Взаимодействие амфифильных полимеров с природными и модельными липидными мембранами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Дёмина, Татьяна Васильевна

• Дёмина, Татьяна Васильевна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Дёмина, Татьяна Васильевна

Содержание.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Основные физико-химические свойства плюроников.

2.2. Искусственные липидные бислои и взаимодействие плюроников с ними.

2.3. Влияние синтетических соединений на флип-флоп липидов.

2.4. Влияние полимеров на проницаемость мембран.

2.5. Применение плюроников в медицине.

2.6. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток и способы ее преодоления.

2.6.1. Основные механизмы множественной лекарственной устойчивости.

2.6.2. Строение и механизм действия Р-гликопротеина.

2.6.3. Использование плюроников для подавления МЛУ.

2.7. Синтез и физико-химические свойства полиглицеринов.

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Определение концентрации полимеров.

4.2. Определение коэффициента распределения полимеров в системе н-гексан - вода.

4.3. Кинетика проникновения доксорубицина в липосомы с градиентом рН.

4.4. Измерение скорости флип-флопа липидов в липосомальных мембранах.

4.5 Культивирование клеток.

4.6. Определение белка.

4.7. Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг.

4.8. Определение цитотоксичности доксорубицина и полимеров.

4.9. Влияние полимеров на цитотоксичность доксорубицина.

4.10. Исследование клеток методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ).

4.11. Изучение выброса доксорубицина из клеток К562ЯЮХ методом спектрофлуорометрии.

4.12. Связывание 3Н-меченых полимеров с клетками К562/ООХ.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Взаимодействие синтетических полимеров с модельными липидными мембранами.

5.1.1. Влияние синтетических блок-сополимеров на скорость трансбислойной миграции липидов (флип-флоп).

5.1.2. Влияние синтетических блок-сополимеров на проницаемость модельной липидной мембраны.

5.2. Взаимодействие синтетических полимеров с клетками.

5.2.1. Характеристика клеток.

5.2.2. Цитотоксичность полимеров.

5.2.3. Влияние полимеров на токсичность доксорубицина.

5.2.4. Влияние полимеров на внутриклеточное накопление доксорубицина.

5.2.5. Влияние полимеров на выброс доксорубицина из клеток.

Выводы.

Список сокращений.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие амфифильных полимеров с природными и модельными липидными мембранами»

Синтетические амфифильные блок-сополимеры в последние годы находят все более широкое применение в медицине и фармакологии. К числу таких соединений относятся и блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, называемые также плюрониками. Обладая низкой токсичностью по сравнению с другими ПАВ, плюроники входят в состав композиций искусственных заменителей крови, выполняя роль стабилизаторов перфторуглеродных эмульсий [1], применяются в технологиях низкотемпературного консервирования органов и тканей [2], в иммунотерапии в качестве адъювантов [3, 4].

Исследования последних лет показали, что плюроники могут быть полезны для решения актуальной проблемы современной онкологии - преодоления устойчивости раковых клеток к широкому кругу лекарственных препаратов. Это явление, получившее название множественной лекарственной устойчивости, возникает в процессе химиотерапии и представляет собой серьезное препятствие для успешного лечения онкологических больных. Оказалось, что плюроники способны восстанавливать чувствительность таких клеток, устойчивых к противоопухолевым антибиотикам, а иногда даже делают их более чувствительными по сравнению с исходными опухолевыми клетками. Лекарственная форма SP1049C, содержащая плюроники и антибиотик доксорубицин, в настоящее время проходит клинические испытания за рубежом [5].

Молекулярный механизм действия плюроников на опухолевые клетки до сих пор непонятен, хотя в последнее время и в этом направлении достигнуты существенные успехи. Было установлено, что плюроники ингибируют выброс лекарств, осуществляемый белками-транспортерами Р-гликопротеином (P-gp) и MRP (Multidrug Resistance Protein) [6-8], вызывают уменьшение внутриклеточной концентрации АТФ [9, 10] и освобождение антибиотиков из внутриклеточных везикул [11, 12]. Взаимодействуют ли плюроники непосредственно с белками-транспортерами или действие полимеров обусловлено влиянием на структуру клеточных мембран, пока неясно. Показано, что встраивание плюроников в искусственные липидные мембраны вызывает увеличение подвижности липидов и повышение проницаемости бислоя по отношению к лекарству [13]. Причем, активны не мицеллы, а единичные молекулы блок-сополимера, и эффективность их действия зависит от гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) макромолекулы [14]. В то же время до сих пор остается неизвестным, какие именно особенности структуры плюроников и входящих в него мономеров определяют их биологическую активность. Поняв молекулярные причины воздействия плюроников на структуру мембраны, можно целенаправленно конструировать полимеры, способные воздействовать на определенные процессы в биологических мембранах.

Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия амфифильных блок-сополимеров, различающихся по структуре их гидрофобного и гидрофильного блоков, с модельными липидными мембранами и живыми клетками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. Цель работы состояла в выявлении структурных параметров сополимеров, обусловливающих их способность возмущать структуру мембран и снижать устойчивость опухолевых клеток к действию лекарств.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Дёмина, Татьяна Васильевна

выводы

1. Впервые установлено, что способность амфифильных блок-сополимеров ускорять флип-флоп липидов в искусственном липидном бислое и увеличивать его проницаемость для доксорубицина зависит от их гидрофобности и объема гидрофобного блока.

2. Показано, что при близких значениях гидрофобности и объема гидрофобного блока эффект сополимера зависит от структуры гидрофильного блока: новые блок-сополимеры, содержавшие разветвленный блок полиглицерина были эффективнее по сравнению с аналогичными по строению плюрониками с линейным блоком полиэтиленоксида.

3. Впервые обнаружено, что блок-сополимеры на основе пропиленоксида и глицерина увеличивают токсичность противоопухолевого антибиотика доксорубицина для клеток, устойчивых к действию лекарства, причем блок-сополимер, содержащий 2 остатка глицерина (Р02) действует сильнее, чем плюроник Ь61, который входит в состав противоопухолевого препарата, прошедшего к настоящему времени 2 фазы клинических испытаний.

4. Установлено, что увеличение токсичности доксорубицина для устойчивых опухолевых клеток в присутствии Рв2 обусловлено ингибированием выброса лекарства из клеток и внутриклеточным перераспределением доксорубицина из цитоплазмы в ядро, где он достигает мишень своего действия - ядерную ДНК.

5. Впервые показано, что взаимосвязь между структурой блок-сополимеров и их способностью снижать устойчивость опухолевых клеток к лекарствам качественно описывается теми же закономерностями, что и воздействие сополимеров на искусственный липидный бислой. Это указывает на важность взаимодействия полимера с мембраной в механизме его действия на клетки, а также свидетельствует о правомерности использования липосом для отбора полимеров с потенциальной биологической активностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Дёмина, Татьяна Васильевна, 2007 год

1. Bentley PK, Davis SS, Johnson OL, Lowe KC, Washington C. Purification of pluronic F-68 for perfluorochemical emulsification. J Pharm Pharmacol 1989; 41 (9):661-663.

2. Segel LD, Minten JM, Schweighardt FK. Fluorochemical emulsion APE-LM substantially improves cardiac preservation. Am J Physiol 1992; 263(3 Pt 2):H730-H739.

3. Allison AC, Byars NE. Immunological adjuvants: desirable properties and side-effects. Mol Immunol 1991; 28(3):279-284.

4. Hunter RL, Bennett B. The adjuvant activity of nonionic block polymer surfactants. II. Antibody formation and inflammation related to the structure of triblock and octablock copolymers. J Immunol 1984; 133(6):3167-3175.

5. Danson S, Ferry D, Alakhov V, Margison J, Kerr D, Jowle D et al. Phase I dose escalation and pharmacokinetic study of pluronic polymer-bound doxorubicin (SP1049C) in patients with advanced cancer. Br J Cancer 2004; 90(11):2085-2091.

6. Kabanov AV, Batrakova EV, Alakhov VY. Pluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer. Adv Drug Deliv Rev 2002; 54(5):759-779.

7. Miller DW, Batrakova EV, Kabanov AV. Inhibition of multidrug resistance-associated protein (MRP) functional activity with pluronic block copolymers. Pharm Res 1999; 16(3):396-401.

8. Kabanov AV, Batrakova EV, Miller DW. Pluronic block copolymers as modulators of drug efflux transporter activity in the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev 2003; 55(1):151-164.

9. Batrakova EV, Li S, Elmquist WF, Miller DW, Alakhov VY, Kabanov AV. Mechanism of sensitization of MDR cancer cells by Pluronic block copolymers: Selective energy depletion. Br J Cancer 2001; 85(12): 1987-1997.

10. Batrakova EV, Li S, Li Y, Alakhov VY, Kabanov AV. Effect of pluronic P85 on ATPase activity of drug efflux transporters. Pharm Res 2004; 21(12):2226-2233.

11. Venne A, Li S, Mandeville R, Kabanov A, Alakhov V. Hypersensitizing effect of pluronic L61 on cytotoxic activity, transport, and subcellular distribution of doxorubicin in multiple drug-resistant cells. Cancer Res 1996; 56( 16):3626-3629.

12. Rapoport N, Marin A, Luo Y, Prestwich GD, Muniruzzaman MD. Intracellular uptake and trafficking of Pluronic micelles in drug-sensitive and MDR cells: effect on the intracellular drug localization. J Pharm Sci 2002; 91(1): 157-170.13.