возбудителю фитофтороза. Простогландины индуцировали не только локальную, но и системную устойчивость, т.е. эффект от обработки

распространялся на весь клубень. Автором обнаружена новая группа имму-

-9

низаторов растений, эффективная в крайне низких концентрациях (10 и 10 М) - простогландины, которые могут найти применение в сельском хозяйстве для защиты растений.

В большинстве приведенных выше работ, авторами были выделены индукторы защитных реакций картофеля из мицелия возбудителя фитофтороза. Однако, есть сообщение относительно индукторов, присутствующих в мицелии возбудителя фузариоза (126). В составе мицелия Fusarium culmorum, обнаружено присутствие метаболитов, являющихся индукторами повышения устойчивости тканей клубней картофеля к инфицированию возбудителем фитофтороза. В экстракте биомассы гриба 70%-ным раствором этилового спирта по крайней мере выделены три фракции веществ, проявляющих индуцирующую активность. Фракция, осаждаемая центрифугированием, и две фракции, полученные методом ультрафильтрации на мембранных фильтрах,

содержащие соединения с молекулярной массой 10 ООО - 30 ООО и ниже 500.

Приведенные выше факты показывают, насколько широк спектр действия микроорганизмов и их метаболитов. Весьма важным представляется исследование взаимоотношения картофеля и бактерий-антагонистов. Возможно, что бактерии-антагонисты и продукты их жизнедеятельности оказывают влияние на биохимические процесы, связанные с защитными реакциями, протекающие в тканях клубней картофеля.

1.4 Биологическая защита растительной продукции от фитопатогенов

при хранении

Борьба с фитопатогенами растений ведется с помощью химических и физических средств, но многолетние наблюдения показали, что их длительное применение приводит к загрязнению окружающей среды, оказывает отрицательное действие на человека и животных, связано с большими материальными затратами. В последнее время ведутся поиски по применению экономически доступных и экологически безопасных средств защиты.

В связи с этим все большее место занимают методы биологического контроля развития патогенеза растительной продукции как при ее выращивании, так и при хранении и переработке. Микробиологические препараты на основе высокоэффективных штаммов, в отличии от пестицидов, менее токсичны, быстро разлагаются, не приводят к аллергическим реакциям, дешевы и удобны в промышленных масштабах применения.

Антагонистическими свойствами в отношении фитопатогенов обладают различные микроорганизмы: бактерии родов Flavobacterium (120, 184), Azobacter (75, 206), Acremonium (166), Eterobacter (205, 213), Pseudomonas (61, 159, 160, 216), Bacillus (40, 92, 160, 161, 162); актиномицеты (45, 100, 104, 168, 180), дрожжи (140, 145, 175, 207), грибы (44, 102, 145).

Современные данные показывают, что антагонистов можно подобрать

к любому возбудителю заболеваний растений - бактериального, грибного, актиномицетного и других происхождений.

К настоящему времени в практику внедрен ряд биологических препаратов, обеспечивающих контроль над возбудителями заболеваний растительной продукции.

Биологическая лаборатория научно-производительной ассоциации "Биота " Краснодарского края (33) производит биопрепараты ризоплан, триходермин, бактофит, микостоп и ряд других. Применение этих препаратов для протравливания семян зерновых культур и обработки полей дает положительный результат против корневых гнилей, мучнистой росы, фузарио-зов.

Лаборатория по исследованию почвенных фитопатогенов, возглавляемая G.C. Papavizas (94), добилась значительных результатов в области биоконтроля. Так, из природной среды выделен Eporidesmium sclerotiorum, заселяющий и разрушающий живые склероции склеротинии, сохраняющиеся в почве. Однократное применение этого выпускаемого промышленностью препарата в поле, где высевался салат-латук, позволило подавить развитие белой гнили на 3-х летний период. Недавно запатентован биологический метод борьбы с фузариозами ( возбудители F. oxysporium, F. moniliforme и др.)(94). Для предупреждения развития болезни используют микроорганизмы из родов Cladosporium и Pseudomonas, которые способны разлагать и де-токсицировать фузариевую кислоту. Наиболее эффективными были С1. werneckii штамм ДК 2011 (FERM BP - 1383 ), P. cepacia штамм ИК - 1 ( FERM BP - 1385 ) и P. solanacearum N 50 А 16 ( FERM BP -1384). Показано, что Talaromuces flavus, выделенный из почвы, эффективен для борьбы с вер-тициллезом баклажанов и повышает урожай этих культур на 60 - 70%. При обработке препаратом микопаразита посадочного материала картофеля уменьшается поражение клубней различными видами гнилей, в результате урожай повышается на 12-21%. Препарат эффективен против корневых гни-

лей хмеля, хлопчатника и маслин. Против белой гнили фасоли ( Sclerotinium roffsil ) отобрано несколько штаммов триходермы и глиокладиума, сокращающих заболевание фасоли на 50 - 60%; под их действием уменьшалось также поражение картофеля ризоктониозом,и урожай повышался на 23%. На основе эффективных штаммов глиокладиума создан препарат против ризок-тониоза и питиоза декоративных культур. С использованием физических и химических мутантов получено несколько стабильных биотипов триходермы и глиокладиума, в том числе с индуцированной устойчивостью к беномилу. Созданы усовершенствованные питательные среды для грибных культур, в состав которых включены дешевые и недешевые компоненты. В США запатентован новый препарат для борьбы с бактериальным ожогом, вызываемым Erwinia amylovora. В состав препарата входит фаг, лизирующий эрвинию, и продуцируемый этим фагом фермент, вызывающий деполимеризацию полисахарида.

В Канаде выявлен гриб - антагонист Cliocladium roseum, который подавляет рост и споруляцию патогенного гриба Botrytis cinerea, на 97 - 100% в

широком диапазоне температур ( 10- 25°). Испытания показали, что обра-

1

ботка растений земляники суспензией спор гриба ( 10 КОЕ/мл) успешно защищает их от серой гнили и позволяет отказаться от применения химического фунгицида (109).

В 1990 - 1993 г. в экспериментальном хозяйстве НИИ фитопатологии (Щ) были проведены лабораторно-полевые опыты по эффективности ряда биопрепаратов для защиты картофеля от фитофтороза.

Исследования проводили на восприимчивом сорте Фреско. Для обработки растений в период вегетации использовали производимые в нашей

40

стране препараты ризоплан (Ps. putida) - 4 л/га из расчета 10 клеток/мл, бак-

тофит ( Bacillus subtilis) - с той же нормой расхода, а также штаммы М2С

ß

гриба Colletotrichum coccodes из расчета 3*10 спор/мл и экстракт гриба Pytheum ultimum - 4 л/га при разведении 1: 100. Изучали влияние на резуль-

тативность заражения листьев картофеля, развитие мицелия в тканях и продуктивность спорообразования. Оценивали ход развития болезни, урожайность растений и пораженность клубней.

В качестве эталонного фунгицида применяли химический препарат по-ликарбацин. Все обработки проводили с помощью ранцевого опрыскивателя ПР - 1. Расход рабочей жидкости 400 л/га.

Микробиологические препараты при нанесении на листья оказывали сдерживающее влияние на всех трех изучаемых этапах патогенеза, но наиболее сильно на заражение листьев и спорообразование. Однако, по этим показателям они уступали поликарбацину. Все биопрепараты в полевых условиях сдерживали инфекцию не более 5 суток, в варианте с поликарбацином и через 5 дней после обработки степень развития фитофтороза сохранялась на уровне 50%. Площадь под кривой, описывающей динамику болезни, в вариантах с использованием микробиальных препаратов достоверно отличалась от контроля, урожайность была выше, а количество пораженных клубней в 2 - 3 раза ниже. Самую высокую антифитофторозную активность из них показал штамм М2С С. coccodes. Растения, обработанные этим препаратом,были несколько выше, чем контрольные.

Наряду с антагонистическими свойствами, одной из важнейших характеристик штаммов, перспективных для защиты растений, является их способность к колонизации корневой системы растений. Исследователи во многих странах мира уделяют большое внимание поиску и изучению микроорганизмов ризосферы с антагонистическими свойствами и созданию на их основе биопрепаратов (3, 17, 25, 73, 150, 166, 176, 206).

В.В. Кочетков и A.M. Воронин (60) сообщают, что среди штаммов Pseudomonas, выделенных из ризосферы дикорастущих злаков, отобрано два перспективных антагонистических штамма, рекомендуемых для получения препаратов: Р. putida BS 1380 ( Армения ) и Р. aureofaciens BS 1393 ( Нижегородская область). Биопрепараты на основе этих штаммов - псевдобактерин -

1 и псевдобактерин - 2 успешно используют в тепличных хозяйствах против корневых гнилей огурца и томата. Псевдобактерин - 2 подавляет более широкий спектр фитопатогенов и эффективен для защиты зерновых культур. Псевдобактерин - 1, помимо антагонистических свойств, стимулирует прорастание семян, рост растений и их урожайность.

Многие штаммы Flavobacterium, Agrobacterium, Enterobacter, Bacillus способны в той или иной мере фиксировать молекулярный азот в ассоциации с небобовыми культурами ( пшеница, рис, ячмень, сорго и т.д.) и/или оказывать иным путем положительное воздействие на их рост и урожайность. Для этих микроорганизмов также разработаны технологические производства соответствующих биопрепаратов, и они находят практическое применение в растениеводстве. Ризобиальные и ассоциативные препараты, помимо существенного повышения урожайности ( 15 - 25%), снижают заболеваемость растений, вызываемую почвенными фитопатогенами. Ряд препаратов ( флавобактерин, агрофил, экстрасол) используются не только для зерновых, но и для выращивания овощных культур - огурцов, томатов, кабачков и т.д. (61).

Таким образом, перспективность применения биологических средств защиты при выращивании растительной продукции очевидна.

Сотрудниками Всероссийского института защиты растений выделены культуры Bacillus subtilis 10-ВИЗР и Streptomyces elleus 8-ВИЗР, подавляющие развитие широкого круга фитопатогенных грибов.

На основе этих штаммов разрабатывают технологические производства и применения новых биопрепаратов алирина Б и алирина С для защиты от ряда опасных микозов: фузариоза колоса, корневых гнилей, мучнистой и ложномучнистой росы овощных, зерновых, цветочных и других культур.

Шениным Ю.Д. и соавторами (119) изучено влияние алирина Б и алирина С на урожайность растений, развитие и распространенность корневой гнили огурца, а также количественный и качественный состав микробиоты

почвы. Для сюавнения использовали бактосЬит СП ( 1 г/Л и тоиходеомин

' ' i X V / X Ж

зерновой С 1 г под растение). В модельных опытах было показано, что сох s Ж s ■ ■ '

вместное внесение препаратов в сооотношении 1:1 предпочтительнее использования одного. Биопрепараты оказывали явно выраженное ростстиму-лируюшее действие, урожай огурца со смесью алиринов выше контрольного на 65,8%. Препараты значительно снижали распространенность и развитие корневых гнилей по сравнению с контролем, защитный эффект биопрепаратов проявлялся на протяжении всего вегетационного периода, в начале в 3 раза и в 4 раза в конце вегетационного периода со смесью алиринов, в 3 раза в начале и в 2 - в конце - в варианте с тоихолеюмином и с бактосЬитом в 1.5

X 1 ' ' i X '

раза в течение всей вегетации П19).

X V ✓

В процессе проведения опытов были изучены количественные и качественные изменения состава микромицетов в ризосфере огурца под действием биопрепаратов. Значительную часть фитопатогенов почвы до закладки опыта составляли представители рода Cladosporium ( оливковая пятнистость огурца), Verticillium, Fusarium и Alternaria ( корневые гнили), Botrytis ( серая гниль огурца ). Через месяц после начала опыта в контроле численность грибов возоосла в трое. а бактерий снизилась. В ваоианте с сочетанием алири-

X X f X X X

нов Б и С обшее количество гоибов почти не изменилось, но из возбудителей

X ' щ/'

заболеваний присутствовали только представители рода Verticillium. числен-

XV X X ' '

ность которых составила 5% от общего числа, совершенно исчезли патогены из рода Fusarium. В варианте с бактофитом обшее количество увеличилось вдвое, однако из представителей фитопатогенов остались лишь грибы рода Verticillium. Наибольшее снижением численности грибов ( более чем в 5 раз) произошло в варианте с внесением алирина Б, изменился их видовой состав, исчезли представители Cladosporium, Botrytis и Alternaria, появились антагонисты - актиномииеты из пола Strentomvces и гпибы рола Pénicillium, тем не

X X X X • • '

менее численность грибов рола Fusarium и Verticillium была достаточно вы-

XX''

сока.

Таким образом, полученные результаты явно свидетельствуют, что внесение в почву биопрепаратов на основе активных штаммов, значительно снижает численность фитопатогенных грибов в ризосфере растения и приводит к ее оздоровлению, создавая благоприятные условия для роста и развития растения. Применение биопрепаратов алирина Б и алирина С приводит не только к значительному снижению ( в 3 - 4 раза) пораженности растений огурца корневыми гнилями, но и к существенному ( почти в 2 раза ) увеличению урожайности этой культуры.

Изложенные данные позволяют сделать вывод о перспективности создания новых микробиологических препаратов для защиты растений от болезней на основе штаммов микробов - антагонистов, позволяющих регулировать структуру агробиоценоза за счет подавления фитопатогенных видов микроорганизмов, и получать экологически чистую сельскохозяйственную продукцию.

Однако, необходимо учитывать, что микробиальная порча является одной из основных причин потерь растительной продукции при длительном холодильном хранении.

Холодильное хранение при температурах, близких к криоскопической, замедляет развитие бактерий и грибов, но не исключает поражение продукции психрофильными микроорганизмами. Для снижения потерь от микроби-альной порчи применяют дополнительные к холоду средства: химические препараты, ультрафиолетовое и радиационное облучение, озонирование, газовые среды с пониженным содержанием диокиси углерода и повышенным азота (14, 20, 22, 122). Однако, все перечисленные средства обладают рядом недостатков ( возможность возникновения различных токсичных веществ, нарушение обмена веществ, требование дифференцированного подхода к каждому виду и сорту продукции, высокая стоимость техники и многие др.), которые сдерживают их широкое промышленное применение.

Биологический контроль грибных и бактериальных инфекций овощей

и фруктов, находящихся на длительном хранении,является сравнительно новой и многообещающей отраслью научных исследований, стоящих максимально близко к практическому воплощению.

Научные исследования и практические результаты в этой области относятся ко многим видам овощей и фруктов. В результате многочисленных и всесторонних исследований, проведенных в различных научных центрах и опытных станциях, определился набор штаммов-антагонистов инфекций, поражающих различные виды сельскохозяйственной продукции при длительном ее хранении. Это касается яблок (130, 158, 209, 210), винограда (135, 147), ананасов (169,171), земляники (130, 134, 161), цитрусовых (135, 160, 175), косточковых плодов (192, 193, 213), а также зерновых культур (136, 207).

Так, например, Trichoderma viridae применяется на землянике как биологический агент, осуществляющий контроль развития серой гнили, вызываемой Botrytis cinerea. Развитие этого возбудителя вызывает значительные потери земляники при ее даже непродолжительном хранении и максимально щадящих условиях транспортировки (161). Частичный контроль над этим возбудителем, поражающим также семечковые плоды ( например, яблоки), достигнут применением водной суспензии конидий Trichoderma harzianum путем опрыскивания садов сразу же после цветения (209). Обработка ягод винограда штаммом Trichoderma species М- 10 снижает потери от серой гнили, вызванной Botrytis cinerea, при хранении в 2 раза. Плоды яблони с механическими повреждениями, обработанные штаммом Candida species Y-4, не поражались при хранении серой и голубой гнилями (72).

Сравнительно недавно появились сообщения, что некоторые бактерии Pseudomonas fluorescens, Agrobacterium radiobacter (151, 157) способны инги-бировать развитие опухолей персиков, томатов и др.

Colyer P.D. и Mount M.S. (141) показали, что обработка семенного картофеля суспензией бактерий-антагонистов Pseudomonas putida перед высадкой снижает на 50% развитие сухой гнили клубней при хранении.

Эти и многие другие примеры показывают, что в последние годы исследованиям в области биоконтроля патогенеза сельскохозяйственной продукции уделяется все более пристальное внимание.

Многие авторы (158, 204, 213, 214), производившие отбор активных штаммов, подавляющих рост и развитие инфекций,отмечали, что некоторые бактериальные изоляты, проявляющие высокую антагонистическую активность в условиях культивирования на искусственных питательных средах in vitro, теряли или не проявляли способность к биоконтролю при проверке ее в модельных опытах на овощах и фруктах in vivo, в условиях, приближенных к практическому способу применения. Так, среди 534 изолятов, проанализированных Janisiewies W.J. in vitro, как потенциальных антагонистов Botrytis cinerea, только 185 было отобрано для опытов in vivo и только один, идентифицированный как Acremonium breve, соответствовал коммерческим требованиям контроля над патогеном (159). Тем же автором было протестировано в лабораторных условиях более 800 штаммов потенциальных антагонистов серой гнили сочных плодов, вызываемой Pénicillium expansum ( пенициллез), выделенных из природных источников. Janisiewies W.J. были выделены два наиболее активных штамма, идентифицированных как Pseudomonas spp. штамм L-22- 64 и дрожжевой изолят F-43-31. Всесторонняя проверка этих штаммов показала, что они в концентрации выше 1-4*10 КОЕ/мл полностью подавляли развитие возбудителя, независимо от концентрации его спор, используемых как инфекционный фон (158).

Вызывает значительный интерес поиск антагонистов комплексу болезнетворных микроорганизмов. Так, например, в комплекс патогенов, наносящих существенный урон при длительном хранении яблок, входят: Botrytis cinerea, Mycor spp., Yleosporium perennans, Phialophora malorum, Penicillum expansum и некоторые другие. Наибольший экономический ущерб от этого комплекса патогенов наносится хранящейся продукции, по мнению Janisiewies W.J. (160) грибами Botrytis cinerea и Pénicillium expansum. В pe-

зультате исследований in vitro и in vivo на зрелых плодах сорта Golden Delicious авторами была избрана следующая комбинация штаммов-антагонистов: Pseudomonas spp. штамм 22-64 и Acremonium breve, выделенные из смывов яблоневых листьев. При их применении наблюдается значительное уменьшение диаметра зон поражения на фруктах, а концентрации

6

клеток-антагонистов 8-9*10 КОЕ/мл предотвращали развитие поражений

з

фруктов, обработанных спорами возбудителя в концентрации 10 КОЕ/мл. Как один, так и другой штамм по отдельности, обладали значительной антагонистической активностью.

В процессе поиска новых штаммов- антагонистов и разработки биопрепаратов на их основе необходимо учитывать технологические условия применения препаратов, при которых достигается максимальный антагонистический эффект. В работах румынских ученых (204) изложены результаты исследований in vitvo спектра действия препарата на основе биомассы Trichoderma viride на 5 патогенных микроорганизмов, вызывающих порчу яблок, картофеля и моркови. Исследованы наиболее часто встречающиеся патогенные грибы: Monilia laxa и Botrytis cinerea в яблоках, Fusarium roseum var. sambucium в картофеле и Sclerotinia sclerotiorum и Stemphlulium radicinum в моркови. Биопрепарат проявлял антагонистическое действие по отношению к исследуемым грибам только при температуре 8, 10, 18°С. Рост грибов Monilia laxa и Sclerotinia sclerotiorum замедлялся под влиянием биопрепарата (0,2%) только при температуре 10, 18°С.

Методы биологического контроля над возбудителями заболеваний сельскохозяйственной продукции чрезвычайно разнообразны: обработка культуральной жидкостью микробов - антагонистов (86, 188, 174), обработка лиофильно высушенными культурами (98), использование биологически активных веществ, выделяемых микробами антагонистами (45, 119, 172), а также препаратами из них (7, 93, 102, 121, 145, 162).

Так, например, Pusey etal (191) применял В-3 штамм Bacillus subtilis как

компонент воскового покрытия персиков при закладке их на хранение, при этом отмечалось, что биологический контроль сохранности персиков, осуществляемый с помощью В-3 штамма, хорошо сочетается с различными применявшимися до настоящего времени способами химического контроля, в частности, применение фунгицида дихлорана, входящего в ту же смесь с восковым покрытием. В другом случае сравнивались фунгицидные и фун-гистатические свойства клеток Е. cloacae в отношении возбудителя одного из видов персиковых гнилей Rhizopus stolonifer с культуральной жидкостью, лишенной бактериальных клеток. Установлено, что отмытые бактериальные клетки проявляют большую активность в отношении возбудителя, чем куль-туральная жидкость или клетки вместе с культуральной жидкостью.

При исследовании культуры Bacillus subtilis выявлено, что наибольший эффект проявляется клетками с культуральной жидкостью или самой культуральной жидкостью, но непродолжительное время.

R.J. Mchaughlin (94) проведены исследования с дрожжами Candida sp. при защите яблок сорта Golden Delicious от возбудителей послеуборочных гнилей, таких как Botrytis cinerea, Pénicillium expansum. При добавлении к суспензии дрожжей СаСЬ^эффективность антагониста значительно повышалась. Преимуществом ряда дрожжевых препаратов является способность их клеток расти при низкой температуре (+5°С), что близко к оптимальному

температурному режиму хранения семечковых плодов. В исследованиях с

8

плодами груши при концентрациях клеток Pseudomonas gladioli 10 КОЕ/мл

9

развитие Botrytis cinerea задерживалось, а при более высокой ( 10 КОЕ/мл) фитопатоген вообще не развивался.

Промышленные способы хранения, транспортировки предусматривают формирование на специальных поточных линиях вокруг собранных плодов тонкой восковой оболочки, служащей дополнительным барьером против проникновения к сочным плодам спор и мицелия грибов-возбудителей. Эта же оболочка предотвращает, в некоторой степени, механические поврежде-

ния и обезвоживание плодов.

В большинстве случаев в воскоподобное вещество, из которого формируется оболочка, добавляют фунгициды, такие как беномил, предотвращающий развитие возбудителей коричневой гнили персиков, или дихлоран, для контроля роста или развития грибов рода Rhizopus. Даже при соблюдении всех этих условий общее время хранения и транспортировки персиков составляет 2-3 недели после уборки, причем хранение осуществляется в холодильных камерах с регулируемой газовой средой. Авторы провели ряд опытов с чистыми культурами, сравнивая действие существующих способов послеуборочного хранения плодов на развитие патогенов с действием выделенного штамма Bacillus subtilis В - 3.

В результате исследований было показано, что обработка воском в комбинации с обработкой штаммом В - 3 , вела к статистически достоверному уменьшению зараженности плодов по сравнению с контрольным вариантами ( обработка воском и воском с фунгицидами), а также к уменьшению диаметра зон поражения плодов. Исследовалась возможность комбинированного применения штамма В - 3 с дихлораном и этой комбинации в составе восковой оболочки. Установлено, что В - 3 в комбинации с дихлораном значительно усиливает фунгицидный эффект послеуборочного хранения плодов, особенно в условиях холодильных камер.

Таким образом, биологический контроль развития возбудителей в тканях плодов может быть успешно совмещен с уже имеющимися методами защиты. В то же время, биометод успешно конкурирует с химическими методами, не обладая их недостатками - "привыкание" возбудителя, токсичностью и т.п. Так, для борьбы с Rhizopus stolonifer ( активный раневый паразит ) до настоящего времени использовали фунгициды, обработку горячей водой, восковое покрытие с добавлением фунгицидов, хранение при низких температурах. Возбудитель R. stolonifer не развивается при температуре ни-

же +7°С, однако, когда температуру повышают при доставке и продаже фруктов потребителю, они могут полностью прийти в непригодность в течение 40-48 часов. В последние годы отмечено массовое появление устойчивых к фунгицидам штаммов грибов R. stolonifer. В связи с этим было проанализировано около 13 бактериальных изолятов - потенциальных антагонистов Rhizopus, и только один из них обладал эффектом на уровне действия фунгицида дихлорана. Этот единственный бактериальный штамм был идентифицирован как Е. cloacae. Развитие заболевания на искусственно инфицированных фруктах ингибировалось штаммом-антагонистом на 70%. Основная масса обработанных фруктов хранилась без поражений при комнатной температуре не двое, а пять суток, некоторые фрукты - до восьми.

Кипрушкиной Е.И. (37) исследована возможность применения в качестве биологических средств защиты картофеля от фитопатогенов при длительном холодильном хранении бактерий-антагонистов рода Pseudomonas различных видов и штаммов. Из природных субстратов было выделено 87 штаммов бактерий рода Pseudomonas, из них отобрано 7 штаммов, проявивших наиболее высокую активность в отношении тест-культур ( Fusariqm solani и Botrytis cinerea ) в опытах in vitro. Установлено, что большим мико-статическим эффектом обладает культуральная жидкость ( КЖ) бактерий, а не нативный раствор, что, как полагает автор, связано с суммарным эффектом самих клеток и продуктов их метаболизма, тогда как нативный раствор, состоит только из веществ, продуцируемых антагонистом. При проверке антагонистического действия штаммов, проявивших максимальный защитный эффект, было установлено, что клетки штаммов Ps. sp. 73, Ps.sp. 115 и Ps. aureofaciens 35 синтезируют антибиотические вещества. В результате исследования физиолого-биохимических изменений, протекающих в клубнях после обработки КЖ бактерий-антагонистов, выявлено, что обработка картофеля бактериями-антагонистами не вызывает существенных физиолого-

биохимических изменений, содержания основных компонентов химического состава клубней, способствует максимальной стабильности углеводного обмена клубней, снижает расход запасных веществ на процессы дыхания, уменьшает потери витамина С и более интенсивно воздействует на процессы распада нитратов. Методом ИК-спектроскопии установлено, что обработка клубней биосредствами способствует сохранению прочных связей липидов мембранным матриксом, замедляя физиолого-биохимические и структурные перестройки в растительных тканях. Предпосадочная обработка картофеля КЖ бактерий-антагонистов повышала урожайность на 9-25% и снижала распространенность болезней в урожае на 42%, при хранении на 13-17%. Обработка картофеля КЖ перед закладкой снижала развитие микробиалыюй порчи при хранении в 3-4 раза в зависимости от штамма микроорганизмов.

Однако, не изучено влияние обработки картофеля КЖ бактерий-антагонистов на защитные механизмы клубней. Иммунитет растений основан на защитных реакциях по отношению к патогенным микроорганизмам и стрессам. Возможно, что бактерии-антагонисты и продукты их метаболизма способствуют активизации защитных реакций клубней картофеля.

Таким образом, перспективность применения микробов-антагонистов против фитопатогенов растительной продукции при ее длительном хранении очевидна. На основании анализа литературы, можно предположить, что бактерии-антагонисты, не только подавляют рост и развитие патогенных для растений микроорганизмов, но и способны синтезировать вещества, активизирующие некоторые защитные механизмы растений, т.е. иммунизировать растения. Необходимо исследование защитных механизмов клубней, а также метаболитов растений, участвующих в различных защитных реакциях картофеля, обработанного биологическими средствами защиты, изыскание оптимальных условий для получения максимального эффекта. Указанные направления и определили цель и задачи настоящих исследований.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ПОСТАНОВКА

ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1 Объекты исследования

Объектом исследования действия биологических средств защиты в опытах in vivo выбраны картофель сортов Невский, Детскосельский и Лу-говской, широко распространенные в Северо-Западной зоне России.

Невский - ранний сорт столового назначения. Выведен в России. Крах-малистость 10,7 - 15%, вкусовые качества и лежкость клубней хорошие. Устойчив к раку, умеренно поражается фитофторозом и вирусными болезнями. Способен давать высокие урожаи на разных типах почв и в разных климатических условиях. Урожайность 37,8 - 50,1 т/га. Масса товарного клубня 86 - 133 г. Клубни округлоовальные, с плоским столонным следом, белые. Глазки мелкие, розовые. Ростки красно-фиолетовые. Мякоть белая.(9)

Детскосельский - среднеранний сорт столового назначения. Выведен в России. Крахмалистость до 18%, вкусовые качества и лежкость клубней хорошие. Устойчив к раку картофеля, средне поражается S-вирусом и паршой обыкновенной, поражается фитофторозом, черной ножкой, вирусами, не поражается железистой пятностостью. Возделывается на всех видах почв. Хорошо отзывается на удобрения. Урожайность 39 - 45 т/га. Масса товарного клубня 110 - 120 г. Клубни крупные, светло-розовые, плоскоовальные, кожура гладкая. Глазки поверхностные, малочисленные, ростки красно-фиолетовые. Мякоть белая.(9)

Картофель выращивали на Павловской опытной станции ВИРа им. Н.И. Вавилова.

Почва - легкий суглинок. Предшественниками картофеля были многолетние травы или яровые зерновые. Осенью проводили зяблевую вспашку, рушение стерни; весной - дискование, внесение органических удобрений 7

ц/га ( из расчета действующего вещества N90 Р90 К90), вспашку с боронованием, нарезку клубней. Посадка гребневая, норма 4-5 ц/га. После посадки проводили три боронования до всходов, одно по всходам, 2-3 окучивания. Летом - трехкратная обработка против фитофтороза микродозами меди, сорто-фитопрочистки. Уборку осуществляли картофелекопалками и картофелеуборочными комбайнами.

Бактерии-антагонисты, используемые в качестве агентов биологической защиты растений от фитопатогенов, обладают рядом преимуществ по сравнению с грибами и актиномицетами (18). Биопрепараты на основе бактерий более технологичны, так как наработка спорового материала из бактерий не требует сложных способов культивирования и специфических питательных сред (5). В отношении актиномицетов необходимо учитывать, что широкое применение их как антагонистического начала в биологической борьбе с болезнями растений может ограничиваться из-за использования этих микроорганизмов в качестве основных продуцентов антибиотиков медицинского назначения (6).

Бактерии рода Pseudomonas, как отмечено многочисленными исследованиями в области изучения антагонизма, являются одной из наиболее перспективных групп бактерий, подавляющих рост и развитие патогенных грибов и бактерий, приносящих существенный урон продукции при хранении ( 8, 75).

Разнообразие биосинтетических и катаболических реакций, высокая скорость роста на простых по составу средах, особенности генетической организации ( наличие плазмид), широкие возможности для генно-инженерного манипулирования, позволяют рассматривать бактерии рода Pseudomonas как перспективный объект для работ в области биотехнологии. Среди микроорганизмов этого рода имеются продуценты витаминов и ко-ферментов, органических и аминокислот, полисахаридов и поверхностно-

активных веществ, ауксинов, гиббереллинов и цитокининов, антибиотиков и др. биологически активных веществ.

Семейство Pseudomanadaceae - это палочковидные, грамотрицатель-ные, не образующие спор бактерии с полярно расположенными жгутиками. Широко распространены в природе. Многие виды образуют флюоресцирующие пигменты. В восьмом издании Берги представлено 265 видов, но только 103 вида находятся в коллекции культур, а остальные даны в приложении, где разделены на виды, ранее отнесенные к роду Pseudomonas, а впо-следствие изъятые из него, и виды, не включенные в род Pseudomonas, но могущие быть отнесены к нему при более подробном изучении. Однако, до сих пор продолжают открывать и описывать новых представителей этого рода.

Выявлено, что у бактерий рода Pseudomonas хорошо развит синтез биологически активных веществ, что обеспечивает им высокую конкурентоспособность, лабильность свойств и адаптивность. Антибиотики, синтезируемые псевдомонадами, составляют обширную группу веществ, различных по природе, но объединенных одной функцией. Псевдомонадами продуцируется свыше 50 веществ, обладающих антагонистической активностью, принадлежащих к феназинам, фенилпирролам, производным индола и являющиеся промежуточными и конечными продуктами метаболизма ароматических аминокислот.

Некоторые виды Pseudomonas синтезируют антибиотики-бактериоцины широкого спектра действия. Эти соединения связываются с рецепторами внешних мембран чувствительных к ним клеток, проникают внутрь клетки, ингибируют синтез белка, разрушают ДНК и мембраны. Бак-териоцины не действуют на человека, животных и растения (75, 212).

Среди бактерий рода Pseudomonas встречаются патогенные виды, однако большинство бактерий этого рода не патогенны для культурных растений. Развиваясь на поверхности растительных продуктов, они используют вещества, выделяемые тканями растительного продукта и имеющиеся на его

поверхности незначительные количества органических загрязнений (62). Некоторые виды псевдомонад усваивают одноуглеродные соединения, например, окись углерода, двуокись углерода, метанол, формальдегид, метилированные амины, могут ассимилировать углекислоту в качестве единственного источника углерода, используя для этого энергию окисления (62, 75). Большинство описанных к настоящему времени бактерий рода Pseudomonas не нуждаются в факторах роста и способны ассимилировать минеральные формы азота в качестве единственного источника азотного питания (75).

Псевдомонады являются неотъемлемой частью эпифитной микрофлоры. Они обильно развиваются в зоне корней вегетирующих растений, а также на гниющих растительных и животных остатках (201). Штаммы бактерий этого рода доступны, легко культивируются, не требуют специальных сложных сред, препараты на их основе дешевы и просты в изготовлении. Псевдомонады сохраняют жизнеспособность и активность длительное время ( в течение года), в зависимости от способа консервирования.

Бактерии рода Mycobacterium как антагонисты и продуценты биологически активных веществ, проявляющих активность в отношении фитопато-генов, практически не исследованы. Однако, известно, что отдельные виды бактерий рода Mycobacterium способны синтезировать антибиотические вещества такие,как антибиотики N-ацетаттирамин, микобактин, смегмамицин (36, 65). Роль сидерофоров у микобактерий выполняют микобактины и экзо-хелины - они выделяются из клетки в виде не содержащих железо соединений, связывают в питательной среде железо и снова поглощаются клеткой. В клетках железо восстанавливается до Fe^ , к которому микобактины и экзо-хелины имеют незначительное сродство и поэтому освобождают его (123).

Бактерии рода Mycobacterium являются естественными обитателями воздуха и кожи рук человека. Всем микобактериям свойственно аэробное дыхание. По особенностям морфологии их следует расположить между ко-ринебактериями и проактиномицетами ( нокардиями). Мицелий они не об-

разуют, но растут в виде слабо ветвящихся клеток неправильной формы. Микобактерии грамположительны и неподвижны, а также обладают кисло-тоустойчивостью. Кислотоустойчивость обусловлена высоким содержанием в клеточных стенках миколовых кислот, которые делают поверхность мико-бактерий воскообразной, сильно гидрофобной. В состав клеточных стенок микобактерий входят муреиновые и миколовые кислоты, арабиноза и галактоза, входящие в состав арабиногалактина-полисахаридов. Микобактерии накапливают в клетках жироподобные вещества и часто даже выделяют их в среду; микобактерии могут содержать до 40% восков.

Микобактерии распространены и в почве. Многие из них могут хорошо расти на средах с парафинами, ароматическими и гидроароматическими углеводородами и даже на простой среде, содержащей только неорганические питательные соли, в парах нефти, нафталина или других летучих углеводородов, выделяющихся из почвы. Микобактерии способны окислять этан, они растут на среде, в состав которой входят метан и этан. Некоторые из бактерий, использующих этан, могут также окислять газообразный водород. Еще большее число видов бактерий развиваются в накопительных культурах за счет использования пропана. Mycobacterium и Pseudomonas также способны окислять бутан. Почвенные микобактерии не нуждаются в добавке других субстратов и растут относительно быстро.

Учитывая высокую антагонистическую активность различных видов микобактерий, их неприхотливость при росте и развитии, при более тщательном их изучении, возможно использование бактерий этого рода против фитопатогенов растительной продукции.

Исходя из изложенных данных, объектом исследования выбраны бактерии рода Pseudomonas и Mycobacterium.

В процессе исследования использовали штаммы 73 и 115 Pseudomonas species, штамм 35 Pseudomonas aureofaciens и штамм 11 Mycobacterium species. Исследуемые штаммы выбраны на основе результатов исследований,

проводимых в Проблемной научно-исследовательской лаборатории кафедры общей холодильной технологии пищевых продуктов СПГАХПТ, как наиболее активные в отношении фитопатогенов картофеля. Бактерии-антагонисты нарабатывали в лаборатории ВНИТИ антибиотиков и ферментов медицинского назначения. Предварительно выделенные из природных источников ( кожура картофеля и моркови, садовые и полевые почвы) бактерии, культивировали в глубинных условиях на различных по составу питательных средах ( соево-глюкозная, дрожжевая, кукурузная). Ферментацию проводили в колбах Эрленмейра емкостью 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды, на

-А

роторной качалке с п= (220+10) мин , при ( 27±1)°С в течение 72-96 часов.

Для обработки клубней картофеля концентрация активных клеток в культуральной жидкости бактерий-антагонистов составляла 10 кл/мл.

Заключение диссертации по теме «Хранение и холодильная технология пищевых продуктов», Гудима, Людмила Ратмировна

ВЫВОДЫ

1. Установлена зависимость биосинтеза суберина, фенольных соединений, пектиновых веществ и активности ферментов-оксидаз в раневой перидерме клубней от температуры и штамма бактерий-антагонистов. Биологические средства защиты активизируют процессы раневой репарации механически поврежденных клубней в лечебный период и при низкой положительной температуре, что повышает устойчивость растительной ткани к инфекционным заболеваниям.

2. Выявлено влияние биологических средств защиты на биосинтез суберина в процессе длительного холодильного хранения в зависимости от сорта картофеля и штамма бактерий; показано увеличение содержания суберина в опытных партиях картофеля в весенний период, с применением штамма 35 Рб. аиегоГа51еш и штамма 11 Мус. эр.

3. Выявлено, что обработка механически поврежденных и неповрежденных клубней биологическими средствами защиты активизирует защитную систему ФС+ФО, что способствует усилению химических барьерных свойств раневой и естественной перидермы клубней против проникновения патогенных микроорганизмов и их метаболитов.

4. Установлено, что обработка картофеля КЖ бактерий-антагонистов не нарушает естественных процессов биосинтеза пектиновых веществ в естественной перидерме клубней при длительном холодильном хранении.

5. Показано, что применение бактерий-антагонистов при длительном холодильном хранении не нарушает нормального дыхательного газообмена, обеспечивает растительному организму более длительное состояние покоя, а также в зависимости от сорта картофеля и штамма бактерий-антагонистов подавляет прорастание клубней.

6. Установлена корреляционная зависимость между содержанием суберина, хлорогеновой и п-кумаровой кислотами, хлорогеновой кислотой и активностью ферментов - фенолоксидазы и пероксидазы, интенсивностью дыхания клубней и активностью ферментов - фенолоксидазы и пероксидазы. Определены коэффициенты парной корреляции и множественной регрессии. Получены уравнения регрессии.

7. Установлено, что обработка картофеля КЖ бактерий-антагонистов перед закладкой снижает развитие микробиальной порчи при хранении в 1,53 раза в зависимости от штамма бактерий и сорта картофеля.

8. Картофель без механических повреждений и с неглубокими механическими повреждениями, обработанный КЖ Рб. Бр. штамм 115, рекомендовано хранить при температуре (3±1)°С без проведения лечебного периода; картофель с глубокими механическими повреждениями рекомендовано обрабатывать КЖ Рб. ер. штамм 115 и Ре. аиегоГаЫеш штамм 35 с проведением лечебного периода и хранение при температуре (3±1)°С.

9. Разработаны дополнения к технологической инструкции (ТИ 9739005-02068491-95) по производству и длительному хранению картофеля с применением искусственного холода и биологических средств защиты.

10. Экономический эффект при обработке картофеля перед закладкой на хранение составляет 142 - 288 руб /т в зависимости от сорта картофеля и штамма микроорганизмов.

139

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Гудима, Людмила Ратмировна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авдюшко С.А. и др. Простогландины возбудителя фитофтороза и их влияние на фитофторозоустойчивость картофеля// Всесоюзная конф. "Механизмы стимуляции и ингибирования роста растений и животных": Тез, докл. Ташкент, 1989 г.-ЗОО с.

2. Айзеншан Б.Е. Антибиотические свойства бактерий.-Киев: Наукова думка, 1973-183 с.

3. Андреева Н.Б., Сорокина Т.А., Хмель И.А. "Штаммы бактерий Pseudomonas maltophilia-продукты хитинолитических ферментов" МКИ6 с. 12 № 9/42, с. 12, № 1/20 Патент РФ 2031119 20.03.95. Б. И. № 8.

4. Арасимович В.В., Балатага C.B., Пономарева Н.П. Методы анализа пектиновых веществ, гемицелюлоз и пектолитических ферментов в плодах.-Кишинев, АН. Молд. ССР, 1970,-84 с.

5. Африкян Э.К. Бактерии-антагонисты и их применение.-Ереван: Изд-во АН Армянской ССР, 1959.-121 с.

6. Бельтюкова К.И., Матышевская М.С., Куликовская М.Д. Методы исследования возбудителей бактериальных болезней растений.-Киев: Урожай, 1968-316 с.

7. Биологические препараты для защиты урожая/ Нугманова Т.А. / Науч.-произв. совещ. 24-26 авг., 1994.: Тез. докл. 4.2.-Пущино, 1994-с. 200-202. Рус. ( РЖ Биология, 1995. № 1 ).

8. Бондаренко А.И., Николаева С.И. Биологические методы защиты растений от заболеваний. В кн.: Применение биологических методов защиты растений в сельскохозяйственном производстве. Кишинев: Штиинца, 1988 с. 44-51.

9. Бульба: Попул. энцикл. справ, по биохимии, возделыванию, хранению и использованию картофеля вкулинарии:Беларусь. БэлЭнц. 1994, -350с.

10. Бурмицкая М.М., Давидович Г.В. и др. Влияние инокуляции бактериями рода Pseudomonas на процесс азотного цикла в ризосфере небобовых растений // Микробиология. 1994, т. 63, вып. 2, с. 326-333.

i i. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C. Приживаемость в почве штамма Pseudomonas Diminuta. ИНМИ, КС-7, утилизирующего хлора-нилины// Микробиология. 1990 г., т. 59, вып. 3, с. 482-490.

12. Вечер A.C., Гончарик М.Н. Физиологи и биохимия картофеля. Минск:

TT 1 лт> Л /■ Л

маука и техника, I у / 3 r.-zoj с.

13. Влахов С.С. Действие антибиотиков на возбудителей бактериозов// Растениеводство.-1974 г., т.11, № 9- с. 123-129.

14. Волкинд ИЛ. Промышленная технология хранения картофеля, овощей и плодов.-М.: Агропромиздат, 1989 г.-239 с.

i 5. Воронкевич И.В. Антагонизм микроорганизмов в почве и перспективы его использования в борьбе с почвообитающими возбудителями болезней растений//' Успехи современной биологии.-1958, т.46, вып. 2,-с.145-

1 п /—

I ЭЭ.

16. Гарагуля А.Д. Антибиотическоедействие почвенных бактерий на фито-патогенные грибы.: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол.

Т Л 1 лиг лп

наук.- хчпев, i.-zö с.

17. Гарагуля А.Д., Бабич Л.В., Киприанова O.A. и др. Способность различных видов бактерий рода Pseudomonas к колонизации корней пшеницы/7 Микробиол. журнал.- 1988, т. 50, № 6, с. 77-81.

i 8. Гарагуля А.Д., Киприанова С.А., Бойка О.И. Антибиотичность бактерий рода Pseudomonas на фитопатогенные грибы/7 Микробиол. жур-

, „„ 1 лп _ л / хе л „ i л^т ЛЛЛ

нал.- i9/4.- т. jo, JSs? z,- с. i у/-zuz.

19. Гаузе Г.Ф. Пути изучения новых антибиотиков.-М.: АН СССР, 1958.172 с.

20. Головкин H.A. Холодильная технология пищевых продуктов.-М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984-240 с.

21. Голышин Н.М. Новые средства защиты растений от болезней// Защита растений.- 1992, вып.8, с. 50-54.

22. Гусев С.А., Метлицкий Л.В. Хранение картофеля.-М.: Колос, 1982 г.-223 с.

23. Гусев С.А. Хранение картофеля. М.: Московский рабочий, 1985-143 с.

24. Дорожкин H.A., Новикова Л.М., Вельская С.И., Викторгин И.В. Антагонистические бактерии, перспективы для защиты картофеля от болезней//ДАН Беларусшм.1991, т.35, вып. 11, с. 1037-1038.

25. Емнова Е.Е., Меренюк Г.В., Сланина В.А. и др. Видовой состав сапро-трофных флюорисцирующих псевдомонад в ризоплане различных видов сельскохозяйственных растений// Микробиология. 1995, т. 64, № 6, с. 820-826.

26. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов.- М.: Наука, 1964-296 с.

27. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений.-1974-216 с.

28. Запрометов М.Н. Образование и функции фенольных соединений в высших растениях// Журнал общей биологии. М.: Наука. 1970, т.31, вып. 2, с.201-222.

29. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их биогенез// Сер. Биологическая химия.- М.: ВИНИТИ, 1988-188 с.

30. Запрометов М.Н. Фенольные соединения.Распространение, метаболизм и функции в растениях.- М.: Наука, 1993-272 с.

31. Захаренко В.А. Экономика использования пестицидов в сельском хозяйстве// Журнал Всесоюзного химического общества им. Менделеева.-1978,-№ 2,-с. 78-82.

32. Иванова Т.М., Рубин Б.А. О природе фенолоксидазного действия пе-роксидазы// Биохимия. 1962, т.27, вып.4, с. 622.

33. Использование ионизирующих излучений в защите растений от вредителей и болезней/ Буфатия О.И., Паращинов Н.П./ Науч.-произв. со-вещ. 24-26 авг., 1994 г.: Тез. докл. 4.2.- Пущино, 1994 г.- с.250-251.

34. Киприанова Е.А., Рабинович A.C. Образование феназин-1-карболовой ¿ислоть! Pseudomonas fluorescens// Микробиология. 1996 ., т.38, № 2, с.

11Л.111

¿-¿--г / .

^ Я Уг^ГТ1ЛТДС1и/~>ор F А PllIinUAD R R Рс AI 1 Л Г»ТГ> /~>Г> О С fl 1 1 ПГРС^РП С ТТ1Л/~\ 17\/1ТРОТ QU.

s . ivimj./iii.iiiWi->Ci iu.i x., V^mri^yiivyu u.xj. 1 jvuuv/niv/iiuj iiüv/i CbvCiiö 11р\_/ДуцСп i dri

DPtriPi'TD// ДутМбчОтиь'и 1 Ой 1 Mo 1 n 1 1 AI

X MVI1U X il iVVlVilA UULL^VV X XJ t I I JlP i fl-\J Ж X\J X XXX^XX. X S О X . ,, j V- V. i JJ ¡HJ.

36. Кожипски Т., Ковшык-Гинзефер 3., Курылович В. Антибиотики, Происхождение, природа и свойства.: В 2-х т.- Варшава; Польское гос. изд-во, 1968 г.-1343 с

37. Козловская Н.В., Обгорельцева И.О., Яковлева Е.П., Колодязная B.C., Кипрушкина Е.И. Роль бактерий-антагонистой в устойчивости картофеля к фитопатогенам пр И длительно XJ3 S^iî С ï~ï M M // ' v C^ J3 Pî M I»J3 âlÎXï'îK cl применения искусственного холода в пищевых отраслях:Межвуз.сб.науч. тр.-СПб.: СПГАХПТ, 1993.-С,26-33.

38. Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф. и др. Вторичные метаболиты новых почвенных штаммов микроскопических грибов родов Aspergyillius и Pénicillium// Микробиология. 1990, т.59, вып.4, с. 601-608.

39. Колотнец Э.И. и др. Антигрибная и антибактериальная активность ак-тиномицетов, разлагающих микоцеллюлозу// Прикл. биохимия и микробиология. 1994, т.ЗО, вып.4-5, с. 644-649.

40. Константинова Г.Е., Кузнецова Н.И., Шамшина Т.И. и др. Ингиби-торная активность штамма Bacillus thuringiensis Г7// Биотехнология. 1994, № 1, с. 15-18.

41. Король И.Т., Прищепа Л.И. Технология применения бактериальных препаратов для защиты капусты от листогрызущих вредителей в Бело-руш-ш -Мн.: Защита растений. 1975.-вып. Х.-с. 86-92.

42. Кретович В.Л. Введение в энзимологию.- М.: Наука, 1986, 332 с.

43. Круглов Ю.В. Микробиологические факторы детоксикации пестицидов// Сельскохозяйственная микробиология.- 1979.- t.XIV. № 6.-с.710-714.

44. Кузнецова М.А., Филиппов А.В., Щербакова Л.А., Воинова Т.М. Микробиологические препараты для защиты картофеля от фитофтороза// Защита и карантин растений. 1996, № 6, с. 16-17.

45. Кузнецов В.Д., Гдалова Т.П. "Штамм актиномицета St. lavendulae Subsp. aruptini для получения аруптина" МКИ4 С2Р 1/06 28.02.91. Б.И. № 10 А.с. 1631083 СССР.

46. Леонтьева Г.В., Чапенко Г.И., Медведева Т.Е., Валюкова Н.И., Озерец-ковская О.Л. Подавление устойчивости картофеля иммуносупрессора-ми побудителем фитофтороза// Прикладная биохимия и микробиология. 1989, т.25, вып.4,с. 532-540.

47. Либберт Э. Физиология растений.- М.: Мир, 1976.-535 с.

48. Любимова И.В., Салькова Е.Г. Лектин-углеводное взаимодействие во взаимоотношениях растение-патоген// Прикл. биохимия и микробиология. 1988, т.24, вып.5, с.595-606.

49. Максимова И.П., Лысак В.В., Блажевич О.В., Фомичев Ю.К. Штаммы Pseudomonas putida М продуцент// Актуальные пробл.-соц.-гуманит. и естеств. наук. Минск, 1991, с. 153-154.

50. Метлицкий Л.В. Основы биохимии плодов и овощей. М.: Экономика, 1976,349 с.

51. Метлицкий Л.В., Мухин E.H. Природа раневых реакций картофеля и их использование для защиты клубней от поражения микроорганизмами// Биохимия плодов и овощей.М.: Наука. 1964, с. 18-35.

52. Метлицкий Л.В. Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов// Прикл. биохимия и микробиология. 1982, т. 18, №6, с. 765-777.

53. Метлицкий Л.В., Мухин E.H., Морозова Н.П. Биохимическая природа раневых реакций и их использование для повышения устойчивости картофеля к микроорганизмам// ДАН СССР. 1963, т. 150, № 6, с. 13821384.

54. Метлицкий Л.В., Озерковская О.Л.,Чаленко Г.И. О фунгитоксичном действии фенольных соединений, возникающих в клубнях картофеля при поражении//ДАН СССР. 1965, т.160, №4, с. 964-968.

55. Метлицкий Л.В., Кораблева Э.П. Биохимическая связь между функциями покоя и иммунитетом растений. в.кн.:Биохимия иммунитета и покоя растений. М.: Наука. 1969, с. 3-21.

56. Методика определения экономической эффективности применения биологических средств защиты растений.-М.: ВАСХИ, 1979.- 30с.

57. Методы современной биохимии.-М.: Высшая школа, 1975, 143 с.

58. Методы биохимических исследований растений. Под ред. Ермакова Л.:Колос, 1972-371с.

59. Михлашевичс Э.П., Мишке И.В., Тевелева М.К., Чернин Л.С. Плазми-ды pPs 136, определяющая синтез цитокининов у Pseudomonas stützen// Всесоюзная конф. "Микроорганизмы- стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных." тез. докл. 4.2. 3-5 окт. 1988. Ташкент, с. 132.

60. Микробиологические средства защиты растений на основе PGPR Pseudomonas/ Конетков В.В., Воронин A.M./ Семин.-совещ. "Экологизация сельскохозяйственного производства СевероКавказского региона" 26-29 июля, 1991: Тез. докл>М., 1995.- с.63-69.

61. Микробные препараты, технология их производства и применения в растениеводстве в России/ Хотянович A.B./ 9 Бах. коллок. по азото-фиксации, посвящ. памяти чл.-кор.РАИ В.Л. Кретовича 24-26 янв., 1995: Тез. докл.- Пущино, 1994.-е. 101.

62. Мишустин Е.И., Емцев В.Т. Микробиология,- М.: Колос. 1978. 320 с.

63. Мослашвили Г.И., Джашаспишвили Л.И., Шенгелия Н.В. Влияние и использование микроорганизмов-стимуляторов ь производстве саженцев/ Всесоюзн. конф. "Микроорганизмы-стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных." Тез. докл.42. Ташкент, 1983, е.-130.

64. Новикова Н.И., Литвиненко А.И., Калько Г.В. Влияние новых препаратов, созданных на основе штаммов микробов-антагонистов, на комплекс возбудителей корневых гнилей огурца// Микробиология и фитопатология. 1995, т.29, вып.5-6, с.6-53.

65. Обгорельцева И.О. Направленный поиск продуктов антибиотиков среды грамположительных неспорообразующих бактерий. Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. 03.00.23- Спб, 1992-19 с.

66. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Караваева К.А., Канева И.М. Характер супрессии фитоалексинообразования при совместимом взаимодействии расы возбудителя фитофтороза у картофеля//Прикл. биохи-

мия и микробиология. 1993, т.29, вып.2, с. 328-332.

67. Озерецковская O.JL, Васюкова Н.И. Новообразование фенолов в поврежденных тканях картофеля//ДАН СССР. 1965, т. 161, № 4, с. 968-970.

68. Орищук Л.Ф. Антибиотические свойства микобактерий и родственных микроорганизмов. Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук.-Киев, 1975.

69. Очеретина О.Ю., Ильинская Л.И., Караваева К.А., Соколовский В.Ю., Озерецковская О.Л. Влияние биогенных индукторов на системы циклических нуклеотидов в клубнях картофеля// Прикл. биохимия и микробиология. 1991, т.27, вып. 6, с. 890-897.

70. Папета Н.Ф. и др. Очистка и характеристика бактериального токсина, ингибирующего рост фитопатогенных грибов// Прикл. биохимия и микробилогия. 1994, т.ЗО, вып. 4-5, с. 593-596.

71. Пашкарь Н.С. Динамика полифенолов в процессе залечивания ран у картофеля//ДАН СССР. 1959, т. 124, N3, С.-715.

72. Перспективные антагонисты для борьбы с послеуборочными гнилями/ Тодираш В.А., Паскарь Р.П., Буйминстру Л.М./ Науч.-прозв. совещ. 24-26 авг. 1994.: Тез. докл. 4.2.- Пущино, 1994.- с. 97.- Рус. ( РЖ Биология, 1995. № 1).

73. Перспективы использования ризосферных микроорганизмов при возделывании сельскохозяйственных культур/ Сидоренко О.Д., Райкова А.Г.// Семин.-совещ. "Экологизация сельскохозяйственного производства Северо-Кавказского региона" 26-29 июля, 1995: Тез. докл.-М., 1995.-с. 200-202.

74. Попова Ж.П., Эськин С.Б., Матисова А.Н. О составе антифунгина-сырца// Бюл. ВНИИ с.-х. микробиологии. 1971, т. 15, № 1, с.79-80.

75. Придагина H.H., Новогрудская Е.Д., Кругляк Е.Б., Чекасина Е.В., Корчак Т.С., Батраков С.Г. Azotobacter chzoococcum- продуцент нового противогрибкового антибиотика// Антибиотики. 1982, № 1, с. 3-6.

76. Проценко М.А. Антагонистические свойства фитопатогенных грибов и

их роль во взаимодействии с растениями-хозяивами// Усп. совр. биологии. 1984, т.98, вып.2., с. 283-291.

77. Процеико М.А., Ладыженская Э.П. Выявление антигена, общего для возбудителя фитофтороза картофеля и растения-хозяина методом двойной иммунодиффузии в гене// Прикл. биохимия и микробиология. 1988, т.24, вып.5, с. 692-698.

78. Райхмист Р.Б. Графики функций.'Справ, пособие, для вузов.-М.гВысшая шк., 1991160с.

79. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука. 1986. 198 с.

80. Рубин Б.А., Будилова С.В. Об изоферментах пероксидазы в клубнях картофеля//ДАН СССР. 1970, т.190, N3, С.-722-724.

81. Рубин Б.А., Хандобина Л.М., Вализнева Т.А. Изменение фенольного комплекса моркови под влиянием заражения Phoma Rostrupii// Доклады Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственной науки имени Ленина. 1972, №4, с. 5-8.

82. Рубин Б.А., Хандобина Л.М., Гераскин Г.В. Изучение изоэнзимного состава полифенолоксидазы моркови в связи с заражением ее Phoma Rostrupii// Научные доклады высшей школы биологических наук. 1971. № 3. с. 78-86.

83. Рубин Б.А., Юрина Е.В. Иммунологический анализ антигенного состава тканей клубней картофеля//ДАН СССР. 1978, t.238,N5, с. 1259-1263.

84. Самородова-Бианки Г.Б., Стрельцина С.А. Исследование биологически активных веществ плодовых культур.- Л.: ВИР. 1989. 82 с.

85. Самородова-Бианки Г.Б., Стрельцина С.А., Басканова Л.Е. Особенности химического состава ягод различных видов жимолости в условиях Ленинградской области// Состояние и перспективы развития редких садовых культур в СССР. Мичуринск, 1989.- с.54-64.

86. Свойства актиномицета Actinomyces flavescens, обуславливающие его фитозащитное действие/ Коломиец Э.И., Здор И.А., Романовская Т.В.//

Холод. 17-19 мая, 1994: Тез. докл.- М., 1994.- с. 51-52.- Рус. ( РЖ Биология, 1994. № 11).

87. Сейков Г.М. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике. Алма-Ата.: Наука. Каз. ССР. 1982,247 с.

88. Серебряная М.З., Бабенко Ю.С. Бактерии рода Achromobacter - стимуляторы роста сельскохозяйственных растений//Всесоюзн. конф. "Микроорганизмы- стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных". Тез. докл. 4.2. Ташкент, 1989,-с. 178.

89. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Буйко О.Н. Влияние ионов железа на антифунгальную активность бактерий рода Pseudomonas// Микробиол. журнал.- 1991. т.53., № 3. с. 80-86.

90. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д. и др. Антибиотическая активность и седерофоры Pseudomonas cepacia// Прикл. биохимия и микробиология. 1990. т.26. № 1, с. 75-80.

91. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.- Киев.: Наукова думка, 1990,- 263 с.

92. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская H.A. Спорообразующие аэробные бактерии- продуценты биологически активных веществ.-Киев.: Наукова думка. 1982.- 278 с.

93. Совершенствование биологического метода защиты растений от болезней с помощью соединений из группы фенилпирролов/ Гаврилов A.A.// 1 Конф. Сев.- Кавказ, региона. "Современные достижения биотехнологии'^ сент., 1995,- Ставрополь, 1995,- с. 18.

94. Соколов М.С., Литвишко Е.Б. Биологическая защита растений в США//Защита растений.- 1993,-№11,-с. 18-20.

95. Соколова В.Е. О роли хлорогеновой кислоты и ее компонентов-, кофейной и хинной кислот в защитных реакциях клубней против Phytophthora infestans// Биохимия плодов и овощей.- М.: Наука. 1964. с. 36-55.

96. Соколова В.Е. Роль некоторых фенольных соединений в защитных ре-

акциях растений против фитопатогенных микроорганизмов// "Фенольные соединения и их биологические функции". Материалы 1-го Всесоюзн. симпозиума по фен. соед. 14-17 дек. 1966. М.; Наука. М: 1968_, с. 269-275.

97. Соколова В.Е. Превращение хлорогеновой кислоты и устойчивость клубней картофеля к фитофторозу// "Биохимия плодов и овощей." сб. 7. М. 1962, с. 96-114.

98. Сравнение эффективности двух препаративных форм ризоплана/ Джа-хипов Ф.С., Корсак И.В., Мироненко Ю.Л., Гурьев М.Д., Митрофанов А.И., Алапыкина В.Н.// Семин.-совещ. "Экологизация сельскохозяйственного производства Сев.- Кавказ региона" 26-29 июля, 1995. Тез. докл.- М. 1995- с. 76-79.

99. Ставская Е.С., Таранова Л.А. и др. Хранение псевдомонад, разлагающих ПАВ// Микробиология. 1990, т.59. вып.1, с. 156-162.

100. Татаринова Н.Т., Гринченко О.С., Варламов В.П., Послехов Г.В., Ва-сикова И.С., Джавахия В.Г. Хинолитический комплекс ферментов Streptomyces Kurssanovii и его использование против возбудителя фу-зариоза пшеницы Fusarium culmorum// Прикл. биохимия и микробиология. 1996, т.32, № 2, с.242-246.

101. Технологическая инструкция (ТИ 9739-005-02068491-95) по производству и длительному хранению картофеля с применением искусственного холода и биологических средств защиты.

102. Третьяков А.П., Щербаков Г.Я., Стирманова Н.И. "Штамм микроми-цета Trichoderma lignorum для производства препаратов против фитопатогенных гр^ибов" МКИ6 А01 63/04, с Л 2, №1/ 14. Патент РФ 2034468 10.05.95. Б.И.№13.

103. Тулемисова К.А. Микробиологические методы защиты растений// Вестн. АН. Каз. ССР. 1990, №6, с.29-36.

104. Тулемисова А.П., Чормонова Н.Т. Поиск актиномицетов-антагонистов возбудителей корневой гнили сахарной свеклы// Антибиотики и химо-

терапия. 1989. т.34. №11. с.816-819.

105. Успанов А.К., Бекмананова Н.Е., Тулемисова К.А. Гриб Trichoderma для получения биопрепаратов против корневых гнилей, чалловых и стеблевых нематод// Микроорганизмы в сельском хозяйстве.Пущино. 1992, с.204-205.

106. Филиппов М.П., Шконенко Г.А. Исследование экстракции пектиновых веществ из плодов растений// Прикл.биохимия и микробиология. 1976, т.ХН. вып.2. с.203-205.

107. Харборн Д. Биохимия фенольных соединений.- М.: Мир., 1968.-452с.

108. Химия антибиотиков/ Шемякин М.М., Хомов A.C., Колосов М.М. и др.: В 2-х т. Т. 1-М., 1961- 774с.

109. Хлопцева Р.И. Биологическая борьба с серой гнилью земляники// Защита растений. 1995; №4. с.-40.

110. Худяков Я.П. Литическое действии почвенных бактерий на паразитные грибы// Микробиология. 1935, т.4, №2,с. 193-198.

111. Худяков Я.П.,Шкляр М.С., Савадеров Е.П. Антибиотик антифунгин, образуемый бактериями рода Pseudomonas// Прикл. биохимия и микробиология. 1965. т. 1, № 12, с. 186-190.

112. Цилосани Г.А., Пантелеев A.A. Действие микробов-антагонистов на фитопатогенные грибы// Защита растений от болезней. Тбилиси, 1987; с.247-259.

113. Чалова Л.И., Авдюшко С.А., Караваева К.А., Юрганова Л.А., Озерецковская О.Л. Активное начало индуктора защитных реакций картофеля//Прикл. биохимия и микробиология. 1988/г. 24, вып.6, с.789-794.

114. Чаленко Г.И. Интенсификация раневых реакций иммунизированных биогенными индукторами клубней картофеля. Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов.М.: Наука. 1990- 182.-е.

115. Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А. Внеклеточная хитиназа Aeromanas liquefaciens// Прикл. биохимия и микробилогия. 1976^.12, вып.2, с. 231242.

116. Шапиро М.С., Трайиииа Г.Г. Лабораторный контроль на предприятиях общественного питания.-М.: Пищевая промышленность. 1962.- 399 с.

117. Шарга Б.М. Микроорганизмы-антагонисты возбудителя бактериального ожога плодовых// Защита растений. 1991. вып.10, с. 15.

118. Шемякина Т.М., Вустин М.М. и др. Новые киллерные токсины, продуцируемые дрожжами Williopsis subsufficiens и Williopsis Beijerincki// Микробиология. 1981. т.60. вып.З. с.501-506.

119. Шенин Ю.Д., Белахов В.В., Рожкова Н.Г. Фунгицидная активность им-брицила и его солей// Антибиотики и химиотерапия. 1996. т.41. №6. с.21-24.

120. Шенин Ю.Д., Кругликова Л.Ф., Васюк Л.Ф., Кожемяков А.П., Чеботарь В.К., Попова Т.А. Новый метаболит с фунгистатической и бакте-риостатической активностью, продуцируемый штаммом Л-30 Flavabacterium spesiesН Антибиотики и химиотерапия. 1996. т.4. №5. с.6-12.

121. Шенин Ю.Д., Кругликова Л.Ф., Калько Г.Н., Новикова H.H. Характеристика алерина В1- основного компонента фунгицидного препарата, продуцируемого штаммом Bacillus subtilis 10-ВИЗР// Антибиотики и химиотерапия. 1995. т.40. №5. с.3-7.

122. Шишкина Н.С. Хранение плодов и овощей в зонах производства.-М.: Агропромиздат. 1991.- 126с.

123. Шлегель Г. Общая микробиология.-М.: Мир., 1987- 567с.

124. Штейнберг М.Е., Завеличко H.A., Ротаренко А.П., Андрокаки Л.С. Gliocladium roceum, Buinier и Gliocladium virens Miller, Giddens et Foster и их микрофильные свойства// Микробиология и фитопатология. 1991. т.25. вып.1. с.34-38.

125. Эффективность биологического метода защиты растений/ Под ред. В.А. Черкасовой./ Кишинев: ВНИИ БМЗР, 1981. -127с.

126. Юрганова Л.А., Ногайделе Д.Е., Чаленко Г.И, Чалова Л.И., Озерец-ковская О.Л. Индуцирующая активность Fusarium culmorum Saee//

Прикл. биохимия и микробилогия. т.25. вып.6, 1989, с.805-810.

127. Юрина Т.П., Ушков A.M., Караваев В.А., Солнцев М.А. Влияние три-хотецина на процесс патогенеза у растений пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины// Физиология растений. 1989. т.36. вып.З. c.5S 1-587.

128. Якимова М.Ф., Присахарь С.И., Апостолов С.Д. Бактерии- стимуляторы роста и развития растений// Всесоюзная конф. "Микроорганизмы-стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных". Тез. Докл. 4.2.,Ташкент- 1989. е.- 234.

129. Alba А.Р.С., De Vay Y.C. Detections of crossreactive antigens between Phy-tophthora infestans ( Mont) De Bary and Solanum species by indirect Enzyme-linked immunosorbent assay// Phytopathology Z. 1985. B112. H2. p.97-104.

130. Andrews J.M., Berbee F.M. et. al. Microbial antagonism to the infected stage of the apple scaf pathogen Venturia indequalis// Phytopathology, 1993.-73.-P.228-234.

131. Antibiotics, bacteriocins and other biological active compounds briefly described// Antibiotics. 1984. Vol.37. №12. P.84-209.

132. Baker R., Elad I., Shen B.-In: Iron Siderophores and Plant Diseases. Plenum Publ. Corp., 1986.- P.77-84

133. Beyer M., Diekmann H.// Appl. Microbiol Biotechnol, 1988. V.23. №2. P.-140-146.

134. Bhatt D.D., Vaughan E.K. Preliminary investigations on biological control of grey mold of strawberries// Plant Deseuse Rep. 962. №46. P.342-345.

135. Brown Y.E., McCornack M.A. Desay caused by Alternaria citri in Florida citrus fruit. Plant Dis. Rep., 1972.-57.-P.909-912.

136. Campbell R. Biological control of soil-borne diseases// Brighton crop prot. conf./ Pests and Diseases. 1990. P.607-615.

137. Cheng X.C., Kihara J., Ying X., Uramoto M., Osuda H.,Kusakore H., Wang В., Kobayachi Y., Ко К., Sama С., Chen Y., Isom O. A new antibi-

otic, taitomycetin// Antibiotics., 1989. Vol.42. №1. P.141-144.

138. Chet I. Mycoparasitism: recounition, phisiology and acology// J. Cell Bioshem. 1989. Vol. 13a, P. 153.

139. Chitinolytic bacteria from airtight stored cereals and from vegetables/ Frandberg E., Schiirees S.// 6th Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME-6 ) Sept.6-11, 1992: Abstr.- Barselona, 1992-P.231.

140. Christensen D. Microorganisms used to fight fruit rot// Science News. 1994. Vol.l45.№23. P.359.

141. Colyer P.D. and Mount M.S. Bacterizabion of potatoes with Pseudomonas putida and its influense on postharvest soft rot discasses//Plant Disease, 1984.-68.-P.703-706.

142. Cook J. Biological control of plant pathogens. Theory to application/Phytopathology. 1985.-75, №l.-P.25-29.

143. Cook R., Weller D. Management of take- all in consecutive crops of wheat or barley.// J. Wiley a sons inc. Innovative approaches to plant disease control.-New-York, 1987.-P.41-76.

144. Davd P.T.// Pesticide. Biochem and physiol. 1988. V.32. P.123.

145. Development of production, formulation and delivery systems/ Hofstein R., Fridlender B.// Crop. Prot. Conf. "Pests and Diseases" Nov. 21-24, 1994. Vo1.3t Farnham, 1994.- P.1273-1280.

146. De Vay J.E., Adler H.E. Antigents common to hosts and parasites// Ann. rev. microbiol. 1976. V.30. P.147-168.

147. Dubos B., Jaillour F. et al. Enploying antagonistis properlies of Fricho-derma against B. cinerea in the protestion of vineyards against grey mold// Phytopathology. 1982.-10.- P.134-137.

148. Elad Y., Chet I., Henis Y.// Can. J. Microbiol. 1982. V.28. №7. P.719-725.

149. Ghisalberty E.H., Chet I., Sivasithamparam K. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma Spp.// Soil Biol Biochem. 1991. №11. P.1011-1020.

150. Glick B., Karaturovic D., Newell P.A. Novel procedure for rapid isolations of plant growth promotin Pseudomonas// Can. J. Microbiol. 1995. Vol.41.

№6. Р.533-536.

151. Glodowski W., Galsky A.// Plant Phusiol, 1978. Vol.61. P. 1031.

152. Goldstein R.M., Mallory L.M., Alexander M.// Appl, Environm. 1985. Vol.50. P.1997.

153. Gutterson N. Microbial fungicides: resent approches to elusidating mechanisms// CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1990, Vol.10. №1. P.69-91.

154. Hayashida S., Choi., Nanri N., Jokojama M., Uematsu T. Control of common seal with an antibiotic biofertilizez produced fro swine feces contaning Stroptomyces albidoflavces//Arg. Biol. Chem. 1989. Vol.53. №2. P.349-354.

155. Howell C., StipanovicR. Control of Rhizoctonia Solani on cotton seedlings with an antibiotic produced by the bacterium// Phytopathology. 1979. Vol.69. №5. P.480-482.

156. Howell C., Stipanovic R. Suppression of pythium ultimum induced damping — off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic, pyoluteorin// Ibid. 1980. Vol.70. №8. P.712-715.

157. Htay K., Kerr A.// Appl. Bacteriol. 1974. Vol.37. P.525.

158. Janisiewiez W.J. Postharvest Biological Control of Blue Mold on apples// Phytopatology. 1987-77. №3. P.481-485.

159. Janisiewiez W.J. Biocontrol of postharvest diseases of apples with antagonist mixture//Phytopatology. 1988.-78. №2. P. 194-198.

160. Janisiewiez W.J., Roitman J. Biological Control of Blue Mold and Grey Mold in apple and pear with Pseudomonas cepacia/ZPhytopatology. 1988.78. №16. P.1697-1700.

161. Janisiewiez W.J., Wilson C.L. Natural agents fight fruit spoilage. Agricaltiral Research. 1990.-№4. P.15-17.

162. Jarosz J., Lipa S. "Bioprepatat to ochrony roslin" MKU6 A 01 №63.00, A 01 №65/00 Патент Польша 167237 31.08.95. PI. №289793.

163. Layaswal R.K., Fermandez M.A., Sehroeder R.G. Isolation and characterization of a Peudomonas Strain that restricts growht of various phytopa-thologenic fungi.//Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol.56. 0.1053-1058.

164. Johnson L.A., Schal. Am. Potato S., 34№7. 207 (1957).

165. Kashyap U. Biological control of some fungal disease of tomatoes by phyl-losphere microorganism.// Ind. Mycol. Plant Pathol. 1978. Vol.8. №1.P.37.

166. Keuken O., Sikova R. Biological control of the root-knot nematode Meloi-dogyne incognita with the Rhisobacteria Bacillus subtilis and bacterial production of toxic metabolites: Avstr. 22nd. Int. Symp. Eur. Soc. Nematol/ Aug. 7-12. 1994// Nematoloyica/ 1995. Vol.41. №3. P.315.

167. Kijima Т., Tezuka Т., Doi Y., Yanashita S., Nemba S., Arie Т. Pseudomonas gladili and a process for biologically controling Fusarium diseases using Pseudomonas gladioly P.V. gladioly.// Hon. Патент №4880745. 1989.

168. Kobinata K., Kusakabe H. A new antibiotic, RK-699A.// Antibiotics. 1989. Vol.42. №8. P.1312-1324.

169. Klopper J.W., Schorth M.N. Effects of rhizoshere colonization by plant growh- promotinyzhizobacteria on potato plant development and yield. Phytopathology. 1980.-70. P. 1078-1082.

170. Klopper J.,Schrath M. Pseudomonas siderophores: a mechanism explaning diseas- seeppressive soils.// Phitopathology. 1981. Vol.71. №2. P.232.

171. Lim Т., Robrback К. Rote of Penicillium Funiculosum strains in the develipment of peneaple fruit diseases.// Phytophatology. 1980. №70. P.663-665.

172. Lorito M., Hayes L., Di P., Woo S., Harman G. Purification, characterization and synergistic activity of a glucan 1,3-ß-glucosidase and an N-acetyl-ß-glucosaminidase from Tricoderma harrianum.// Phytopathology. 1994. Vol.84. №4. P.398-405.

173. Manibhushan K., Srenivasap-rusad S., Baby U., Joe I. Susuptibility of rice sheath bleght pathogen to my coparaites./ Curr. Sei. (India) 1984. Vol.58.№9. P.575-578.

174. Matteson M., Burr Т., Smith C., Corrad-greia M. Isolation, selection and screening of bacteria as potential biological control agents for Venturia in-aegualis.// Ibit. 1994. Vol8. №5. P.545.

175. McGuire K., Hagenmaler K. Storage waxes thet support growth of Candida oleophila for biocontrol Pénicillium digitatum on citrus. Abstr. APS Annu. Meet. Aug.-12-16. 1995.// Ibit. 1995. Vol.85. №10. P. 1166.

176. Microorganisms for biological control of plant.// Eur. Biotechnol. Newslett. 1995. №208. P.6-7.

177. Misaghi I., Stowell L., Gogan R., Spearman L. Fungistatic activity of water-soluble fluorescent pigments of fluorescent Pseudomonas.// Phytopathology. 1982. Vol.72. №1. P.33-36.

178. Morris R.O.//Ann. Rev. Plant. Physol. 1986. Vol.37. P.509.

179. Mukhopadhyay A.N.// Indian. J. Mycol and Plant Patrol. 1987. Vol.17. №1. P.l-X.

180. Nair M., Chandra A., Thorogood D., Ammermann E., Walker N., Kiehs K. Gopalamicin, an antifungal macrodiolide produced by soil actinomycetes.// Agricaltirul and food Chemistry. 994. Vol.42. №10. P.2308-2310.

181. Neilands J.B., Peterson T., Leong J. High- affinity iron transport in microorganisms.// Iron III coordination compoundsof the siderophores agrobac-tin and parabactin. Symp. Ser. 1980.- 140.- P.263-278.

182. Neilands S., Valenta J. Iron-contaning antibiotics.// Met. Jons. Biol. Syst.-1985. №19. P.313-333.

183. Neugebauer E., Gamache B., Dery C.V., Brzezinski R.// Microbiol. 1991/ Vol.156. №3.P.192-197.

184. Nitrogen-fixing rhisobacteria. Fungistatic mode of action./ Tchebotar V.K., Popova T.A., Vassiuk L.F., Kozhemyakov A.P., Puchaev R.V., Okazova A.G.// 10th Inter. Cong, on Ntrogen Fixation May 28-june 3., 1995.- Dor-drescht. Boston. London. 1995. P.778.

185. Okazaki K., Tagawa K.//J Ferment Bioeny. 1991. Vol.71. №4. P.273-241.

186. Osman A.R., Fahim N.N. Add.-El- Kader M.M. Biological control of Lupin wilt.// Egipt J. Phytopathol. 1986. Vol.18. №1. P. 11-25.

187. Palmerley R.A., Callow J.A. Common antigents in extracts of P. Inf. and potatoes.//Physiol plant pathol. 1978. Vol.12. №2. P.241-248.

188. Parke S. "Biological iniculant effective against Aphanomices" MKU5 С12. №1/20. Патент США. 5244768.

189. Patil I.S., Srikant К., Hegde K.K. Antagonistic action of species of Tricho-derma, Bacillus and Streptomyces on Drechslera sorociniana (Sacc) Subram// Pesticides. 1987. Vol.21. №21. P.22.

190. Priest F.G. Product and applications.//Bacccillus N.Y.,L., 1989. P.293-320.

191. Pusey P.L., Wilson C.L., et al. Compatility of B. Subtilis for Postharvest control of peach brown rot with Commercial Fruit Waxes. Dicloranand Cold-storage cenditions. Plant Deseas, 1986.- 70. №6. P.587-592.

192. Pusey P.L., Wilson C.L. Control of brown rot with a bacillus bacterium Phytopathology. 1983.-83. P.823.

193. Pusey P.L., Wilson C.L. Effect of bacterial ntagonists fungal rots of de-siduons fruit. Phytopathology. 1982.-72.- P.710.

194. Pusztai A.// Acta Biochem Bophys Humg. 1987. Vol.22. №4. P.355-375.

195. Renwick A., Powell K., De Bruyen E., Irearbe V. Biological control of soil-born plant pathogens.// Brighton crop. prot. cont./ Pests, and Diseases. 1990. P.227-231.

196. Saito H. et al. Smegmatocin (mycobacteriocin) from Mycobacterium smeg-matis (ATCC 14468).//Bacteriology. 1983. Vol.153. P.1294-1300.

197. Scumbaum A., Mauch F., Vogeli U. et al..// Nature. 1986. Vol.24. №6095. P.365-367.

198. Sneh В., Dubler M., Elad J. Chlamydospore germination F. oxysporum F. sp. cucumerinomas affected by fluorescent and lytic bacteria from a F. sup-presive soil. Phytopathology. 1984.-74.- P. 1115-1124.

199. Stowell L., Staghellini M., Misaghi I. The bacteriostatic activity of fluorescent pigment on Pseudomonas Fluorescens.// Phytopathology. 1981. Vol.71. №8. P.906.

200. Studies on ecological and physiological characterictics of yeald increasing bacteria (YIB) in relation to plant health./ Ji P., Vti R., Chen В.// 6th Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME-6) Sept.6-11, 1992: Abstr.-Barcelona. 1992-

P.89.

201. Suslow T.V., Schroth M.N. Rhizobacteria of sugar buts: effect of seed application and root colonization on yield. Phytopathology, 1982^72,2«P. 199-206.

202. Tahvonen K., Avikainen H. The biological control of seed- borne alternaria brassiciola of cruciferous plants with a powdery preparation of streptomyces Sp.//J. Agr. Sci, Finl. 1987. Vol.59. №3. P. 119-208.

203. Tapio E., Pohto-lahdenpera A. Interaction mellan antagonister och patho-gensa svampar.// Vaxtskuddsnotiser. 1989. Vol.53. №1-2. P. 12-18.

204. Tasca G.H., Bogoescu M. Lucr sti. Inst, ceresi protect valorific si und legum. si. fruct, 1990-20.-i P.53-64.

205. The defermination of the mechanisms of bacterial biological control of fusarium dry rot./ Chase M., Bochm M., Schisler D.// 88th Annu. Meet, stafe Acad. Sci. "Sustaing Planet Earth" Oct. 6-7. 1995. Abstr> Trans, state. Acad. Sci, 1995.-88., Suppl. P.63.

206. The effectiveness of preparations of associative nitrogen- fixing bacteria on potato.// Lukin S.M., Simakov G.V., Morosov A.M.// 10th Inter. Cong, on Nitrogen Fixation. May 28-june 3. 1995.- Dordrescht, Boston, London. 1995.-P.768.

207. The yeast Hansenula anomala inhibits the growth of grain storage molds./ Schnurer S., Bjonberg A., Prothon F.// 5th Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME) Sept. 6-11. 1992: Abstr.- Barseloma. 1992. P. 127.

208. Thomashow L., Weller D. Role of a phenozine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gacumannomyces graminis var. tritici.// S. Bacteriol. 1998. Vol.170. №8. P.3499-3508.

209. Tronsmo A., Ystaas J. Biological control of Botrits cinirea an apple. Plant. Dis. 1980. 6U. 1009.

210. Tronsmo A., Dennis C. Effect of temperatine on antagonists properties of Tricoderma species. Trans. 6r. Mycol. Sac., 1978-3.- P.469-479.

211. Vanderberg P., Gonzales C., Wright A., Kunku B. Iron -Chelating compounds prodused by soil Pseudomonas: Correlation with fungal growth in-

hibition.// Appl. and Environ. Microbiol. 1983. Vol.46. №1. P. 128-132.

212. Vidaver A.K. Bactericens: The and the reaite. Plant. Dis., 1983.-67. №5.-P.478-475.

213. Wilson C.L., Franklin J.D., et al. Biological control of Rhizopus rot of peach with Enterobacter cloacue. Phytopathology. 1987-77., №2.- P.303-308.

214. Wilson C.L., Franklin J.D. FRUit volatiles inhibitory to Monilia fructicola and B. cinerea. Plant. Disease. 1986.-71. №4.- P.316-321.

215. Wilkeman G. Iron complex product Siderophores. Biotechnology. 1897.-8.-P.216-242.

216. Wilson C. Managing the microflora of harvested fruits and vegetables to en-hanse resestacs.// Ibit. 1984. Vol.79. №12. P.1387-1393.

217. Wit P.I.G.M.// Biology and molucalar biology of plant- pathology interactions./ Ed.j.A., Baily. Berlin: Springer.- Verlay. 1986. P.149-170.

218. Zhand L., Hizai M., Shoda H.// S. Ferm. Bioeng. 1991. Vol.72. P.392.

219. Zhand L., Hizai M., Shoda H.// Ferm. Bioeng. 1992. Vol.74. P. 174.

159