Взаимодействие вирусов растений с антителами: количественные закономерности и практическое применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Сафенкова, Ирина Викторовна

• Сафенкова, Ирина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сафенкова, Ирина Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Г.1. Морфологи вирусов растений.

1.2. Антигенные свойства вирусов и иммунные комплексы вирусов.

1.3. Физико-химические модели взаимодействий антиген-антитело.

1.4. Способы изучения взаимодействия вирусов с антителами.

1.5. Иммуноаналитические системы для детекции вирусов.

1.6. Свойства изучаемых иммуноаналитических систем.

1.7. Корреляция характеристик иммунохимических взаимодействий и показателей иммуноанатитических систем.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

Глава 3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ С АНТИТЕЛАМИ.

3.1. Характеристика иммунореагентов.

3.2. Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом цитофлуориметрии.

3.3. Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом поверхностного плазменного резонанса на приборе Biacore X.

3.4. Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом атомно-силовой микроскопии.

3.5. Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом иммуноферментного анализа.

3.5.1. Количественная характеристика иммунной реакции взаимодействия вирусов растений с антителами в иммуноферментном анализе.

3.5.2. Аналитические характеристики иммуноферментной системы на основе взаимодействия вирусов растений с антителами.

Глава 4. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ С АНТИТЕЛАМИ, КОНЪЮГИРОВАННЫМИ С

КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ.

4.1. Получение препаратов антител, конъюгированных с наночастицами коллоидного золота.

4.1.1. Получение наночастиц коллоидного золота и их характеристика.

4.1.2. Получение конъюгатов наночастиц коллоидного золота с антителами.

4.2. Характеристика взаимодействия вирусов и конъюгатов наночастиц коллоидного золота с антителами методом поверхностного плазменного резонанса на приборе Biacore X.

4.3. Характеристика взаимодействия вирусов и конъюгатами наночастиц коллоидного золота с антителами методами просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии.

4.4. Характеристика взаимодействия вирусов и конъюгатов наночастиц коллоидного золота с антителами методом иммуноферментного анализа.

4.5. Характеристика взаимодействия вирусов и конъюгатов наночастиц коллоидного золота с антителами методом иммунохроматографического анализа.

Глава 5. РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ.

5.1. Оптимизация условий иммунохроматографии.

5.2. Определение порогов детекции иммунохроматографических тест-систем.

5.3. Апробация тест-систем для анализа растительного материала.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие вирусов растений с антителами: количественные закономерности и практическое применение»

Работа посвящена характеристике биохимических и биоаналитических аспектов взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с наночастицами коллоидного золота. Большинство вирусов растений состоит из нуклеиновой кислоты, полностью покрытой упорядоченными копиями белка оболочки. Такая морфология позволяет отнести вирусы растений к поливалентным антигенам с регулярным расположением детерминант. При взаимодействии вирусов со специфическими антителами происходит образование сложных иммунных комплексов, состав которых определяется соотношением реагентов и константами иммунохимической реакции. Возможность поливалентных взаимодействий обусловлена близким расположением идентичных антигенных детерминант на поверхности вирусной частицы и подвижностью Fab-фрагментов иммуноглобулинов.

Определение количественных характеристик реакции поливалентных антигенов с антителами является необходимой основой для описания процессов формирования ими иммунных комплексов разного состава. Вирусы растений — информативный природный материал для изучения поливалентных взаимодействий. В то же время иммунохимическая характеристика вирусов растений создает научную основу для создания высокочувствительных биоаналитических систем их детекции, что имеет большое практическое значение. Для этой цели также необходимо выявление корреляций между свойствами иммунореагентов и физико-химическими характеристиками процессов образования иммунных комплексов вирус-антитело. Эффективным инструментом для такого исследования являются конъюгаты антител и наноразмерных носителей, в первую очередь коллоидного золота, которое благодаря своим уникальным свойствам широко используется в биоаналитических системах.

Одним из активно развивающихся направлений биоанализа являются иммунохроматографические тест-системы. Экспрессное определение растительных вирусов методом иммунохроматографии на основе коллоидного золота - эффективный подход для выявления различных фитопатологий, что обусловливает актуальность разработки и производства этих тест-систем в России.

Вышеизложенные соображения обуславливают актуальность данной работы. Ее целью являлось изучение количественных закономерностей взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с наночастицами коллоидного золота и применение полученных результатов для разработки экспрессных методов иммунохроматографического анализа вирусов растений.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:

1. Исследовать процессы иммобилизации антител на поверхности наночастиц коллоидного золота разного размера.

2. Изучить количественные закономерности взаимодействия вирусов растений с нативными антителами.

3. Сравнить количественные характеристики взаимодействия между вирусами и конъюгатами антител с наночастицами коллоидного золота, различающимися по составу.

4. Изучить влияние состава и свойств иммунореагентов на аналитические характеристики иммунохроматографических тест-систем.

5. Разработать иммунохроматографические тест-системы для детекции вирусов растений.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Сафенкова, Ирина Викторовна

выводы

1. Установлено, что изменение валентности конъюгата антител с наночастицами коллоидного золота за счет увеличения площади носителя приводит к изменению его аффинности. Равновесная константа ассоциации взаимодействия вирусов с конъюгатами выше, чем взаимодействия с нативными антителами, причем разница данных величин составляет от одного (частицы с диаметром 6,4 нм) до трех порядков (частицы с диаметром 52 нм).

2. Изучены кинетические зависимости взаимодействия вирусов с антителами и их конъюгатами. Показано, что для конъюгатов коллоидного золота большего размера (в ряду наночастиц с диаметром от 5 до 60 нм) кинетическая константа диссоциации комплекса вирус-конъюгат уменьшается, а кинетическая константа ассоциации увеличивается более чем на два порядка.

3. Проведено сравнительное изучение свойств конъюгатов, полученных при разной степени заполнения антителами поверхности частиц коллоидного золота. Показано, что увеличение содержания антител в конъюгате выше величины, минимально необходимой для стабилизации коллоидных частиц, не приводит к существенным отличиям в связывании вирусов.

4. Установлена зависимость между размером коллоидных частиц в конъюгатах с антителами и пределом обнаружения вирусов в иммуно-хроматографическом анализе. Показано, что минимальный предел обнаружения достигается при использовании частиц с диаметром 33 нм.

5. Разработаны иммунохроматографические тест-системы для экспрессного (10 мин) выявления Х-вируса картофеля, вируса табачной мозаики, вируса крапчатости гвоздики и вируса шарки сливы. Показана их эффективность для детекции вирусов в растительном материале.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сафенкова, Ирина Викторовна, 2010 год

1. Holmes F.E., Handbook of phytopathogenic viruses. 1939. Burgess: Minneapolis, Minn. 221.

2. Lwoff A.,Tournier P, The Classification of Viruses II Annual Review of Microbiology, 1966. 20(1): p. 45-74.

3. Lwoff A., Home R., Toumier P, A System of Viruses. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1962. 27: p. 51-55.

4. Andrewes C.H., Classification and Nomenclature of Viruses II Annual Review of Microbiology, 1952. 6(1): p. 119-138.

5. Bang F.B., Morphology of Viruses II Annual Review of Microbiology, 1955. 9(1): p. 2144.

6. Fauquet C.M., Mahy B.W.J., Regenmortel M.H.V., Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses, in Encyclopedia of Virology. 2008. Academic Press: Oxford, p. 9-23.

7. Kuhn J.,Jahrling P., Clarification and guidance on the proper usage of virus and virus species names I I Archives of Virology. 155(4): p. 445-453.

8. Van Regenmortel M.H.V., Virus species and virus identification: Past and current controversies II Infection, Genetics and Evolution, 2007. 7(1): p. 133-144.

9. Mayo M.A., Developments in plant virus taxonomy since the publication of the 6th ICTV Report И Archives of Virology, 1999.144(8): p. 1659-1666.

10. Casjens S., Mahy B.W.J., Regenmortel M.H.V., Capsid Assembly: Bacterial Virus Structure and Assembly, in Encyclopedia of Virology. 2008, Academic Press: Oxford, p. 432-440.

11. Matthews R.E.F., Plant virology. 2004. San Diego: Academic Press. 1001.

12. Crick F.H.C., Watson J.D., Structure of Small Viruses II Nature, 1956. 177(4506): p. 473475.

13. Костюченко B.A., Мееянжинов В.В., Архитектура сферических вирусов II Успехи биологической химии, 2002. 42: р. 177-192.

14. Zandi R., Reguera D., Bruinsma R.F., Gelbart W.M., Rudnick J., Origin of icosahedral symmetry in viruses II Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004.101(44): p. 15556-15560.

15. Phelps D.K., Speelman В., Post C.B., Theoretical studies of viral capsid proteins II Current Opinion in Structural Biology, 2000.10(2): p. 170-173.

16. Hagan M.F., Chandler D., Dynamic Pathways for Viral Capsid Assembly II Biophysical Journal, 2006. 91(1): p. 42-54.

17. Morozov A.Y., Bruinsma R.F., Assembly of viral capsids, buckling, and the Asaro-Grinfeld-Tiller instability II Physical Review E. 81(4): p. 041925.

18. Luo M., Mahy B.W.J., Regenmortel M.H.V., Assembly of Viruses: Nonenveloped Particles, in Encyclopedia of Virology. 2008. Academic Press: Oxford, p. 200-204.

19. Namba K., Stubbs G., Structure of tobacco mosaic virus at 3.6 A resolution: implications for assembly II Science, 1986. 231(4744): p. 1401-1406.

20. Butler P. J., Self-assembly of tobacco mosaic virus: the role of an intermediate aggregate in generating both specificity and speed II Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci, 1999. 354(1383): p. 537-50.

21. Kegel W.K., van der Schoot P., Physical regulation of the self-assembly of tobacco mosaic virus coat protein II Biophys J, 2006. 91(4): p. 1501-12.

22. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U., Ball C.J., Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. 2005, London: Elsevier / Academic Press. P. 1162.

23. Lypez-Moya J.J., GarcHa J.A., Mahy B.W.J., Regenmortel M.H.V., Potyviruses, in Encyclopedia of Virology. 2008. Academic Press: Oxford, p. 313-322.

24. Martelli G.P., Adams M.J., Kreuze J.F., Dolja V.V., Family Flexiviridae: A Case Study in Virion and Genome Plasticity 11 Annual Review of Phytopathology, 2007. 45(1): p. 73100.

25. Atabekov J., Dobrov E., Karpova O., Rodionova N., Potato virus X: structure, disassembly andreconstitution II Molecular Plant Pathology, 2007. 8(5): p. 667-675.

26. Loebenstein G., Berger P.H., Brunt A.A., Lawson R.H., Virus and virus-like diseases of potatoes and production of seed-potatoes. 2001. Springer. P. 488.

27. Kendall A., McDonald M., Bian W., Bowles Т., Baumgarten S.C., Shi J., Stewart P.L., Bullitt E., Gore D., Irving T.C., Havens W.M., Ghabrial S.A., Wall J.S., Stubbs G., Structure offlexible filamentous plant viruses И J Virol, 2008. 82(19): p. 9546-54.

28. Salvador В., Garcia J.A., Simon-Mateo C., Causal agent of sharka disease: Plum pox virus genome andfunction of gene products IIEPPO Bulletin, 2006. 36(2): p. 229-238.

29. Candresse Т., Cambra M., Causal agent of sharka disease: historical perspective and current status of Plum pox virus strains II EPPO Bulletin, 2006. 36(2): p. 239-246.

30. Morgunova E.Y., Dautcr Z., Fry E., Stuart D.I., Stel'mashchuk V.Y., Mikhailov A.M., Wilson K.S., Vainshtein B.K., The atomic structure of Carnation Mottle Virus capsid protein IIFEBS Letters, 1994. 338(3): p. 267-271.

31. Van Regenmortel M.H.V., Mahy B.W.J., Antigenicity and Immunogenicity of Viral Proteins, in Encyclopedia ofVirology. 2008. Academic Press: Oxford, p. 137-142.

32. Мейл Д., Бростофф Д., Рот Д.Б., Ройтг А., Иммунология. 2007. Москва: Логосфера. С. 568.

33. Harris L.J., Skaletsky Е., McPherson A., Crystallographic structure of an intact IgGl monoclonal antibody II Journal of Molecular Biology, 1998. 275(5): p. 861-872.

34. San Paulo A., Garcia R., High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes II Biophys J, 2000. 78(3): p. 1599-605.

35. Павельев А.Б., Курочкин И.Н., Чернов С.Ф., Исследование методом сканирующей туннельной микроскопии Ленгмюровских тенок антител и ферментов, полученных на основе амфифильных полиэлектролитов II Биологические мембраны, 1998:15: р. 342-348.

36. Houde D., Arndt J., Domeier W., Berkowitz S., Engen J.R., Characterization of IgGl Conformation and Conformational Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry II Analytical Chemistry, 2009. 81(7): p. 2644-2651.

37. Roux K., Strelets L., Michaelsen Т., Flexibility of human IgG subclasses II J Immunol, 1997. 159(7): p. 3372-3382.

38. Pellequer J.L., Westhof E., Van Regenmortel M.H.V., John J.L., Predicting location of continuous epitopes in proteins from their primary structures, in Methods in Enzymology. 1991. Academic Press, p. 176-201.

39. Вершигора A.E., Общая иммунология. 1990. Киев: Высшая школа. С. 736.

40. Air G.M., Graeme Laver W., Luo M., Stray S.J., Legrone G., Webster R.G., Antigenic, sequence, and crystal variation in influenza В neuraminidase 11 Virology, 1990. 177(2): p. 578-587.43.