Замедленная флуоресценция водоросли хлорелла в оценке иммунитета клубней картофеля тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Прокушкин, Анатолий Станиславович

• Прокушкин, Анатолий Станиславович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Прокушкин, Анатолий Станиславович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. Физиолого-биохимические механизмы устойчивости

растений к фитопатогенам

1.1. Особенности физиолого-биохимических механизмов покоя клубней картофеля

1.2. Механизмы иммунитета картофеля Solanum tuberosum L

1.3. Механизмы действия защитных веществ растений

1.4. Методы оценки сортов картофеля на устойчивость к болезням

ГЛАВА 2. Замедленная флуоресценция хлорофлла в оценке физиологического состояния и действия различных веществ на

растения

2.1. Современные представления о механизме ЗФ

2.2. Использование ЗФ в целях биологического тестирования 33 ГЛАВА 3. Объект и методы исследования

3.1. Объект исследований: картофель Solanum tuberosum L

3.2. Тест-организм: микроводоросль Chlorella vulgaris Beijer

3.3. Методы исследований 40 ГЛАВА 4. Зависимость интенсивности замедленной флуоресценции от

условий ее измерения и параметров тест-культуры водоросли

4.1. Зависимость показателей ЗФ в от плотности суспензии водоросли

4.2. Влияние времени экспозиции и условий освещения на выход ЗФ

4.3. Роль интенсивности возбуждающего света

4.4. Нормирование чувствительности тест-организма при помощи контрольного токсиканта

4.5. Влияние физико-химических параметров тестируемых сред

?

ГЛАВА 5. Сортовые особенности действия клеточного сока клубней

картофеля на тест-организм

5.1. Сортовая специфичность действия гомогенатов клубней картофеля на замедленную флуоресценцию хлорофилла водоросли хлорелла

5.2. Особенности фитотоксичекого действия клеточного сока клубней

ГЛАВА 6. Роль "вторичных метаболитов" тканей клубней картофеля в

формировании фитотоксического эффекта

6.1. Характеристика фитотоксических веществ тканей клубней картофеля и их роль в устойчивости к патогенам

6.1.1. Фенольные соединения и их роль в устойчивости и фитотоксических эффектах

6.1.2. Роль продуктов окисления ФС в защитных реакциях картофеля

6.2. Роль гликоалкалоидов в фитотоксической реакции

6.3. Оценка влияния постинфекционных факторов устойчивости 92 ГЛАВА 7. Устойчивость сортов картофеля по отношению к фитофторе 100 ВЫВОДЫ 106 ЛИТЕРАТУРА 108 Приложения

з

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Замедленная флуоресценция водоросли хлорелла в оценке иммунитета клубней картофеля»

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важнейших составляющих решения проблемы борьбы с поражением культурных растений микроорганизмами и другими паразитами является постижение механизмов химической устойчивости растений к болезням (Харборн, 1985; Остроумов, 1986). Главную роль среди веществ ответственных за формирование фитоиммунитета играют соединения "вторичного метаболизма", несущие помимо этого и иные функции, которые до сих пор интенсивно изучаются. Важно отметить, что набор защитных механизмов разных видов растений строго специфичен. Среди веществ фитоиммунитета существенный интерес проявляется к таким соединениям, как фенольные вещества, алкалоиды, терпеноиды и т.д (Запрометов, 1993; Lyon, 1998; Partridge, 1998). Подавляющее большинство исследований показывает, что в связи с широким использованием защитных веществ в других физиологических реакциях их действие неспецифично и оказывает воздействие на фитопатогены и прочие микроорганизмы, обеспечивая барьер на пути инвазии (Горленко, 1973; Гусев, Метлицкий, 1982; Сердюков и др., 1984). В то же время обнаружено, что посредством этих веществ растения влияют и друг на друга в аллелопатических взаимодействиях и сдерживают атаки фитофагов (Райе, 1978; Гродзинский и др., 1987 и т.д.).

Отдельной проблемой выносится потеря устойчивости селекционными сортами, которая заключается, как правило, в изменении физиологических и биохимических свойств патогенов и возникновении рас паразитов, преодолевших устойчивость растения (Сердюков, 1984). В селекционной практике известно, что вновь создаваемые устойчивые сорта растений требуют постоянного контроля и регулярной смены (Писарев, Трофимец, 1982; Росс, 1989). Здесь же можно выделить, что сорт как генетически обусловленная совокупность потенциальных

свойств растения реализует их в зависимости от конкретных экологических условий, в которых оно развивается. Т.е. компоненты генотипа проявляются лишь в определенных условиях среды и могут значительно варьировать из года в год (Котова, 1990).

В связи с этим представляется важным поиск методов, позволяющих качественно отбирать сорта и отдельные растения, обладающие высокой устойчивостью к фитопатогенам и хорошей лёжкостью клубней характерных для каждого отдельного года. В то же время неспецифические механизмы действия защитных соединений, которые характеризуют фитоиммунные реакции, позволяют предположить, что в систему оценки устойчивости сортов можно вводить не только специфические фитопатогенные микроорганизмы, но и иные способные реагировать в ответ на присутствие этих веществ в тест-среде. Исключение составляют системы распознавания и формирования реакций сверхчувствительности (СВЧ), которые запускаются, согласно последним исследованиям, при контактах уже тесно связанных фитопатогенов и растений-хозяев. В то же время вещества, играющие важную роль в создании устойчивости, и в частности в СВЧ, как показано в ряде обзорных работ, имеют определенный набор сайтов. Среди них можно выделить мембраны, процессы фотосинтеза, дыхания, в том числе электрон-транспортные цепи, и ряд других (Dix, 1979; Татаринцев и др., 1984; Рощина, Рощина, 1989; Anderson, 1991; Appel, 1992).

В связи с этим можно считать оправданным использования одного из широко применяемых в биотестировании объектов - одноклеточных зелёных водорослей, и в частности Chlorella vulgaris, в качестве тест-организма защитного потенциала растений к фитопатогенам. В настоящее время в исследованиях физиологического состояния и стрессовых реакций растений широко применяются методы, основанные на

измерении и анализе замедленной флуоресценции хлорофилла (ЗФ) (Гольд и др., 1984; Renger, Schreiber, 1986; Веселовский, Веселова, 1990).

Выбор клубней картофеля Solanum tuberosum в качестве объекта исследований обусловлен важностью этой сельскохозяйственной культуры, а также соображениями доступности и легкости его подготовки к исследованиям.

На основании всего вышеизложенного нам представляется перспективным оценить защитный потенциал клубней картофеля с помощью регистрации действия их гомогенатов на показатели замедленной флуоресценции хлорофилла водоросли хлорелла. Благодаря введению нового относительного показателя ЗФ (Grigoriev et al., 1995; 1997; Григорьев, Бучельников, 1997), разработанного в нашей лаборатории, не зависящего от мутности изучаемого раствора, появилась возможность оценки интегральной фитотоксичности сока клубней.

В связи с этим, данная работа посвящена изучению влияния компонентов клеточного сока клубней ряда сортов и их гибридных линий на выход замедленной флуоресценции хлорофилла водоросли хлорелла в зависимости от состояния тест-организма, интенсивности возбуждающего света, состава тест-среды и др. с целью:

1) выявления природы факторов, ответственных за формирование фитотоксического эффекта сока клубней картофеля;

2) изучения механизмов действия защитных соединений, характерных для клубней картофеля;

3) определения возможности оперативной оценки устойчивости клубней разных сортов картофеля к фитопатогенам;

4) выработки рекомендаций по использованию ЗФ для оценки иммунного потенциала клубней картофеля.

Работа выполнялась на кафедре экологии Красноярского государственного университета под руководством к.б.н., профессора КрасГУ Ю.С.Григорьева в период с 1994-98 гг. Исследования по теме работы были поддержаны следующими грантами: грант Красноярского краевого Фонда науки (4Б0294, 1995г.), грант по программе МНТК "Биотехнология" (1994-1997 гг.), стипендиями молодых ученых Красноярского краевого фонда науки (1996-97).

В заключение выражаю свою искреннюю благодарность моему руководителю кандидату биологических наук, профессору КрасГУ Ю.С. Григорьеву за руководство и помощь в проведении работы, а также в целом всем сотрудникам кафедры экологии. Особую признательность выражаю И.С. Кравчуку и Н. Прокопьеву за неоценимый вклад в осуществление проведенных исследований и их оформление.

ГЛАВА 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ФИТОПАТОГЕНАМ.

Существование огромного числа фитопатогенных микроорганизмов не ограничивает жизненность высших растений и их фитоиммунитет является скорее правилом, а восприимчивость - исключением (Горленко, 1973; Харборн, 1985; Телитченко, Остроумов, 1991). Отмечается, что из большого разнообразия паразитарных микроорганизмов, способных проникать в растение, каждый вид поражается лишь относительно небольшим их числом, по отношению же ко всем остальным растение обладает так называемым видовым иммунитетом (Метлицкий, 1976, 1982 и др.).

Следует однако заметить, что до последнего времени значительное внимание специалистов было сосредоточено лишь на изучении биохимической природы сортовой устойчивости, т.е. устойчивости к фитопатогенам, которые в ходе эволюции сумели преодолеть видовой иммунитет и стали грозными врагами культурных растений. Между тем, как отмечается в (Метлицкий, 1976; Росс, 1989; Lyon, 1998), исследование биохимических механизмов видового иммунитета и их своевременная оценка должны способствовать выявлению устойчивости растения в целом.

1.1. Особенности физиолого-биохимических механизмов покоя клубней

картофеля

Проблеме изучения физиологии и биохимии такой важной сельскохозяйственной культуры как картофель посвящено значительное количество монографий и обзорных статей (Вечер, Гончарик, 1973, Метлицкий, 1976 и др.).

Покой клубней картофеля, подобно состоянию покоя практически всех видов сосудистых растений, разделяется на два отчетливо наблюдаемых периода: естественный (глубокий) и вынужденный (Гусев, 1982). Различия между ними можно кратко охарактеризовать способностью выхода из него при благоприятных внешних условиях (Кораблева, 1990).

Известно, что степень устойчивости растений к фитопатогенам тесно связывают с физиологическим состоянием их тканей и органов и, в частности, с эндогенным ритмом процессов роста (Метлицкий и др., 1969; Барская и др., 1972; Вечер, Гончарик, 1973). Как правило, молодые, активно растущие растения обладают гораздо менее высокой устойчивостью к болезням, чем уже сформировавшиеся (Барская и др., 1972; Бейли, 1985). Клубни картофеля (строение клубня приведено на Рис. 1) также более устойчивы к патогенам в состоянии глубокого покоя, когда подавлен рост меристематических тканей - "глазков". Однако состояние покоя свойственно не всему клубню, а лишь его меристеме. Паренхимные ткани покоящихся клубней находятся в состоянии активной жизнедеятельности, о чем, в частности, свидетельствует их более активная реакция на поранение (образование раневой перидермы, биосинтез крахмала, фенолов и др.) по сравнению с клубнями, вышедшими из покоя (Гусев, Метлицкий, 1982).

Продолжительность периода покоя клубней картофеля является генетическим признаком сорта, а также зависит от условий внешней среды, при которых происходит формирование клубней и последующее их хранение (Метлицкий, 1972; Muller., Borger, 1981; Росс, 1989).

Во время покоя, как показано в работах (Метлицкий, 1976; Рубин, Аксенова, 1976; Озерецковская, 1990; Appel, 1991; Lyon, 1998; Partridge, 1998), блокируется ряд биохимических процессов, сопровождающих

0 2,5 мм

0 50 мм

Рис. 1. Схематическое строение клубня картофеля. 1а - эпидермис с отдельными участками перидермы; 16 - перидерма; 2 - кора; 3 - наружняя флоэма; 4 - ксилема; 5 - внутренняя флоэма; 6 - сердцевина. Вверху диаграмма, характеризующая соотношение отдельных тканей клубня в радиальном направлении (Гусев, Метлицкий, 1982).

нормальный рост клеток. Это происходит благодаря действию эндогенных ингибиторов роста, среди которых обнаружены фенольные соединения (ФС) - хлорогеновая и кофейная кислоты, скополетин и соединение терпеноидной природы - абсцизовая кислота (Метлицкий и др., 1969, 1972; Rhodes, 1979). Так, во время глубокого покоя в тканях клубней картофеля накапливаются скополетин и кофейная кислота, содержание которых в момент выхода из покоя уменьшается (Кораблева и др., 1969; Кораблева и др., 1990). Оба этих соединения в период глубокого покоя подавляют рост растительной ткани и спор

микроорганизмов (Запрометов, 1988; 1993; Рощина, Рощина, 1989). В этот период происходит также и падение общего содержания ФС в клубнях (рис. 2). Помимо этого имеет место и тканеспецифичность содержания этих соединений (рис. 3).

Механизм действия природных ингибиторов роста связан с угнетением процесса окислительного фосфорилирования, что приводит к обеднению клетки макроэргическими соединениями, а также со стимуляцией дыхания и инактивацией ИУК (Кораблева, 1990).

Кроме того, различные полифенолы инактивируют ферменты углеводного обмена и вызывают изменения в азотном и фосфорном обмене (Lyon, 1998). Как показывают исследования, окончание покоя клубней характеризуется началом синтеза нуклеиновых кислот (Кораблева и др., 1969; Метлицкий, Озерецковская, 1973; Lyon, 1998), репрессия которого в период глубокого покоя происходит под действием фенольных ингибиторов роста (Кораблева и др., 1972).

14 т

з 12

i-Q

^ « • 1П

е * s 10

§ I 3

Э § 8 -1

S S

Си О

<и Он 2 6

st о я °

о е

о я

53 4

0

+

+

УШ IX X XI ХП I П Ш IV V VI Месяцы определения

Рис. 2. Общее содержание ФС в клубнях картофеля сорта Любимец в период покоя (Васюкова, Метлицкий, 1969).

2

У меристем хранящихся клубней картофеля существует

определенный ритм активности окислительных ферментов. Их

активность падает по мере прохождения глубокого покоя (сентябрь-

январь) и повышается в период подготовки к прорастанию (февраль-

апрель) (Васюкова, Метлицкий, 1969). В паренхиме клубней активность

этих ферментов почти не меняется (Метлицкий, 1972; Кораблева, 1990).

0,8 у —кожура

мякоть

VIII IX X XI XII I II III IV Месяцы определения

V VI

Рис. 3. Общее содержание ФС в разных тканях клубней картофеля сорта Любимец (Васюкова, Метлицкий, 1969).

С окончанием глубокого покоя и прорастания клубней в запасающей паренхиме преобладают реакции гидролиза, в результате которых растущие ткани снабжаются легкорастворимыми и физиологически активными веществами (Muller, Borger, 1981; Смит, 1985; Озерецковская, 1990). В этот период ткани клубней значительно менее устойчивы к заражению фитопатогенами (Смит, 1985; Ingham, 1976). Это было показано при изучении устойчивости клубней к совместимым расам Phytophtora infestans (Mont) de Вагу (Метлицкий, 1972; 1973; Вечер, Гончарик, 1973; Кораблева, 1990).

1.2. Механизмы иммунитета картофеля Solanum tuberosum L.

Принято считать (Горленко, 1973; Вечер, Гончарик, 1973; Котова, 1990), что если при видовом иммунитете устойчивость растений к паразитарным микроорганизмам является абсолютной, то при сортовом иммунитете защитные силы растений более ограничены. Так один сорт будучи устойчивым к одной расе паразита может поражаться другой (Ащайе, Дьяков, 1976; Озерецковская и др., 1994). Это происходит вследствие того, что каждый ген устойчивости ответственен за невосприимчивость растения не вообще к возбудителю болезни, грибу, бактерии или вирусу, а лишь к отдельным его разновидностям. В то же время, большинство патогенных микроорганизмов представляют собой популяции, состоящие из нескольких физиологических рас, иногда значительно различающихся по вирулентности (Горленко, 1973; Росс, 1985; Котова, 1990).

Изучение устойчивости картофеля к разным расам фитофторы показало, что она контролируется соответствующими генами устойчивости (R-генами) (Ащайе, Дьяков, 1976). Количество этих генов обуславливает устойчивость к тому или иному числу рас патогена (Метлицкий, 1976). Эти данные в полной мере соответствуют концепции Флора "ген на ген" (Thompson and Burdon, 1992), согласно которой каждому гену устойчивости растения (R-гену) комплементарен соответствующий ген вирулентности патогена (Метлицкий и др., 1969; 1972; 1976; Озерецковская, 1990).

Однако на практике наряду с устойчивостью, обусловленной R-генами, особенно в последнее время в связи с повсеместным распространением высоковирулентных рас гриба фитофторы (Котова, 1990), большое значение имеет полевая, или полигенная устойчивость, направленная не против каких-то определенных конкретных рас или

видов фитопатогеииых микроорганизмов, а против всех одновременно. В этом случае предполагается не полная несовместимость, а лишь относительная устойчивость. В работах (Гусев, Метлицкий, 1982; Росс, 1985) показано, что при полевой устойчивости поражение происходит медленнее, спорообразование растягивается и тем самым ослабляется угроза возникновения эпифитотий (Котова, 1990).

Отмечается также, что клубни картофеля всех сортов по отношению к специфическим болезням, поражающим их во время хранения, обладают лишь относительной устойчивостью (Кораблева и др., 1980; Писарев, Трофимец, 1982; Гусев, Метлицкий, 1982; Сердюков, Писарев, Старцева, 1984). Но по степени устойчивости различные сорта настолько различны между собой, что без учета этого невозможно организовать квалифицированного их хранения (Попкова, Шнайдер, 1978; Котова, 1990).

Согласно современным представлениям, все защитные механизмы растений, в том числе клубней картофеля, по отношению к фитопатогенам можно схематически представить в виде четырех обособленных групп (Гусев, Метлицкий, 1982; Харборн, 1985; Телитченко, Остроумов, 1990).

1. физиологическая резистентность - патоген лишен возможности контакта;

2. конституционные защитные вещества - стероидные гликоалкалоиды и ФС (табл. 1);

3. продукты превращения конституционных веществ;

4. синтез фитоалексинов (табл. 2) и лишение паразита жизненно-важных метаболитов.

Эта схема, как и любая другая, является условной (Метлицкий, 1976; Горленко, 1973; Гусев, Метлицкий, 1982), т.к. не всегда удается

провести резкую границу между продуктами превращения конституционных веществ и вновь образующимися фитоалексинами.

Однако немаловажен факт взаимодействия защитных механизмов. Наиболее четко он прослеживается на примере специфической для растительного мира реакции сверхчувствительности (СВЧ), которая является важным фактором видового иммунитета и сортовой устойчивости (Метлицкий, 1976; Рубин, Арциховская, 1982 и т.д.). Механизм СВЧ достаточно сложен и многостадиен. Общим результатом его служит гибель патогена вследствие отравления либо недостатка необходимых метаболитов. Одна из важнейших ступеней СВЧ - это некротизация ткани, прилегающей к месту проникновения фитопатогена. Исследования этого процесса обнаружили обратную зависимость между устойчивостью и количеством некротизирующихся клеток (Максимова и ДР-, 1996).

Таблица 1

Содержание ФС в интактных и пораженных тканях клубней картофеля, мкг/г сырой ткани (Гусев, Метлицкий, 1982).

Хлорогеновая кислота Кофейная кислота

Интактная паренхима Раневая перидерма Прираневая ткань Некротизированная ткань, несовместимая раса Ткань, прилегающая к некротизированной Зараженная ткань, совместимая раса Ткань, прилегающая к зараженной

30 Следы

80 11,5

112 Следы

49 7,5

97 Следы

37 Следы

52 0

Механизм развития СВЧ достаточно серьезно изучен (Метлицкий, 1976; Рощина, Рощина, 1985; Darvill, Albersheim, 1984; Partridge, 1997 и др.), однако вещества участвующие в нем до сих пор активно обсуждаются. Одни авторы (Метлицкий, 1976; Lyon, 1997, Partridge, 1997) решающую роль отводят фитоалексинам, тогда как другие - ФС и системе полифенол-полифенолоксидаза (Платонова и др., 1972; Ingham, 1976; Appel, 1992; Appel, Shultz, 1992), а также гликоалкалоидам (Озерецковская и др., 1969). Тем не менее, касаясь роли ФС в формировании устойчивости к фитопатогенам, отметим, что большинство авторов (Метлицкий, 1976; Гусев, Метлицкий, 1982) склонны считать накопление полифенолов в интактных тканях, а также активизирование процессов их ферментативного окисления в ответ на поражение более или менее универсальным фактором горизонтальной устойчивости.

Таблица 2

Содержание ФА в ответ на инфицирование фитофторой в тканях клубней картофеля разных сортов, в мкг/г сырой ткани (Гусев, Метлицкий, 1982).

Ришитин Любимин

Устойчивые сорта:

Любимец 105 97

Красноуфимский 105 120

Темп 92 140

Детскосельский 89 100 Восприимчивые сорта:

Северная роза 15 18

Приекульский ранний 22 13

В заключение следует указать, что к наиболее вредоносным заболеваниям картофеля относят фитофтороз, раннюю сухую

пятнистость, мокрые и сухие гнили и паршу (Дорожкин, Ремнева, 1976; Новотельнова и др., 1979; Дьяков, 1983; Котова, 1990; Васюкова, Озерецковская, 1991). Больше всего изучены механизмы устойчивости картофеля к фитофторозу, который вызывается грибом Phytophtora infestans и является одной из самых опасных болезней, поражающих эту сельскохозяйственную культуру как в процессе вегетации, так и хранения. Несмотря на разработанные меры борьбы с фитофторозом, эта болезнь до сих пор причиняет значительный ущерб урожаю картофеля (Ащайе, Дьяков, 1976; Гусев, Метлицкий, 1982; Озерецковская, 1990 и т.д.). В связи с этим оценка устойчивости согласно принятым тестам была проведена на расе гриба, выделенного из пораженных клубней картофеля сорта Бронницкий (см. Главу 3).

1.3. Механизмы действия защитных веществ растений

Преинфекционные (конституционные) соединения - это в большинстве своем вещества относимые ко "вторичному" метаболизму, среди которых соединения фенольной природы занимают важное место. Мишенями действия этих веществ служат процессы роста, деления и элонгации клеток, клеточные мембраны, энергетические и метаболические реакции. Отмечается, что характер действия фенольных соединений (ФС) определяется расположением гидроксильных групп в бензольном кольце, m-фенолы способны стимулировать, а о- и р-фенолы -ингибировать ростовые процессы (Рощина и др., 1985; Рощина, Рощина, 1989; Rhodes, 1979). Мишенью действия фенолов является фермент РНК-полимераза на этапе транскрипции. Установлено, что резорцин стимулирует, а пирокатехин ингибирует синтез РНК. Джорджевич с соавт. (1987) показали, что фенолы, экскретируемые корнями Trifolium repens, способны в значительной мере менять транскрипционную

активность гена, ответственного за образование клубеньков Rhizobium trifolii. Входящие в состав экскрета гидроксилированные флавоны (наиболее сильно 7,4-дигидроксифлавон) стимулируют транскрипцию этого гена в низкой концентрации (5x10" М). И, напротив, такие соединения, как кумарин, умбеллиферон и изофлавон препятствуют этой индукции.

Относительно действия ФС на ростовые функции следует особо подчеркнуть, что биологические тесты, часто используемые для оценки активности экстрактов изучаемых растений, показывают ростовую реакцию при относительно высоких концентрациях метаболитов, которые редко встречаются в интактных растениях (Рощина, 1973; Прокушкин, Григорьев, 1996). Поэтому при всей простоте и доступности метода ростовых биотестов он имеет существенные ограничения при его использовании для изучения механизмов действия.

В случае, если действие преинфекционных факторов превышает известный предел, то в клетках наблюдается не только остановка роста, но и ингибирование важнейших физиологических функций, в конечном итоге приводящих к деструктивным изменениям. Так наряду с изменением подвижности клеточных структур в клетке происходит повышение проницаемости мембран (Акулова, 1977; Ладыженская и др., 1987; Барский и др., 1992; Lyon, 1997). Соответственно это сказывается на их барьерных функциях и приводит к выходу ряда соединений из их компартментов. В работе В.Д Рощиной и В.В.Рощиной (1989) было показано, что выход антоцианового пигмента из тканей свеклы был вызван обработкой их экстрактами растений, содержащих вещества полифенольной природы, так как сила повреждающего действия коррелировала с содержанием веществ этой группы. Исследовано также влияние индивидуальных фенолов разной структуры, отличающихся

прежде всего по количеству и положению оксигрупп в бензольном кольце. Наибольшей токсичностью обладают фенолы с орто-расположением гидроксилов, тогда как мета-соединения значительной активностью не обладают. Сила воздействия фенолов на проницаемость мембран для антоциана и водопоглощающую способность изменяется также при введении в молекулу функциональных групп и зависит как от химической природы этих групп, так и их расположения. Наиболее сильно, как указывается в работе (Мальян и др., 1977), фитотоксическое действие фенолов повышается при включении в их молекулу карбоксильной группы.

Молекулярный механизм действия растительных метаболитов вторичной природы осуществляется через ферментативные процессы, осуществляющиеся в мембранах при переносе электронов в реакциях фотосинтеза и дыхания.

В 70-х годах было показано (Рощина, 1973), что водные экстракты листьев некоторых древесных растений способны подавлять реакцию Хилла с ДХФИФ. Активным действующим веществом были соединения полифенольной природы. В суспензии хлоропластов при внесении в нее вытяжек протекает целый ряд событий. Возможно темновое восстановление некоторого количества ДХФИФ, сопровождающееся окислением полифенолов в хиноны, которые на свету конкурировали с ДХФИФ за протоны водорода, образующиеся при световом разложении воды. Полимерные таннины и сопровождающие их фенолы благодаря взаимодействию с белками ингибировали ферментативные системы и изменяли структурную организацию хлоропластов, что в конечном итоге приводило к снижению способности хлоропластов восстанавливать ДХФИФ. Редукция на свету хинонов до соответствующих гидрохинонов показана в работе Цвейга с соавт. (1969).

Из индивидуальных соединений фенольной природы, действующих на энергетические реакции, изучены нафтахиноны, флавонолы и некоторые фенольные кислоты. В концентрациях порядка 10"4 М р-бензохинон и 2,5 диметилбензохинон подавляют дыхание митохондрий клубней картофеля Solanum tuberosum и фасоли Phaseolus vulgaris (Perry, 1967), что сопровождается снижением уровня фосфорилирования и активности ферментов малат- и сукцинат-дегидрогеназ (Makovec, Sindelar, 1984). Регуляторы электронного переноса и фосфорилирования дыхательной и фотосинтетической электрон-транспортных цепей найдены в группе флавоноидов (Рощина, Акулова, 1973; Акулова, 1977; Грибова и др., 1987). В работе В.И. Кефели и Р.Х. Турецкой (1964 цит. по Рощина, Рощина, 1989) установлен отчетливый разобщающий эффект под влиянием группы флавоноидов. Соединения типа кверцитина, кэмпферола и их гликозидированные и ацетилированные производные в митохондриях и хлоропластах обладают свойствами ингибиторов переноса энергии и разобщителей (Кожокару и др., 1977; Музафаров и др., 1983; Музафаров, Кожокару, 1987). К ингибиторам переноса энергии относится также широко известный компонент выделений яблони - флоридзин. Полагают, что большую роль в ингибировании играет гидроксильная группа в а-положении фенольного кольца. Именно она регулирует АТР-азную активность и окислительное фосфорилирование митохондрий (Stenlid, 1970). Возможность непосредственного участия флавоноидов в электрон-транспортной цепи хлоропластов как окислителей или восстановителей показана в опытах Такагамы (1983) и E.H. Музафарова с сотр. (1983; 1987). Гликозидированные производные кверцетина обладают протонофорными свойствами, снижая величину АрН (Кожокару и др., 1977), взаимодействуют с АТФ-синтетазой как аллостерические

регуляторы (Мальян и др., 1977). Флоридзин ингибирует синтез АТФ в хлоропластах на восстановительной стороне цитохрома / и пластоцианина (Рощина, 1978). Сравнивая влияние различных групп флавоноидов, встречающихся в растениях, на реакции хлоропластов, Морланд и Ноицки (1987) обнаружили, что наиболее чувствительным к ним является процесс фотофосфорилирования. Таким образом, мишенью действия флавоноидов следует считать АТФазу хлоропластов, а наиболее эффективными ингибиторами синтеза АТФ - флавоны по сравнению флавонолами и флавононами.

Из других групп фенолов значительное влияние на энергетические процессы оказывают производные бензойной, циннамовой и хлорогеновой кислот. Они сильно ингибируют поглощение 02 митохондриями и сопряженное фосфорилирование у картофеля Solarium tuberosum, а также малат- и сукцинат-дегидрогеназ (Makovec, Sindelar, 1984). Как свидетельствуют исследования JI.B. Метлицкого с соавторами (1972), полулетальная концентрация фенольных соединений (ЭД50) при взаимодействии картофеля с грибом Fusarium solani составляет: для кофейной кислоты - 170 мкг/мл, для хлорогеновой - 210 мкг/мл (Метлицкий, 1972).

Алкалоиды с фенольной группой также могут воздействовать на энергетические реакции, однако их роль при этом очень мало изучена. Алкалоид капсаицин (Рощина и др., 1986) ингибирует как электронный перенос, так и фотофосфорилирование. Ингибирование электронного транспорта наблюдается на участке ФС I, о чем можно судить по торможению реакции фотовосстановления НАДФ+ или феррицианида. Ингибирующее действие в данном случае не обусловлено прямым влиянием на белки - переносчики электронов. Предполагается, что

капсаицин действует как мембраноактивный агент, изменяющий состояние мембран.

Изменение метаболических процессов - один из важнейших биологических эффектов, вызываемых веществами вторичного метаболизма. Механизм этого влияния может проявляться через регуляцию активности ферментов или путем изменения направленности самого процесса. Некоторые флавоноиды - кверцетин, рутин, флоридзин, эпигаллокатехин, влияющие и на энергетические процессы, могут регулировать скорость ассимиляции С02 в изолированных хлоропластах шпината Зртасга о1егасеае (Любимов, Назарова, 1986). Флавоноиды могут оказывать влияние и на активность ферментов. Так, в литературе отмечается повышение в их присутствии активности рибулозодифосфаткарбоксилазы и ингибирование малик-энзима, участника основных путей фотодыхания и дыхания. Другие группы ФС ((З-нафтол, кофейная кислота, салициловая кислота) стимулируют активность нитратредуктазы.

Нужно также отметить и влияние ФС на азотный обмен. В основном оно касается фенолкарбоновых кислот, которые широко представлены в растениях. Показано (Райе, 1978), что коричная кислота (10"5 М) вызывает в суспензии клеток розы уменьшение включения 14С глюкозы в белки и одновременно повышает включение метки в аминокислоты. Феруловая кислота при тех же условиях подавляет как синтез белка, так и включение метки в аминокислоты. Сведения об ингибировании некоторых специфических ферментов, в том числе пектолитических, целлюлазы, каталазы, пероксидазы (ингибируются таннином), амилазы, протеиназы, дегидрогеназы, декарбоксилазы и др., фенолкарбоновыми кислотами и таннинами обобщены в монографии (Гродзинский, 1987).

Отдельную группу составляют, например у картофеля, гликоалкалоиды - соланин и чаконин, обладающие свойствами поверхностно-активных веществ и соответственно воздействующие на мембраны патогенов. Эти гликоалкалоиды более фунгитоксичны, чем полифенолы: ЭД50 соланина и чаконина составляет 6 мкг/мл (для грибов рода Fusarium), но они, как отмечается в работе (Метлицкий, 1972) не могут служить предохранением от фитофтороза. В то же время в работе (Озерецковская и др., 1969) указывается значительная роль, которую играют именно гликоалкалоиды.

К следующей группе стрессовых метаболитов относятся фитоалексины (ФА) - соединения, которые аккумулируются в ответ на разнообразные травмы растительной ткани и играют ведущую роль в устойчивости растений к болезням (Haard, 1983). Именно эти соединения относят к факторам постинфекционной природы, поскольку их содержание значительно возрастает лишь в ответ на инвазию патогена либо иное повреждающее действие. Чаще всего накопление фитолексинов происходит при инфицировании растений грибами или бактериями, а также при воздействии физических и химических факторов (Бейли, 1985).

Хотя многие экстремальные факторы вызывают образование фитоалексинов, но химический состав и количество их, как предполагается, изменяется в зависимости от конкретного воздействия. В пользу этого мнения свидетельствуют работы Vaverka с соавт. (1986, цит. по Lyon, 1997), в которых с помощью различных факторов индуцировали образование ФА в листьях сои Glycine soja. При этом обнаружено, что содержание фазеолина и 6-а-оксифазеолина изменялось в зависимости от действующего фактора от 2 до 420 мкг/г. Наибольшее количество ФА

зарегистрировано при индуцировании Pseudomonas glycinea, наименьшее - при механическом повреждении.

ФА образуются в здоровых клетках растений, которые примыкают к поврежденным участкам ткани. Затем ФА или близкие их предшественники перемещаются в некротизированные ткани, где и накапливаются в токсических для паразита концентрациях (Бейли, 1985).

Стимулом для синтеза ФА служат биохимические агенты -индукторы, или элиситоры, которые содержатся в клеточных стенках интактных клеток бактерий, грибов, а также в тканях растения-хозяина (Роменская и др., 1994). Они освобождаются после гибели клеток и мигрируют в живые клетки, где и индуцируют синтез ФА (Darvill, Albersheim, 1984; Озерецковская, Чалова, 1985). Элиситоры оказывают воздействие на генетические системы растений, активируя экспрессию генов, кодирующих синтез ферментов метаболизма ФА. Элиситоры по химической природе представляют собой фрагменты пектина -олигосахариды или полисахариды. Конкретный механизм образования ФА зависит от его химической природы. Как уже упоминалось, все ФА -вещества вторичного происхождения и для их биосинтеза используются или активируются уже имеющиеся в растительных клетках биосинтетические пути, последние этапы которых могут быть связаны с образованием ферментов de novo.

ФА - высокотоксичные вещества, их эффективная доза составляет 10"5-10"4 М (Смит, 1985). Этого достаточно для разрушения протопласта патогенов. Действие этих стрессовых метаболитов, как отмечается, характеризуется своей неспецифичностью и связано с их липофильностью, благодаря которой они легко проникают в мембраны и разрушают их (Darvill, Albersheim, 1984).

На основании всего вышесказанного можно заключить, что вещества, характерные для защитных реакций высших растений, в большинстве случаев действуют на мембранные структуры, а также процессы электронного транспорта как в цепи дыхания, так и фотосинтеза. В связи с этим нам видится обоснованным применение биотеста, основанного на регистрации ЗФ хлорофилла а, напрямую связанного с первичными реакциями фотосинтеза и передачей электронов, для оценки степени устойчивости растения. Особый интерес вызвало изучение возможности оценки полевой устойчивости клубней картофеля Solanum tuberosum в период покоя в связи с важностью этой культуры и в не меньшей степени отсутствия экспрессного метода скрининга уровня устойчивости при закладке на хранение и в его течение. Реализация этого методического подхода является одной из задач данной работы.

1.4. Методы оценки сортов картофеля на устойчивость к болезням

Методам оценки степени иммунности сортов картофеля, а также и других культурных растений, посвящен ряд обзоров и учебников по фитоиммунитету и фитопатологии (Будин, 1965; Трофимец и др., 1978; Писарев, Трофимец, 1982; Букасов, Камераз, 1972; Сердюков, 1984). Поэтому в настоящей работе мы лишь кратко остановимся на этой проблеме.

Очевидно, что степень иммунности определяется не только количеством пораженных растений, но и характером реакции на внедрение патогена (Niemera et al., 1996). Это находит выражение в формировании хлороза или некроза в месте проникновения паразита, в разном развитии хлороза и некроза вокруг пустул или в других

проявлениях болезни. Эти обстоятельства достаточно важно учитывать при оценке восприимчивости растений к фитопатогенам.

Основными используемыми методами проверки устойчивости сортов и гибридных линий картофеля являются на настоящий момент методы внесения рас патогена в ткани растения и визуальная оценка области поражения. Для самой оценки предлагаются специализированные шкалы иммунности, разработанные на большом фактическом материале. Однако следует учитывать некоторую субъективность результатов, а также отсутствие связи с механизмами устойчивости, лежащими в основе разработанных шкал (Гусев, Метлицкий, 1982).

Иной подход к определению фитоиммунного статуса картофеля основан на выделении сортов-дифференциаторов для определения физиологических рас Phytophtora infestans. Схема определения предусматривает корреляцию каждой расы с определенным генотипом хозяина (Горленко, 1973). В качестве сортов-дифференциаторов включены преимущественно образцы вида Solanum demissum, размножаемых семенами. Как в случае и с другими культурными растениями, настоящий метод трудно сопоставим с реальным положением дел, поскольку сравнительный материал не дает представления об отношении местных сортов к выявленным расам.

В последнее время распространение получили методы с использованием культуры ткани (Максимова и др., 1996). В этой связи отмечается , что взаимодействие растения-хозяина и патогена в условиях клеточной культуры в большой степени отражает общую картину взаимоотношения целого растения с возбудителем болезни. В этой связи метод активно внедряется в селекцию на болезнеустойчивость, поскольку имеет ряд неоспоримых преимуществ в сравнении с традиционными методами описанными выше. Однако следует обратить внимание и на ряд

сдерживающих факторов, которые ограничивают его применение в практической селекции. В первую очередь это сложность инфицирования культуры клеток растений (Daub, 1986; Леонова, 1986; Максимова и др., 1996) и отсутствие объективных и оперативных методов оценки селекционного материала (Будин, 1965; Букасов, 1972; Новотельнова и др., 1979; Гусев, Метлицкий, 1982; Росс, 1989; Новотельнова, 1994). В связи с этим в работе Н.И. Максимовой с соавт. (1996) отмечается необходимость решения этих проблем через познание феноменологии и механизмов взаимодействия растительных клеток и патогена при совместном их культивировании.

Очевидно, что немаловажным в процессе селекции на требуемый уровень устойчивости является отслеживание родительских признаков и наследование генов устойчивости - R-генов (см. выше). Кроме того, практикуется метод выращивания материала из меристематических тканей незараженных вирусными, грибными и бактериальными болезнями. Последний, однако, вызывает критические замечания вследствие очень быстрой заражаемости картофеля в полевых условиях (Сердюков, 1984; Серебренников, 1994). При этом наиболее существенной проблемой становится поражение более серьезными паразитарными организмами, особенно это касается вирусных инфекций, занимающих нишу более слабых, присутствовавших до этого. Последствия выражаются в значительном падении урожайности культур на второй-третий годы после введения в сельскохозяйственную практику.

Другой проблемой, возникающей при достаточно долгом использовании в практике, является ухудшение породных качеств сортов. Эта проблема возникает вследствие ряда причин. Среди них можно выделить появление новых физиологических рас фитопатогенов, изменениями в самих растениях на физиолого-биохимическом уровне,

обусловленных неблагоприятными условиями среды, несоответствие сортовой агротехники и т.д. (Гусев, Метлицкий, 1982; Писарев, Трофимец, 1982).

Отмечается, что для преодоления подобных сдвигов в фитоиммунном статусе сортов рекомендуется улучшение агротехнических подходов к сорту, в том числе использование свежераспаханных земель, улучшение минерального питания, оздоровление и обновление семенного материала и т.д.

Примерами ухудшения качества сортовых показателей служат и некоторые сорта представленные в Красноярском крае. Так сорт Колпашевский, районированный в 60-х годах, к настоящему времени значительно ухудшил свои показатели устойчивости (Писарев, Трофимец, 1982; Современная технология..., 1996). Низкие показатели сорта Адретта, по-видимому, обусловлены его слабой адаптированностью к местным климатическим и прочим условиям культивирования.

В целом можно отметить, что внешние факторы способны в значительной мере изменять параметры восприимчивости растений, в том числе картофеля, к фитопатогенным, а также к неспецифическим, сапрофитным организмам. Такие экологические факторы как температура, влажность, обеспеченность элементами минерального питания оказывают свое действие как в период роста и формирования растений, так и в период их хранения (Метлицкий, 1972; Писарев и др., 1976; Гусев, Метлицкий, 1982; Кравцов, Серебренников, 1991; Серебренников, 1994).

В связи с этим значительную научную и практическую ценность, на наш взгляд, будет представлять оценка показателей как сортов, так и собранного урожая из разных по экологической обстановке районов. На основании такой оценки представляется возможным отбирать наиболее

устойчивую часть для продолжительного хранения, а урожай, характеризующийся незначительным уровнем фитоиммунности использовать в первую очередь. В дополнение к этому, разрабатываемый метод может оказать существенную помощь для оперативной оценки устойчивости сортов в поле при условии обязательного сравнения на начальных этапах с иными показателями, базирующимися на вышеописанных параметрах фитоиммунитета.

ГЛАВА 2. ЗАМЕДЛЕННАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ХЛОРОФЛЛА В ОЦЕНКЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ И ДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РАСТЕНИЯ

Замедленная флуоресценция (ЗФ) растений наблюдается после выключения света как очень слабое (квантовый выход менее 10"4), затухающее десятки секунд свечение (см. обзор Гаевский, Моргун, 1993). Многокомпонентный характер этого явления указывает на сложную природу реакций, лежащих в его основе. В то же время, сходный характер спектров ЗФ и непосредственно флуоресценции хлорофилла позволяет сделать общий вывод о том, что послесвечение связано с переходом молекулы хлорофилла с синглетного возбужденного уровня на основной (8*г переход). Вместе с тем чувствительность ЗФ к воздействиям, изменяющим функционирование ФС И, свидетельствует о том, что кванты ЗФ испускаются при дезактивации вторично возбужденного синглетного электрона хлорофилла в РЦ данной фотосистемы (Гольд и др., 1984; Веселовский, Веселова, 1990; Гаевский, Моргун, 1993 и т.д.).

2.1. Современные представления о механизме ЗФ

Собственно ЗФ испускается вследствие обратной реакции пары хлорофилл-первичный хинон Р+680С)"а. Суть механизма генерации ЗФ может быть проиллюстрирована схемой, приведенной на рис. 4.

В результате поглощения кванта света в реакционном центре происходит разделение заряда и образование электрического потенциала в виде донор-акцепторной пары. При рекомбинации заряда пары Р+680(^~ (обратный процесс) молекула хлорофилла вновь возбуждается с последующим излучением кванта света. Однако квантовый выход возбуждения хлорофилла при этом, как считается, составляет величину в

несколько процентов, а основная часть рекомбинаций происходит без излучения.

11Уфл1Ч11У„

Иу

4,.

■'тепло

Z?Q

шр е

а\|/

ЛрН

-»АТР

Рис. 4. Гипотетическая блок-схема генерации послесвечения и его регуляции со стороны первичных процессов фотосинтеза. Р - пигмент (хлорофилл); Z и Q - первичные донор и акцептор ФС II соответственно; тр е - транспорт электронов; АрН и ЛТ - протонный и электронный градиенты на мембране тилакоида; Ьуь, 11уфл, Ьупс - кванты возбуждающего света, флуоресценции и послесвечения, соответственно (Григорьев и др., 1983; Гольд и др., 1984).

Чем больше скорость транспорта электронов, то есть количество электронов, переданных по ЭТЦ, тем больше число рекомбинантных пар, и, следовательно, выше интенсивность ЗФ. На основании этого ЗФ может использоваться для оценки активности фотосистемы 2 интактных фотосинтезирующих объектов. Однако связь между процессом ЗФ и состоянием ФС II не всегда имеет пропорциональный характер. Одна из основных причин этого - наличие определенных конкурентных отношений за энергию разделенных зарядов между "паразитным" высвечиванием кванта в форме ЗФ и восстановлением естественных акцепторов электронов в ЭТЦ фотосинтеза. В связи с этим повышение активности ФС 1, вызывая усиление оттока электронов от О, приводит к тушению ЗФ. Другой причиной, вызывающей непропорциональное соотношение между интенсивностью послесвечения и скоростью транспорта электронов, в литературе называется зависимость обоих этих

процессов от реакций фотофосфорилирования. Показано (Гольд и др., 1984), что д\|/, снижая энергию активации реакций рекомбинации, тем самым увеличивает квантовый выход ЗФ даже при неизменном количестве донор-акцепторных пар.

Приведенные сложные системы регуляции процесса послесвечения обуславливают характер его индукционных переходов (ИП) ЗФ, которые вызывают значительный интерес благодаря возможности получения обширной информации о состоянии зеленого растения (рис. 5)

Рис. 5. Характерный интегрированный сигнал индуцированных светом изменения ЗФ с обозначением фаз индукции (Гаевский, Моргун, 1993).

После включения света наблюдается две фазы индукции ЗФ: быстрая OID и медленная DPS, длящиеся, соответственно, 200 мс и несколько минут. Наблюдаемые параметры индукционной кривой тесным образом связаны с первичными реакциями фотосинтеза. При этом максимум I линейно зависит от интенсивности возбуждающего света и соответствует моменту появления наибольшего количества РЦ в

Р

I

D

t 1 Зс ' |

состоянии Р+680СГ ПРИ переходе донорных комплексов ФС II в высшие окисленные состояния. Фаза ГО связана с процессом восстановления пула пластохинонов, а время достижения промежуточного минимума Б может служить показателем восстановительной активности комплекса ФС II. В основе фазы ЭР лежит перенос электронов внутрь тилакоида, при этом она не связана с установлением трансмембранного градиента протонов, а с нейтрализацией отрицательно заряженных буферных групп внутри тилакоида. Выход М§2* и других катионов металлов из тилакоида по градиенту электрического потенциала в основном определяет снижение выхода ЗФ в фазу РБ (Григорьев и др., 1982; Гаевский, Моргун, 1993).

Можно отметить, что связь между интенсивностью миллисекундного свечения и первичными процессами фотосинтеза носит довольно сложный характер. Природа систем регуляции до конца не ясна, но тем не менее, процесс ЗФ считается одним из основных механизмов оценки состояния фотосинтетического аппарата и в целом растительной клетки, позволяющий работать на нативных объектах. В связи с этим этот метод находит значительное развитие в физиологических, гидробиологических и экологических исследованиях (Гольд и др., 1984; Гладышева, 1986; Григорьев и др., 1989; Веселовский, Веселова, 1990; Григорьев и др., 1983; Прокушкин, Григорьев, 1996).

2.2. Использование ЗФ в целях биологического тестирования

Как следует из литературы, показатель ЗФ довольно широко применяется для оценки состояния фотосинтезирующего аппарата растения под действием внешних факторов, как физической (освещенность, температура), так и химической природы (ионы тяжелых металлов, гербициды, рН и т.д.). Особое место занимают работы, в

которых изучаются сами механизмы индукции ЗФ и связь между ними и такими процессами фотосинтеза, как фотофосфорилирование и фиксация С02. В работах (Reinman et al., 1981; Matorin et al., 1982; Yerkes et al., 1983; Packham, Barber, 1983; Гольд и др., 1984; Грибова и др., 1987; Григорьев и др., 1989; Григорьев и др., 1993) обсуждается характер действия ряда веществ (витамин КЗ, ФМС, ДНФ, ферредоксин, феррицианид, АДФ, ДХФИФ и т.д.) которые выступают в роли кофакторов, разобщителей ЭТЦ и значительно изменяют параметры выхода ЗФ.

Такие ингибиторы переноса электронов от ФС II, как диурон и гербициды сим-триазинового ряда (напр., прометрин и симазин). вызывают значительное тушение ЗФ на высоких интенсивностях возбуждающего света, причем это тушение может варьировать в зависимости от условий освещения и температурного режима (Packham, Barber, 1983; Караваев и др., 1985; Григорьев и др., 1989; Bilger, Schreiber, 1990; Кафаров и др., 1990; Григорьев и др., 1993; Григорьев и др., 1995; Григорьев и др., 1996). Изучение характера концентрационной зависимости действия этих веществ (Рис. 6) показало, что при повышении их содержания в среде сначала наблюдается повышение интенсивности ЗФм, а затем происходит достаточно резкое снижение величины быстрой компоненты ЗФ. Повышение в этих условиях медленной компоненты, которая насыщается при низких интенсивностях света, связывают с тем, что гербицид, блокируя отток электронов от ФС II и переводя Q в более восстановленное состояние, вызывает образование большего числа рекомбинирующих пар (Гладышева, 1986; Григорьев и др., 1989).

И наоборот, быстрая компонента, регистрируемая при высоких интенсивностях возбуждающего света, которые способствуют восстановлению Q и образованию значительного градиента протонов на

мембране тилакоида, в присутствии перечисленных веществ, вызывающих рассеивание А|ыН, снижается в несколько раз.

Эффект тушения ЗФ обнаруживается также при использовании специфических кофакторов циклического и нециклического фотофосфорилирования (Агпоп й а1., 1971; Григорьев и др., 1982; Гольд и др., 1984; Веселовский, Веселова, 1990; Гаевский, Моргун, 1993).

контроль 0,01 0,1 1

Концентрация диурона, мкг/л

Рис. 6. Зависимость интенсивности замедленной флуоресценции, возбуждаемой высокой (В) и низкой (Н) интенсивностью света, коэффициента токсичности (KT) от коцентрации диурона в среде

(Григорьев и др., 1996).

Помимо перечисленных эффектов, вызываемых специфическими веществами, изменяющими организацию фотосинтетического аппарата, следует отметить тот факт, что ЗФ в последнее время все шире используется для оперативного контроля за фитотоксичностью различных сред (Renger, Schreiber, 1986; Walsh, Merril, 1995). Однако, как следует из ряда работ, данный способ не обеспечивает высокую точность измерения эффекта анализируемых проб, поскольку интенсивность послесвечения

будет зависеть не только от величины регистрируемого токсического действия, но и от мутности и цветности раствора. В связи с этим в работах (Григорьев и др., 1995; Григорьев и др., 1996) предлагается использование нового подхода к определению фитотоксичности, который основан на измерении амплитуды индукционного максимума ЗФ водоросли хлорелла в миллисекундном интервале затухания при

л

возбуждении светом сначала высокой интенсивности (50-120 Вт/м ), а

■л

затем низкой (5-10 Вт/м ). При этом, квантовый выход и, следовательно, интенсивность ЗФ на высоком свету, при котором доминирует быстрая компонента затухания, снижается после добавления фитотоксических веществ. И, наоборот, на низком свету, когда свечение представлено медленной компонентой, токсический эффект проявляется в виде увеличения интенсивности ЗФ.

Повышение чувствительности метода достигается в данном случае благодаря тому, что возрастание интенсивности ЗФ на низком свету (медленная компонента) наблюдаются при значительно меньших концентрациях токсиканта, чем его снижение на высоком (см. Рис. 6). В результате с помощью показателя ЗФв/ЗФн удается обнаружить более низкую степень фитотоксичности и, следовательно, меньшие концентрации веществ, чем при регистрации одной быстрой компоненты.

Настоящий подход, как показали Ю.С. Григорьев и Е.А. Фуряев (1995), позволяет определять и вещества, оказывающие токсическое ингибирующее действие на терминальные акцепторы ЭТЦ (ОМ-ионы) не регистрируемые при обычных условиях. В этом случае несколько изменяется сама процедура опыта и наибольшей информативностью обладает медленная компонента. В основе этого лежит ее стимуляция в следствии накопления Дц,Н на мембране тилакоида в присутствии циан-ионов. Также отмечается, что введение предварительной засветки

водорослевого тест-организма в течение 45-60 мин во многих случаях позволяет этому методу чувствовать тяжелые металлы. В этих условиях происходит световая инактивация белка D1 ФС II (Styring et al., 1990; Hundal et al., 1990; Aro et al., 1990; Virgin et al., 1991; Aro et al., 1993) без его ресинтеза при наличии в среде тяжелых металлов (Акк, 1995; Grigoriev et al., 1996; 1997).

Обширные исследования, проведенные в нашей лаборатории (Григорьев и др., 1995, и т.д.), свидетельствуют о перспективности использования ЗФ для оценки фитотоксичности различных сред и в том числе биологически активных экстрактов из растений. В связи с этим в настоящей работе была изучена возможность применения ЗФ в качестве оперативного и легко регистрируемого показателя физиологической активности клеточного сока клубней ряда сортов картофеля для оценки его устойчивости к поражению фитопатогенами.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Прокушкин, Анатолий Станиславович

выводы

1. Чувствительность тест-организма, воспроизводимость и достоверность получаемых результатов существенным образом зависят от световых условий содержания водоросли в период проведения эксперимента и измерения ее замедленной флуоресценции. Среди других факторов выделяются плотность суспензии, рН тестируемой среды и содержание органических сольвентов. Состояние тест-организма и его пригодность к работе следует определять по уровню фитотоксичности стандартной концентрации модельного токсиканта - диурона.

2. Характер фитотоксического действия клеточного сока клубней картофеля имеет специфические механизмы, отличаясь от таких ингибиторов фотосинтетического транспорта электронов, как диурон. Наблюдаемое существенно большее возрастание выхода ЗФ при возбуждении светом низкой интенсивности на фоне постоянного или незначительного снижения свечения на высоком свету определяется в первую очередь факторами химической природы.

3. Фитотоксичность клеточного сока коррелирует с содержанием в клубнях экстрагируемых фенольных соединений (коэффициент корреляции - 0,96). Сходное по характеру действие на ЗФ клеточного сока и фенолкарбоновых кислот указывает на возможность участия последних в формировании его фитотоксичности. Основной фитотоксический эффект гомогената клубня картофеля обусловлен веществами, содержащимися в его покровных тканях. Паренхима клубня практически не оказывает влияния на ЗФ тест-организма.

4. Участие гликоалкалоидов в формировании фитотоксического эффекта клеточного сока клубней картофеля незначительно и проявляется лишь при их накоплении в процессе световой экспозиции. Повышение фитотоксичности клеточного сока при механическом повреждении клубней недостоверно.

5. Степень фитотоксического действия сока клубней меняется в период хранения: коэффицинт токсичности максимален осенью, снижается в зимние месяцы и вновь возрастает весной. Сходная динамика характерна для общего содержания фенольных соединений в клубнях.

6. Ранжирование сортов по степени увеличения фитотоксичности сока клубней - Кардинал, Адретта, Колпашевский, Броницкий, Уральский ранний, Невский, Лорх, Красноярский ранний хорошо совпадает с последовательностью их расположения по признаку устойчивости к болезням в процессе хранения.

7. Скорость развития некроза в тканях клубней изученных сортов картофеля после инокуляции в них возбудителя фитофтороза имеет обратную зависимость с фитотоксичностью выделенного сока (коэффициент корреляции равен -0,69) и соответствует степени устойчивости сорта к болезням.

8. Исследованный методический подход определения фитотоксичности выделенного сока клубней картофеля представляется перспективным как для оперативной оценки их иммунитета, так и селекционного отбора сортов по данному признаку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Прокушкин, Анатолий Станиславович, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Акк Г.Я., Ловягина Е.Р., Кауров Ю.Н., Иванов И.И. Влияние ионов кобальта на замедленную и быструю люминесценцию хлоропластов гороха // Физиология растений. 1995. Т. 42. (2). - С. 268-271.

2. Акулова Е.А. Флавонолы - эндогенные регуляторы энергетического обмена хлоропластов. Пущино, 1977. - С. 100-125.

3. Александрова Л. П., Осипов В. И. Методика фракционирования фенольных соединений тканей хвойных // Исследование обмена веществ древесных растений.- Новосибирск: Наука. 1985. - С. 96-102.

4. Ащайе А., Дьяков Ю.Т. Фитоалексины как таксономический признак пасленовых и фактор их сопряженной эволюции с Phytophtora infestans (Mont.) De Вагу // Бюлл. M. о-ва. исп. природы, отд. биологич., Т. 81 (1). 1976.-С. 73-86.

5. Барская Т. А., Кораблева Н. П., Морозова Э. В. Фитофтороустойчивость клубней картофеля в зависимости от физиологического состояния // Иммунитет и покой растений.- М.: Наука. 1972. - С. 45-58.

6. Барский Е. Л., Кравцова Т. Р., Самуилов В. Д. и др. Действие антиоксидантов фенольной природы на фотосинтетический перенос электронов в хлоропластах // Биохимия. 1992. Т. 57. В. 9. - С. 14271431.

7. Бейли Дж.А. Механизмы накопления фитоалексинов // Фитоалексины / Под. Ред. Дж.А. Бейли. Киев: Наук. Думка. 1985. - С. 282-313.

8. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М.:. 1977. -215 с.

9. Будин К.З. Биологические особенности роста ранний сортов картофеля, приемы их выведения и семеноводства. М.: ВНИЭСХ. 1965.-321 с.

Ю.Букасов С.М., Камераз А.Я. Селекция и семеноводство картофеля. Л.: "Колос". 1972.-245 с.

П.Буров В. Н., Сазонов А. П. Биологически активные вещества в защите растений.- М.: Агропромиздат. 1987. -199 с.

12.Васюкова Н. И., Метлицкий Л. В. Изучение фунгитоксичности перидермы и некротизированной ткани клубня картофеля // Биохимия иммунитета и покоя растений. М.: Наука. 1969. - С. 23-31.

13.Веселовский В. А., Веселова Т. В. Люминесценция растений.- М.: Наука, 1990. - С. 41-47.

14.Вечер А. С., Гончарик М. Н. Физиология и биохимия картофеля.-Минск: Наука и техника. 1973. -262 с.

15.Воловик A.C., Глез В.И. Защита картофеля от болезней. М.: Колос. 1995. -46 с.

16.Гаевский Н. А., Моргун В. Н. Использование переменной и замедленной флуоресценции хлорофилла для изучения фотосинтеза растений // Физиология растений. 1993. Т. 40. В. 1. - С. 136-144.

17.Гладышева Е.Е. Исследование светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции нативных растительных объектов. Диссертация ... канд.биол.наук. Красноярск. 1986. -145 с.

18.Гольд В. М., Гаевский Н. А., Григорьев Ю. С., Гехман А. В. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла. Красноярск: КГУ. 1984. - 65 с.

19.Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В. Физико-химические основы действия гербицидов // Биохимия. 1989. Т. 30. В. 1. - С. 29-51.

20.Горленко М.В. Краткий курс иммунитета растений к инфекционным болезням. Изд. 3-е. Учеб. Пособ. М., Высшая школа, 1973. -366 с.

21.Грибова 3. П., Музафаров Е. Н., Антоновский В. Л. Антагонизм действия флавонолов и гербицидов на электронный транспорт высших

растений // Тезисы докладов IV Всесоюз. Симп. по фенольным соединениям. Таллин, 1987. - С. 27.

22.Григорьев Ю.С. Светоиндуцируемые изменения флуоресценции хлорофилла а у различных групп растений // Дисс. канд. биол. наук. Красноярск. 1974. -169 с.

23.Григорьев Ю. С., Гладышева Е. Е., Моргун В. Н., Гольд В. М. Световая зависимость индукционных переходов быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла нативных систем И Физиология растений, 1993. Т. 30. В. 2. - С. 261-268.

24.Григорьев Ю. С., Знак Н. Ю., Гладышева Е. Е. и др. Температурная зависимость замедленной флуоресценции водорослей, адаптированных к различным температурам // Физиология растений. 1989. Т. 36. В. 2.-С. 391-398.

25.Григорьев Ю.С., Фуряев Е.А. Способ определения концентрации циан-ионов в растворе // Патент № 2046319. 1995.

26.Григорьев Ю.С., Фуряев Е.А., Андреев A.A. Способ определения содержания фитотоксических веществ // Патент № 2069851. 1996

27.Григорьев Ю.С., Прокушкин A.C., Абакумова Н.В., Чуруксаева C.B. Новый метод биотестирования загрязнений объектов окружающей среды на водорослях // Тезисы международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды - ПООС-95", Томск, 12-15 сентября 1995. - С. 29

28.Григорьев Ю.С., Прокушкин A.C., Короткий Т.И., Жилинская Г.Н. Биологический метод и аппаратура для оперативного контроля содержания гербицидов в моркови и оценки устойчивости клубней картофеля к болезням. Тезисы и статьи Междунар. Эколог. Конгресса, Воронеж, 22-28 Сентября 1996 г., секция "Сельское хоз-во и охрана окружающей среды". - С. 58.

29.Григорьев Ю.С., Прокушкин A.C., Пахарькова Н.В., Абакумова Н.В., Бучельников М.А. Оперативные методы и аппаратура для биологического контроля загрязнения окружающей среды и продукции растениеводства. Материалы региональной конференции "Аналитика Сибири", Новосибирск, 10-14 ноября 1996 г. - С. 18.

30.Григорьев Ю.С., Прокушкин A.C., Пахарькова Н.В., Абакумова Н.В., Бучельников М.А. Универсальная биологическая система оперативного контроля экологической опасности загрязнения окружающей среды. Тез. докл. всерос. конф. по анализу объектов окр. среды "Экоаналитика-96", Краснодар, 29 сент,- 4 окт. 1996. - С. 23-24.

31.Гродзинский А. М., Головко Э. А., Горобец С. А. и др. Экспериментальная аллелопатия. Киев: Наукова думка. 1987. - 236 с.

32.Гусев С.А., Метлицкий JI.B. Хранение картофеля. М.: Колос. 1982. -221 с.

33.Дорожкин H.A., Ремнева З.И. Фитофтора картофеля и томатов. Минск: Урожай. 1976. - 224 с.

34.Дьяков Ю.Т. Физиолого-биохимические механизмы устойчивости растений к грибным болезням // Итоги науки и техники. Защита растений. 1983. Т. 3. -356 с.

35.3апрометов М. Н. Специализированные функции фенольных соединений в растениях // Физиология растений. 1993. Т. 40. В. 6. - С. 921-931.

Зб.Запрометов М. Н. Фенольные соединения растений и их биогенез // Итоги науки и техники, серия биологическая химия. 1988. 27. - 188 с.

37.3апрометов М. Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука. 1993. - 285 с.

38.Ильинская JI. И., Горенбург Е. В., Чаленко Г. И. и др. Участие метилжасмоната в индуцировании устойчивости картофеля к

возбудителю фитофтороза // Физиология растений. 1996. Т. 43. В. 5. -С. 713- 720.

39.Караваев В.А., Кукушкин А.К., Шагурина Т.Л., Солнцев М.К. Изменение индукции флуоресценции листьев высших растений в присутствии метилвиологена и диурона // Биофизика. 1985. Т. 30. - С. 661-665.

40.Козицкая В.Н. Фенольные соединения водорослей и их физиологическая роль // Гидробиол. журн. 1984. Т. 20. N. 3. - С. 54-65.

41.Кафаров P.C., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Влияние высоких температур на активность фотосистемы II и перекисное окисление липидов в клетках хлореллы // Физиология растений. Т. 37. В. 3. - С. 569-575.

42.Кожокару А.Ф., Рузиева Р.Х., Топалы Э.Е. Протонофорная активность флавоноидов и разобщение окислительного фосфорилирования. Пущино. 1977.-С. 73-99.

43.Кораблева Н. П. Биохимические механизмы гормональной регуляции покоя клубней картофеля // Регуляция роста и развития картофеля. М.: Наука. 1990. - С. 62-68.

44.Кораблева Н. П., Ладыженская Э. П., Морозова Э. В. и др. Влияние регуляторов роста на биосинтез нуклеиновых кислот в точках роста клубней картофеля в покое и при прорастании // Биохимия иммунитета и покоя растений. М.: Наука. 1969. - С. 78-82.

45.Кораблева Н. П., Попова Л. В., Морозова Э. В. и др. Активность ß-глюкозидазы в клубнях картофеля при переходе от покоя к росту и при поражении Phytophtora infestans // Иммунитет и покой растений. М.: Наука. 1972.-С. 21-29.

46.Кораблева Н.П., Караваева К.А., Метлицкий Л.В. Изменение содержания абсцизовай кислоты в тканях клубней картофеля во время

глубокого покоя и прорастании // Физиология растений. 1980. Т. 27. В. З.-С. 585-591.

47.Котова К.А. Хозяйственно-биологическая и селекционная ценность коллекции сортов картофеля // Селекция и семеноводство картофеля на основе биотехнологии. Л.: 1990. - С. 13-19.

48.Кравцов А. А., Серебренников В. С. Картофель. М.: Агропром. 1991.-С. 18- 25.

49.Курсанова Т. А. Развитие представлений о природе иммунитета растений. М.: Наука. 1988. - 104с.

50.Ладыженская Э. П., Грикун И. Н., Кораблева Н. П. Подавление активности мембран-связанной АТФазы - один из механизмов аллелопатического действия фенольных соединений // Тезисы докладов V Всесоюз. Симп. по фенольным соединениям. Таллин. 1987. -С.70-71.

51.Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1980. - 184 с.

52.Леонова Н.С. Использование метода культуры тканей в селекции картофеля // Сибирский вестн. с.-х. науки. 1986. Т. 112. № 3. - С. 18-24.

53. Любимов В.Ю., Назарова Г.Н. Влияние флавоноидов на фотосинтетическую фссимиляцию С02 изолированными хлоропластами шпината. Пущино. 1986. - С. 104-115.

54.Максимова Н. И., Мацкявичене Е. В., Гужова Н. В. Взаимоотношения гриба Phytophtora infestans и клеток картофеля в суспензионной культуре при совместном выращивании // Физиология растений. 1996. Т. 43. В. 2.-С. 285- 290.

55.Мальян А.Н., Музафаров E.H., Акулова Е.А. Взаимодействие флавонолов агликона, гликозидированных и ацилпроизводных с сопрягающим фактором фотофосфорилирования CF1. Пущино. 1977. -С. 41-55.

56.Метлицкий JI. В. Основы биохимии и технология хранения картофеля. М.: Колос. 1972. - 207 с.

57.Метлицкий Л. В. Фитоиммунитет: молекулярные механизмы. М.: Наука. 1976. - 50 с.

58.Метлицкий Л. В., Кораблева Н. П., Морозова Э. В., Попова Л. В. Биохимическая взаимосвязь между функциями покоя и иммунитета растений // Биохимия иммунитета и покоя растений. М.: Наука. 1969.-С. 29-32.

59.Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л. Фитоалексины. М.: Наука. 1973.

- 176с.

60.Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л., Вульфсон Н. С. Обнаружение, биологическая активность и химическая природа нового фитоалексина картофеля- любимина // Иммунитет и покой растений. М.: Наука. 1972.

- С. 78-88.

61.Метлицкий Л. В., Савельева О. Н., Озерецковская О. Л. Фунгитоксичность продуктов ферментативного окисления хлорогеновой и кофейной кислот // Иммунитет и покой растений. М.: Наука. 1972. - С. 65-69.

62.Методика количественной бумажной хроматографии Сахаров, органических кислот и аминокислот у растений. Под ред. 1962.

63.Музафаров E.H., Христин М.С., Струбицкий И.В. Окислительно-восстановительные превращения фенольных соединений в хлоропластах // Биофизика. 1983. Т. 28. № 4. - С. 621-624.

64.Музафаров Е. Н., Кожокару А. Ф. Механизмы действия флавоноидов в мембранных системах // Тезисы докладов V Всесоюз. Симп. по фенольным соединениям. Таллин. 1987. - С. 97- 99.

65.Новотельнова Н.С. Фитофторовые грибы. Л.: Наука. 1994. -150 с.

66.Новотельнова Н.С., Легенькая P.C. Болезни сельскохозяйственных растений, вызываемые пероноспоровыми грибами // Методическое

пособие по диагностике болезней и определению возбудителей. JL: 1974.-40 с.

67.Новотельнова Н.С., Пыстина П.А., Голубева О.Г. Пероноспоровые грибы-патогены культурных растений в СССР. JL: Наука. 1979. -152 с.

68.0верчук В.И., Мацко В.Н. Гликоалкалоиды картофеля. ВИНИТИ МСХ СССР. 1975.-40 с.

69.0зерецковская O.JI., Чалова Л.И. Биогенные индукторы образования фитоалексино в растениях // Микология и фитопатология. 1985. Т. 19. № 3. - С. 260-267.

70.0зерецковская О. Л. Фрагменты ксилоглюкана- регуляторы иммунных эффектов в картофеле // Физиология растений. 1995. Т. 42. В. 5. - С. 773- 779.

71.0зерецковская О. Л. Клеточные и молекулярные механизмы иммунитета картофеля // Регуляция роста и развития картофеля. М.: Наука. 1990.-С. 131-136.

72.0зерецковская О. Л. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням // Физиология растений. 1994. Т. 41. В. 4.-С. 626- 633.

73.0зерецковская О. Л., Давыдова М. А., Васюкова Н. И. Участие гликоалкалоидов а- соланина и а- чаконина в защитных свойствах покровных, раневых и некротизированных тканей клубня картофеля // Биохимия иммунитета и покоя растений. М.: Наука. 1969. - С. 69-73.

74.Пасешниченко В.А. Гликоалкалоиды картофеля и методы их определения. Тр. НИИКХ. 1972. В. 11. - С. 130-138.

75.Писарев Б.А., Трофимец Л.Н. Семеноводство. М.: Россельхозиздат. 1982. - 238 с.

76.Писарев Б.А., Гусев С.А., Осберг В.В Влияние минеральных удобрений на устойчивость картофеля в период хранения к Fusarium

solani. // Прикладная биохимия и микробиология. 1976. Т. 12. В. 6. - С. 922-926.

77.Платонова Т. А., Метлицкий JI. В. Локализация полифенолов и полифенолоксидазы в растительной клетке и их взаимодействие при физиологических заболеваниях плодов // Иммунитет и покой растений. М.: Наука. 1972.-С. 55-64.

78.Попкова К.В., Шнайдер Ю.И. Болезни картофеля. М.: Колос. 1980. -304 с.

79.Прокушкин A.C., Григорьев Ю.С. Метод определения устойчивости клубней картофеля к фитопатогенам на основе водорослевого биотеста / Материалы Всероссийской научной конференции "Экология Южной Сибири - 2000 г." Абакан. 1998. С. 158.

80. Прокушкин A.C., Григорьев Ю.С., Короткий Т.И. Использование водорослевого биотеста для оценки устойчивости клубней картофеля к фитопатогенам // Микробиология и фитопатология, 1999 (в печати).

81.Прохорчик P.A., Волынец А.П. Действие флавоноидов на активность хлоропластов люпина и гороха // Физиология и биохимия культ, растений. 1973. Т. 5. № в. - С. 623-628.

82.Райе Э. Аллелопатия. М.: Мир. 1978. -392 с.

83.Роменская И.Г., Чаленко Г.И., Леонтьев Г.В. Биологическая активность фрагментов клеточных стенок картофеля // Прикл. Биохимия и микробиология. 1994. Т.30. В. 6. - С. 907-916.

84.Росс X. Селекция картофеля. М.: Агропромиздат. 1989. -189 с.

85.Рощина В.В., Акулова Е.А. Действие флоридзина на фотосинтетический электронный транспорт // Биохимия. 1978. Т. 43. № 5.- С. 899-903.

86.Рощина В.Д. Редуцирующая способность настоев из листьев древесных растений и подавление ими реакции Хилла с ДХФИФ // Физиолого-биохимические основы взаимодействия растений в

фитоценозах / Под ред. A.M. Гродзинского. Киев: Наук, думка. 1973. №4.-С. 10-15.

87.Рощина В.В., Рузиева Р.Х., Мухин E.H. Капсаицин из плодов красного перца Capsicum annuum L. как регулятор фотосинтетического транспорта электронов // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. Т. 22. №3.-С. 403-409.

88.Рощина В. В. Энергетические аспекты фитонцидного действия фенольных соединений // Фитонциды. Бактериальные болезни растений. Тезисы докладов. Киев: Наукова думка. 1985. Ч. 1. - С. 44-45.

89.Рощина В. Д., Рощина В. В. Выделительная функция высших растений. М.: Наука. 1989. - С. 135- 138.

90.Рубин Б. А., Аксенова В. А. Белковые компоненты клетки во взаимодействии растения и паразита // Итоги науки и техники, серия Физиология растений. М. 1976. Т. 2. - С. 7-32.

91.Рубин Б. А., Арциковская Е. В. Биохимия и физиология иммунитета растений. М.: Высшая школа. 1968. -260 с

92.Сердюков А.Е., Писарев Б.А., Старцева Л.И. Семеноводчество картофеля. М.: Колос. 1984. -160 с.

93.Серебренников B.C. Перспективы и эффективность применения химических и физических регуляторов роста в картофелеводстве. М.: ВНИИТЭСХ. 1986. -50 с.

94.Серебренников Т.М. Характеристика сортов картофеля по основным хозяйственно полезным признакам. М.: Наука. 1994. -С. 51-68.

95.Смит Д.А. Токсичность фитоалксинов // Фитоалексины / Под. Ред. Дж.А. Бейли. Киев: Наук. Думка. 1985. - С.215-243.

96.Современная технология возделывания картофеля в Красноярском крае // Методические рекомендации для слушателей ФПК. Красноярск: КГАУ. 1996.-18с.

97.Тамбиев А. X. Реакционная способность экзометаболитов растений. М.: МГУ. 1984. -72 с.

98.Татаринцев Н. П., Лебедева А. И., Музафаров Е. Н. Влияние катехинов на АТРазную активность CFb процессы фотофосфорилирования и восстановлния NADP+ в хлоропластах // Биохимия. 1984. Т. 49. В. 6. -С. 924- 926.

99.Телитченко М. М., Остроумов С. А. Введение в проблемы биохимической экологии. М.: Наука. 1990. -288с.

ЮО.Трофимец Л.Н., Анисимов Б.В., Литун Б.В. Достижения селекции и семеноводства картофеля. М.: Знание. 1978. -64 с.

101.Физиология иммунитета растений / отв. ред. Цинин Н. В. М.: Наука. 1968. -205с.

102.Харборн Д. Введение в экологическую биохимию. М.: Мир. 1985. -12 с.

103.Хромова Л.М., Седнина Г.В., Бутенко Р.Г. Клеточная селекция картофеля // С.-х. биология. 1983. № 6. - С. 3-12.

104.Alscher R.G. Biosynthesis and antioxidant function of glutathione in plants // Physiol, plant. 1989. 77. pp. 457-464.

105.Anderson A.J. Phytoalexins and plant resistance // Mycotoxines and phytoalexins (Eds. Sharma R.P, Salunkhe D.K.). 1991. pp. 569-594.

106.Appel H.M. Phenolic in ecological interactions: the impotance of oxidation // Soil physical chemistry. 1992. P. 463.

107.Appel M. H., Schultz J. C. Activity of phenolics in insects may requre oxidation // Plant Polyphenols. NY.: Acad. Press. 1992. P. 609.

108.Arnon D.I., Knaff D.B., McSwain B.D., Chain R.K. Three light reactions and two photosystems of plant photosynthesis // Photochemistry and Photobiology. 1971. V. 14. pp. 397-425.

109.Aro E.A., Hundal T., Carlborg I., Andersson B. In vitro studies on light-induced inhibition of photosystem II and D1-protein degradation at low temperatures // Biochimica et Biophysica acta. 1990. 1019. pp. 269-275.

110.Aro E.A., Carlborg I., Andersson B. Photoinhibition of photosystem II. Inactivation, protein damage and turnover // Biochimica et Biophysica acta. 1993. 1143. pp. 113-134.

11 l.Bashan Y., Okon Y., Henis Y. Peroxidase, polyphenoloxidase and phenols relation to resistance against Pseudomonas syringae pv. Tomato in tomato plants // Can. J. Bot. 1987. V. 65. pp. 366-372.

112.Bilger W., Schreiber U. Chlorophyll luminescence as an indicator of stress-induced damage to the photosynthetic apparatus. Effects of heat-stress in isolated chloroplasts //Photosynthesis research. 1990, 25. pp. 161171.

113.Byrd R.J,W., Fielding A.H., Williams A.H. The role of oxidized polyphenols in the varietal resistance of apples to brown rot // Phenolics in plants in health and desease. Pergamon Press. London. 1960. pp. 95-99.

114.Darvill A.G., Albersheim P. Phytoalexins and their elicitors as defense against microbial infection in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. 1984. Vol.35, pp. 243-275.

115.Daub M.E. Tissue culture and the selection of resistance to pathogens // Ann. Rev. Phytopathol. Palo Alto. 1986. V. 24. P. 159.

116.Del Moral R. On the variability of chlorogenic acid concentration // Oecologia. 1972. 9. pp. 289-300.

117.Dix N.J. Inhibition of fungi by gallic acid in relation to growth on leaves and litter // Trans. Br. Micol. Soc. 1979. V. 73. pp. 332-336.

118.Dixon R.A. Plant tissue culture methods in the study of phytoalexin induction // Tissue culture methods for plant pathologists. Oxford. 1980. P. 278.

119.Doke N., Miura T. Involvement of active oxygen in induction of plant defense against infection and injury // Active oxygen/Oxidative stress and plant metabolism (Eds. Pell E., Steffen K.). Am. Soc. Plant. Physiol. Penn State Univ. 1991. pp. 84-96.

120.Djordjevic M.A., Redmond J.W., Batley M., Rolfe B.G. Clovers secrete specific phenolic compounds which either stimulate or repress nod gene expression in Rhizobium trifolii // EMBO J. 1987. Vol. 6. N 5. pp. 11731179.

121.Ersek A.A., Barna B., Kiraly Z. Role of oxidative stress in plants on the development of necrosis induced by pathogens // Radicals, ions and tissue damage (Eds. Matkovicz B., Karmazin L.) Akademiai Kiado. Budapest. 1990. pp. 1-18.

122.Graham M.J., Graham T.L. Rapid accumulation of anionic peroxidases and phenolic polymers in soybean cotyledon tissues following treatment with Phytophtora megasperma wall glucan // Plant. Physiol. 1991. V. 97. pp. 1445-1455.

123.Grigoriev Yu.S., Prokushkin A.S. et al. Rapid phytoxicity bioassay based on measurement of chlorophyll delayed fluorescence // Abstract book of Second SETAC world congress: Global Environmental Protection: Science, Politics, and Common Sense / Vancouver, 5-9 November 1995. P. 9.

124.Grigoriev Yu.S., Prokushkin A.S. et al. Rapid phytoxicity bioassay based on measurement of chlorophyll delayed fluorescence / Abstract book of Second SETAC World Congress: Global Environmental Protection: Science, Politics, and Common Sense / Vancouver, 5-9 November 1995. P. 9.

125.Grigoriev Yu.S., N.V.Pacharkova, M.A.Buchelnikov, A.S.Prokushkin. Chlorophyll delayed fluorescence as a tool for rapid monitoring of environment pollution. Seventh Annual Meeting of SETAC-Europe, April 6-10 1997, Amsterdam, The Netherlands. Abstract book. № P-13.8, p. 261.

126.Haard N.F. Stress metabolites // Post-harvest physiology and crop preservation / Ed. M. Liberman. NY; L.: Plenum press, 1983. pp. 299-314.

127.Hundal T., Aro E.A., Carlborg I., Andersson B. Restoration of light-induced photosystem II inhibition without de novo protein synthesis // FEBS. V. 267 (2). pp. 203-206.

128.1ngham J.L. Infection resistance and its consequent classification // Phytochemistry. 1976. Vol. 15. P. 1791-1793.

129.1ngram D.S. The expression of R-gene resistance to Phytophtora infestans in tissue culture of Solanum tuberosum // J. Gen. Microbiol. 1967. V. 49. N 9. P. 99.

130.1ngram D.S., Robertson N.F. Interaction between Phytophtora infestans and tissue culture of Solanum tuberosum // J. Gen. Vicrobiol. 1965. V. 40. pp. 431-441.

131.Kolma M., Conn E.E. Tissue distribution of chlorogenic acid and of enzimes involved in its metabolism in leaves of Sorghum bicolor // Plant Physiol. 1982. V. 80. pp. 922-925.

132.Kumar A. Solanum phytoalexins // Mycotoxines and phytoalexins (Eds. SharmaRP, SalunkheDK). 1991. pp. 511-558.

133.Lyon G. Plant/pathogen interactions at the cellular level: a summary and model. 1998. Http://bitrws400.scri.sari.ac.uk.

134.Makovec P., Sindelar L. The effect of phenolic compounds on the activity of respiratory chain enzymes and on respiration and phosphorylation activities of potato tuber mitochondria // Biol. Plant. 1984. Vol. 26. N 6. pp. 415-422.

135.Marigo G. Sur une methode de fractionnement et d'estimation des composes phenoliques chez les vegetaux // Analysis. 1973. N. 2. pp. 106 -

136.Matern U., Kneusel R.E. Phenolic compounds in plant decease resistance //Phytoparasitica. 1988. V. 22. pp. 213-226.

137.Matorin D.N., Ortoidze T.V., Nikolaev G.M., Venediktov P.S. Rubin A.B. Effects of dehydration on electron transport activity in chloroplasts // Photosynthetica 1982. 16 (2). pp. 226-233.

138.Morgun V. N., Grigor' ev Yu. S., Gekhman A. V. The relation of light-induced changes of chlorophyll delayed fluorescence and C02 fixation of plants. Photosynthetica, 1992.- 26(4).- P. 571-577.

139.Moreland D.E., Novitzky W.P. Interference by luteolin, quercetin and taxifolin with chloroplast-mediated electron transport and photophosphorylation // Plant and Soil. 1987. Vol. 98, N 1. P. 145-159.

140.Muller K.O., Borger H. Experimeentelle Untersuchungen über die Phytophtora-Resistenz der Kartoffel // Arb. Biol. Abt. 1981. Berlin. 23. pp. 189-231.

141.Niemera B.A., Hammerschmidt R., Safir G.R. Postharvest Suppression of Potato Dry Rot (Fusarium sambucinum) in Prenuclear Minitubers by Arbuscular Mycorrhizal Fungal Inoculum // American Potato Journal. 1996 73(11). pp. 509-515.

142.Oh H.I., Hoff J.E., Armstrong G.S., Haff L.A. Hydrophobic interaction in tannin-protein complexes // J. Agric. Chem. 1980. V. 28. pp. 394-398.

143.0ssipov V.l., Nurmi K., Loponen J., Prokoiev N., Haukioja E., Pihlaja K. HPLC isolation and identification of flavonoids from white birch Betula pubescens leaves // Biochemical systematics and ecology. 1995. V. 23. N. 3 pp. 213-222.

144.Packham N., Barber J. Recognition of interaction between the donor electron-transfer chains of photosystem II under conditions of partial inhibition of oxygen evolution // Biochimica et Biophysica Acta. 1983. 723. pp. 247-255.

145.Pan S., Mukherjee B., Ganguly A. Antifungal activity of some naturally flavonoids // Ztscr. Pflanzenkrankh. Und pflanzenschuts / 1985. Bd. 92. N 4. pp. 392-395.

146.Partridge J.E. Plant pathology - in public interest. 1998. Http://www.biotech.unl.edu.

147.Perry S.F. Inhibition of respiration by juglone in Phaseolus and Lycopersicon // Bull. Torrey Bot. Club. 1967. Vol. 94, N 1. pp. 26-30.

148.Pierpoint W.S. o-quinones formed in plant extracts. Their reactions with amino acids and peptides // Biochem. J. 1969. V. 112. pp. 609-616.

149.Prokushkin A., Grigoriev Y., Abakumova N. Chlorophyll delayed fluorescence of algae as a biomonitor of toxic effect and pollutant concentration // Abstract book of 17th Annual Meeting: Parterships for the environment: Science, education and policy / Washington, 17-21 November 1996.

150.Reinman S., Mathius P., Conjaeud H., Stewart A. Kinetics of reduction of primary donor of photosystem II: influence of pH in various preparations // Biochimica et Biophysica Acta. 1981. 635. 429-433 pp.

151.Renger G., Schrieber U. Practical applications of fluorometric methods to algae and higher plant research // Light emission by plants and bacteria (Eds. GovinjeeA.J., Fork D.C.). 1986. NY. Academic Press, pp. 587-619.

152.Ride J.P. The role of cell wall alterations in resistance to fungi // Ann. Appl. Bot. 89, pp. 302-306

153.Rhodes MJC The physiological significance of plant phenolic compounds. The biochemistry of plant phenolics. Clarendon Press/ Oxford. 1979. pp. 100-118.

154.Sanchez-Ferrer A., Bru R., Valero E. Changes in pH dependent grape polyphenoloxydase activity during maturation // J. Sci. Food. Agric. 1989. V. 37. pp. 1242-1245.

155.Siegler D., Price P.W. Secondary compounds in plants: primary functions //Am. Nat. 1976. V. 110. pp. 101-105.

156.Stenlid G. Flavonoids as inhibitors of the formation of adenosine triphosphate in plant mitochondria // Phytochemistry. 1970. Vol. 9, N 11. Pp. 2251-2256.

157.Styring S., Carlborg I., Ehrenberg A., Andersson B. Strong light photoinhibition of electrontransport in PII. Impairment of the function of the first quinone acceptor, Qa // Biochimica et Biophysica acta. 1990. 1015. pp. 269-278.

158.Swain T. Secondary compounds as protective agents // Ann. Rev. Plant Physiol. 28, pp. 479-501.

159.Tahara S. The role of plant secondary metabolites in plant-microorganism relationships // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1988. Vol. 62. N 6. pp. 990994.

160.Takahama U. Redox reactions between kaempferol and illuminated chloroplasts // Plant Physiol. 1983.Vol. 71, N 3. pp. 598-601.

161.Thompson, J. N. and Burdon, J. J. Gene-for-gene coevolution between plants and parasites. Nature. 1992. 360:121-125.

162.Virgin I., Salter A., Ghanotakis D., Andersson B. Light-induced D1 protein degradation is catalyzed by serine-type protease // FEBS. V. 287 (1,2). pp. 125-128.

163.Yerkes C.T., Babcock G.T., Crofts A.R. A tris-induced change in the midpoint potential of Z, the donor to photosystem II, as determined by the kinetics of the back reaction // FEBS letters. 1983. V. 158 (2). 359-363 pp.

164.Walsh G. E., Merril R. G. Algal bioassays of industrial and energy process effluents // Environmental toxicology. 1995. Vol. 5, N 3. pp. 567-576

165.Zucker W. Tannins: does structure determines function? An ecological perspective //Amer. Natur. 1983. Vol. 121. pp. 335-365.

166.Zweig G., Hitt I. E., Cho D.H. Possible mechanisms of the mode of action of quinone herbicides // Progress in photosynthesis research / Ed. H. Metzner. Tubingen: Springer, 1969. Vol. 3. pp. 1728-1736.