Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Жуков, Дмитрий Вячеславович

• Жуков, Дмитрий Вячеславович
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Жуков, Дмитрий Вячеславович

Список сокращений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Углеводородные загрязнения окружающей среды

2.1.1. Состав углеводородных загрязнителей: нефти, мазута, нефтешламов

2.1.2. Восстановление почв, загрязненных углеводородами

2.1.2.1. Методы восстановления природных объектов при нефтяных загрязнениях

2.1.2.2. Биологическая очистка почв

2.2. Свойства и применение бактерий рода Rhodococcus в биоремедиации 18 2.2.1 .Общая характеристика микроорганизмов рода Rhodococcus

2.3. ПАУ-разлагающие микроорганизмы

2.4. Механизмы биодеградации углеводородов

2.'4.1. Механизмы биодеградации алифатических углеводородов 25 2.4.2. Механизмы расщепления ароматических УВ 28 2.4.2.1. Расщепление ароматической структуры 28 2.4.2.2 Механизмы биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ)

2.5. Идентификация микроорганизмов в почве 41 2.5.1. Иммунохимические методы идентификации микроорганизмов с акцентом на родококки

2.5.1.1. Реакция иммуноагглютинации

2.5.1.2. Иммунодиффузия

2.5.1.3. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)

2.5.1.4. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

2.5.1.5. Иммуноферментный анализ (ИФА)

3. Материалы и методы

3.1. Объекты исследования

3.1.1. Оптимизация состава питательных сред для масштабированного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»

3.1.2. Полевые испытания препарата «Родер» (сухой формы) для биоремедиации почв, загрязненных углеводородами

3.2. Условия проведения лабораторных экспериментов

3.2.1. Адаптация штаммов к исследуемому субстрату

3.2.2. Изучение закономерности потребления смеси парафинов и дизельного топлива в качестве единственного источника углерода

3.2.3. Проведение скрининга культур микроорганизмов

3.2.4. Выделение чистых культур

3.2.5. Изучение способности клеток сорбировать ПАУ

3.2.6. Изучение закономерности потребления ПАУ в качестве единственного источника углерода и в присутствии косубстрата

3.2.7. Изучение закономерности потребления алифатических углеводородов культурой Pseudomonas sp.

3.2.8. Испытания разработанного ммунохимического анализа штаммов R. ruber и R, erytropolis

3.3. Методы

3.3.1. Гравиметрический анализ почвенных проб

3.3.2. Определение содержания летучих жирных кислот (ЛЖК)

3.3.3. Определение содержания алканов

3.3.4. Определение концентрации ПАУ

3.3.5. Определение концентрации растворимого белка

3.3.6. Определение СОг в газовой фазе

3.3.6. Проведение окраски по методу Грама

3.3.7. Расчет кинетических параметров биодеградации углеводородов

3.3.8. Определение численности микроорганизмов классическим микробиологическим методом

3.3.9. Определение клеток R. ruber и R erythropolis методом ИФА

3.3.9.1. Получение антисывороток против R. ruber и R. erythropolis

3.3.9.2. Сорбция клеток на планшете

3.3.9.3. Тестирование антисывороток

3.3.9.4. Построение калибровочной кривой

3.3.10. Выделение ДНК

3.3.11. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК

3.3.12. Детектирование продуктов ПЦР

3.3.13. Очистка ПЦР-фрагментов

3.3.14. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей

4. Результаты и обсуждение

4.1. Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»

4.2. Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов

4.2.1. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной застарелым мазутом (Обуховский завод, участки №1 и №2)

4.2.2. Биоремедиация препаратом «Родер» железнодорожного шлама

4.2.3. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной нефтью

4.2.4. Сравнительный анализ результатов деградации углеводородных загрязнений препаратом «Родер»

4.3. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D)

4.3.1. Кинетические закономерности биодеградации жидких парафинов адаптированными штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D) 87 '

4.3.2. Кинетические закономерности биодеградации углеводородов дизельного топлива адаптированными штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D)

4.4. Изучение биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ)

4.4.1.Изучение биодеградации ПАУ штаммами R. ruber и R. erythropolis

4.4.2. Скрининг эффективных биодеструкторов ПАУ

4.4.3. Выделение чистой культуры из накопительной культуры 2ПЗ и ее идентификация

4.4.4. Кинетические свойства культуры Pseudomonas aeruginosa при росте на различных углеводородах

4.5. Исследование влияния Р. aeruginosa на рост R. ruber и R. erythropolis

4.6. Совместное потребление ПАУ и гексадекана консорциумом трех штаммов

4.7. Определение концентрации клеток родококков методом ИФА

5. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений»

В настоящее время, проблемы охраны окружающей среды и рационального природопользования, а также повышения уровня экологической безопасности, рассматриваются как первостепенные в общемировом масштабе. Одними из наиболее опасных загрязнителей практически всех компонентов природной среды (поверхностных и подземных вод, почв, растительного покрова и атмосферного воздуха) являются нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие отходы - нефтешламы.

Ежегодно в мире образуются миллионы тонн жидких и твердых отходов нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности. Места хранения таких отходов представляют серьезную опасность для окружающей среды, а многочисленные аварии при добыче, переработке и транспортировки нефти и нефтепродуктов являются причиной масштабных загрязнений природных объектов. Попадая в окружающую среду, ископаемые углеводороды, в частности нефть и продукты ее переработки, не только губят флору и фауну, но и наносят прямой вред здоровью человека (например, некоторые компоненты нефти проявляют канцерогенную активность). При этом самоочищение загрязненных территорий без вмешательства человека длится десятками лет, кроме того, естественная способность окружающей среды к самовосстановлению с каждым годом снижается. Как следствие, остро встает вопрос о необходимости проведения максимально эффективной очистки загрязненных территорий с учетом состава загрязнителей, экономических и экологических и факторов.

Среди всего спектра методов устранения последствий углеводородных загрязнений, биологические методы справедливо признаны в мире наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными. Особенно перспективным является метод биоремедиации, основанный на использовании микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды в процессе своей жизнедеятельности. В процессе биоремедиации углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в углекислый газ, частично переходит в биомассу клеток, и частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве. В настоящее время изучению этой проблемы посвящено большое число научных исследований, и интерес к этой тематике растет. Научные лаборатории всего мира продолжают разрабатывать препараты-нефтедеструкторы, действие которых основано на использовании уникальных возможностей углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в их состав. Тем не менее, при использовании микроорганизмов в биоремедиации возникает ряд проблем.

Например, микробам, часто, и самим нужна определенная помощь, так как в местах сильных загрязнений значительно нарушен необходимый для жизнедеятельности микроорганизмов баланс углерода, азота, фосфора и других питательных компонентов. Для смягчения этой проблемы вместе с препаратами вносятся минеральные и органический удобрения (состав которых специально разрабатывается для конкретного препарата и загрязнения), раскислители почвы (в случае почв с пониженным рН), ПАВы, сорбенты, а также производится периодическая вспашка очищаемых участков для улучшения массообмена.

Кроме того, зачастую препараты проявляют требуемую активность только для загрязнения определенного состава, и присутствие некоторых компонентов нефти в большей концентрации пагубно влияет на общее действие препарата: в качестве примера можно привести загрязнения нефтепродуктами, содержащими повышенное количество смол, асфальтенов, полиароматических углеводородов, которые являются очень токсичными для микроорганизмов. В этом случае для достижения положительных результатов целесообразно использовать методы биоаугментации, т.е., дополнительного внесения микроорганизмов, обладающих повышенной активностью именно к таким компонентам.

Также встает вопрос о том, какое влияние оказывают вносимые с препаратами добавки удобрений на аборигенные сообщества микроорганизмов, так как существуют технологии очистки природных объектов от нефтяных загрязнений, которые основаны на биоремедиации без привлечения микробных препаратов, но использующие активизацию различными способами аборигенной микрофлоры. Поэтому поведение вносимых с препаратом микроорганизмов на фоне аборигенных микроорганизмов и вклад их в процесс биодеградации загрязнения также является важной проблемой. Для ее решения в мире разрабатываются различные методы идентификации и контроля микроорганизмов в почве.

Имеющийся в нашей лаборатории препарат «Родер», состоит из штаммов R. ruber Ac-1513-D и R. erythropolis Ac-1514-D. Он был разработан для ликвидации свежих аварийных разливов нефти и довольно успешно испытывался в различных регионах России для микробиологической очистки водных поверхностей и грунтов от загрязнений углеводородами нефти. В настоящее время востребованы биологические методы облагораживания нефтяных шламов, в том числе отходов НПЗ, железнодорожных шламов, территорий, загрязненных мазутом. Интересным представлялось применение штаммов препарата «Родер» для биоремедиации такого рода загрязнений, изучение самого процесса биоремедиации, его эффективности.

Кроме того, в начале 90-х годов практически полностью прекратилось производство сырья, которое использовалось для полупромышленного получения препарата «Родер» по Регламенту, разработанному в 1994 г. Поэтому встал вопрос о поиске новой сырьевой базы и разработке нового регламента для получения препарата «Родер».

Очень злободневным, в первую очередь для нефтяников, является разработка методов, которые позволили бы доказать, что работают именно микроорганизмы препаратов при ликвидации последствий аварийных разливов нефти, а не аборигенная микрофлора, активизированная внесением удобрений и применением агротехнических мероприятий. Все изложенное выше стало основой исследований, проведенных в настоящей диссертационной работе.

В процессе выполнения диссертационной работы была выявлена недостаточно высокая эффективность деградации ПАУ штаммами препарата «Родер», поэтому встал вопрос о поиске эффективных деструкторов ПАУ для повышения биодеградации нетрадиционных углеводородных загрязнений.

2. Литературный обзор

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Жуков, Дмитрий Вячеславович

5. Выводы

1. Оптимизирован состав питательных компонентов среды для масштабного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер», выход биомассы на оптимизированной среде стал в 1,5 раза больше по сравнению с исходной.

2. Показано, что в результате биодеградации нефтяных загрязнений почвы препаратом «Родер» практически полностью потребляются алифатические углеводороды, а в остатке находятся в основном смолисто-асфальтеновая и полиароматическая составляющие загрязнителя.

3. Были определены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммами R. ruber и R. erythropolis, входящими в состав препарата «Родер».

4. В результате скрининга накопительных культур микроорганизмов, выделенных из различных образцов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, была выбрана культура (2ПЗ), обладающая повышенной активностью по отношению к ПАУ. Из накопительной культуры 2ПЗ был выделен чистый штамм, который методами молекулярной биологии был идентифицирован как Pseudomonas aeruginosa.

5. Были определены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммом Pseudomonas aeruginosa. Было установлено, что выделенный штамм обладал в 3 раза большей удельной метаболической активностью по отношению к ПАУ, чем штаммы препарата «Родер».

6. Было показано, что штамм Р. aeruginosa не оказывает отрицательного влияния на рост штаммов R. ruber и R. erythropolis и при совместном использовании трех штаммов активность к ПАУ возрастает в 2 раза за счет присутствия штамма Р. aeruginosa. Показана принципиальная возможность использования консорциума трех штаммов при биодеградации загрязнений, содержащих повышенное (выше 50%) количество ПАУ.

7. Разработана методика для количественного определения штаммов R. ruber и R. erythropolis в жидких средах и в почве на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Жуков, Дмитрий Вячеславович, 2008 год

1. Мурыгина В.П., Войшвилло Н.Е., Калюжный С.В. "Биопрепарат "Родер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов". Патент РФ № 2174496. -2001.

2. Методы и средства борьбы с нефтяным загрязнением вод Мирового океана //Под. ред. Нестеровой М.П. JI.: Гидрометеоиздат. - 1989. - 208 с.

3. Вылкован А.И., Венцюлис Л.С., Зайцев В.М, Филатов В Д. Современные методы и средства борьбы с разливами нефти // Санкт-Петербург: Центр-Техинформ. - 2000. - 204 с.

4. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. // Практическое руководство.- Санкт-Петербург. 2000. - 250 с.

5. Rosenberg Е., Ron E.Z. Bioremediation of Petroleum Contamination. // Bioremediation: principles and applications. Cambridge University Press. New York. USA. 1996. - P. 100-124.

6. Десяткин, А.А. Разработка технологии утилизации нефтяных ш'ламов: Дис. канд. тех. наук. Уфа: Уфимский государственный нефтяной технический университет. - 2007 . -183 с.

7. Баннов П.Г. Процессы переработки нефти. М.: ЦНИИТЭ Нефтехим. - 2000. - 224 с.

8. Peneda-Flores G., Mesta-Howard A.M. Petroleum asphaltenes: generated problematic and possible biodegradation mechanisms // Microbiología. 2001. - V.3. - P: 143-150.

9. Арчегова И.Б. Рекультивация земель на Севере. Рекомендации по рекультивации земель на Крайнем Севере // Вып. 1, Изд. второе (дополненное). Сыктывкар: УрО РАН. -1997.- 34 с.

10. Гарейшина А.З., Ахметшина С.М., Гараев И.Х. Комплексная технология ликвидации нефтяных загрязнений с дальнейшей рекультивацией почвы.// Нефтяное х-во. 1998. - № 2. - С. 69 - 70. .

11. Wild J.R., Varfolomeyev S.D., Scozzafava A. Perspectives in bioremediation: technologies for environmental improvement // NATO Science Partnership Sub-series 3: High Technology, Kluwer Academic Publishers Group. 1997. - V. 19. - 140 p.

12. Шульгин А.И. Эффективная технология рекультивации нарушенных земель // Экология и промышленность России. 2000. - №. 3. - С. 29 - 32.

13. Alexander M. Biodégradation and Bioremediation. San Diego: Academic Press. - 1994. -302 p.

14. Orszulik S.T. Environmental technology in the oil industry New York: Blackie Academic & Professional. - 1997. - 401 p.

15. Bioremediation: principles and applications / Ed. Crawford R.L., Crawford D.L.; New York: Cambridge University Press. 1996. - 412 p.

16. Brusseau M.L., Miller R.M., Zhang Y., Wang X., Bai G.Y. Biosurfactant- and cosolvent-enhanced remediation of contaminated media // Surfactant Enhanced Subsurface Remediation, ACS Symposium Series 594, American Chemical Soc. 1995. - 594 p.

17. Мурыгина В.П., Аринбасаров М.У., Калюжный C.B. Очистка водной поверхности и грунтов от нефтяных загрязнений биопрепаратом "Родер" // Экология и промышленность России. 1999 - № 8. - С. 16-19.

18. Valentina P. Murygina, Maria Y. Markarova, and Sergey V. Kalyuzhnyi. Application of biopreparation "Rhoder" for remediation of oil polluted polar marshy wetland in Komi Republic // Environment International. 2005. - V. 31. - P. 163-166.

19. Murygina, V., Markarova M., Kalyuzhnyi S. Experience of preparation "Rhoder" applications for bioremediation of oil-polluted polar marshy wetland in Komi Republic // Proc. 8th Int. Biorem. Symp. Baltimore, USA. - 6-9 June 2005. - V. 1. - P. 290 - 294.

20. Ouyang Wei, Liu Hong, Murygina V., Yu Yongyong, Xiu Zengde, Kalyuzhnyi S. Comparison of bio-augmentation and composting for remediation of oily sludge: A field-scale study in China // Proc. Biochem. 2005. - V. 40. - P. 3763-3768.

21. Коронелли T.B., Комарова Т.И., Игнатченко A.B. Взаимодействие псевдомонад и микобактерий в смешанной культуре при окислении углеводородов // Микробиология. -1984. Т. 53. - №. 2. - С. 213 - 217.

22. Гусев М.В., Коронелли Т.В., Королев Ю.Н. Изучение динамики накопления и утилизации углеводородов клетками Mycobacterium paraffinicum с помощью ИК-спектроскопии // Микробиология. 1978. - Т. 47. - №. 6. - С.1025 - 1029.

23. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Игнатченко А.В. Роль эмульсификаторов в адсорбции углеводородов клетками Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1983. - Т. 52. - №. 1. - С. 94 - 97.

24. Коронелли Т.В., Калюжная Т.В. Изменение в структуре сапрофитных микобактериальных клеток под действием изоназидов // Микробиология. 1983. - Т. 52. -№. 2. - С. 278 - 282.

25. Golovleva L.A., Aliyeva R.M., Naumova R.P., Gvozdyak, P.I. Microbial bioconversion of pollutants // Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 1992. - V. 124. - P. 41 -78.

26. Скрябин Г. К., Головлева JI. А. Биотехнология очистки окружающей среды от ксенобиотиков. //Изв. АН СССР: Сер. Биологическая. 1986. - № 6. - С. 805 - 813.

27. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С. С. Микробиологическая очистка воды. -Киев: Наук. Думка. 1978. - 266 с.

28. Квасников Е. И., Клюшникова Т. М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах. - Киев: Наук, думка. - 1982. - 132 с.

29. Goodfellow М. Numerical taxonomy of some nocardioform bacteria // J. Gen. Microbiol. 1971.-V. 69.-№. l.-P. 33 80.

30. Broughton R. E., Wilson H. D., Goodman N. L. Septic arthritis and osteomyelitis caused by an organism of the genus Rhodococcus II J. Clin. Microbiol. 1981. - V. 13. - P. 209 - 213.

31. Нестеренко О. А., Ногина Т. M., Квасников Е. И. Циклы развития некоторых коринеподобных и нокардиоподобных бактерий // Микробиология. 1978. Т. 49. - № 6. -С. 952 - 959.

32. Rowbotham Т. J., Cross Т. Rhodococcus coprophilus sp. no v.: an aerobic nocardioform actinomycete belonging to the rhodochrous complex II J. Gen. Microbiol. 1977. - V. 100. - P. 123 - 138.

33. Красильников H. А., Коронелли Т. В., Калюжная Т. В. Окрашенные парафинокисляющие микобактерии // Микробиология. 1972. - Т. 41. - № 3. - С. 513 - 516.

34. Daisuke Кота, Yuichi .Sakashita, Kenzo Kubota, Degradation of car engine oil by Rhodococcus sp. NDKK48 and Gordonia sp NDKY76A // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. -V. 67.-№. 7.-P. 1590-1593.

35. Pommier M.T., Mishael G. Isolation and characterization of an O-methylglucose-containing lipopolysaccharide produced by Nocardia otitidis-caviarum // J. Gen. Microbiol. 1986. - V. 132.-№. 9.-P. 2433 -2441.

36. Rapp P., Bock H., Wrai V., Wagner F. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from R. erythropolis grown on n-alkanes // J. Gen. Microbiol. 1979. - V. 115. - P. 491 -503.

37. Батраков С.Г., Мухитдинова О.А., Бергельсон Л.Д., Коронелли Т.В. Липиды микобактерий. Аналог корд-фактора с нормальными С12 С16 -жирными кислотами из Mycobacterium paraffinicum II Биоорган. Химия. - 1979. - Т. 5. - С. 1495 - 1503.

38. Luz М., Paje F., Neilan В.A., Couperwhite I. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene 11 Microbiology. 1997. - V. 143. - P. 2975-2981.

39. Квасников E. И., Нестеренко О. А., Романовская В. А., Касумова- С. А. Микроорганизмы родов Nocardia и Micobacterium, использующие природные и индивидуальные газообразные углеводороды // Микробиология. -1971. Т. 40. - № 2. - С. 280-288.

40. Steffen Т., Hatakka A., Hofrichter М. Degradation of benzoa.pyrene by the litter-decomposing basidiomycete Stropharia coronilla: role of manganese peroxidase. // American Society for Microbiology. 2003. - V. 69. - №. 7. - P. 3957-3964.

41. Habe H., Omori T. Genetics of Polycyclic Aromatic hydrocarbon metabolism in diverse bacteria. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67. P. 225-243.

42. Grund E., Denecke В., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. Strain B4 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 57. - P. 3462-3469.

43. Muller J.G., Chapman P.J., Pritchard P.H. Isolation and characterization of a fluoranthene-utilizing strain of Pseudomomas paucimibilis II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - №. 6.-P. 1079-1086.

44. Weissinfels W.D., Beyer M., Klein J. Degradation of phenanthrene, fluorine and fluoranthene by pure bacterial cultures. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 32. - P. 479484.

45. Komatsu T., Omori T., Kodama T. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons acenaphthene and acehaphthylene by a pure bacterial culture // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. - V. 57. - P. 864-865.

46. Ellis B., Harold P., Kronberg H. Bioremediation of a creosote contaminated site // Environ. Technol. 1991. -V.12. - P. 447-459.

47. Holt J., Ilothem S., Howerlon H., Larson R. 9,10-Phenanthrenequinone Photoautocatalyzes its Formation from Phenanthrene, and Inhibits Biodégradation of Naphthalene // J. Environ. Quality. 2005. - V. 34. - P. 462-468.

48. Barclay C. D., Farquhar G. F., Legge R. L. Biodégradation and sorption of polyaromatic hydrocarbons by Phanerochaele chrysosporium 11 Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 42. -P. 958-963.

49. Bouchez M., Balanchet D., Besnainou B. Kinetic studies of biodégradation of insoluble compounds by continuous determination of oxygen consumption. // J. Appl. Microbiol. 1997. -V. 82.-P. 310-316.

50. Jonathan W. C. Wong, Min Fang, Zhenyong Zhao, Baoshan Xing. Effect of surfactants on solubilization and degradation of phenanthrene under thermophilic conditions. // J. Environ. Quality. 2004. - V. 33. - P. 2015-2025.

51. Stefan J. Grimberg, William T. Stringfellow, Michael D. Aitken. Quantifying the biodégradation of phenanthrene by Psendomonas stutzeri P16 in the presence of a nonionic surfactant. //Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - №. 7. - P. 2387-2392.

52. Boonchan S., Margaret L. B., Grant A. S. Degradation and mineralization of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 66. - №. 3. - P. 1007-1019.

53. Sepic E., Bricelj M., Leskovsek H. Biodégradation studies of polyaromatic hydrocarbons in aqueous media. //J. Appl. Microbiol. 1997. - V. 83. - P. 561-568.

54. Heath D.J., Lewis C.A., Rowland S.J. The use of high temperature gas chromatography to study the biodégradation of high molecular weight hydrocarbons // Org. Geochem. 1997. - V. 26. - №. 11-12. - P. 769-785.

55. Setti L., Lanzarini G., Pifferi P.G., Spagna G. Further research in the aerobic degradation of n-alkanes in a heavy oil by a pure culture of Pseudomonas sp. // Chemosphere. 1993. - V. 26. -№. 6.-P. 1151 - 1157.

56. Sharma S.L., Pant A. Biodégradation and conversion, of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp II Biodégradation. 2000. - V. 11. - P. 289 - 294.

57. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. M.: "Мир". - 1982. - 310 с.

58. Maeng J.H., Sakai Y., Tani Y., Kato N. Isolation and characterization of a novel oxygenase that catalyzes the first step of n-alkane oxidation in Acinetobacter sp. strain M-l // J. Bacteriol. -1996. V. 178. - №. 13. - P. 3695 - 3700.

59. Vasu R. Parekh, Traxler R. W., Sobek J. M. N-Alkane oxidation enzymes of a Pseudomonas II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 57. - №. 4. - P. 881 - 884.

60. Sutherland J.B., Selby A.L., Freeman J.P., Evans F.E. Metabolism of phenanthrene by Phanerochaete chrysosporium II Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - №. 11. - P. 3310 -3316.

61. Chi Ming So, Young L.Y. Initial reactions in anaerobic alkane degradation by a sulfate reducer, Strain AK-01 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - №. 12. - P. 5532 - 5540.

62. Young L.Y., Phelps C.D. Metabolic biomarkers for monitoring in situ anaerobic hydrocarbon degradation // Environmental Health Perspectives. 2005. - V. 113. - №. 1. - P. 62 - 67.

63. Cheng Q., Thomas S.M., Kostichka K., Valentine J.R., Nagarajan V. Genctic Analysis of a Gene Cluster for Cyclohexanol Oxidation in Acinetobacter sp. Strain SE 19 by In Vitro Transposition // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - №. 17. - P. 4744 - 4751.

64. Tadashi F., Tatsuya N., Koji T., Junichi K. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. - V. 68. -№. 10. - P. 2171 - 2177.

65. Bugg T.D.H., Winfield C.J. Enzymatic cleavage of aromatic rings: mechanistic aspects of the catechol dioxygenases and later enzymes of bacterial oxidative cleavage pathways // Nat. Prod. Rep. 1998.-V. 15. - №. 5. - P. 513 - 530.

66. Asturias J.A., Timmis K.N. Three different 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase genes in the gram-positive polychlorobiphenyl-degrading bacterium Rhodococcus globerulus P6 // J. Bacteriol. 1993.-V. 175.-P. 4631 -4640.

67. Bumpus J.A., Tien M., Wright D., Aust S.D. Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus // Science. 1985. - V. 228. - №. 21. - P. 1434 - 1436.

68. Cerniglia C.E., Freeman J.P., White G.L., Heflich R.H., Miller D.W. Fungal metabolism and detoxification of the nitropolycyclic aromatic hydrocarbon 1-nitropyrene // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 50. №. 3. - P. 649 - 655.

69. Cerniglia C.E., White G.L., Heflich R.H. Fungal metabolism and detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons // Arch. Microbiol. 1985. - V. 143. №. 2. - P. 105 - 110.

70. Haak B, Fetzner S., Lingens F. Cloning, nucleotide sequence, and expression of the plasmid-encoded genes for the two-component 2-halobenzoate 1,2-dioxygenase from Pseudomonas cepacia 2CBS // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - №. 3. - P. 667 - 675.

71. Haemmerli S.D., Leisola M.S.A., Sanglard D., Fiechter A. Oxidation of benzo(a)pyrene by extracellular ligninase of Phanerochaete chrysosporhm II J. Biol. Chem. 1986. - V-. 261. - P. 6900 - 6903.

72. Mason J. R., Cammack R. The electron-transport proteins of hydroxylating bacterial dioxygenases // Annu. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 277 - 305.

73. Massey V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins // J. Biol. Chem. -1994. V. 269. - №. 36. - P. 22459 - 22462.

74. Nakatsu C.H., Wyndham R.C. Cloning and expression of the transposable chlorobenzoate-3,4-dioxygenase genes of Alcaligenes sp. strain BR60. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. -№ 11.-P. 3625-3633.

75. Neidle E.L., Hartnett C., Ornston L.N. Characterization of Acinetobacter calcoacelicus catM, a repressor gene homologous in sequence to transcriptional activator genes // J. Bacteriol. 1989. -V. 171,-№ 10.-P. 5410 - 5421.

76. Van der Meer J.R. Evolution of novel metabolic pathways for the degradation of chloroaromatic compounds // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. - V. 71. № 1 - 2. - P. 159 - 178.

77. Rabus R., Kube M., Beck A., -Widdel F., Reinhardt R. Genes involved in the anaerobic degradation of ethylbenzene in a denitrifying bacterium, strain EbNl // Arch. Microbiol. 2002. -V. 178. №. 6. - P. 506- 516.

78. Kanaly R.A., Harayama S. Biodégradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - №. 8. - P. 2059-2067.

79. Loh K.C., Chua S.S. Ortho pathway of benzoate degradation in Pseudomonas putida: induction of meta pathway at high substrate concentrations // Enzyme Microb. Technol. 2002. -V. 30. - P. 620 - 626.

80. Dagley S. A biochemical approach to some problems of environmental pollution // Essays Biochem. 1975. - Y. 11. - P. 81 - 138.

81. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonads. The ring-fission mechanism // Biochem. J. 1964. - V. 91. - P. 251-261.

82. Ensley B.D., Gibson D.T. Naphthalene dioxygenase: purification and properties of.a terminal oxygenase component// J. Bacteriol. 1983. - V. 155. - №. 2. - P. 505-511.

83. Ensley B.D., Gibson D.T., Laborde A.L. Oxidation of naphthalene by a multicomponent enzyme system from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816 // J. Bacteriol. 1982. - V. 149. - №. 3. - P.948-954.

84. Grund E., Denecke B., Eichenlaub R. Naph- other carriers for encapsulation of microbial cells thalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - №. 6. - P. 1874-1877.

85. Monticello D. J., Bakker D., Schell M., Finnerty W. R. Plasmid-borne Tn5 insertion mutation resulting in accumulation of gentisate from salicylate // Appl. Environ. Microbiol. -1985,-V. 49.-№.4.-P. 761-764.

86. Jimenez J.I., Miñambres B., García J.L., Díaz E. Genomic analysis of the aromatic catabolic pathways from Pseudomonas putida KT2440. // Environ. Microbiol. 2002. - V. 4. - №. 12. - P. 824-841.

87. Dean-Ross D., Moody J.D., Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. Metabolism of anthracene by a Rhodococcus species // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 204. - P. 205-211.

88. Samanta S.K., Chakraborti A.K., Jain R. K. Degradation of phenanthrene by different bacteria: evidence for novel transformation sequences involving the formation of 1-naphthol. // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. - V. 53. - №. 1. - P. 98-107.

89. Heitkamp M.A., Freeman J.P., Miller D.W., Cerniglia C.E. Pyrene degradation by a Mycobacterium sp.: identification of ring oxidation and ring fission products. // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - №. 10. - P. 2556-2565.

90. Van Hamme D. J., Singh A., Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology. // Microbiology and Molecular. Biology Reviews. 2003. - V. 67. - №. 4. - P. 503-549.

91. Cerniglia C.E., Althaus J.P., Evans F.E., Freeman J.P. Fungal metabolism of acenaphthene by Cunninghamella elegcms. II Chem. Biol. Interact. 1983. - V. 44. - №. 1-2. - P. 119-132.

92. Cerniglia C.E., Campbel W.L., Freeman J.P., Fu P.P. Evans F.E. Stereoselective fungal metabolism of methylated anthracenes. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - №. 3. - P. 661-668.

93. Cerniglia C.E., Yang S.K. Enantiomeric composition of the ¿rcms-dihydrodiols produced from phenanthrene by fungi // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - №. 1. - P. 119-135.

94. Field J.A., de Jong E., Feijoo Costa G., de Bont J.A.M. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by new isolates of white-rot fungi. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. -V. 58.-№.7.-P. 2219-2226.

95. Hammel K.E., Gai W.Z., Green В., Moen M.A. Oxidative degradation of phenanthrene by the ligninolytic fungus Phanerochaete chrysosporium. II Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. -№. 6. - P. 1832.

96. Muyzer G., Brinkhoff N., Nubel U., Santegoeds C., Shaffer H Wawer C. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In.: Molecular microbial ecology manual. Kluver Academic Publishers. The Netherlands. - 1997. - P. 1 - 27.

97. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментпого анализа. М.: Изд. Высш. Шк. - 1991. - 288 с.

98. Ившина И. Б. Экспрессные методы диагностики углеводородокисляющих родококков // Экология, человек и проблемы охраны природы. УНЦ АН СССР. - 1983. - С. 44 - 56.

99. Ouchterlony О. Gel Diffusion Techniques. // In: Immunological methods. Oxford, Blackwell, London. - 1964. - V. 16. - P. 55-78.

100. Mancini G., Carbonara A., Heremans G. Immunological quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. // Immunochemistry. -1965. -V. 2. № 3. - P. 235-254.

101. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. М.: Изд. Колосс. - 2003. - 432 с.

102. Ившина И.Б., Кеворков Н.Н., Коблова И.В. Идентификация бактерий рода Rhodococcus, используя метод иммунодиффузии // Микробиология. 1982. - Т.51. - №. 4. -С. 636 - 641.

103. Ившина И.Б., Коблова И.В., Безматерых Г.И. Идентификация бактерий рода Rhodococcus с помощью метода иммунодиффузии // Микробиол. Журн. 1986. - Т.48. - № 2.-С. 8- 13.

104. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А., Кеворков Н.Н. Антигенная структура родококков, культивированных на различных средах // Микробиология. 1985. - Т. 54. - №. 2. - С. 290 -292.

105. Ившина И.Б., Гвоздяк О.Р., Богомягкова О.А., Шкаруба В.В. Использоваение метода иммунодиффузионного анализа для определения штаммов микрококков // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №. 1. - С 78-82.

106. Gillis Т.Р., Thompson J.J. Double-Label Fluorescence Immunoassay of Bacteria // J. Clin. Microbiol. 1978. - V. 8. - № 3. - P. 351-353.

107. Барбан П.С., Пшеничков P.A., Пантюхина A.H., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск: УрО РАН. - 1988. - 175 с.

108. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Никифоров Н.В. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в почву // Материалы Международной Конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Россия. 14-16 сентября 2005.-С. 87-88.

109. Brigmon R.L., Bitton G., Zam S.G., O'Brien В. Development and application of a monoclonal antibody against Thiothrix spp. II Appl Environ. Microbiol. 1995. -V. 61. - № 1. -P. 13-20.

110. Watanabe K., Hino S. Identification of a functionally important population in phenol-digesting activated sludge with antisera raised against isolated bacterial strains // Appl Environ. Microbiol. 1996. -V. 62. - № 10. - P. 3901-3904.

111. Рыбак Б.М. Анализ нефти и нефтепродуктов. М.: Гостоптехиздат. 1962. - 888 с.

112. Скляр В. И. Биокаталитические системы получения водорода и метана: Дис. канд. хим. наук. Фрунзе: Институт органической химии АН Киргизской ССР. - 1987. - 154 с.

113. Р. Дорсон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М.: Мир. -1991.- 543 с.

114. С. Д. Варфоломеев, С.В. Калюжный. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высш. Шк. - 1990. - 295 с.

115. Birnboim НС, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. - №. 6. - P. 1513-1523

116. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. -chichester UK: Academic Press. 1991. - P. 115-175.

117. Sanger F., Nicklen S., Coulsen A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.

118. Незлин P.C. Строение и биосинтез антител. М.: Наука. - 1969. - С. 65-93.

119. Опытно-промышленный регламент на производство препарата-нефтедеструктора Родер 7113020480 11- 05. Москва 2005 г.