Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Салова, Анна Владимировна

• Салова, Анна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Салова, Анна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

1.7. Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эндоцитоз

2.1.1. Типы эндоцитоза

2.1.2. Клатрин-зависимый рецептор-опосредованный эндоцитоз

2.1.3. Эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов

2.1.3.1. ЭФР и его рецептор

2.1.3.2. Регуляция эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

2.2. Квантовые точки

2.2.1. Синтез и свойства КТ

2.2.2. Функционализация КТ

2.2.3. Взаимодействие с клетками неспецифических (нетаргетных) КТ

2.2.4. Специфическое взаимодействие КТ с клетками

2.2.5. Цитотоксичность КТ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культивирование клеток

3.2. Квантовые точки

3.3. Флуоресцентные витальные красители

3.4. Ингибиторы

3.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

3.6. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Анализ проникновения в клетки инертных КТ (ПЭГ-КТ)

4.2. Исследование эндоцитоза ТАТ-КТ

4.3. Исследование эндоцитоза ЭФР-КТ

5. ОБСУЖДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт»

Визуализация происходящих в живой клетке процессов имеет огромное значение для их понимания. Существенные усилия затрачиваются на создание оптических микроскопов» с высокой разрешающей способностью и разработку новых методических подходов. Такие методы, как FRET, FRAP, TIRF и др., все шире используются для выявления локализации макромолекул и их взаимодействий. Во всех методах визуализации на оптическом уровне, в основном, используются флуоресцентные красители, например, проникающие через клеточную мембрану (акридиновый оранжевый (АО), LysoTracker) или способные встраиваться в гидрофобные липидные слои и таким образом метить плазматическую мембрану и производные ее структуры - эндосомы или Т-систему (RH 414, di-8-ANEPPS). Принципиально новый уровень исследования внутриклеточных процессов приобрели благодаря внедрению методов с использованием флуоресцентно меченых антител, узнающих определенные антигены, а также зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его модификаций.

Несмотря на неоспоримые достоинства этих подходов, они имеют ряд существенных недостатков. Так, многие флуорофоры отличаются низкой фотостабильностью и быстро «выгорают», что делает невозможным длительные наблюдения. Относительно низкий квантовый выход позволяет выявлять интересующие исследователя молекулы лишь в достаточно высоких концентрациях, в некоторых случаях значительно превышающих физиологический уровень. Каждый флуорофор имеет, как правило, свой диапазон длин волн возбуждения и широкий спектр флуоресценции. Это ограничивает возможность использования некоторых красителей для детекции мишеней на микроскопах с определенным набором лазеров и затрудняет подбор пар для одновременного выявления двух мишеней. Кроме того, для выявления внутриклеточных белков в большинстве случаев применяют фиксацию и пермеабилизацию клеток, что может в определенной степени искажать результаты.

Опыт применения антител к поверхностным антигенам, например, к рецепторам фактора роста на живых клетках показал, что эти антитела могут влиять на внутриклеточную судьбу меченных ими молекул (например, стимулировать эндоцитоз в отсутствие лиганда), приводя, таким образом; к. появлению артефактов: Так, например, ряд антител к HER2, одному из рецепторов семейства ErbB, не имеющего собственного лиганда и не способного подвергаться эндоцитозу, могут стимулировать этот процесс и таким образом удалять этот онкопротеин с поверхности клеток. Подобные антитела широко применяются в терапии опухолей, гиперэкспрессирующих HER2 (Ben-Kasus et al., 2009).

Для фундаментальных исследований механизмов функционирования того или иного белка требования к метке, с помощью которой отслеживается поведение белка-мишени, совершенно- иные. В этом случае можно сформулировать набор требований к «идеальной» флуоресцентной метке: (1) отсутствие влияния на поведение молекулы-мишени; (2) возможность длительных прижизненных наблюдений; (3) возможность выявления молекул, концентрация которых в клетке мала, вплоть до визуализации одиночных молекул; (4) возможность одновременного мечения нескольких мишеней. Однако в случае применения той или иной метки для прикладных целей (диагностика, терапия, адресная доставка лекарств и др.) способность метки изменять судьбу молекул-мишеней может, в конечном итоге, быть использована для усиления их действия или достижения дополнительных эффектов. С этой точки зрения, понимание того, как, когда и почему метка влияет на поведение мишени, становится особенно важным. Поскольку в этом случае предполагается введение меченых молекул в организм (например, для детекции опухолевых клеток), весьма существенным являются специфичность их взаимодействия с клетками-мишенями, токсичность, пути вывода из организма и т. д.

Очевидно, что ни один из широко применяемых красителей не удовлетворяет всему набору требований, поэтому усилия по поиску все новых и новых флуорофоров и улучшению свойств уже существующих не прекращаются.

Появившийся сравнительно недавно новый класс флуорофоров- — полупроводниковые нанокристаллы — квантовые точки (КТ), — обладает многими свойствами, позволяющими считать его совершенно уникальным (А1тза1:о8, 1996; Олейников и др., 2007; Вуи & а1., 2008). Действительно, КТ имеют широкую полосу возбуждения (от УФ до видимой части' спектра); узкий и симметричный спектр флуоресценции, максимум которого зависит от размера ядра КТ; высокий квантовый выход; исключительную фотостабильность. Однако материалы, из которых синтезируют КТ (элементы П-У1 (СсШе, Сс1Те, СёБ и гп8е) и Ш-У (1пР и 1пАз) групп периодической системы), сами по себе токсичны, а исходные размеры КТ (2— 9 нм) значительно увеличиваются при их функционализации — придания им способности растворяться в биологических жидкостях и специфически связывать определенные мишени (НПс1 е! а1., 2008; Ве1е11ап1у а1., 2009; Вуи Й а1., 2010).

Очевидно, что для введения КТ в исследовательскую практику и понимания возможных ограничений их применения, как в фундаментальных исследованиях, так и в прикладных областях, необходимо детальное исследование того, насколько они «нейтральны» по отношению к процессам, в которых участвуют меченные ими молекулы. В связи с этим возникает ряд вопросов. Во-первых, важно знать, зависит ли возможность взаимодействия КТ с клетками от типа клеток. Ответ на этот вопрос очень существенен для понимания последствий введения КТ в организм в диагностических или лечебных целях. Во-вторых, необходимо выяснить, влияют ли КТ на поведение лигандов, проникающих в клетку разными способами. В-третьих, чрезвычайно важно понять, насколько существующие представления о механизмах входа в клетку и последующей судьбе биологически активных молекул, полученные с помощью традиционных иммунофлуоресцентых методов на фиксированных клетках, соответствуют данным, получаемым при мечении этих белков КТ на живых клетках. 7

Bs связи с вышеизложенным в настоящей работе исследовали три типа КТ (на основе CdSe/ZnS): (1) КТ, покрытые слоем полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые минимально» взаимодействуют с биологическим материалом и могут рассматриваться как инертные;: (2) КТ. конъюгированные с ТАТ-пептидом, который; представляет собой фрагмент ТАТ-белка вируса ВИЧ-1 и относится' к пептидам; проникающим в клетку (cell penetrating peptide, GPP); TAT-пептид часто используют как вектор для ¡переноса через мембрану различных макромолекул; (3) КТ, конъюгированные с: эпйдермальным фактором роста; (ЭФР). Выбор ЭФР для решения поставленных задач связан^ во-первых, с большим количеством данных по эндоцитозу рецептора этого ростового фактора; позволяющих провести корректное сравнение многих параметров эндоцитоза, стимулированного немодифицированным и меченным КТ лигандом. Во-вторых, рецептор ЭФР является сигнальным белком, участвующим в регуляции таких важных процессов; как пролиферация; клеточная подвижность, выживание при апоптозе и др., что позволяет в перспективе исследовать возможное: влияние КТ на внутриклеточную сигнализацию; В-третьих, развитие многочисленных опухолей эпителиального происхождения, в частности, опухолей ЖКТ, коррелирует с гиперэкспрессией, рецептора ЭФР, что делает исследования функционирования этой мишени особенно важными для медицинской практики.

Основные представления по динамике эндоцитоза рецептора ЭФР были сформированы на основе иммунофлуоресцентных исследований на фиксированных клетках (Beguinot et al., 1984). Неизвестно, насколько данные, получаемые при фиксации клеток, отражают нативные процессы, протекающие в живых клетках. Использование КТ позволяет проводить эксперименты, на живых клетках. В настоящее время данные о системных исследованиях по динамике эндоцитоза рецептора ЭФР на живых клетках практически отсутствуют.

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Салова, Анна Владимировна

7. ВЫВОДЫ

1. Динамика взаимодействия и путь проникновения квантовых точек (КТ) в клетки зависят от типа клеток и функционализации КТ;.при этом способ проникновения КТ в клетку определяется лигандом, а не КТ.

2. Инертные ПЭГ-КТ не проникают в клетки НеЬа и в Т-систему и саркоплазму скелетных мышечных волокон, тогда как профессионально фагоцитирующие макрофагоподобные клетки 1774 при длительной инкубации способны поглощать и накапливать инертные ПЭГ-КТ.

3. Совместное использование КТ, акридинового оранжевого и липофильных красителей (ИН 414 или &-8-АЫЕРР8) позволило продемонстрировать, что ТАТ-КТ, проникая путем эндоцитоза в миобласты, не способны интернализоваться миотубулами, несмотря на то, что процесс формирования эндосом в этих клетках не нарушен.

4. Основные стадии эндоцитоза комплексов ЭФР-КТ: взаимодействие с рецепторами, интернализация, слияние эндосом, их транспортировка по микротрубочкам и формирование мультивезикулярных тел — не отличаются от этапов эндоцитоза; стимулированного немодифицированным ЭФР.

5. Соотношение биотин-ЭФР и стрептавидин-КТ при формировании комплекса влияет на эффективность образования эндосом, при этом оптимальным молярным соотношением ЭФР:КТ является 4:1.

6. Использование КТ в качестве метки ЭФР вызывает изменения в динамике эндоцитоза рецептора ЭФР. Комплексы ЭФР-КТ выявляются в клетке в течение существенно более длительного времени, чем ЭФР-рецепторные комплексы.

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Беляева Т. Н., Адамян С. Я., Кроленко С. А., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Салона А. В., Фаддеева М. Д. 2009. Распределение и спектры флуоресценции АО в миобластах и одиночных мышечных волокнах. Цитология. 51 (2) : 103-110.

2. Беляева Т. Н., Салона А. В., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Корнилова Е. С., Кроленко С. А. 2009. Нецелевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях клеток. Цитология. 51 (10) : 830-837.

3. Салова А. В., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Корнилова Е. С., Кроленко С. А., Беляева Т. Н. 2011. Изменение локализации компонентов везикулярного аппарата клетки в процессе дифференцировки миобластов в миотубулы в культуре. Цитология. 53 (3) : 19-26.

4. Belyaeva Т., Leontieva Е., Mozhenok Т., Salova А. 2007. Spectral characteristics of acridine orange accumulated within acidic organelles of tb — myoblasts in culture and in skeletal muscle fibers. Abstracts of 16 ESGLD Workshop : 136.

5. Leontieva E., Belyaeva Т., Salova A., Mozhenok Т., Kharchenko M., Zlobina M., Krolenko S. 2008. The interactions of untargeted and targeted quantum dots with living cells. Abstracts of ELSO Meeting : 64.

6. Салова А. В., Беляева Т. H., Кроленко С. А., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Е. С.Корнилова. 2008. Применение квантовых точек в исследованиях живых клеток. Материалы междунар. научно-методич. семинара: "Современные методы микроскопии в исследовании живых систем" : 33.

7. Салова А. В. 2008. Нецелевые и целевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях различных клеток. Материалы Политехнического симпозиума. "Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона" : 126.

8. Салова А. В., Беляева Т. Н., Корнилова Е. С., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А. 20091 Прижизненные исследования динамики поступления- квантовых точек в клетки HeLa (лазерная сканирующая, конфокальная- микроскопия). Материалы 1-й международной^ научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» : 330-332.

9. Belyaeva Т. N., Leontieva Е. A., Kornilova Е. S., Mozhenok Т. P., Salova А. V., Krolenko S. А. 2009. Laser confocal microscopic study of Quantum-Dots uptake into the cells by EGF-mediated endocytosis. Abstracts of 17th ESGLD Workshop : 8.

10.Салова А. В., Беляева Т. H., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А, Корнилова Е. С. 2009. Проблемы и перспективы*применения нецелевых и целевых квантовых точек в исследованиях живых клеток. Материалы второго международного форума по нанотехнологиям : 807-809.

11.Salova A., Belyaeva Т., Kornilova Е., Leontieva Е., Mozhenok Т., Krolenko S. 2009. Laser confocal microscopic study of targeted quantum dots uptakeinto HeLa cells. Abstracts of international conference "Modern microscopy techniques in biology and medicine" : 26. i

12.Салова А. В., Леонтьева E. А., Моженок Т.П., Кроленко С. A, Корнилова E. С., Беляева Т.Н. 2010. Применение функционализированных квантовых точек в-исследованиях эндоцитоза в живых клетках [Электронный ресурс, 1 диск (CD-ROM)]. Материалы третьего международного форума по нанотехнологиям. М.: Российская корпорация нанотехнологий.

13.Салова А. В., Беляева Т. Н., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А, Корнилова Е. С. 2010. Динамика поступления квантовых точек в клетки HeLa. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Цитология. 52 (6) : 505.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что применение квантовых точек (КТ) делает возможным выявление меченных ими мишеней, находящихся в очень низких концентрациях, в живых клетках. Более того, КТ исключительно удобны для изучения* и количественного анализа таких процессов, как транслокация везикул, меченных КТ, по микротрубочкам и слияние везикул. Проведенное исследование позволяет говорить о том, что не КТ, а лиганды определяют тот путь, с помощью которого комплексы будут проникать в клетки. При этом необходимо учитывать особенности каждого конкретного механизма (например, необходимость димеризации рецепторов) для формирования наиболее эффективных с точки зрения интернализации и «полноценных» с точки зрения их биологических эффектов комплексов КТ с лигандами. Однако также очевидно, что КТ, даже инертные, нельзя считать нейтральными маркерами. Во-первых, они могут поглощаться клетками, которые исследователи не рассматривают в качестве мишени при постановке основной задачи. Во-вторых, мечение ими определенных лигандов в принципе способно изменять дальнейшую судьбу интернализованных лигандов. Имея в виду, что рецептор ЭФР не только участвует в регуляции широкого спектра клеточных процессов в норме, но и часто гиперэкспрессируется при трансформации клеток, разработка методов детекции таких одиночных клеток в доступных для неинвазивного вмешательства органах (например, в ЖКТ) представляется весьма перспективной. Показанное нами накопление КТ, связанного с ЭФР, в лизосомах, делает возможным разработку протоколов выявления одиночных трансформированных клеток и длительного мониторинга поведения клеток в организме. Высокий квантовый выход и фотостабильность КТ делает их первыми кандидатами для использования в таких подходах. Однако наши данные говорят о том, что необходимы дополнительные исследования, посвященные выяснению последствий выявленных изменений динамики эндоцитоза. Для применения КТ в медицине необходимо минимизировать все побочные эффекты, например, поглощение профессиональными

78 фагоцитами несвязавшихся с клетками-мишенями ЭФР-КТ, а также клетками почек и печени. Неясным также остается вопрос о судьбе клеток после аккумуляции в них КТ. Дальнейшие исследования этих аспектов остаются первоочередной задачей. Важным также является выяснение того, соответствуют ли сигнальные свойства рецепторов, надолго задерживающихся в клетке, сигнальным свойствам нативных лиганд-рецепторных комплексов. В связи с появлением все большего количества доказательств сигнальной роли интернализованных тирозинкиназных рецепторов, в том числе на поздних стадиях эндоцитоза, этот вопрос становится одним из основных в рассматриваемой области.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Салова, Анна Владимировна, 2011 год

1. Кроленко С. А. 1975. Т-система мышечных волокон. Л.: Наука. 128 с.

2. Кроленко С. А., Адамян С. Я., Беляева Т. Н., Моженок Т. П. 2003. Локализация кислых органоидов в скелетных мышечных волокнах лягушки. Цитология. 45 (7) : 714-721.

3. Кроленко С. А., Адамян С. ЯБеляева Т. Н., Моженок Т. П., Салова А. В. 2007. Конфокально-микроскопическое исследование мембранных органоидов скелетного мышечного волокна в процессе распространяющегося некроза. Цитология. 49 (2) : 107—114.

4. Крылова Т. А., Фридлянская И. И. 1988. Культивирование скелетно-мышечных клеток. В кн.: Методы культивирования клеток. Л., Наука : 282-290.

5. Никольский Н. Н., Соркин А. Д., Соркин А. В. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

6. Олейников В. А., Суханова А. В., Набиев И. Р. 2007. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине. Российские нанотехнологии. 2 (1-2) : 160-173.

7. Харченко М. В., Аксенов Н. Д., Корнилова Е. С. 2002. Влияние гипертонического раствора сахарозы и 5-(М,М-гексаметилен)-амилорида на рецептор-опосредованный и жидкофазный эндоцитоз. Цитология. 44 (7) : 681-690.

8. Abe Т., Такапо К., Suzuki A., Shimada Y., Inagaki М., Sato N., Obinata Т., Endo Т. 2004. Myocyte differentiation generates nuclear invaginations traversed by myofibrils associating with sarcomeric protein mRNAs. J. Cell Sci. 117 : 6523-6534.

9. Akerman M. E., Chan W. C., Laakkonen P., Bhatia S. N., Ruoslahti E. 2002. Nanocrystal targeting in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 : 12617-12621.

10. Alivisatos A. P. 1996. Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots. Science. 271 :933-937.

11. Anderson R. G. 1998. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67 : 199-225.

12. Bache K. G., Raiborg C., Mehlum A., Stenmark H. 2003. STAM and Hrs are subunits of a multivalent ubiquitin-binding complex on early endosomes. J. Biol. Chem. 278 : 12513-12521.

13. Ballou B., Ernst L. A., Andreko S., Harper T., Fitzpatrick J. A., Waggoner A. S., Bruchez M. P. 2007. Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mouse tumor models. Bioconjug. Chem. 18 : 389-396.

14. Barua S., Rege K. 2009. Cancer-cell-phenotype-dependent differential intracellular trafficking of unconjugated quantum dots. Small. 5 : 370-376.

15. Beguinot L., Lyall R. M., Willingham M. C., Pastan I. 1984. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81 : 2384-2388.

16. Ben-Kasus T., Schechter B., Lavi S., Yarden Y., Sela M. 2009. Persistent elimination of ErbB-2/HER2-overexpressing tumors using combinations of monoclonal antibodies: relevance of receptor endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 : 3294-3299.

17. BentzenE. L., Tomlinson I. D., Mason J., GreschP., Warnement M. R., Wright D., Sanders-Bush E., Blakely R., Rosenthal S. J. 2005. Surface modification to reduce nonspecific binding of quantum dots in live cell assays. Bioconjug. Chem. 16 : 1488-1494.

18. Biju V., Itoh T., Anas A., Sujith A., Ishikawa M. 2008. Semiconductor quantum dots and metal nanoparticles: syntheses, optical properties, and biological applications. Anal. Bioanal. Chem. 391 : 2469-2495.

19. Biju V., Itoh 71, Ishikawa M. 2010. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging. Chem. Soc. Rev. 39 : 3031-3056.

20. Bruchez M. Jr., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A. P. 1998. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 : 2013-2016.

21. Burattini S., Ferri P., Battistelli M., Curci R., Luchetti F., Falcieri E. 2004. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. Eur. J. Histochem. 48 : 223-233*.

22. Cahill K. 2009. Simple model of the transduction of cell-penetrating peptides. IET Syst. Biol. 3 : 300-306.

23. Cai W., Chen X. 2008. Preparation of peptide-conjugated quantum dots for tumor vasculature-targeted imaging. Nat. Protoc. 3 : 89-96.

24. Carpenter G. 1992. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. Faseb J. 6 : 3283-3289.

25. Carpenter G., Cohen S. 1979. Epidermal growth factor. Annu Rev. Biochem. 48 : 193-216.

26. Chan W.C.W., Nie S. 1998. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science 281 : 2016-2018.

27. Chan W. S. W., Maxwell D. J., Gao X., Bailey R. E., Han M., Nie S. 2002. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. 13 : 40^16.

28. Chen B., Liu Q., Zhang Y., Xu L., Fang X. 2008. Transmembrane delivery of the cell-penetrating peptide conjugated semiconductor quantum dots. Langmuir. 24 : 11866-11871.

29. Chen F., Gerion D. 2004. Fluorescent CdSe/ZnS nanocrystal-peptide conjugates for long-term, nontoxic imaging and nuclear, targeting in living cells. Nano Lett. 4 : 1827-1832.

30. Choi H. S., Liu IV., Liu F., Nasr K., Misra P., Bawendi M. G., Frangioni J. V. 2010. Design considerations for tumour-targeted nanoparticles. Nat. Nano. 5 : 42-47.

31. Cohen S. 1962. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-born animal: J:. Biol; Chem. 237:1555-1562.

32. Dauber W., Voigt T., HärtelX., Mayer J. 2000. The T-tubular network and its triads in the sole plate sarcoplasm of the motor end-plate of mammals. J Muscle Res. Cell Motil. 21 : 443-449.

33. Delehanty J. B., Mattoussi H., Medintz I: L. 2009. Delivering quantum dots into cells: strategies, progress and remaining issues. Anal. Bioanal. Chem. 393 : 1091-1105.

34. Delehanty J. B., Medintz I. L., Pons T., Brunei F. M., Dawson P. E., Mattoussi H. 2006. Self-assembled quantum dot-peptide bioconjugates for selective intracellular delivery. Bioconjug. Chem. 17 : 920-927.

35. Derfus A. M., Chan W. C. W., Bhatia S. N. 2004a. Intracellular delivery of quantum dots for live cell labeling and organelle tracking. Adv. Mater. 16 : 961-966.

36. Derfus A. M., Chan W. C. W., Bhatia S. N. 2004b. Probing the cytotoxicity of semiconductor quantum dots. Nano Lett. 4 : 11-18.

37. Duan Hi, Nie S. 2007. Cell-penetrating* quantum dots based on multivalent and endosome-disruptingsurface coatings. J. Am. Chem. Soc. 129 : 3333-3338.

38. Dubertret B., Skourides P., Norris D. J., Noireaux V., Brivanlou A. H:, Libchaber A. 2002. In vivo imaging* of quantum» dots encapsulated in phospholipid micelles. Science. 298 : 1759-1762.

39. Duchardt F., Fotin-Mleczek M., Schwarz H., Fischer R., Brock R. 2007. A comprehensive model for the cellular uptake of cationic cell-penetrating peptides. Traffic. 8 : 848-866.

40. Dunn K. W., Maxfield F. R. 1992. Delivery of ligands from sorting endosomes to late endosomes occurs by maturation of sorting endosomes. J. Cell Biol. 117 : 301-310.

41. Dupre S., Volland C., Haguenauer-Tsapis R: 2001. Membrane transport: ubiquitylation in endosomal sorting. Curr. Biol. 11 : 932-934.

42. De Duve C. 1963. The lysosome. Sci. Am. 208 : 64-72.

43. Erogbogbo F., Yong K., Roy L, Xu G., Prasad P. N., Swihart M. T. 2008. Biocompatible luminescent silicon quantum dots for imaging of cancer cells. ACS Nano. 2 : 873-878.

44. Flucher B. E., Terasaki M., Chin H. M., Beeler T. J., Daniels M. P. 1991. Biogenesis of transverse tubules in skeletal muscle in vitro. Develop. Biol. 145 : 77-90.

45. Geys J., Nemmar A., Verbeken E., Smolders E., Ratoi M., Hoylaerts M. F., Nemery B., Hoet P. H. 2008. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: impact of surface charge. Environ Health Perspect. 116 : 16071613.

46. Germain R. N. 2004. An innately interesting decade of research in immunology. Nat. Med. 10 : 1307-1320.

47. Gruenberg J., Griffiths G., Howell K. E. 1989. Characterization^ of the early endosome and putative endocytic carrier vesicles in vivo and' with an assay of vesicle fusion in vitro. J. Cell Biol. 108 : 1301-1316.

48. Hardman R. 2006. A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physicochemical and environmental factors. Environ Health Perspect. 114 : 165-172.

49. Heuser J. E., Anderson R. G. 1989. Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. J. Cell Biol. 108 :38SM00.

50. Hild W. A., Breunig M., Goepferich A. 2008. Quantum dots nano-sized probes for the exploration of cellular and intracellular targeting. Eur. J. Pharm. Biopharm. 68 : 153-168.

51. Hines M. A., Guyot-Sionnest P. 1996. Synthesis and characterization of strongly luminescent ZnS-capped CdSe nanocrystals. J. Phys. Chem. 100 : 468-471.

52. Holbro T., Civenni G., Hynes N. E. 2003. The ErbB receptors and their role in cancer progression. Exp. Cell Res. 284 : 99-110.

53. Hoshino A., FujiokaK., Oku T., Suga M, Sasaki Y. F., Ohta T., Yasuhara M., Suzuki K., Yamamoto K. 2004. Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano Lett. 4 : 2163-2169.

54. Howarth M., Liu W., Puthenveetil S., Zheng Y., Marshall L. F., Schmidt M: M., Wittrup K. D., Bawendi M. G., Ting A., Y. 2008. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on?living cells. Nat. Meth. 5 : 397—399.

55. Hurley J. H., Emr Si D. 2006. The ESCRT complexes: structure and mechanism of a membrane-trafficking network. Annu Rev. Biophys. Biomol: Struct: 35 : 277-298.

56. Jaiswal J. K, Mattoussi H., Mauro J. M., Simon S. M. 2003. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nat. Biotechnol. 21 : 47-51.

57. Jorissen R. N., Walker F., Pouliot N., Garrett T. P., Ward C. W., Burgess A. W. 2003. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp. Cell. Res. 284 : 31-53.

58. Jovic M, Sharma M., Rahajeng J., Caplan S. 2010. The early endosome: a busy sorting station for proteins at the crossroads. Histol. Histopathol. 25 : 99-112.

59. Kairdolf B. A., Mancini M. C., Smith A. M., Nie S. 2008. Minimizing nonspecific cellular binding of quantum dots with hydroxyl-derivatized surface coatings. Anal. Chem. 80 : 3029-3034.

60. Kaisto T., Rahkila P., Marjomaki V., Parton R. G., Metsikko K. 1999. Endocytosis in skeletal muscle fibers. Exp. Cell Res. 253 : 551-560.

61. KelfT. A., Sreenivasan V. K., Sun J., Kim E. J., Goldys E. M., Zvyagin A. V. 2010. Non-specific cellular uptake of surface-fiinctionalized quantum dots. Nanotechnology. 21 :285105.

62. Kharchenko M. V., Aksyonov A. A., Melikova M. M., Kornilova. E. S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31 : 349359.

63. Kingeter L. M., Schaefer B. C. 2009. Expanding the multicolor capabilities of basic confocal microscopes by employing red and near-infrared quantum dot conjugates. BMC Biotechnol. 9 : 49.

64. Kirchner C., Liedl T., Kudera S., Pellegrino T., Javier A. M., Gaub H. E., Stoelzle S., Fertig N., Parak W. J. 2005. Cytotoxicity of colloidal,' cdse and cdse/zns nanoparticles. Nano Lett. 5 : 331—338.

65. Kollias H. D., Perry R. L., Miyake T., Aziz A., McDermott J. C. 2006. Smad7 promotes and enhances skeletal muscle differentiation. Mol. Cell. Biol. 26 : 6248-6260.

66. Kong C., Su X., Chen P. /., Stahl P. D. 2007. Rinl interacts with signal-transducing adaptor molecule (STAM) and mediates epidermal growth factor receptor trafficking and degradation. J. Biol. Chem. 282 : 15294-15301.

67. Koshman Y. E., Waters S. B., Walker L. A., Los T., de Tombe P., Goldspink P. H., Russell B. 2008. Delivery and visualization of proteins conjugated to quantum dots in cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 45 : 853-856.

68. Krolenko S. A., Adamyan S. Ya., Belyaeva T. N., Mozhenok T. P. 2006. Acridine orange accumulation in acid organelles of normal and vacuolated frog skeletal muscle fibres. Cell Biol. Int. 30 : 933-939.

69. Krolenko S. A., Lucy J. A. 2001. Reversible vacuolation of T-tubules in skeletal muscle: mechanisms and implications for cell biology. Int. Rev. Cytol. 202 : 243-298.

70. Kuo T. R., Lee C. F., Lin S. J., Dong C. Y., Chen C. C., Tan H. Y. 2011. Studies of Intracorneal Distribution and Cytotoxicity of Quantum Dots: Risk Assessment of Eye Exposure. Toxicol. 24 : 253-261.

71. Lee J., Kim J., Park E., Jo S., Song R. 2008. PEG-ylated cationic CdSe/ZnS QDs as an efficient intracellular labeling agent. Phys. Chem. Chem. Phys. 10 : 1739-1742.

72. Li S., Wang Y., Wang H., Bai Y., Liang G., Wang Y., Huang N., Xiao Z. 2011. MicroRNAs as participants in cytotoxicity of CdTe quantum dots in NIH/3T3 cells. Biomaterials 32 : 3807-3814.

73. Lidke D. S., Nagy P., Heintzmann R., Arndt-Jovin D. J., Post J. N., Grecco H. E., Jares-Erijman E. A., Jovin T. M. 2004. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nat. Biotechnol. 22 : 198-203.

74. Lin S., Xie X., Patel M. R., Yang Y H., Li Z., Cao F., Gheysens O., Zhang Y., Gambhir S. S., Rao J. H., Wu J. C. 2007. Quantum dot imaging for. embryonic stem cells. BMC Biotechnol. 7:67.

75. Lindgren M., Hallbrink M., Prochiantz A., Langel U. 2000. Cellpenetrating peptides. Trends Pharmacol. Sci. 21 : 99-103.

76. Lindmo K., Stenmark H. 2006. Regulation of membrane traffic by phosphoinositide 3-kinases. J. Cell Sci. 119 : 605-614.

77. Liu W., Howarth M., Greytak A. B., Zheng Y., Nocera D. G., Ting A. Y., Bawendi M. G 2008. Compact biocompatible quantum dots functionalized for cellular imaging. J. Am. Chem. Soc. 130 : 1274-1284.

78. Lu Z., Joseph D., Bugnard E., Zaal K. J., Ralston E. 2001. Golgi complex reorganization during muscle differentiation: visualization in living cells and mechanism. Mol. Biol. Cell. 12 : 795-808.

79. Mainardes R. M., Gremiao M. P., Brunetti I. L., da Fonseca L. M., Khalil N. M. 2008. Zidovudine-loaded PLA and PLA-PEG blend nanoparticles: Influence of polymer type on phagocytic uptake by polymorphonuclear cells. J. Pharm. Sci. 98 :257-267.

80. Mahto S. K., Park C., Yoon T. H., Rhee S. W. 2010. Assessment of cytocompatibility of surface-modified CdSe/ZnSe quantum dots for BALB/3T3 fibroblast cells. Toxicol In Vitro. 24 : 1070-1077.

81. Marsh M., McMahon H. T. 1999. The structural era of endocytosis. Science. 285 :215-220.

82. Maysinger D., Behrendt M, Lalancette-Hebert M., Kriz J. 2007. Real-time imaging of astrocyte response to quantum dots: in vivo screening model system for biocompatibility of nanoparticles. Nano Lett. 7 : 2513-2520.

83. Mellman I., Fuchs R., Helenius A. 1986. Acidification of the endocytic and exocytic pathways. Annu. Rev. Biochem. 55 : 663-700.

84. Miaczynska M., Pelkmans L., Zerial M. 2004. Not just a sink: endosomes in control of signal transduction. Curr. Opin. Cell Biol. 16 : 400-406.

85. Michalet X., Pinaud F. F., Bentolila L. A., Tsay J. M., Doose S., Li J. J., Sundaresan G., Wu A. M, Gambhir S. S., Weiss S. 2005. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 : 538-544.

86. Michalet X., Pinaud F., Lacoste T. D., Dahan M., Bruchez M. P., Alivisatos A. P., Weiss S. 2001. Properties of fluorescent semiconductor nanocrystals and their application to biological labeling. Single Mol. 2 : 261-276.

87. MinshallR. D., Tiruppathi C., Vogel S. M., Niles W. D., Gilchrist A., Hamm H. E., Malik A. B. 2000. Endothelial cell-surface gp60 activates vesicle formation and trafficking via G(i)-coupled Src kinase signaling pathway. J. Cell. Biol. 150 : 1057-1070.

88. Mok H., Bae K. H., Ahn C. H., Park T. G. 2009. PEGylated and MMP-2 specifically dePEGylated quantum dots: comparative evaluation of cellular uptake. Langmuir 25 : 1645-1650.

89. Mueller J., Kretzschmar I., Volbner R., Boisguerin P. 2008. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chem. 19 : 2363-2374.

90. Murphy R. F. 1991. Maturation models for endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 1 : 77-82.

91. Murray C. B., Norris D. J., Bawendi M. G. 1993. Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E = S, Se, Te) semiconductor nanocrystallites. J. Am. Chem. Soc. 115 : 8706-8715.

92. Niles W. D., Malik A. B. 1999. Endocytosis and exocytosis events regulate vesicle traffic in endothelial cells. J. Membr. Biol. 167 : 85-101.

93. Pan Y. L, Cai J. Y., Oin L., Wang H. 2006. Atomic force microscopy-based celli nanostructure for ligand-conjugated quantum dot endocytosis. Acta Biochirm Biophys. Sin. 38 : 646-652.

94. Park J., Gu L., von Maltzahn G., Ruoslahti E., Bhatia S. N., Sailor M. J. 2009. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nat. Mater. 8 : 331-336.

95. Pelkmans L. 2005. Secrets of caveolae- and lipid raft-mediated endocytosis revealed by mammalian viruses. Biochim. Biophys. Acta. 1746 : 295-304.

96. Poon G. M., Gariepy J. 2007. Cell-surface proteoglycans as molecular portals for. cationic peptide and polymer entry into cells. Biochem. Soc. Trans. 35 : 788-793.

97. Pradhan N., Goorskey D., Thessing J., Peng X. 2005. An alternative of CdSe nanocrystal emitters: pure and tunable impurity emissions in ZnSe nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127 : 17586-17587.

98. Puente L. G., Voisin S., Lee R. E., Megeney L. A. 2006. Reconstructing the regulatory kinase pathways of myogenesis from phosphopeptide data. Molt Cell Proteomics. 5 : 2244-2251.

99. Raj an S. S., Liu H. Y., Vu T. Q. 2008. Ligand-bound quantum dot probes for studying the molecular scale dynamics of receptor, endocytic trafficking in live cells. ACS Nano. 2 : 1153-1166.

100. Ralston E. 1993. Changes in architecture of the Golgi complex and other subcellular organelles during myogenesis. J. Cell Biol. 120 : 399-409.

101. Ralston E., Ploug T., Kalhovde J., Lomo T. 2001. Golgi complex, endoplasmic reticulum exit sites, and microtubules in skeletal muscle fibers are organized by patterned activity. J. Neurosci. 21 : 875-883.

102. Reiss P., Protiure M., Li L. 2009. Core/Shell semiconductor nanocrystals. Small. 5 : 154-168.

103. Ren Y„ Cheng L., Rong Z., Li Z, Li Y, Zhang X., Xiong S., Hu J., Fu X. Y., Chang Z. 2008. hSef potentiates EGF-mediated MAPK signaling through affecting EGFR trafficking and degradation. Cell Signal. 20 : 518-533.

104. Ruan G., Agrawal A., Marcus A. I., Nie S. 2007. Imaging and tracking of tat peptide-conjugated quantum dots in living cells: new insights into nanoparticle uptake, intracellular transport, and vesicle shedding. J. Am. Chem. Soc. 129 : 14759-14766.

105. Ryman-Rasmussen J. P., Riviere J. E., Monteiro-Riviere N. A. 2006. Penetration of intact skin by quantum dots with diverse physicochemical properties. Toxicol. Sei. 91 : 159—165.

106. Ryman-Rasmussen J. P., Riviere J. E., Monteiro-Riviere N. A. 2007a. Variables influencing interactions of untargeted quantum dot nanoparticles with skin cells and identification of biochemical modulators. Nano Lett. 7 : 1344-1348.

107. Ryman-Rasmussen J. P., Riviere J. E., Monteiro-Riviere N. A. 2007b. Surface coatings determine cytotoxicity and irritation potential -of quantum dot nanoparticles in epidermal keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 127 : 143—153.

108. Sanger J. W., Chowrashi P., Shaner N. C., Spalthoff S., Wang J., Freeman N. L., Sanger J. M. 2002". Myofibrillogenesis in skeletal muscle cells. Clin. Orthop. Relat. Res. 66 : 153-162.

109. Sawant R., Torchilin V. 2011. Intracellular delivery of nanoparticles with CPPs. Methods Mol. Biol. 683 : 431-451.

110. Schlessinger J. 1988. Regulation of cell growth and transformation by the epidermal growth factor receptor. Adv. Exp. Med. Biol. 234 : 65—73.

111. Smith A. M., Nie S. 2009. Next-generation quantum dots. Nat. Biotech. 27 : 732-733.

112. Steinman R. M., Mellman I. S., Muller W. A., Cohn Z. A. 1983. Endocytosis and the recycling of plasma membrane. J. Cell Biol. 96 : 1-27.

113. Sukhanova A., Devy J., Venteo L., Kaplan H., Artemyev M., Oleinikov V., Klinov D., Pluot M., Cohen J. H., Nabiev I. 2004. Biocompatible fluorescent nanocrystals for immunolabeling of membrane proteins and cells. Anal. Biochem. 324 : 60-67.

114. Tekle C., Deurs B., Sandvig K., Iversen T. G. 2008. Cellular trafficking of quantum dot-ligand bioconjugates and their induction of changes in normal routing'of unconjugated ligands. Nano Lett. 8 : 1858-1865.

115. Thome R. G., Nicholson,C. 2006. In vivo diffusion analysis with quantum:dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 : 5567-5572.

116. Thornell L. E., Price M. G. 1991. The cytoskeleton in muscle cells in relation to function. Biochem. Soc. Trans. 19 : 1116-1119.

117. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell. 61 : 203-212.

118. Vu T. Q., MaddipatiR., Blute T. A., Nehilla B. J., Nusblat L., Desai T. A. 2005. Peptide-conjugated quantum dots activate neuronal receptors and initiate downstream signaling of neurite growth. Nano Lett. 5 : 603-607.

119. Walther C., Meyer K., Rennert R., Neundorf I. 2008. Quantum dot-carrier peptide conjugates suitable for imaging and delivery applications. Bioconjug Chem. 19 :2346-2356.

120. Wang C, Gao X, SuX. 2010. In vitro and in vivo imaging with quantum dots. Anal Bioanal Chem. 397 : 1397-1415.

121. Wang L., Nagesha D. K., Selvarasah S., Dokmeci M. R., Carrier R. L. 2008. Toxicity of CdSe nanoparticles in Caco-2 cell cultures. J. Nanobiotechnology. 6 : 11-26.

122. Wang Y., Pennock S., Chen X., Wang Z. 2002. Endosomal signaling of epidermal growth factor receptor stimulates signal transduction pathways leading to cell survival. Mol. Cell Biol. 22 : 7279-7290.

123. Wei Y., JanaN. R., TanS. J., YingJ. Y 2009. Surface coating directed cellular delivery of TAT-functionalized quantum dots. Bioconjug. Chem. 20 : 17521758.

124. Weisz O. A. 2003. Acidification and protein traffic. Int. Rev. Cytol. 226 : 259319.

125. Wileman T., Harding C., Stahl P. 1985. Receptor-mediated endocytosis. Biochem. J. 232 : 1-14.

126. Wiley H. S., Burke P. M. 2001. Regulation, of1 receptor tyrosine kinase signaling by endocytic trafficking. Traffic. 2001 2 : 12-18.

127. Wilkinson K. D. 2000.' Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev. Biol. 11 : !41

128. Wu X, Liu H., Liu J., Haley K. N., Treadway J. A., Larson J. P., Ge N., Peale' F., Bruchez M. P. 2003. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 :41-46.

129. Xiong R., Li Z., Mi L., Wang P. N., Chen J. Y., WangL., Yang W. L. 2010. Study on the intracellular fate of Tat peptide-conjugated quantum dots by spectroscopic investigation. J. Fluoresc. 20 : 551—556.

130. Xiao Y., Forry S. P., Gao X., Hoi brook R. D., Telford W. G., Tona A. 2010. Dynamics and mechanisms» of quantum dot nanoparticle cellular uptake. J. Nanobiotechnology.8 : 13 (000-000).

131. Xue F. L., Chen J. Y., Guo J., Wang C. C., Yang W. L., Wang P. N., Lu D. R. 2007. Enhancement of intracellular delivery of CdTe quantum dots (QDs) to living cells by Tat conjugation. J. Fluoresc. 17 : 149-154.

132. Yana M., Zhanga Y., Xua K., Fub T., Qinb H., Zhenga X. 2011. An, in vitro study of vascular endothelial toxicity of CdTe quantum dots. Toxicology. 282 :

133. Zhang L. W., Monteiro-Riviere N. A. 2009. Mechanisms of quantum dot nanoparticle cellular uptake. Toxicol Sci. 110 : 138-155.148.94.103.