Закономерности формирования резистентности организма к Bacillus anthracis под влиянием искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба (экспериментальное исследование) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.16, кандидат биологических наук Колесникова, Ольга Борисовна

• Колесникова, Ольга Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Колесникова, Ольга Борисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ

ВАКЦИН ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ.

1.1 Состцр и топография антигенов Bacillus anthracis.

1.2 Современные представления о механизмах фагоцитоза

В. anthracis и его роли в формировании резистентности макроорганизма

1.3 Сибиреязвенные вакцинные препараты и принципы их конструирования

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Экспериментальные животные.

2.2 Штаммы бактерий.

2.3 Питательные среды.

2.4 Выращивание микробной массы.

2.5 Приготовление антигенных комплексов.

2.5.1 Получение антигенного комплекса КС + ПА + белок С путем конъюгирования глутаральдегидом.

2.5.2 Получение антигенного комплекса КС + ПА + белок С путем конъюгирования дигидратом адипиновой кислоты.

2.6 Определение физико-химических свойств полученных антигенов.-.

2.7 Иммунохимические и иммунобиологические методы исследования антигенов.

2.8 Получение макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов

2.8.1 Получение резидентных перитонеальных макрофагов

2.8.2 Получение полиморфноядерных лейкоцитов.

2.9 Определение адгезивной активности макрофагов.

2.10 Определение фагоцитарной активности макрофагов.

2.11 Определение метаболитов кислорода в фагоцитах.

2.12 Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

2.13 Определение активности НАДФ-Н-оксидазы.

2.14 Определение активности миелопероксидазы.

2.15 Определение содержания неферментных катионных белков

2.16 Определение активности NO-синтазы.

2.17 Определение активности супероксиддисмутазы.

2.18 Определение цитокинпродуцирующей активности фагоцитов.

2.19 Статистические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3 ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ИСКУССТВЕННЫХ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА PER SE И ПРИ ОДНОВРЕМЕННОМ ПРИМЕНЕНИИ С ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМИ ПРЕПАРАТАМИ.

ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO ФАГОЦИТИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МОНО- И ПОЛИНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ МОРСКОЙ СВИНКИ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С В. ANTRACIS И ЕГО ИСКУССТВЕННЫМ АНТИГЕННЫМ КОМПЛЕКСОМ В СОЧЕТАНИИ С ИММУНОМОДУЛЯТОРАМИ.

4.1 Влияние антигенов сибиреязвенного микроба в сочетании с арабиногалактаном и скваленом на показатели фагоцитарной активности макрофагов морской свинки.

4.2 Бактерицидные системы фагоцитов при взаимодействии с сибиреязвенным микробом и его искусственными антигенными комплексами.

4.2.1 Кислородзависимый метаболизм фагоцитов морской свинки.

4.2.2 Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы перитоне-альных макрофагов морской свинки.

4.2.3 Активность НАДФ-Н-оксидазы перитонеальных макрофагов морской свинки.

4.2.4 Активность супероксиддисмутазы.

4.2.5 Активность миелопероксидазы.

4.2.6 Содержание неферментных катионных белков.

4.2.7 Продукция монооксида азота фагоцитирующими клетками.

4.2.8 Цитокинпродуцирующая активность фагоцитов.

ГЛАВА 5 РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА.

5.1 Влияние искусственных антигенных комплексов сибиреязвенного микроба, арабиногалактана и сквалена на функциональные особенности фагоцитов морской свинки in vivo.

5.1.1 Адгезивные свойства фагоцитов.

5.1.2 Фагоцитарная активность макрофагов и завершенность фагоцитоза.

5.2 Действие искусственных антигенных комплексов сибиреязвенного микроба и иммуномодуляторов на бактерицидные механизмы фагоцитов экспериментального животного.

5.2.1 Кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов морской свинки.

5.2.2 Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы.

5.2.3 Синтез монооксида азота фагоцитами морской свинки.

5.2.4 Активность миелопероксидазы.

5.2.5 Содержание неферментных катионных белков.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Закономерности формирования резистентности организма к Bacillus anthracis под влиянием искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба (экспериментальное исследование)»

Актуальность проблемы

Сибирская язва, являющаяся особо опасным инфекционным заболеванием людей и животных, остается важной проблемой для здравоохранения и ветеринарии [42, 48]. Потенциальная возможность заражения человека Bacillus anthracis поддерживается не только периодически возникающими эпизоотиями болезни, но и существованием множественных почвенных очагов, распространенных на всех континентах и не регистрирующихся лишь на немногих островных территориях [64, 65].

Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана еще и с тем, что В. anthracis остается в списке объектов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что особенно наглядно проявилось событиями 2001 года в США. В связи с этим, продолжение детального изучения иммунологии сибирской язвы и протективных свойств ее возбудителя в настоящее время весьма актуально [17, 95, 104, 108, 147].

Анализ результатов экспериментальных и практических наблюдений, свидетельствует о необходимости разработки новых безопасных и эффективных вакцин против сибирской язвы на основе протективных бактериальных антигенов или их рекомбинантных аналогов [103, 105, 129, 185, 232].

Исследование пригодности различных субклеточных фракций В. anthracis с привлечением иммуномодуляторов и адъювантов, обеспечивающих целенаправленное действие на иммунную систему организма человека и животных, может определить принципы отбора и конструирования высокоиммуногенных препаратов, пригодных для специфической иммунопрофилактики сибирской язвы.

Недостаточная эффективность и ограниченные возможности применения современных сибиреязвенных вакцин на основе живых клеток или их фрагментов определяет актуальность для практического здравоохранения разработки высокоэффективных, но слабо реактогенных химических вакцин [1, 7, 8].

Цель исследования - выявить закономерности формирования резистентности организма к В. anthracis под действием искусственного антигенного комплекса, созданного на основе протективного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба в сочетании с иммуномо-дуляторами.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Изучить фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба и его антигенов.

2. Исследовать активность фагоцитов, определяющую бактерицидный потенциал перитонеальных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов при поглощении искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба.

3. Сопоставить бактерицидную активность в отношении В. anthracis перитонеальных макрофагов морских свинок, иммунизированных живой сибиреязвенной вакциной и экспериментальным иммунным комплексом в сочетании с иммуномодуляторами.

4. Испытать в экспериментальных условиях иммуногенные препараты на протективную эффективность по отношению к высоковирулентному штамму возбудителя сибирской язвы.

Научная новизна

Впервые на основе исследований искусственного антигенного препарата (ДАК-конъюгат), состоящего из изолированных клеточных стенок, протективного антигена и белка С сибиреязвенного микроба показано, что примированные ДАК-конъюгатом и иммуномодуляторами фагоциты экспериментальных животных продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а), обеспечивающие запуск каскада иммунных реакций; активируются системы, способствующие захвату (хемотаксис, адгезия, поглощение) и внутриклеточной деградации микроба путем одновременной активации кислород-зависимых,. нитроксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов.

Приоритетными являются данные о том, что в процессе иммуногенеза, вызванном искусственным антигенным комплексом, имеет место активация фагоцитарного процесса за счет повышения функциональной способности, в. частности бактерицидного потенциала макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов.

Экспериментально доказано, что искусственный антигенный комплекс обладает иммуногенной и протективнойактивностью.

Показана принципиальная возможность повышения* протективных свойств искусственного антигенного комплекса за счет использования им-муномодуляторов естественного происхождения- (арабиногалактан, сква-лен).

Теоретическое и практическое значение работы

G учетом современных представлений о факторах вирулентности сибиреязвенного микроба изучены особенности формирования резистентности макроорганизма экспериментальных животных, что уточняет и дополняет знания о патогенезе, иммуногенезе этой особо опасной инфекции и позволяет целенаправленно воздействовать на отдельные этапы фагоцитарного процесса.

Разработаны методологические подходы и принципы конструирования искусственного антигенного препарата (ДАК-конъюгат) на основе изолированных клеточных стенок, протективного антигена и белка С В. ап-thracis СТИ-1 обладающего иммуногенной и протективной активностью.

Показано, что арабиногалактан и сквален при одновременном введении морским свинкам с конъюгатом белковых препаратов и клеточных стенок, химически связанных дигидратом адипиновой кислоты, повышают протективную активность этого иммуногенного комплекса, что проявляется увеличением числа выживших экспериментальных животных, инфицированных сибиреязвенным микробом.

Патогенетически обоснована возможность тестирования степени активности фагоцитирующих клеток в ответ на введение стимулирующего агента и функций, связанных с бактерицидной способностью для характеристики неспецифической резистентности организма.

Результаты работы послужили основой для разработки и модификации методов изучения бактерицидных механизмов фагоцитоза и иммунной перестройки организма, которые отражены в методических рекомендациях «Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (2008 г.). Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского, Ставропольского противочумных институтов, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН.

Положения, выносимые на защиту

1. Искусственный антигенный комплекс, созданный на основе протек-тивного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба, обладает иммуногенной и протективной активностью. Иммуномодуляторы естественного происхождения (сквален, арабиногалактан) повышают про-тективные свойства ДАК-конъюгата, что проявляется увеличением числа выживших экспериментальных животных (в 1,5-2,0 раза), инфицированных В. anthracis.

2. Фагоциты, стимулированные искусственным антигенным комплексом (ДАК-конъюгат) в сочетании с иммуномодуляторами продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а), индуцирующие запуск каскада иммунных реакций и активацию систем, способствующих захвату и внутриклеточной деградации микроба путем стимуляции кислородзависимых, нит-роксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. В процессе иммуногенеза, вызванного ДАК-конъюгатом, активируются клеточные факторы иммунитета за счет повышения функциональной способности, в частности, бактерицидного потенциала макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов.

Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, представлены на:

• Международной научной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004);

• Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика РАМН СССР С.П. Карпова (Москва, 2004);

• Научно-практической конференции «Противочумная служба в России и ее роль в обеспечении эпидемического благополучия в России» (Москва, 2004);

• Всероссийской научной конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004);

• VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств — участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);

• Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007);

• Региональной научной конференции «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Республики Бурятия» (Улан-Удэ, 2007);

• Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины — 2008» (Санкт-Петербург, 2008);

• Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008);

• научных конференциях Иркутского противочумного института (2002-2008).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 15 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, одна монография «Структура и иммуномодули-рующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его метал-лопроизводных».

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками. Список литературных источников содержит 238 наименований, в том числе 172 - зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Колесникова, Ольга Борисовна

107 ВЫВОДЫ

1. Искусственный антигенный комплекс, созданный на основе высоко-очищенных препаратов клеточных стенок, протективного антигена и белка С сибиреязвенного микроба — ДАК-конъюгат — не токсичен при парентеральном введении экспериментальным животным (морские свинки, белые мыши), обладает иммуногенной и протективной активностью, сопоставимой или превышающей специфическую активность вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

2. При стимуляции ДАК-конъюгатом in vitro макрофагов морской свинки фагоцитарные реакции в отношении В. anthracis СТИ-1 носят незавершенный характер. ДАК-конъюгат in vitro стимулирует кислородзависимые, нитроксидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

3. ДАК-конъюгат in vitro при совместном применении с арабиногалактаном и скваленом стимулирует синтез медиаторов воспаления (ФНО-а), обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза сибиреязвенного микроба. Арабиногалактан и сквален оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, повышая функциональную способность фагоцитирующих клеток.

4. ДАК-конъюгат при совместном парентеральном применении с арабиногалактаном и скваленом повышает резистентность организма экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба за счет активации бактерицидных систем фагоцитов в большей степени, чем живая сибиреязвенная вакцина.

5. Возросший антимикробный потенциал макроорганизма, обусловленный ДАК-конъюгатом при сочетанном введении с иммуномодуляторами, обеспечивает увеличение числа выживших экспериментальных животных (в 1,5-2,0 раза) при инфекционном процессе, вызванном В. anthracis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на успехи в изучении протективных антигенов сибиреязвенного микроба, единственным препаратом для специфической профилактики сибирской язвы в России в настоящее время продолжает оставаться сибиреязвенная вакцина СТИ, сконструированная на основе аттенуиро-ванных живых клеток В. anthracis еще в прошлом веке. Как и многие живые вакцины другого микробного профиля, вакцина СТИ обладает нежелательными побочными свойствами, недостаточно эффективна и не пригодна для применения на фоне неспецифической профилактики сибирской язвы антибиотиками [39, 66, 187, 227, 228].

В странах Европы, Северной Америки, других регионов мира на протяжении многих лет используется сибиреязвенная вакцина, сконструированная на основе протективного, в том числе рекомбинантного, антигена сибиреязвенного микроба. Препарат лишен многих балластных компонентов, свойственных живой вакцине, более безопасен, но заметно уступает последней по специфической протективной эффективности [228].

Анализ результатов экспериментальных и практических наблюдений свидетельствует о необходимости разработки новых безопасных и эффективных вакцин против сибирской язвы на основе протективных бактериальных антигенов или их рекомбинантных аналогов [39, 49, 112, 228]. Однако проблема создания субъединичных вакцин не сводится только к получению протективных антигенов или ответственных за формирование иммунитета отдельных антигенных детерминант. Как правило, очищенные или синтезированные антигены и антигенные детерминанты, взятые отдельно, не способны индуцировать выраженный иммунный ответ: необходимый эффект удается достигать только лишь при тщательном подборе адъювантов и матричных носителей, обладающих необходимым иммуно-модулирующим действием [24, 52, 81].

К настоящему времени накопилось достаточное количество материала, свидетельствующего о возможности использования иммуномодуляторов в качестве адъювантов для повышения эффективности вакцинации. Проблема повышения иммуногенности вакцин связана не только с низкой активностью вакцинных препаратов, но и с измененной реактивностью макроорганизма [32, 49, 50].

В литературе имеются данные о возможности повышения неспецифической резистентности макроорганизма такими преимущественно синтетическими препаратами как мурамилдипептид, ликопид, полиоксидоний, бе-митил и другие [27, 50, 55, 56]. В настоящее время большое внимание уделяется полисахаридам растительного происхождения. Несколько таких полисахаридов, в частности, сирингин, К-212, диквертин, арабиногалактан, железо- (феррогал) и кобальтсодержащие нанобиокомпозиты на основе арабиногалактана, нам любезно предоставили для экспериментального изучения их действия на клетки СМФ сотрудники Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского. Среди них по своим физико-химическим свойствам, простоте применения и доступности наше внимание привлек арабиногалактан. Использованный в экспериментах препарат выделен из лиственницы сибирской Larix sibirica, водорастворим, не токсичен, не пироге-нен для экспериментальных животных, характеризуется уникальными биологическими свойствами и большими потенциальными возможностями использования его в научных и медицинских целях [4, 22, 28]. Иммуномоду-лирующие свойства АГ в последние годы выявлены, в частности, при взаимодействии клеток макроорганизма с возбудителями чумы и псевдотуберкулеза [16]. Сведения об его применении для иммуностимуляции при сибирской язве в доступной литературе отсутствуют.

В связи с этим нами была предпринята попытка дать комплексную характеристику влияния ДАК-конъюгата (искусственный антигенный комплекс, созданный на основе протективного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба), с использованием АГ на клетки фагоцитарной системы экспериментальных животных.

В параллельных опытах дополнительно к арабиногалактану мы исследовали иммуностимулирующую способность сквалена - субстрата биологического происхождения, широко распространенного в тканях растений, животных и человека и нашедшего применение в составе сибиреязвенной вакцины на основе протективного антигена [105].

Для решения вопросов, какие системы иммунокомпетентных клеток подвержены воздействию специфических антигенов сибиреязвенного микроба, и какова роль в этом процессе иммуномодуляторов растительного происхождения, мы провели серию экспериментов на модели ПМ и ПЯЛ морских свинок in vitro и in vivo. В первой серии опытов исследовали клетки интактных морских свинок и белых мышей, во второй - клетки этих же животных после однократного парентерального воздействия на них комплексного антигена - ДАК-конъюгата per se, а также в сочетании с арабиногалактаном или скваленом.

Известно, что одним из важнейших этапов в патогенезе сибирской язвы является герминация спор В. anthracis в вегетативные клетки. Процесс превращения спор в бациллы является стимулом для секреции как провос-палительных, так и антивоспалительных цитокинов [189].

Одним из первых этапов реализации иммунного ответа после активации моноцитов/макрофагов внеклеточными индукторами бактериального, вирусного или растительного происхождения, химическими соединениями или другими цитокинами является продукция провоспалительного цито-кина ФНО-а. Уровень ФНО-а в крови повышается уже через 15 мин от момента поступления индуктора, достигает плато через 90—120 мин и снижается до исходного показателя через 240-360 мин [59]. Выделение цитокинов моноцитами/макрофагами служит одной из основных причин развития острой фазы воспаления и появления клинических симптомов при острой инфекции.

На следующем этапе развития иммунного ответа продуцируемый макрофагами ФНО-а способствует мобилизации клеток в очаг инфекции. Попадая в кровяное русло, эти молекулы действую через свои рецепторы на эндотелиальные клетки сосудов. В эндотелиоцитах активируются гены, ответственные за синтез специальных молекул адгезии, которые обеспечивают прилипание к сосудистой стенке циркулирующих в крови грануло-цитов, моноцитов и лимфоцитов. Прилипание к эндотелию для клетки — первый шаг выхода из сосуда и мобилизации в очаг инфекции. Таким образом, ФНО-а является аутокринным и паракринным активатором моноцитов/макрофагов, способствуя увеличению их числа в очаге инфекции. У самих макрофагов имеются рецепторы для ФНО-а, через которые он может их активировать, посылая с поверхности клеток сигналы к их ядру [59].

TNF-a, являясь одним из основных цитокинов, обладающих провос-палительной функцией, запускает «цитокиновый каскад» в очаге воспаления, увеличивая продукцию ИЛ-1, -2, -6, -10 и ИФН-у, которые в свою очередь оказывают влияние на экспрессию ФНО-a и его рецептора. ИЛ-6 и ИЛ-1 усиливают продукцию ФНО-a и его растворимого рецептора, ИЛ-10, напротив, снижает содержание ФНО-а [59, 70].

Важная роль в формировании резистентности организма к бактериальным патогенам провоспалительных цитокинов послужила основанием для исследования влияния комплексного антигена сибиреязвенного микроба и модуляторов иммунного ответа на продукцию ФНО-a. Установлено, что как в отдельности, так и в сочетании с АГ или СКВ ДАК-конъюгат активирует синтез ФНО-a перитонеальными макрофагами белых мышей. Наиболее высокие показатели продукции цитокина зафиксированы при комплексном воздействии на ПМ ДАК-конъюгата совместно с АГ и СКВ (144,9 ± 0,7 пг/мл).

Как показал детальный анализ полученных результатов, В. anthracis стимулировало продукцию ФНО-а перитонеальными макрофагами в 1,31,9 раз меньше, чем ДАК-конъюгат или его сочетание с иммуномодулято-рами.

Таким образом, ДАК-конъюгат не содержащий ЛФ и ОФ сибиреязвенного микроба, способствует повышению продукции ФНО-а перитонеальными макрофагами, а наличие токсина в В. anthracis вызывает нарушения секреции фагоцитами этого провоспалительного цитокина. Выявленный нами дисбаланс синтеза ФНО-а макрофагами подтверждается исследованиями других авторов [69, 120].

В ходе исследования установлено, что фагоциты, стимулированные ДАК-конъгатом, по поглотительной способности (величинам ПАФ и ФИ), превосходят не только интактные макрофаги, но и макрофаги, стимулированные спорами вакцинного штамма сибиреязвенного микроба. Фагоцитоз В. anthracis СТИ-1 макрофагами морской свинки, стимулированными ДАК-конъюгатом in vitro, является незавершенным (98,4 %). АГ, особенно в сочетании со СКВ, повышает способность ДАК-конъюгата стимулировать поглотительную активность фагоцитов, и обеспечивают вероятность завершенного фагоцитоза сибиреязвенного микроба ПМ в 5,3 раза больше, чем в контроле.

Таким образом, перитонеальные макрофаги примированные В. anthracis и ДАК-конъюгатом, сохраняют способность фагоцитировать споры В. anthracis, однако наличие в живой сибиреязвенной вакцине токсина существенно снижает способность фагоцитов освобождаться от микроба, возможно, за счет нарушения секреции клетками провоспалительного цитокина ФНО-а.

Общеизвестно, что осуществление фагоцитоза клетками системы мо-нонуклеарных фагоцитов и полиморфноядерными лейкоцитами сопровождается увеличением потребления кислорода, повышением активности ферментов гексозомонофосфатного шунта, а также возрастающим образованием перекиси водорода и супероксиданиона в этих клетках [41, 58, 59].

Анализ данных, полученных при изучении влияния ДАК-конъюгата в сочетании с АГ и СКВ на КЗМ интактных ПМ и ПЯЛ морской свинки в НСТ-тесте, позволил выявить стимулирующую способность всех исследованных препаратов. В ПМ наиболее высокие показатели НСТ-теста зафиксированы в присутствии ДАК-конъюгата + АГ и ДАК-конъюгата + АГ + СКВ. Макрофаги, примированные АГ и СКВ по степени активности окислительного метаболизма достоверных различий по сравнению с контролем (интактные клетки) не выявлено. При контакте с ПЯЛ наиболее высокие показатели КЗМ обеспечивает ДАК-конъюгат + АГ + СКВ.

Таким образом, в отличие от спор В. anthracis, не способных в достаточной мере противостоять при внедрении в фагоцит таким антибактериальным факторам как О'г и Н2О2, ДАК-конъюгат + АГ + СКВ стимулирует выработку активных форм кислорода иммунокомпетентными клетками морской свинки, что в свою очередь способствует завершенности фагоцитоза [184] и повышению резистентности организма.

Согласно современным представлениям, активные формы кислорода, обладающие сильным бактерицидным действием, используются фагоцитами для уничтожения вторгшихся микроорганизмов, а НАДФ-Н-оксидазы - группа ассоциированных с мембраной энзимов принимают активное участие в этом процессе [41, 59]. НАДФ-Н-оксидаза катализирует продукцию супероксида (02-), используя в качестве донора электронов НАДФ-Н: 02 + НАДФ-Н = 2 02- + НАДФ+ + Н\ Генерированный супероксид далее служит стартовым материалом для широкого круга реактивных оксидан-тов, таких как свободные радикалы, синглетный кислород, перекись водорода и др. [41, 60].

Учитывая важную роль НАДФ-Н-оксидазы в бактерицидных механизмах фагоцитоза, нами была предпринята попытка, исследовать влияние искусственного антигенного комплекса как per se, так и в сочетании с АГ и

СКВ на активность НАДФ-Н-оксидазы фагоцитов. Отмечено стимулирующее действие всех исследованных препаратов на активность этого фермента перитонеальных макрофагов морских свинок по сравнению с контролем, однако максимально достоверные значения ферментативной активности регистрируются при взаимодействии фагоцитов с комплексным препаратом ДАК-конъюгат + АГ + СКВ.

Известно, что Г6ФДГ - ключевой фермент пентозомонофосфатного шунта — катализирует начальную реакцию окисления глюкозо-6-фосфата, при которой акцептором водорода является НАДФ [41]. Следует отметить, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и СКВ оказывает на активность Г6ФДГ перитонеальных макрофагов более выраженное стимулирующее воздействие (в 1,2—1,6 раза), чем ДАК-конъюгат per se или конъюгат в сочетании только с АГ или СКВ. В контрольных (нестимулированных) фагоцитах активность Г6ФДГ была в 2,1 раза ниже, чем в активированных ДАК-конъюгатом (р < 0,05).

Таким образом, примирование фагоцитирующих клеток ДАК-конъюгатом и иммуномодуляторами сопровождается активацией в этих клетках Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы, что свидетельствует об усилении в них окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФНАДФ-Н. Связанная с этим активация КЗМ обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая носит дифференцированный характер в зависимости от применяемого препарата.

Внутриклеточную антиокислительную защиту обеспечивают, в основном, СОД и каталаза. Считается, что этот фермент удаляет избыток токсических супероксидных радикалов и тем самым защищает биологические мембраны от окислительного повреждения. Активность СОД во многих случаях зависит от уровня супероксиданиона в тканях, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора [41, 58, 59].

В ходе выполнения настоящего исследования нами были проанализированы данные по изменению активности СОД макрофагов и ПЯЛ. Так, под воздействием всех испытанных препаратов в ПЯЛ, в меньшей степени - в ПМ (значения в 7 раз ниже) отмечено повышение активности СОД, особенно выраженное при стимуляции процесса комплексом ДАК-конъюгат в сочетании с АГ + СКВ, увеличивая тем самым бактерицидный эффект в отношении патогена.

Таким образом, активность СОД зависит как от вида фагоцитов, так и от свойств взаимодействующих агентов. Наиболее выраженный положительный эффект стимуляции в фагоцитах процесса превращения супероксида в перекись водорода с участием СОД выявлен при сочетанном применении ДАК-конъюгата с иммуномодуляторами.

Известно, что МПО является основой кислородзависимой системы ПЯЛ, бактерицидный эффект которой связан с ее способностью продуцировать высокоактивные агенты, участвующие в защите организма хозяина от патогенов [41].

В связи с этим, на следующем этапе нашей работы мы проводили оценку действия ДАК-конъюгата, АГ и СКВ на активность МПО. Показано, что все исследованные препараты повышают активность миелоперок-сидазы ПЯЛ морских свинок. Наиболее высокие показатели активности фермента обеспечивали ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (более чем в 1,5 раза по сравнению с контрольными значениями) и ДАК-конъюгат + СКВ (в 1,4 раза). ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат + АГ, АГ и СКВ поддерживали активность МПО на уровнях, превосходивших контрольный на 15,7—23,2 %.

Таким образом, в результате проведенного исследования нами показано, что ДАК-конъюгат как per se, так и в сочетании с АГ и СКВ оказывают положительное влияние на МПО систему фагоцитов, повышая тем самым неспецифическую защиту организма.

В литературе имеются сведения о том, что в дополнение к активным формам кислорода в качестве антимикробного агента рассматривается молекула монооксида азота [41]. Нами исследовано действие препаратов на синтез монооксида азота. Следует заметить, что действие ДАК-конъюгата в сочетании с АГ, АГ + СКВ или СКВ на ПЯЛ и макрофаги не было равнозначным. Наибольшее стимулирующее действие на синтез монооксида азота в ПЯЛ оказывал ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (4,20 ± 0,04 мкМ/106 фагоцитов) и ДАК-конъюгат + АГ (3,98 ± 0,01), в макрофагах - ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (2,46 ± 0,06) и СКВ (2,24 ± 0,01). Контрольные значения активности NO-синтазы в ПЯЛ и макрофагах не превышали 0,80 ± 0,01 и 0,54 ± 0,01 мкМ/106 фагоцитов, соответственно.

Анализ данных, полученных при изучении влияния in vitro ДАК-конъюгата с иммуномодуляторами на макрофаги и ПЯЛ экспериментальных животных, позволил выявить, что все исследованные препараты повышают функциональную активность системы фагоцитирующих клеток, связанную с NO-синтазой. Основываясь на имеющиеся в литературе данные об участии монооксида азота в бактерицидных механизмах фагоцитоза, логично предположить, что ДАК-конъюгат как per se, так и в сочетании с АГ и СКВ могут способствовать усилению киллинга инфекционного агента в тканях и внутри фагоцитирующих клеток.

При исследовании кислороднезависимых бактерицидных механизмов фагоцитов мы уделили особое внимание неферментным катионным белкам, поскольку по своеобразному электростатическому механизму воздействия на клеточные структуры микробов НКБ резко отличаются от описанных выше ферментных систем.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии исследованных препаратов на НКБ. Наиболее выраженную активацию НКБ (в 1,4-1,5 раза, р < 0,05) наблюдали при воздействии на ПЯЛ ДАК-конъюгата в сочетании с АГ + СКВ. ДАКконъюгат, АГ и СКВ, взятые в отдельности, в меньшей мере (в 1,2-1,3 раза), но также повышают в фагоцитах уровень содержания НКБ, усиливая таким образом их бактерицидную способность.

Таким образом, ДАК-конъюгат in vitro стимулирует неспецифическую резистентность организма при участии кислородзависимых, нитро-ксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных. Арабиногалактан и сквален оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, усиливая бактерицидный потенциал фагоцитов.

Имеющиеся в настоящее время данные литературы из-за их разрозненности и недостаточности сравнительных данных не позволяют пока определить факторы, играющие ключевую или, по крайней мере, ведущую роль в процессе иммуногенеза при сибирской язве. Для решения проблемы, носят ли они универсальный или строго индивидуальный характер, необходимо комплексное сравнительное исследование.

Главная задача исследования in vivo состояла в том, чтобы проследить реакцию клеток иммунной системы макроорганизма на комплексное воздействие ДАК-конъюгата и иммуномодуляторов как на системном, так и на элементарном уровне. Это дало бы возможность не только констатировать факт пролонгирования иммунного ответа, но и судить о некоторых механизмах иммунокоррегирующего действия вводимых препаратов.

Установлено, что у морских свинок, получивших парентерально ДАК-конъюгат, во все сроки иммуногенеза (от 3 до 30 сут.) возрастает адгезивная активность перитонеальных макрофагов — с 48,5 ± 3,1 до 60,0 ± 2,3 усл. ед. в контрольных пробах и от 74,0 ± 1,3 до 96,0 ± 2,2 усл. ед. - в опытных. В наибольшей мере повышению адгезивной способности фагоцитов морских свинок способствовал ДАК-конъюгат в сочетании с АГ + СКВ (от 87,5 ± 1,7 до 121,7 ± 2,2 усл. ед. при р < 0,05).

ДАК-конъюгат при одновременном применении с АГ и скваленом оказывает стимулирующее действие и на поглотительную способность фагоцитов. Этот вывод подтверждает положительная тенденция изменения использованных оценочных параметров ПАФ и ФИ. Однако наиболее впечатляющим в этом плане является почти двукратный рост показателя завершенности фагоцитоза - процесса, определяющего судьбу возбудителя сибирской язвы в макроорганизме. Так, при изучении влияния ДАК-конъюгата, АГ и СКВ на протективную активность получены данные, позволяющие констатировать, что АГ и СКВ обеспечивают повышение процента выживаемости животных, а СКВ, кроме того, — снижение иммунизирующей дозы конъюгата. Материалы следующего опыта показали, что АГ, СКВ и АГ + СКВ параллельно с увеличением процента выживаемости животных способствуют оптимизации другого важного показателя про-тективности вакцинных препаратов — средней продолжительности жизни вакцинированных животных, возрастающей в 1,2-1,7 раза по сравнению с показателями, которые обеспечивает один ДАК-конъюгат. Вакцина СТИ-1 в аналогичных условиях продлевала жизнь вакцинированных ею животных не более чем на 8 %.

Таким образом, ДАК-конъюгат при одновременном применении с АГ и СКВ оказывает стимулирующее действие на фагоцитарную активность фагоцитов, вследствии чего повышаются протективные свойства этого антигенного комплекса.

Для выяснения вопроса, на какие звенья фагоцитарной системы влияют, ДАК-конъюгат + АГ + СКВ, ДАК-конъюгат + СКВ и сибиреязвенная вакцина СТИ-1 в процессе иммунизации морских свинок, исследована активность ферментов кислородзависимого бактерицидного механизма фагоцитов - Г6ФДГ, НАДФ-Н-оксидазы и миелопероксидазы.

Полученные результаты показали, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и скваленом оказывает стимулирующее воздействие на выработку активных форм кислорода, в макрофагах при фагоцитозе В. anthracis СТИ-1, что выражалось в высоких значениях показателей ФП и ЦПА во все сроки (3, 7, 10, 14 и 30 сут.) наблюдения. Пик окислительной активности (174,0 ± 2,2 усл. ед.) приходится на 14 сут. после инъекции препаратов, в последующие сроки имеет место постепенное снижение количества формазан-положительных клеток, характеризующих выраженность КЗМ в фагоцитах иммунных животных. Процесс иммуногенеза сопровождается активацией в отдельные сроки после инъекции морским свинкам комплексного препарата (ДАК-конъюгат + АГ + СКВ) Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы иммуно-компетентных клеток, что свидетельствует об усилении окисления в них глюкозы в гексозомонофосфатном шунте, наработке НАДФ-Н, стимуляция бактерицидного метаболизма фагоцитов и, как следствие, — повышение антимикробного потенциала фагоцитирующих клеток. Активация обоих ферментов в клетках крови на 10 сут. после иммунизации животных происходит интенсивнее у особей, вакцинированных ДАК-конъюгат + АГ + СКВ, чем сибиреязвенной вакциной СТИ-1.

Фагоциты вакцинированных морских свинок превосходят аналогичные клетки интактных животных и по активности миелопероксидазы. Закономерных различий в активности фермента в зависимости от введенного препарата (ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат + АГ или ДАК-конъюгат + АГ + СКВ) не выявлено.

В ПЯЛ иммунных морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ или СКВ, экзоцитоз неферментных катионных белков при поглощении сибиреязвенного микроба происходит более активно, чем в лейкоцитах как интактных животных, так и животных, иммунизированных вакцинным штаммом или только ДАК-коньюгатом, но результаты небыли достоверными относительно контроля.

Известно, что эндогенная окись азота является одним из важнейших факторов неспецифической антиинфекционной защиты макроорганизма. Дефицит NO способствует размножению возбудителей в тканях и внутри фагоцитирующих клеток, что сопровождается усилением тяжести течения инфекционного процесса и его хронизацией.

Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных экспериментальных животных в зависимости от использованного для исследования in vivo препарата показал, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и скваленом несколько превосходит ДАК-конъюгат с АГ и значительно - СТИ по интенсивности влияния на продукцию NO (р < 0,05).

Так, заметный прирост содержания NO-синтазы в перитонеальных макрофагах наблюдается уже на третьи сутки после иммунизации морских свинок и сохраняется в последующие сроки (р < 0,05). Макрофаги животных, которым ДАК-конъюгат вводили одновременно с АГ и скваленом, на 14-21 сут. после вакцинации по интенсивности синтеза монооксида азота превосходили макрофаги животных, получивших вакцину СТИ-1, что свидетельствует о повышении активности NO-синтазы фагоцитов этих животных и, естественно, — усилении их антиинфекционной защиты.

Таким образом, ДАК-конъюгат в сочетании с арабиногалактаном и скваленом активирует бактерицидные системы фагоцитов в большей степени, чем живая сибиреязвенная вакцина. Возросший антимикробный потенциал макроорганизма, обусловленный ДАК-конъюгатом при сочетанием введении с иммуномодуляторами, обеспечивает увеличение числа выживших экспериментальных животных (в 1,5—2,0 раза) при инфекционном процессе, вызванном В. anthracis.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований нами на основе клеточных стенок, соматического белкового антигена (белка С) и протективного компонента токсина сибиреязвенного микроба сконструирован антигенный комплекс, обладающий в эксперименте иммуногенными и протек-тивными свойствами. Полученные результаты подтверждают имеющееся в литературе мнение о том, что защитные функции сибиреязвенной вакцины определяются не только протектнвным антигеном, а и другими компонентами микробной клетки (в нашем случае — белком С), что расширяет перспективы изыскания альтернативных антигенных фракций сибиреязвенного микроба.

Согласно имеющимся в литературе предположениям о том, что факторами, лимитирующими эффективность фагоцитоза В. anthracis СТИ-1, являются ингибирующее влияние микроба на адгезивную способность фагоцитирующих клеток, дисбаланс окислительного метаболизма фагоцитов, устойчивость бактерий к лизосомальным ферментам фагоцитов и их способность после эндоцитоза попадать в фагосому, избегая губительного действия микробицидных факторов фагоцита. Отсюда становится ясным, что для повышения эффективности фагоцитоза следует направленно воздействовать именно на фагоцитарный процесс. Безусловно, важен факт успешного применения арабиногалактана и сквалена в качестве иммуномодуля-торов, повышающих специфическую активность ДАК-конъюгата и неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба.

Таким образом, в ходе экспериментов нами обоснованы принципы рационального подхода к конструированию вакцинных сибиреязвенных препаратов нового поколения. Показана возможность тестирования степени активности фагоцитирующих клеток в ответ на введение стимулирующего агента и функций, связанных с бактерицидной способностью для характеристики неспецифической резистентности организма.

С учетом литературных данных о механизмах иммуностимулирующего воздействия арабиногалактанов и сквалена растительного происхождения, собственных материалов о роли АГ лиственницы сибирской и ДАК-конъюгата на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных представляется возможным гипотетически сформулировать комплекс факторов, вовлекаемых искусственным антигенным комплексом (ДАК-конъюгат) в сочетании с АГ и СКВ при реализации его иммунокоррегирующей способности.

На основании вышеизложенного можно предложить следующую концептуальную схему механизмов действия ДАК-конъюгата в сочетании с АГ и СКВ на функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток (рис. 17).

Синтез цитокинов и других БАВ

Фагоцитарная активно1

Кислорода висим ые бактерицидные системы (НСТ-тест, Г6ФДГ, НАДФН-оксидаза. СОД, МПО)

Нитроксидэависимые бактерицидные системы (NO-си нтаза)

Кислородзависимые бактерицидные системы (НСТ-тест, Г6ФДГ, НАДФНоксидаза, СОД МПО) |

К ислоро днез авис имые бактерицидные системы (HKf

Нитроксидзависимые бактерицидные системы (NO-си нтаза)

NK-штки ШШШMlI

Цитотоксическая ИНФ-а активность в ИФН-у отношении ил-з возбудителей ИЛ-8

ИЗ

ТЭ о <-s со ж и S 03 X ед so

S 3 г я о

ГО я ас w м я>

-J га оэ Ж о о >н

Q4

Формирование резистентности организма к В, anthracis

Примечание: данные литературы выделены курсивом.

Рис. 17. Концептуальная схема механизмов действия ДАК-конъюгата в сочетании с арабиногалактаном и скваленом на функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Колесникова, Ольга Борисовна, 2008 год

1. Абалакин, В.А. Выявление специфических антигенов при экспериментальной сибирской язве / В.А. Абалакин, Л.В. Сергеева, Б.Л. Черкасский // Журн. микробиол. 1989. - № 12. - С. 63-67.

2. А. с. 742673 СССР, МПК4 А 61 В 5/00. Способ производства химического антраксина (сибиреязвенного аллергена) / Э.Н. Шляхов, С.А. Шварц. № 742673/31.; заявл. 22.02.68; опубл. 23.04.68, Бюл. 23. -4 с.

3. Антонова, Г.Ф. Структура арабиногалактана из древесины лиственницы {Larix sibirica) / Г.Ф. Антонова, А.И. Усова // Биоорганическая химия. 1984. - Т. 10, № 12. - С. 1664-1669.

4. Арабиногалактан лиственницы полимерная матрица для биогенных металлов / С.А. Медведева и др. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2002. - № 7. - С. 45-49.

5. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Ленинград: Наука, 1962. -180 с.

6. Бабич, М.А. Получение очищенного полисахаридного антигена из культур сибирской язвы / М.А. Бабич, В.А. Плотникова // Тр. гос. науч.-контрольного ин-та вет. препаратов. 1952. - Т. 3. - С. 167-169.

7. Борисов, И.В. Патоморфологические изменения у морских свинок при иммунизации дезинтегрированной массой сибиреязвенного микроба / И.В. Борисов, О.Н. Лопаткин // Особо опас. инфекции на Кавказе: Тез. докл. Ставрополь, 1985. - С. 145-146.

8. Бургасов, П.Н. Сибиреязвенная инфекция / П.Н. Бургасов, Г.И. Рожков. -М, 1984.-212 с.

9. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови здоровых людей in vitro / Б.В. Пинегин и др. // Журн. микробиол. 1994. — № 3. - С. 79-82.

10. Влияние поверхностного соматического антигена сибиреязвенного микроба на протективные свойства конструируемых химических вакцин / М.В. Безносов и др. // Scientific J. -2000. -N 8. -P. 138-144.

11. Выделение и очистка протективного антигена и отечного фактора из культурального фильтра Bacillus anthracis СТИ-1. / С.Н. Рогов и др. // Журн. мед. паразитол. и паразит, болезней 1995. - № 4. - С. 35-38.

12. Выделение поверхностного антигена из вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1 / М.В. Безносов и др. // Журн. микробиол. 1997. — № 1,-С. 9-13.

13. Голубинский, Е.П. Активность бактерицидных систем фагоцитов у интактных и иммунизированных против туляремии морских свинок / Е.П. Голубинский, И.С. Бойкова, В.И. Дубровина // Журн. микробиол. — 1995.-№2.-С. 77-79.

14. Дише, 3. Цветные реакции углеводов / 3. Дише // Методы химии углеводов. М., 1967. - С. 20-25.

15. Евтеева, Е.В. Внеклеточные антигены сибиреязвенного микроба и их диагностическое значение / Е.В. Евтеева // Дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / Рос. н.-и. противочум. ин-т «Микроб». Саратов, 2003. - 123 с.

16. Езепчук, Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий / Ю.В. Езепчук. М: Наука, 1977. - С. 10-11.

17. Жукова, А.Н. Сибирская язва в Волгоградской области и некоторые вопросы ее лабораторной диагностики / А.Н. Жукова, Н.Г. Тихонова, А.В. Липницкий // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. научн. трудов. Волгоград, 2000. - С. 82-86.

18. Зайцева, Л.Г. К механизму комбинированного воздействия имму-номодуляторов на фагоцитарные клетки / Л.Г. Зайцева, Г.И. Васильева // Журн. микробиол. 1994. - № 4. - С. 17-20.

19. Земсков, В.М. Гетерогенность и перераспределеение субпопуляций перитонеальных макрофагов / В.М. Земсков, В.И Понтин, С.В. Родионов // Иммунология. 1986. - № 2. - С. 34-38.

20. Изменение активности миелопероксидазы и кислой фосфатазы в нейтрофилах периферической крови человека при стимуляции клеток in vitro / Т.Л. Бурая и др. // Журн. микробиол. 1991. - № 10. - С. 52-55.

21. Кондратьева, A.M. Изменение активности окисления субстратов цикла трикарбоновых кислот в митохондриях органов белых мышей под действием токсина Bacillus anthracis / A.M. Кондратьева, Г.И. Борсук,

22. Э.Е. Тафелыитейн // Соврем, аспекты профилакт. зооноз. инфекций: Тез. докл. к Всесоюз. конф. специалистов противочум. учреждений. Иркутск, 1984.- 4.3.-С. 16-17.

23. Красникова, И.М. Патогенетически обоснованные принципы коррекции экспериментальных железодефицитных анемий: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 14.00.16 / ВСНЦ СОР АМН. Иркутск, 2003. - 26 с.

24. Марков, Е.Ю. Иммуноэлектрофоретический анализ сложных белковых смесей / Е.Ю. Марков, Э.Е. Хавкин // Электрофоретические методы анализа белков. Новосибирск, 1981. - С. 68-97.

25. Марков, Е.Ю. Проблемы и перспективы совершенствования средств специфической профилактики инфекционных болезней / Е.Ю. Марков, Е.П. Голубинский, Л.Я. Урбанович // Журн. инфекционной патологии. -1998. Т. 5, № 4. - С. 3-6.

26. Молекулярные механизмы, лежащие в основе сибиреязвенной инфекции на ранних стадиях, и поиск новых вакцин / А.В. Степанов и др. // Вестн. Рос. АМН. 1997. - № 6. - С. 16-20.

27. Монцевичюте-Эрингене, Е.В. Упрощенные математикостатисти-ческие методы в медицинской исследовательской работе / Е.В. Монцевичюте-Эрингене // Патол. физиол. и эксп. терапия. 1964. - № 4. - С. 71-78.

28. Нарциссов, Р.П. Применение р-нитротетразолия фиолетового для количественной цитохимии дегидрогеназ лимфоцитов человека / Р.П. Нарциссов // Архив анатомии и гистологии. — 1969. — № 5. — С. 85—91.

29. О механизме действия левамизола на клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы / Ю.Н. Фаворская и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1980. - № 10. - С. 456-458.

30. Ойвин, В.А. Статистическая обработка результатов в экспериментальных исследованиях / В.А. Ойвин // Патол. физиол. и эксп. терапия. -I960.-№4.-С. 76-85.

31. Отчет о НИР (заключительный). Изучение действия токсических фракций сибиреязвенного микроба на энергетический обмен тканей животных / Иркутский н.-и. противочум. ин-т. Науч. руководители Голу-бинский Е.П., Борсук Г.И. - Иркутск, 1985. - 76 с.

32. Пигаревский, В.Е. К методике применения лизосомально-катионного теста в лабораторно-диагностической практике / В.Е Пигаревский, Ю.А Мазинг// Лаб. дело. 1981. - № 10. - С. 579-582.

33. Плехова, Н.Г. Бактерицидная активность фагоцитов / Н.Г. Плехова // Журн. микробиол. 2006. - № 6. - С. 89-96.

34. Поиск новых аттенуироваинных штаммов для создания живой сибиреязвенной вакцины / Л.И. Маринин и др. // Пробл. мед. и экол. био-технол. Оболенск, 1999. - С. 101-102.

35. Повышение эффективности специфической профилактики сибирской язвы в эксперименте / О.И. Коготкова и др. // Соврем, аспекты природной очаговости, эпидемиол. и профилакт. особо опас. инфекций: Тез. докл. Ставрополь, 1993. - С. 337-338.

36. Получение высокоактивных иммунных сывороток против антигенов сибиреязвенного микроба / С.Н. Тюменцев и др. // Соврем, аспекты профилакт. зооноз. инфекций: Тез. докл. научн. конф. Ставрополь, 1993. - С. 298-299.

37. Прохорова, М.И. Методы биохимических исследований / М.И. Прохорова. Л., 1982.- С. 168-171.

38. Регуляция функции клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы сальмозаном / Л.Г. Зайцева и др. // Журн. микробиол. 1988. - № 7. -С. 63-68.

39. Ромашевская, Е.И. Влияние разных субклассов перитонеальных макрофагов на антителообразование в культуре / Е.И. Ромашевская, Э.Л. Хасман, Д.Р. Каулен // Иммунология. М., 1981. - № 2. - С. 21-25.

40. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Г.Г. Онищенко и др. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - С. 12-17.

41. Сибирская язва: ранние шаги внутриклеточной стадии развития инфекции / И.В. Бахтеева и др,. // Мол. генетика, микробиол., вирусол. -2005.-№4.-С. 3-9.

42. Семенченко, Т.А. Эпидемиологические аспекты неспецифической профилактики инфекционных заболеваний / Т.А. Семенченко // Вестн. Рос. АМН. -2001. -№ 11.-С. 25-29.

43. Сергеева, Л.В. О заболеваемости сибирской язвой среди привитых против нее людей / Л.В. Сергеева // Актуал. вопр. эпидемиол. инфекционных болезней: Тр. Московского НИИВС им. И.И. Мечникова. М., 1981.-Вып. 6.-С. 173-176.

44. Состояние и перспективы специфической профилактики чумы / С.М. Дальвадянц и др. // Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997 г., Саратов). Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 202-203.

45. Спирин, А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот / А.С. Спирин // Биохимия. 1958. — Т. 23, вып. 5.-С. 656-662.

46. Спешников, П.Г. Иммунологические методы индикации инфекционных агентов / П.Г. Спешников / В кн.: Биологическая безопасность / Под. ред. Г.Г. Онищенко и др.. М.: Медицина, 2006. - 303 с.

47. Стимуляция регенерации гемопоэза мышей под действием транслома / JI.A. Игнатенко и др. // Радиобиология. — 1990. — Т. 30. — С. 55-56.

48. Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных / В.И. Дубровина и др.. Иркутск: Аспринт, 2007. - 145 с.

49. Усиление фагоцитарной активности клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы при пероральном введении лактобацил / Л.Г. Зайцева и др. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1986. - № 9. - С. 691-694.

50. Учитель, И.Я. Макрофаги в иммунитете / И.Я. Учитель. М.: Наука, 1978.- 199 с.

51. Фрейдлин, И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитоки-новой иммунорегуляции / И.С. Фрейдлин // Иммунология. 2001. - № 5. — С. 4-7.

52. Фрейдлин, И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека / И.С. Фрейдлин // Учебное пособие. -Л., 1986.-37 с.

53. Хансон, Р. Химический состав бактериальной клетки / Р. Хансон, Дж. Филлипс // Методы общей бактериологии. Пер. с англ. в 3 томах. — М., 1984.-Т. 2.-С. 283-373.

54. Характеристика взаимодействия Bacillus anthracis с фагоцитами хозяина в связи с плазмидным спектром причинного агента / С.Ф. Попов и др. // Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 13-16.

55. Цитоэнзимохимические исследования лейкоцитов периферической крови лабораторных животных / В.М. Сафронова, Н.А. Локтев, Л.А. Рак, О.В. Логвиненко; Ставропольский н.-и. противочум. ин-т. Ставрополь, 1994 - 102 с. - Деп. в ВНТИ РФ 25.05.94; № 648.

56. Черкасский Б.Л. Сибирская язва как биологическое оружие / Б.Л. Черкасский. М.: ИнтерСЭН, 2002. - 40 с.

57. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы / Б.Л. Черкасский. М.: ИнтерСЭН, 2002. - 384 с.

58. Чумная химическая вакцина / С.М. Дальвадянц и др. // Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997 г., Саратов). Саратов, 1997. - Т. 1. -С. 201.

59. A recombinant 63-kDa form of Bacillus anthracis protective antigen produced in the yeast provides protection in rabbit and primate inhalational challenge models of anthrax infection / R.W. Hepler et al. // Vaccine. 2006. -Vol. 24, N 10. - P. 1501-1514.

60. Additional conjugation methods and immunogenicity of Bacillus anthracis poly-y-d-glutamic acid-protein conjugates / J. Kubler-Kielb et al. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 8. - P. 4744-4749.

61. Anthrax edema toxin cooperates with lethal toxin to impair cytokine secretion during infection of dendritic cells / J.N. Tournier et al. // J. Immunol. -2005.-Vol. 174, N8.-P. 4934^1941.

62. Anthrax lethal factor cleaves MKK3 in macrophages and inhibits the LPS/IFNgamma-induced release of NO and TNFalpha / R. Pellizzari et al. // FEBS Lett. 1999. - Vol. 462, N 1-2. - P. 199-204.

63. Anthrax lethal toxin impairs innate immune functions of alveolar macrophages and facilitates Bacillus anthracis survival / WJ. Ribot et al. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 9. - P. 5029-5034.

64. Anthrax lethal toxin-mediated killing of human and murine dendritic cells impairs the adaptive immune response / A. Alileche et al. // PLoS Pathog. -2005.-Vol. 1, N 2. -P. el9.

65. Anthrax lethal toxin paralyzes neutrophil actin-based motility / R.L. During et al. / Infect. Dis. 2005. - Vol. 192, N 5. - P. 837-845.

66. Anthrax lethal toxin paralyzes neutrophil actin-based motility by blocking Hsp27 phosphorilation / R.L. During et al. // EMBO J. 2007. - Vol. 26, N9.-P. 2240-2250.

67. Anthrax lethal toxin rapidly activates caspase-l/ICE and induces extracellular release of interleukin (IL)-lbeta and IL-18 / R. Cordoba-Rodriguez et al. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, N 20. - P. 20563-20566.

68. Anthrax toxins inhibit immune cell chemotaxis by perturbing che-mokine receptor signaling / S. Rossi Paccani et al. // Cell Microbiol. 2007. -Vol. 9,N4.-P. 924-929.

69. Anthrax toxins: A paradigm of bacterial immune suppression / C.T. Baldari et al. // Trends Immunol. 2006. - Vol. 27, N 9. - P. 434-440.

70. Anthrax vaccines / M. Splino et al. // Ann. Saudi Med. 2005. -Vol. 25, N2.-P. 143-149.

71. Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax / S. Cohen et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 8. - P. 4549-4558.

72. Auerbach, S. Studies on immunity to anthrax VI. Immunising activity of protective antigen against various strains of Bacillus anthracis / S. Auerbach, G. Wright // J. Immunol. 1955. - V. 75. - P. 129.

73. Babiuk, L.A. Molecular approaches to disease control / L.A. Babiuk, S. Gomis, R. Hecker // Poult. Sci. 2003. - Vol. 82, N 6. - P. 870-875.

74. Bacillus anthracis spores stimulate cytokine and chemokine innate immune responses in human alveolar macrophages through multiple mitogen-activated protein kinase pathways / K. Chakrabarty et al. // Infect. Immun. -2006. Vol. 74, N 8. - P. 4430-4438.

75. Bacillus anthracis toxins inhibit human neutrophil NADPH oxidase activity / M.A. Crawford et al. // J. Immunol. 2006. - Vol. 176, N 12. -P. 7557-7565.

76. Bacillus anthracis virulent plasmid pX02 genes found in large plasmids of two other Bacillus species / V.A. Luna et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. -Vol. 44, N 7. - P. 2367-2377.

77. Baillie, L. Anthrax vaccine development work at CBD Porton Down / L. Baillie // 4th International Conference on Anthrax, 10-13 June, 2001, An-apolis, Maryland, USA, 2001.

78. Baillie, L. Human immune responses to the UK human anthrax vaccine / L.W. Baillie, K. Fowler, P.C. Turnbull // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87, N2.-P. 306-308.

79. Baillie, L. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis / L. Baillie, A. Moir, R. Manchee // J. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 84, N 5. - P. 741-746.

80. Barber, G. Sur les poliosides du Bacillus anthracis / G. Barber, E. Lilistean, I. Nafta // Arch. Roumain. Pathol. 1957. - Vol. 16, N 4. - P. 573578.

81. Barnard, J.P. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen / J.P. Barnard, A.M. Friedlander // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, N 2. - P. 562-567.

82. Beveridge, T.J. Surface layers of bacteria / T.J. Beveridge, L.L. Graham // Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 55. - P. 684-705.

83. Bhatnagar, R. Anthrax toxin / R. Bhatnagar, S. Batra // Crit. Rev. Microbiol. 2001. - Vol. 27, N 3. - P. 167-200.

84. Biochemical and physiological changes induced by anthrax lethal toxin in J774 macrophage-like cells / P.C. Hanna, S. Kochi, RJ. Collier // Mol. Biol. Cell. 1992. - Vol. 3, N 11. - P. 1269-1277.

85. Boyden, E.D. Nalplb controls mouse macrophage susceptibility to anthrax lethal toxin / E.D. Boyden, W.F. Dietrich // Nat. Genet. 2006. - Vol. 38, N2.-P. 137-138.

86. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72, N 2. - P. 248-254.

87. Brey, R.N. Molecular basis for improved anthrax vaccines / R.N. Brey // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2005. - Vol. 57, N 9. - P. 1266-1292.

88. Brossier, F. Anthrax spores make an essential contribution to vaccine efficacy / F. Brossier, M. Levy, M. Mock // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, N2.-P. 661-664.

89. Candela, T. CapE, a 47-amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis polyglutamate capsule synthesis / T. Candela, M. Mock, A. Fouet // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, N 22. - P. 7765-7772.

90. Cataldi, A. Construction and characterization of a protective antigen-deficient Bacillus anthracis strain / A. Cataldi, E. Labruyere, M. Mock // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4, N 7. - P.1111-1117.

91. Chabot, D.J. Anthrax capsule vaccine protects against experimental infection / D.J. Chabot, A. Scorpio, S.A. Tobery // Vaccine. 2004. - Vol. 23, N4.-P. 43-47.

92. Characterization of the Bacillus anthracis S-layer: cloning and sequencing of the structural gene / I. Etienne-Toumelin et al. // J. Bacteriol. -1995.-Vol. 177, N3.- P. 614-620.

93. Characterization of neutral and an acidic polysaccharide having immunological activities from the root of Paeonia lactiflora / M. Tomoda et al. //Biol. Pharm. Bull. 1993 - Vol. 16, N 12. - P. 1207-1210.

94. Characterization of two novel polysaccharides having immunological activities from the root of Panax ginseng / M. Tomoda et al. // Biol. Pharm. Bull.- 1993.-Vol. 16, N 11. -P. 1087-1090.

95. Combining anthrax vaccine and therapy: a dominant-negative inhibitor of anthrax toxin is also a potent and safe immunogen for vaccines / B.A. Aulin-ger et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 6. - P. 3408-3414.

96. Comparative efficacy of experimental anthrax vaccine candidates against inhalation anthrax in rhesus macaques / B.E. Ivins et al. // Vaccine. -1998. Vol. 16, N 11-12. - P. 1141-1148.

97. Comparative secretome analyses of three Bacillus anthracis strains with variant plasmid contents / J.M. Lamonica et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 6. - P. 3646-3658.

98. Comparative vaccine efficacy of different isoforms of recombinant protective antigen against Bacillus anthracis spore challenge in rabbits / W.J. Ribot et al. // Vaccine. 2006. - Vol. 24, N 17. - P. 3469-3476.

99. Comparison of the immunological memory after DNA vaccination and protein vaccination against anthrax in sheep / U.K. Hahn et al. // Vaccine. -2006. Vol. 24, N 21. - P. 4595-4597.

100. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli / V. Chauhan et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2001.-Vol. 283, N2.-P. 308-315.

101. Cote C.K. Roles of macrophages and neutrophils in the early host response to Bacillus anthracis spores in a mouse model of infection / C.K. Cote, N. Van Rooijen, S.L. Welkos // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 1. - P. 469480.

102. Coulson, N.M. Bacillus anthracis protective antigen, expressed in Salmonella typhimurium SL 3261, affords protection against anthrax spore challenge / N.M. Coulson, M. Fulop, R.W. Titball // Vaccine. 1994. - Vol. 12, N15.-P. 1395-1401.

103. CpG oligodeoxynucleotides adsorbed onto polylactide-co-glycolide microparticles improve the immunogenicity and protective activity of the licensed anthrax vaccine / H. Xie et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 2. -P. 828-833.

104. Crowle, A.J. Immunodiffusion / A.J. Crowle. 2-nd ed. - New York: Academic Press, 1973. - 545 p.

105. Cytotoxic activity of BacillusMnthracis protective antigen observed in a macrophage cell line overexpressing ANTXR1 / I.I. Salles et al. // Cell Microbiol. 2006. - Vol. 8, N8.-P. 1272-1281.

106. Demonstration that the galactosyl and arabinosyl residues in the cell-wall arabinogalactan of Mycobacterium leprae and Mycobacterium tuberculosis are furanoid / M. McNeil et al. // Carbohydr. Res. 1987. - Vol. 166, N 2. -P. 299-308.

107. Developing subunit immunogens using В and T cell epitopes and their constructs derived from the F1 antigen of Yersinia pestis using novel delivery vehicles / L. Sabhnani et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003. -Vol. 38, №3.-P. 215-229.

108. Developmental switch of S-layer protein synthesis in Bacillus anthracis / T. Mignot et al. // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 43, N. 6 - P. 16151627.

109. Direct inhibition of T-lymphocyte activation by anthrax toxins in vivo / J.E. Comer et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 12. - P. 8275-8281.

110. Duration of protection of rabbits after vaccination with Bacillus anthracis recombinant protective antigen vaccine / S.F. Little et al. // Vaccine. -2006. Vol. 24, N 14. - P. 2530-2536.

111. Early Bacillus anthracis-macrophage interactions: intracellular survival survival and escape / T.C. Dixon et al. // Cell Microbiol. 2000. -Vol. 2, N6.-P. 453-463.

112. Effect of aluminum hydroxide adjuvant and formaldehyde in the formulation of rPA anthrax vaccine / S.F. Little et al. // Vaccine. 2007. — Vol. 25, N 15. - P. 2771-2777.

113. Effect of the lower molecular capsule released from the cell surface of Bacillus anthracis on the pathogenesis of anthrax / S. Makino et al. // J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 186, N 2. - P. 227-233.

114. Evidence for adjuvanticity of anthrax edema toxin / A. Quesnel-Hellmann et al. // Vaccine. 2006. - Vol. 24, N 6. - P. 699-702.

115. Experimental anthrax vaccines: efficacy of adjuvants combined with protective antigen against an aerosol Bacillus anthracis spore challenge in guinea pigs / B. Ivins et al. // Vaccine. 1995. - Vol. 13, N 18. - P. 17791784.

116. Expression of Bacillus anthracis protective antigen in transgenic chloroplasts of tobacco, a non-food/feed crop / J. Watson et al. // Vaccine. -2004. Vol. 22, N 31. - P. 4374-4384.

117. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax / M.A. Aziz et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - Vol. 299, N 3. - P. 345-3 51.

118. Ezzell, J.W. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis / J.W. Ezzell, T.G. Abshire // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, N2.-P. 349-356.

119. Ezzell, J.W. The capsule of Bacillus anthracis, a review / J.W. Ezzell, S.L. Welkos // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol., N 2. - P. 250.

120. Fairbanks, G. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane / G. Fairbanks, T.L. Steck, D.F.H. Wallach //Biochemistry.-1971.-Vol. 10, № 13.-P. 2606-2617.

121. Fate of germinated Bacillus anthracis spores in primary murine macrophages / C. Guidi-Rontani et al. // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 44, N 1. -P. 297.

122. Fouet, A. Bacillus anthracis cell envelope components / A. Fouet, S. Mesnage // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. - Vol. 271. - N 5. -P. 87-113.

123. Friedlander, A.M. Anthrax vaccines / A.M. Friedlander, S.L. Wel-kos, B.E. Ivins / Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. - Vol. 271, N. - P. 33-60.

124. Fully virulent Bacillus anthracis does not require the immunodominant protein BclA for pathogenesis / J. Bozue et al. // Infect. Immun. 2007. -Vol. 75, N 1. - P. 508-511.

125. Goodman, J.W. Studies on the relation of a prior immune response to immunogenicity / J.W. Goodman, D.E. Nitecki // Immunology. 1967. -Vol. 13.-P. 577-583.

126. Gu, M.L. Protection against anthrax toxin by vaccination with a DNA plasmid encoding anthrax protective antigen / M.L. Gu, S.H. Leppla, D.M. Klinman // Vaccine. 1999. - Vol. 17, N. 14. - P. 340-344.

127. Gupta, P. Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis / P. Gupta, S.M. Waheed, R.Bhatnagar // Protein Expr. Purif. 1999. - Vol. 16, N 3. - P. 369-376.

128. Hahn, U.K DNA vaccination against anthrax in mice-combination of anti-spore and anti-toxin components / U.K Hahn, R. Boehm, W. Beyer // Vaccine. 2006. - Vol. 24, N 21. - P. 456904571.

129. Hermanson, G. A cationic lipid-formulated plasmid DNA vaccine confers sustained antibody-mediated protection against aerosolized anthrax spores / G. Hermanson, V. Whitlow, S. Parker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -Vol. 101, N37.-P. 13601-13606.

130. Hirsch, J.G. Studies of bactericidal action of phagocytes / J.G. Hirsch // J. Exp. Med. 1956. - Vol. 103. - P. 613-615.

131. Identification of a protein subset of the anthrax spore immunome in humans immunized with the anthrax vaccine adsorbed preparation / I.T. Kudva et al. // Infect Immun. 2005. - Vol. 73, N 9. - P. 5685-5696.

132. Identification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis Sterne spore germination / M. Akoachere et al. // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282, N 16. -P. 12112-12118.

133. Identification of Bacillus anthracis by using monoclonal antibody to cell wall galactose-N-acetylglucosamine polysaccharide / J.W. Ezzell et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, N 2. - P. 223-231.

134. Identification of chromosomally encoded membranal polypeptides of Bacillus anthracis by a proteomic analysis: prevalence of proteins containing S-layer homology domains / T. Chitlaru et al. // Proteomics. 2004. - Vol. 4, N3.-P. 677-691.

135. Identification of in-vivo expressed immunogenic proteins by serological proteome analysis of Bacillus anthracis secretome / T. Chitlaru et al. // Infect Immun. 2007 Mar 12; [Epub ahead of print].

136. Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis / C. Redmond et al. // Microbiology. 2004. - Vol. 150, Pt 2. - P. 355-363.

137. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium / C. Steichen et al. // J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185, N 6. -P. 1903-1910.

138. Immunization against anthrax with Bacillus anthracis protective antigen combined with adjuvants / B.E. Ivins et al. // Infect. Immun. 1992. -Vol. 60, N2.-P. 662-668.

139. Immunogenicity and tolerance of ascending doses of a recombinant protective antigen (rPA102) anthrax vaccine: a randomized, double-blinded, controlled, multicenter trial / G.J. Gorse et al. // Vaccine. 2006. - Vol. 24, N33-34.-P. 5950-5959.

140. Impairment of dendritic cells and adaptive immunity by anthrax lethal toxin / A. Agrawal et al. // Nature. 2003. - Vol. 424, N 6946. - P. 329-334.

141. Importance of nitric oxide synthase in the control of infection by Bacillus anthracis / K.W. Raines et al. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 4. - P. 2268-2276.

142. Inactivation of Bacillus anthracis spores in murine primary macrophages / H. Hu et al. // Cell Microbiol. 2006. - Vol. 8, N 10. - P. 1634-1642.

143. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate / T.T. Wang et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2004. -Vol. 40, N3.-P. 231-237.

144. Inhibition of mitogen-activated protein kinase signalling by Bacillus anthracis lethal toxin causes destabilization of interleukin-8 mRNA / S. Batty et al. // Cell Microbiol. 2006. - Vol. 8, N 1. - P. 130-138.

145. Interaction of the 20 kDa and 63 kDa fragments of anthrax protective antigen: kinetics and thermodynamics / K.A. Christensen et al. // Biochemistry. 2005. - Vol. 44, N 3. - P. 1047-1053.

146. Ivins, B.E. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis / B.E. Ivins, S.L. Welkos // Infect. Immun. -1986. Vol. 54, N 2. - P. 537-542.

147. Ivins, B.E. Recent advances in the development of an improved, human anthrax vaccine / B.E. Ivins, S.L. Welkos // Eur. J. Epidemiol. — 1988. — Vol. 4, N 1. — P. 12-19.

148. Ivins, B.E. Efficacy of a standart human vaccines against Bacillus anthracis spore challenge in guinea pigs / B. Ivins, P.F. Fellows, G.O. Nelson 11 Vaccine. 1994. - Vol. 12, N 10. - P. 872-874.

149. Kaneda, T. Iso- and anteiso-fatty acids in bacteria: biosynthesis, function, and taxonomic significance / T. Kaneda // Microbiol. Rev. 1991. -Vol. 55, N4.-P. 288-302.

150. Kaplow, L.S. A histochemical procedure for locating and evaluation leukocyte alkaline phosphatase activity in smears of blood and bone morrow / L.S. Kaplow//Blood.- 1955.-Vol. 10, N10.-P. 1023-1029.

151. Keppie, J. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. IX. Its Aggressins and their mode of action / J. Keppie, P.W. Harris-Smith, H. Smith // Brit. J. Exptl. Path. 1963. - V. 44, N 4. - P. 446^153.

152. Klimpel, K.R. Anthrax toxin lethal factor has homology to the thermo-lysin-like proteases and displays proteolytic activity / K.R. Klimpel, N. Arora,

153. S.H. Leppla // Absr. 93 rd Gen. Meet Amer. Soc. Microbio). Washington. -1993.-Vol. 111.-P. 45.

154. Kochler, T.M. Plasmid related differences in capsule production by Bacillus anthracis and characterization of a fertility plasmid from Bacillus sub-tilis (natto) / T.M. Kochler // Diss. Abstr. Internat., B. - 1988. - V. 49, № 3. -P. 633-B.

155. Laemmli, U.K. Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events / U.K. Laemmli, M. Favre // J. Mol. Biol. 1973. - Vol. 80. -P. 575-599.

156. Lai, E.M. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis and Bacillus anthracis / E.M. Lai, N.D. Phadke, M.T. Kachman // J. Bacteriol. -2003.-Vol. 185, N4.-P. 1443-1454.

157. Lawrence, D. Differentiation of Bacillus anthracis from Bacillus cereus by gas chromatographic whole-cell fatty acid analysis / D. Lawrence, S. Heitefuss, H.S. Seifert // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29, N 4. - P. 1508-1512.

158. Leonard, C. Integrated physical and genetic mapping of Bacillus cereus and other gram-positive bacteria based on the IS231A transposition vectors / C. Leonard, O. Zekri, J. Mahillon // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, N 5. -P. 2163-2169.

159. Leppla, S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations in eukaryotic cells / S.H. Leppla //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - Vol. 79, N 10. - P. 3162-3166.

160. McConnell, M.J. Adenovirus-based prime-boost immunization for rapid vaccination against anthrax / M.J. McConnell, P.C. Hanna, M.J. Imperiale // Mol. Ther. 2007. - Vol. 15, N 1. - P. 203-210.

161. McConnell, M.J. Cytokine response and survival of mice immunized with an adenovirus expressing Bacillus anthracis protective antigen domain 4 / M.J. McConnell, P.C. Hanna, M.J. Imperiale // Infect. Immun. 2006. -Vol. 74, N2.-P. 1009-1015.

162. Meynell, E. The roles of serum and carbon dioxide in capsule formation by Bacillus anthracis / E. Meynell, G.G. Meynell // J. Gen. Microbiol. -1964.-V. 34, N 1. —P. 153-164.

163. Meynell, G.G. The biosynthesis of poly-D-glutamic acid, the capsular material of Bacillus anthracis / G.G. Meynell, E. Meynell // J. Gen. Microbiol. -1966. V. 43, N1.-P. 119-138.

164. Mikszta, J.A. Microneedle-based intradermal delivery of the anthrax recombinant protective antigen vaccine / J.A. Mikszta, J.P. Dekker, N.G. Harvey // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, N 12. - P. 6806-6810.

165. Molecular characterization and protein analysis the Cap region with essential for encapsulation in Bacillus anthracis / S. Makino // J. Bacteriol. -1989.-Vol. 171, N2.-P. 722-730.

166. Molecular characterisation of Bacillus anthracis main S-layer component: evidence that it is the mojor cell-associated antigen / S. Mesnage et al. // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 23, N 6. - P. 1147-1155.

167. Mosser, E.M. The Bacillus anthracis cholesterol-dependent cyto-lysin, Anthrolysin O, kills human neutrophils, monocytes and macrophages / E.M. Mosser, R.F. Rest // BMC Microbiol. 2006. - Vol. 6. - P. 56-62.

168. Murine macrophages kill the vegetative form of Bacillus anthracis / T.J. Kang et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 11. - P. 7495-7501.

169. N-fragment of edema factor as a candidate antigen for immunization against anthrax / M. Zeng et al. // Vaccine. 2006. - Vol. 24, N 5. - P. 662670.

170. Park, B.H. Infection and nitro-blue tetrazolium reduction by neutrophils: a diagnostic aid / B.H. Park, S.M. Firkig, E.M. Smithwick // Lancet. -1968. Vol. 2, N 7567. - P. 532-534.

171. Perry, R.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague / R.D. Perry, J.D. Fetherston // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 10. - P. 35-66.

172. Peterson, G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable / G.L. Peterson // Anal. Biochem. -1977. Vol. 83, N 2. - P. 346-356.

173. Pickering, A.K. Macrophages release tumor necrosis factor alpha and interleukin-12 in response to intracellular Bacillus anthracis spores / A.K. Pickering, T.J. Merkel // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, N 5. -P. 3069-3072.

174. Plant-based vaccine: mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge / V. Koya et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, N 12. - P. 8266-8274.

175. PLGA-dendron nanoparticles enhance immunogenicity but not lethal antibody production of a DNA vaccine against anthrax in mice / S. Ribeiro et al. // Int. J. Pharm. 2007. - Vol. 331, N 2. - P. 228-232.

176. Poly(gamma-D-glutamic acid) protein conjugates induce IgG antibodies in mice to the capsule of Bacillus anthracis: a potential addition to the anthrax vaccine / R. Schneerson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. -Vol. 100, N 15. - P. 8945-8950.

177. Poly-gamma-glutamate capsule-degrading enzyme treatment enhances phagocytosis and killing of encapsulated Bacillus anthracis I A. Scorpio et al. //Antimicrob. Agents Chemother. 2007. - Vol. 51, N 1. - P. 215-222.

178. Protection against anthrax with recombinant virus-expressed protective antigen in experimental animals / L.C. Iacono-Connors et al. // Infect. Immun. 1991.-Vol. 59, N6.-P. 1961-1965.

179. Protective efficacy of a recombinant protective antigen against Bacillus anthracis challenge and assessment of immunological markers / B.W. McBride et al. 11 Vaccine. 1998. - Vol. 16, N 8. - P. 810-817.

180. Protective immunity induced by Bacillus anthracis toxin-deficient strains / C. Pezard et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N 4. - P. 13691372.

181. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, № 1. - P. 265-275.

182. Proteolytic activation of MAP-kinase-kinase by anthrax lethal factor / N.S. Duesbery, C.P. Webb, S.H. Leppla et al. // Science. 1998. - Vol. 280, N5.-P. 734-737.

183. Proteomic profiling and identification of immunodominant spore antigens of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis / V.G. Delvecchio et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - Vol. 72, N 9. -P. 6355-6363.

184. Purification and characterization of the major surface array protein from the avirulent Bacillus anthracis / J.W. Farchaus et al. // J. Bacteriol. -1995. Vol. 177, N9.-P. 2481-2489.

185. Purified Bacillus anthracis lethal toxin complex formed in vitro and during infection exhibits functional and biological activity / R.G. Panchal et al. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280, N 11. - P. 10834-10839.

186. Real-time monitoring of the membrane-binding and insertion properties of the cholesterol-dependent cytolysin anthrolysin О from Bacillus anthracis / S. Cocklin et al. 11 J. Mol. Recognit. 2006. - Vol. 19, N 4. - P. 354362.

187. Recherhes sur les haptens du Bacillus anthracis et leur localisation dans la cellule bacteriemie / G. Barber et al. // Arch. Roumain. Pathol. Esptl. Microbiol. 1957. - Vol. 19, N 3. - P. 379-389.

188. Record, B.R. Physicochemical examination of polyglutamic acid from Bacillus anthracis grown in vivo / B.R. Record, R G. Wallis // Biochem. J. -1956. Vol. 63 - P. 443-447.

189. Resident CD1 lc+ lung cells are impaired by anthrax toxins after spore infection / A. Cleret et al. // J. Infect. Dis. 2006. - Vol. 194, N 1. - P. 8694.

190. Resistance to the Sterne strain of B. anthracis: phagocytic cell responses of resistant and susceptible mice / S.L. Welkos et al. // Microb. Pathog. 1989. - Vol. 7, N 1. - P. 15-35.

191. Rhie, G.E. A dually active anthrax vaccine that confers protection against both bacilli and toxins / G.E. Rhie, M.H. Roehrl, M. Mourez // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-Vol. 100, N19.-P. 10925-10930.

192. Rhie, G.E. Efficacy of non-toxic deletion mutants of protective antigen from Bacillus anthracis / G.E. Rhie, Y.M. Park, J.S. Han // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. - Vol. 45, N 2. - P. 341-347.

193. Role of Bacillus anthracis spore structures in macrophage cytokine responses / S. Basu et al. // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, N 5. - P. 23512358.

194. Role of macrophage oxidative burst in the action of anthrax lethal toxin / Hanna P.C. et al. / Mol. Med. 1994. - Vol. 1, N 1. - P. 7-18.

195. Sellman, B.R. Dominant-negative mutants of a toxin subunit: an approach to therapy of anthrax / B. R. Sellman, M. Mourez, R. J. Collier // Science. -2001. -Vol. 292, N 5517. P. 695-697.

196. Sellman, B.R. Point mutation in anthrax protective antigen that block trans-location / B.R. Sellman, Sh. Nassi, J. Collier // J. Biol. Chem. 2001. -Vol. 276, N 11. - P. 8371-8376.

197. Shlyakhov, E.N. Human live anthrax vaccine in the former USSR Shlyakhov E.N., Rubinstein E / E.N. Shlyakhov // Vaccine. 1994. Vol. 12, N28.-P. 727-735.

198. Significant passive protective effect against anthrax by antibody to Bacillus anthracis inactivated spores that lack two virulence plasmids / J. Enkhtuya et al. // Microbiology. 2006. - Vol. 152, Pt 10. - P. 3103-3110.

199. Singh, Y. Internationalization and processing of Bacillus anthracis lethal toxin by toxin-sensitive and resistans cells / Y. Singh, S.H. Leppla, R. Bhatnagar // J. Biol. Chem. -1989. Vol. 264, N 19. - P. 11099-11102.

200. Streatfield, S J. Engineered chloroplasts as vaccine factories to combat bioterrorism / S J. Streatfield // Trends Biotechnol. 2006. - Vol. 24, N 8. -P. 339-342.

201. Structural analysis and evidence for dynamic emergence of Bacillus anthracis S-layer networks / E. Couture-Tosi et al. // J. Bacteriol. 2002 — Vol. 184, N. 23. - P. 6448-6456.

202. Surface structure, hydrophobicity, phagocytosis, and adherence to matrix proteins of Bacillus cereus cells with and without the crystalline surface protein layer / A. Kotiranta et al. // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, N. 10 -P.4895-4902.

203. Taxonomy of Bacillus anthracis. http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ Taxonomy / Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=86661 &lvl=3&keep= 1 & srch-mode= 1 &unlock (01 марта 2007 г.).

204. The capsule and S-layer: two independent and yet compatible macro-molecular structures in Bacillus anthracis / S. Mesnage et al. / J. Bacteriol. -1998.-Vol. 180, N 1. -P. 52-58.

205. The extracellular and cytoplasmic proteomes of the non-virulent Bacillus anthracis strain UM23C1-2 / H. Antelmann et al. // Proteomics. 2005. -Vol. 5, N 14. - P. 3684-3695.

206. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria / T.D. Read et al. 11 Trends Microbiol. 2003. -Vol. 11, N7.-P. 297-299.

207. The S-layer homology domain as a means for anchoring heterologous proteins on the cell surface of Bacillus anthracis / S. Mesnage et al. // J. Appl. Microbiol. 1999. - N 87 - P. 256-260.

208. Thorne, C.B. Production of toxin in vitro by Bacillus anthracis and its separation in two components / C.B. Thorne, D.M. Molnar, R.E. Strange // J. Bacterid. 1960. - Vol. 79. - P. 450-455.

209. Thorne, C.B. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptide by Bacillus anthracis / C.B. Thorne, C.G. Gomez, R.D. Housewright I I J. Bacteriol. 1952. - Vol. 63. - P. 363-368.

210. Thorne, C.B. Bacillus anthracis. In: Sonenshein A.L., Hoch J.A., Losick R. (eds). Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria. American Society for Microbiology Washington, DC, 1993. - P. 113-124.

211. Titball, R.W. Vaccination against bubonic and pneumonic plague / R.W. Titball, E.D. Williamson // Vaccine. 2001. - Vol. 19, N 30. - P. 41754184.

212. Titball, R.W. Second and third generation plague vaccines / R.W. Tit-ball, E.D. Williamson // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - Vol. 529. - P. 397-406.

213. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Stachelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, N 9. -P. 4350-4354.

214. Translocation of Bacillus anthracis lethal and oedema factors across endosome membranes / C. Guidi-Rontani et al. // Cell Microbiol. 2000. -Vol. 2, N 3. -P. 259-264.

215. Troy, F.A. Chemistry and biosynthesis of the poly (g-D-glutamyl) capsule in Bacillus licheniformis. I. Properties of the membrane mediated biosynthetic reaction / F.A. Troy // J. Biol. Chem. 1973. - Vol. 248, N 1. - P. 305315.

216. Turnbull, P.C. Anthrax vaccines: past, present and future / P.C. Turn-bull // Vaccine. 1991. - Vol. 9, N 8. - P. 533-539.

217. Turnbull, P.C. Definitive identification of Bacillus anthracis a review / P.C.B. Turnbull // J. Appl. Microbiol. - 1999. - Vol. 87, N 2. - P. 237240.

218. Use of anthrax vaccine in the USA. Recomendations of the Advisory Committee on Immunization Practices // Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Atlanta, 2000. V. 49, RR-15.

219. Welkos, S.L. Differences in susceptibility of inbred mice to Bacillus anthracis / S.L. Welkos, TJ. Keener, P.H. Gibbs // Infect. Immun. 1986. -Vol. 51, N3.-P. 795-800.

220. Wu, L. A method for purification of bacterial R-type lipopolysaccha-rides (lipooligosaccharides) / L. Wu, C. Tsai, C.E. Frasch // Anal. Biochem. — 1987. Vol. 160, N 2. - P. 281-289.

221. Zaman, Z. Quantitation of proteins solubilized in sodium dodecyl sul-fate-mercaptoethanol-tris electrophoresis buffer / Z. Zaman, R.L. Verwilghem // Anal. Biochem. 1979. - Vol. 100, N 1. - P. 64-69.

222. Ziperle, G.F. Glucosamine substitution and muramidase susceptibility in Bacillus anthracis / G.F. Ziperle, J.W. Ezzell, RJ. Doyle // Can J. Microbiol. 1984. - Vol. 30, N 5. - P. 553-559.