Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Булушова, Наталья Владимировна

• Булушова, Наталья Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Булушова, Наталья Владимировна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Организация Cry-белков

2.1.1. Физико-химические свойства Cry-белков

2.1.2. Сравнение первичной структуры Cry-бел ков

2.1.3. Пространственная организация молекулы Cry-белков

2.1.4. Механизм действия Cry-белков

2.2. Пищеварительные эндопептидазы насекомых

2.2.1. Общая характеристика ферментов

2.2.2. Связь между набором кишечных протеиназ и рН. Компартментализация средней кишки

2.2.3. Множественные формы кишечных протеиназ насекомых

2.2.4. Изменение спектра кишечных протеиназ в ходе развития насекомого

2.2.5. Индуцибельный характер синтеза протеолитических ферментов насекомых

2.2.6. Эволюция кишечных протеиназ

2.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков

2.3.1. Ход ограниченного протеолиза Cry-белков определяется особенностями их пространственной структуры

2.3.2. Особенности действия пищеварительных протеиназ насекомых на 8-эндотоксины ВТ

2.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых

2.4.1. Связывание Cry-белков с мембранами кишечного эпителия чувствительных насекомых

2.4.2. Кадгериноподобный рецептор Сгу-белков

2.4.3. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков

2.4.4. Элементы структуры Сгу-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором

2.4.5. Доказательство участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo<.

2.4:6: Токсинсвязывающие свойства аминопептидазы N

2.4.7. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N.

2.4.8. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Сгу-белков.

2.4.9. Щелочная фосфатаза

2.4.10. ADAM металлопротеиназа

2.4.11. Альфа-амилаза

2.4.12. Так что же является рецептором 8-эндотоксинов ВТ в организме чувствительных насекомых?

2.4.13. Механизм бивалентного взаимодействия токсина с апикальной мембраной клеточного эпителия

2.4.14. Другие кандидаты на роль рецептора Cry-белков

2.4.15. Альтернативные представления о механизме действия токсинов

2.5. Изучение способности токсинов ВТ образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах

2.5.1. Участие а-спиралей домена I в образовании пор

2.5.2. Изучение взаимодействия с мембранами синтетических пептидов, соответствующих а-спиралям N-концевого домена

2.5.3. Мутагенез спирального домена

2.5.4. Свойства пор, образуемых активированными токсинами ВТ в искусственных фосфолипидных мембранах и мембранах чувствительных клеток

Электрическая проводимость пор

Размер пор

Ионная селективность

2.5.5. Олигомсризация Cry-белков и ее связь с порообразованием

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Получение кишечного экстракта гусениц G. mellonella

3.3. Определение общей протеолитической активности

3.4. Определениетриптической активности!

3.5. Определение активности химотрипсина1 . 74'

3.6. Определение активности пролинэндопептидазы

3.7. Определение активности металлопротеиназ

3.8. Изучение влияния рН на протеолитическую активность экстракта средней кишки <7. те11опе11а

3.9. Изучение влияния ингибиторов на протеолитическую активность кишечного экстракта гусениц (т. теПопеПа

3.10. Определение постэлектрофоретической активности методом зимографии

3.11. Электрофорез в денатурирующих условиях

3.12. Выделение трипсина из кишечного экстракта & теПопеПа

3.13. Определение Ы-копцевой аминокислотной последовательности

3.14. Выделение химотрипсина из кишечного экстракта О. теПопеПа.

3.15. Выделение 8-эндотоксинов

3.16. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков

3.17. Вестерн-блотгинг

3.18. Определение концентрации белка

3.19. Биотинилирование белков

3.20. Получение препаратов везикул апикальных мембран (ВВМУ) кишечного эпителия личинок Т.тоШог и гусениц & теПопеПа.

3.21. Определение активности лейцинаминопептидазы

3.22. Определение активности щелочной фосфатазы

3.23. Изучение белкового состава апикальной мембраны клеток кишечного эпителия.

3.24. Синтез аффинных сорбентов СгуЗА^кДа- и Сгу9А65кда-аминогексилагарозы

3.25. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков Т. тоШог

3.26. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков С.те11опе11а.

3.27. Лиганд-блотгинг

3.28. Изучение связывания белков, элюированных с аффинных сорбентов

Cry ЗА^кДа- и Cry 9А б5кда-аминогексилагароза с токсинами ВТ. • различной специфичности

3.29. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции.

3.30. Масс-спектрометрическое исследование

3.31. Регистрация изменений мембранного потенциала и трансмембранного градиента рН на везикулярной мембране

3.32. Определение токсичности СгуЗА и продуктов его протеолиза для насекомых

4. Результаты и обсуждение

4.1. Изучение комплекса протеиназ средней кишки гусениц G. mellonella (состав, свойства, ограниченный протеолиз 5-эндотоксина Сгу9А B.thuringiensis)

4.1.1. Изучение суммарной протеолитической активности экстрактов, полученных из различных отделов средней кишки гусениц

G. mellonella

4.1.2. Анализ ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки G. mellonella с помощью специфических субстратов протеиназ

4.1.3. Ингибиторный анализ протеиназ средней кишки G. mellonella

4.1.4. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса кишечного экстракта G. mellonella методом зимографии

4.1.5. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса кишечного экстракта G. mellonella методом ионообменной хроматографии

4.1.6. Выделение и характеристика фермента с триптической активностью из кишечного экстракта G. mellonella

4.1.7. Получение препарата частично очищенного химотрипсина из экстракта средней KmniaiG. mellonella

4.1.8. Протеолиз белков кристаллов подвида galleriae ВТ кишечным экстрактом гусениц G. mellonella и некоторыми присутствующими в нем ферментами.

Список сокращений

ALP щелочная фосфотаза

AM передний отдел средней кишки

AME экстракт переднего отдела средней кишки

APN нейтральная аминопептидаза

ВВМ мембрана щеточной каемки

BBMV везикулы мембраны щеточной каемки

BSA бычий сывороточный альбумин

ВТ Bacillus thuringiensis

ВТР бис-Tris-nponaH; 1,3-бме-Гп5-(гидроксиметил)метиламинопропан

BzRpNA бензоил-аргинин-ияря-нитроанилид

CR кадгериноподобные повторы

СгуЗАдсвда 49кДа фрагмент токсина СгуЗА

DnpAALR-NH2 амид 2,4-динитрофенил-аланил-аланил-лейцил-аргинина

DTT дитиотреитол

DS-Na, SDS додецилсульфат натрия dsRNA двухцепочечная РНК

Е - 64 транс-эпоксисукцинил-Ь-лейциламидо-(4-гуанидино)бутан

ЕС эктодомен

FCCP карбонилцианид-и-трифторметоксифенилгидразон

ForAAFpNA формил-аланил-аланил-фенилаланин-иора-нитроанилид

FPLC высоко эффективная жидкостная хроматография

GlpAALpNA пироглутамил-аланил-аланил-лейцин-лсря-нитроанилид

HEPES тУ-2-гидроксиэтилпиперазин-//-2-этансульфоновая кислота

MES 2-[//-морфолино]этансульфоновая кислота

ММ средний отдел средней кишки

MPED ассоциированный с мембранной внутриклеточный домен

Mr молекулярная масса р! изоэлектрическая точка

PBS фосфатная буферная система

РМ задний отдел средней кишки

PME экстракт заднего отдела средней кишки

PC фосфатидилхолин

SBTI соевый ингибитор трипсина

SKTI, STI соевый ингибитор трипсина Куница

SucAAPFpNA сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланин-«£7/?а-нитроанилид

TBR токсин связывающий район

ТМ трансмембранный пептид

TLCK тозил-Ь-лизин-хлорметилкетон

ТРСК тозил-Ь-фенилаланин-хлорметилкетон

ТРРС1 хлорид тетрафенилфосфония

Z-AAPpNA бензилоксикарбонил-аланил-аланил-пролин-иора-нитроанилид

АТФ аденозинтрифосфат

БСА бычий сывороточный альбумин кДНК комплементарная ДНК

ДМФА диметилформамид

ДФФ диизопропилфторфосфат дтт дитиотреитол

ЛВ50 летальное время

ОФ о/?гао-фенантролин

ПААГ полиакриламидный гель

РСА рентгено-структурный анализ

РНК рибонуклииновая кислота

ТФУ трифторуксусная кислота

ТХУ трихлоруксуная кислота

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид

ЭГТА соль этиленгликольтетрауксусной кислоты

ЭДТА соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

В работе использованы стандартные однобуквенные и трехбуквенные обозночения аминокислот.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A»

Актуальность проблемы;

Насекомые - вредители» запасов? - распространены; повсеместно и наносят большой вред; зерну и зернопродуктам. По данным Организации по продовольствию шсельскому хозяйству (ФЛО) ООН, они-ежегодно уничтожают не менее 5-10% мировых запасов зерновых культур. Вредители снижают всхожесть семян, загрязняют зерно и зернопродукты, уменьшают их массу (вес); ухудшают пищевые и хлебопекарные качества;, являются? переносчиками различных инфекций: Поврежденное зерно* намного быстрее поражается, плесневыми грибами; которые, прорастая; портят его, выделяя приэтом вредные и канцерогенные вещества; Из насекомых-вредителей на территории нашей страны наиболее опасны: мучной и обыкновенный волосатый клещи, амбарный и рисовый долгоносик, большой; и малый мучные хрущаки, мельничная и мучная* огнёвки.

Bs свою- очередь,, гусеницы большой; вощинной- моли Galleria mellonella наносят ощутимый вред пчеловодству. Так, потери: воска; связанные с. размножением огнёвки, достигают^, по меньшей мере, 20 % от его производства, а пораженность пчелиных семей составляет 10-28 % от их общего числа.

Применение химических методов борьбы с насекомыми-вредителями в большинстве случаев не возможно,, так как делает продукцию не пригодной к употреблению. Значительно более перспективными являются биоинсектициды, и, прежде всего,- препараты; полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных, подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (5-эндотоксинов, Сгу-белков), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. Создание высокоэффективных биоинсектицидов этого класса; для конкретных насекомых-вредителей, а также разработка путей предохранения от возникновения у них резистентности к препарату требует знания процессов; происходящих при попадании 8-эндотоксинов в организм насекомого-мишени. Вследствие этого, изучение различных стадий патологического эффекта (активации 8-эндотоксинов под действием кишечных протеиназ, связывания со специфическими рецепторами-в мембранах кишечного эпителия, образования трансмембранных пор) является весьмаактуальным.

Цели и задачи исследования.

Целыо работы было изучение взаимодействия энтомоцидных белков СгуЗА (В. thuringiensis ssp. tenebrionis). и Gry9A (В. thuringiensis ssp. galleriae)¡ с пищеварительной системой чувствительных к hhm¡ насекомых, личинок большого мучного хрущака Tenebrio molitor и гусениц пчелиной огнёвки Gallería mellonella, соответственно.

Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучить первичные характеристики пищеварительной системы гусениц Gallería mellonella и ее участие в активации токсина Сгу9А;

- выделить, специфические рецепторы, ответственные за« связывание токсинов СгуЗА и Сгу9А с кишечным эпителием личинок Tenebrio molitor и. гусениц Gallería mellonella, соответственно;

- изучить действие токсина СгуЗА на. ионную проницаемость апикальных мембран кишечного эпителия личинок мучного хрущака.

Научная новизна.

В работе впервые:

- изучен комплекс пищеварительных протеолитических ферментов гусениц Gallería mellonella, получен препарат электрофоретически чистого трипсина из этого насекомого; доказана способность кишечных протеиназ G. mellonella эффективно активировать белок Сгу9А, токсичный против этого насекомого;

- методом аффинной хроматографии из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Tenebrio molitor выделены белки 66 и 58 кДа, специфически связывающие 6-эндотоксин СгуЗА, а из аналогичных мембранных препаратов гусениц Gallería mellonella - 67 кДа белок, специфически связывающий активированный токсин Сгу9А; произведена предварительная идентификация указанных белков;

- показано наличие в препарате BBMV Tenebrio molitor собственных ионных каналов и частично изучены их свойства; установлено, что под действием

Cry-белков в BBMV личинок Т. molitor открываются дополнительные поры или каналы, обладающие значительно большей проницаемостью для катионов щелочных и щелочноземельных металлов, чем для соответствующих анионов.

Практическая ценность работы.

Полученные данные о взаимодействии энтомоцидных токсинов СгуЗА и Сгу9А с элементами пищеварительной системы личинок Tenebrio molitor и гусениц Gallería mellonella создает базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного эффекта этих белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов нового поколения с существенно повышенной эффективностью против насекомых - вредителей запасов и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Булушова, Наталья Владимировна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые охарактеризован комплекс протеолитических ферментов средней кишки гусениц Gallería mellonella, осуществляющий высокоэффективный ограниченный протеолиз токсичного для этого насекомого белка Сгу9А. Показано, что преобладающими протеиназами кишечного экстракта являются сериновые протеиназы. Выявлено наличие 5 форм трипсина и 2 форм химотрипсина.

2. Выделена и частично охарактеризована одна из форм трипсина. Показано, что в протеолизе 8-эндотоксина Сгу9А принимают участие как трипсин, так и химотрипсин.

3. С помощью аффинной хроматографии из BBMV Gallería mellonella выделен белок, специфически связывающий токсин Сгу9А, относящийся к классу аминопептидаз. Аналогичным образом из BBMV Tenebrio molitor выделены СгуЗА-связывающие белки - а-амилаза и А-субъединица вакуолярной АТФ-азы.

4. Показано, что апикальные мембраны эпителиальных клеток личинки мучного хрущака имеют собственные ионные каналы, проницаемые для ионов К+, Mg и Са2+, но не проницаемые для крупных анионов. 6-Эндотоксин СгуЗА увеличивает проницаемость данных мембран за счет образования новых (или активации собственных) ионных каналов.

BBMV I

Рисунок 35. Гиперполяризация BBMV (а) и стимуляция кислотного сдвига рН внутри везикул (б) в бессолевой буферной среде (рН 8,6), запускаемые добавлением к

2+ везикулярной суспензии 5-эндотоксина СгуЗА. BBMV, нагруженные Mg , суспендировали в буферной среде (рН 8,6), содержащей сафранин О (а) или акридиновый оранжевый (б). К суспензии добавлено (указано стрелкой) 40 нМ СгуЗА, 20 мМ MgS04 и 2 мкМ FCCP.

Согласно полученным результатам через поры или каналы, образуемые токсином СгуЗА, способны проходить ионы калия, магния и кальция. Подобная особенность ионных каналов, индуцируемых Сгу-белками, выявлена и в везикулах апикальных мембран кишечника чешуекрылых, для которых продемонстрирована их проницаемость для ионов щелочных и щелочноземельных металлов [Uemura et al, 1992]. Кроме того, образование каналов, проницаемых для ионов кальция, характерно также для токсического эффекта Cry 1С и Cry 1 Ас на культуры клеток насекомых Sf9 и СП, соответственно [Monette et al, 1997, Potvin et al, 1998]. Нами не обнаружено какого-либо действия СгуЗА на поляризацию везикулярной мембраны в присутствии в инкубационной среде хлорида калия. Это обстоятельство может объясняться тем, что по селективности по отношению к К+

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Булушова, Наталья Владимировна, 2010 год

1. Akerman K.E.O. and' Wikstrom, K.F. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Letters, 68, 191-197.

2. Apell, H.-J. and Bersch, B. (1987) Oxonol VI as an optical indicator for membrane potentials in lipid vesicles. Biochim: Biophys. Acta, 903(3), 480-94.

3. Alcantara, E.P., Alzate, O., Lee, M.K., Gurtiss, A., and Dean, D.H. (2001) Role of a-helix seven of Bacillus thuringiensis CrylAb 5-endotoxin in membrane insertion, structural stability and ion channel activity. Biochemistry, 40,2540-2547. —-—~~"

4. Alzate, O., You, T., Claybon, M., Osorio, C., Curtiss, A. and Dean, D.H. (2006) Effects of Disulfide Bridges in Domain I of Bacillus thuringiensis CrylAa delta-Endotoxin on Ton-Channel Formation in Biological Membranes. Biochemistry, 45(45),

5. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, DJ. (1991) Cytotoxicity of a cloned Bacillus thuringiensis subsp. israelensis CrylVB toxin to an Aedes aegypti cell line. FEMS Microb. Lett., 83,273-276.

6. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, DJ. (1992) Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo. FEMS Microb. Lett., 94, 63-68.

7. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1993) Effects on toxicity of eliminating a cleavage site in a predicted interhelical loop in Bacillus thuringiensis CrylVB 8-endotoxin. FEMS Microb. Lett., Ill, 255-262.

8. Angus, T.A. (1954) A bacterial toxin paralysing silkworm larvae. Nature, 173,

9. Arenas, I., Bravo, A., Soberon, M., and Gomez, I. (2010) Role of alkaline phosphatase from Manduca sexta in the mechanism of action of Bacillus thuringiensis CrylAb toxin. J. Biol. Chem., 285(17): 12497-12503.13597-605.545.546.

10. Aronson, A.I., Wu,- D:, and Zhang, C. (1995) Mutagenesis of specificity and" toxicity regions of- Bacillus thuringiensis protoxin gene. J. Bacteriol., 177, 4059-4065.

11. Aronson, A.I., Geng, C., and Wu, L. (1999) Aggregation of Bacillus thuringiensis CrylA'toxins upon binding to target insect larval midgut vesicles. Appl. Invironment. Microb., 65, 2503-2507.

12. Aronson, A.I. and Shai, Y. (2001) Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiol. Lett., 195, 18.

13. Azuma, M., Harvey, W.R., and Wieczorek, H. (1995) Stoichiometry of K+/H+ antiport helps to explain extracellular pH 11 in a model'epithelium. FEBS Letters, 361, 153-156.

14. Bah, A., Frankenhuyzen, K. van, Brousseau, R., and Masson, L. (2004) The Bacillus thuringiensis CrylA toxin: effects of trypsin and chymotrypsin site mutations on toxicity and stability. J. Invertebrate Pathol., 85, 120-127.

15. Barbehenn, R.V. (2003) Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species. J. Chem. Ecol., 29, 683-702.

16. Barrows, B.D., Griffitts, J.S., and Aroian; R.V. (2007) Resistance is non-futile: resistance to Cry5B in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Invertebr. Pathol., 95(3), 198-200.

17. Belfiore, C.J., Vadlamudi, R.K., Osman, Y.A., and Bulla, L.A., Jr. (1994) A specific binding protein from Tenebrio molitor for the insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Biochem Biophys Res Commun., 200(1), 359-364.

18. Blankemeyer, J.T. Demonstration of a pump-mediated efflux in the epithelial potassium active transport system of insect midgut (1978) Biophys. J., 23,313-318.

19. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method'for the quantitation* of microgram* quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. AnalytBiochem., 72, 248-254.

20. Broehan, G., Kemper, M., Driemeier, D:, Vogelpohl, I., and Merzendorfer, H. (2008) Cloning and expression analysis of midgut chymotrypsin-like proteinases in the tobacco hornworm. J. Insect. Physiol., 54(8), 1243-1252.

21. Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. (2005) Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications. J. Mol. Biol., 348, 363-382.

22. Candas, M., Francis,. B.R., Griko, N.B., Midboe, E.G., and Bulla, L.A. (2002) Proteolytic cleavage of the developmentally important cadherin BT-Rj in the midgut epithelium of Manduca sexta. Biochermistry, 41:13717-13724.

23. Candas, M., Loseva, O., Oppert, B., Kosaraju, P., and Bulla, L.A. Jr. (2003) Insect resistance to Bacillus thuringiensis. Alterations in the indianmeal moth larval gut proteome. Mol. Cell Proteomics, 2(1), 19-28.I