Выявление дифференциальных молекулярных маркеров раковых стволовых клеток колоректальной аденокарциномы человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Гисина, Алиса Михайловна

• Гисина, Алиса Михайловна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Гисина, Алиса Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цель и задачи исследования

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. 1 Концепция раковых стволовых клеток (РСК)

1.1.1 Современные представления о возникновении и прогрессии опухолей: теория клональной эволюции и теория раковой стволовой клетки

1.1.2 Основные отличия РСК от дифференцированных раковых клеток

1.1.2.1 Особенности роста in vivo и in vitro

1.1.2.2 Экспрессия специфических поверхностных и внутриклеточных маркеров

1.1.2.3 Эксклюзия флуоресцентных красителей

1.2 РСК при колоректальном раке человека

1.2.1 Колоректальный рак: классификация, этиология, патогенез

1.2.2 Доказательства существования РСК при колоректальном раке человека

1.2.3 Молекулярные отличия РСК и дифференцированных раковых клеток при колоректальном раке человека

1.3 Новые подходы прогнозирования течения и терапии онкологических заболеваний на основе результатов исследования РСК

1.3.1 Корреляция численности РСК и клинического исхода заболевания

1.3.2 Сигнальные пути, характерные для РСК

1.3.3 Сигнальные пути РСК в качестве мишеней для терапии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Опухолевый материал

2.1.1. Получение опухолевого материала

2.1.2. Приготовление суспензии опухолевых клеток

2.1.3. Определение жизнеспособности клеточной культуры при помощи МТТ-теста

2.2. Клеточные линии

2.2.1. Культивирование клеточных линий

2.2.2. Анализ контаминации клеток микоплазмой

2.3 Проточная цитометрия: подготовка проб и проведение анализа

2.3.1. Подготовка проб к анализу поверхностных маркеров клеток

2.3.2. Анализ поверхностных маркеров клеток

2.3.3. Окрашивание клеток витальным красителем DyeCycle Violet (DCV)

2.3.4. Окрашивание клеток витальным красителем Rhodamine 123 (Rh 123)

2.3.5. Цитометрический анализ эксклюзии витального красителя DCV

2.3.6. Цитометрический анализ эксклюзии витального красителя Rh 123

2.4 Клеточная сортировка

2.4.1. Подготовка проб для клеточной сортировки

2.4.2. Проведение клеточной сортировки

2.5 Протеомный анализ

2.5.1 Экстракция белка из образцов клеток

2.5.2 Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров

2.5.3 Хроматографическое разделение пептидов

2.5.4 Масс-спектрометрическая регистрация пептидов c помощью высокоразрешающего прибора Orbitrap Velos

2.5.5 Идентификация масс-спектрометрических данных в программном обеспечении Mascot

2.5.6 Относительный количественный анализ в программном обеспечении Progenesis LC/MS

2.5.7 Анализ данных сравнительного протеомного анализа

2.6 Статистический анализ данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Анализ гетерогенности клеточного состава опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой

3.2 Исследование экспрессии маркера СD133, ассоциированного с раковыми стволовыми клетками, в образцах опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой

3.3 Выявление раковых стволовых клеток на основе анализа эксклюзии витальных красителей - метод «боковой популяции»

3.4 Анализ экспрессии CD133 на клетках «боковой популяции»

3.5 Сравнительный анализ экспрессии поверхностных молекул на РСК колоректальной аденокарциномы и на дифференцированных раковых клетках

3.6 Сравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии СЭ133 из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой

3.7 Сравнительный протеомный анализ субпопуляций раковых клеток с высоким и низким уровнем экспрессии СЭ133 в клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

119

4.1 Численность CD133-позитивных РСК варьирует в образцах колоректальной

аденокарциномы, полученных от пациентов

4.2 Процент CD133-позитивных клеток в «боковой популяции» не повышен относительно общей популяции раковых клеток

4.3 РСК из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной

аденокарциномой характеризуются повышенным уровнем экспрессии белков, связанных с возникновением и прогрессированием злокачественных опухолей. 123 4.4 Профили белков РСК клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 и опухолевых образцов от пациентов с колоректальной

аденокарциномой имеют существенные отличия

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление дифференциальных молекулярных маркеров раковых стволовых клеток колоректальной аденокарциномы человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

По данным Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания остаются одной из основных причин смертности в мире - ежегодно происходит порядка 8 миллионов случаев смерти от рака. Это указывает на недостаточную эффективность современных стратегий терапии злокачественных заболеваний. Важным фактором, до сих пор не учитываемым при разработке противоопухолевых препаратов, является опухолевая гетерогенность, заключающаяся в существовании фенотипических и функциональных отличий между различными субпопуляциями раковых клеток одной и той же опухоли [1]. Одна из концепций, объясняющих природу опухолевой гетерогенности, концепция раковой стволовой клетки (РСК), предполагает существование особой субпопуляции клеток, ответственной за возникновение и прогрессию опухоли, а также воспроизводящей все остальные популяции более дифференцированных опухолевых клеток [2]. Непрекращающийся рост числа работ, связанных с исследованием свойств РСК, и накопление доказательств существования данной субпопуляции клеток при различных злокачественных заболеваниях свидетельствует об актуальности данной темы для понимания биологии рака, а также для разработки новых методов противоопухолевой терапии. К настоящему времени уже известны некоторые маркеры, которые могут быть использованы для выявления РСК в опухолевой ткани [3]. Однако остается актуальным поиск дополнительных дифференциальных маркеров РСК, которые будут способствовать более надежной идентификации этой субпопуляции и смогут служить в качестве мишени при разработке новых способов терапии опухолей.

Объектом данного исследования является колоректальная аденокарцинома, одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний как в России, так и в мире. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России в 2012 году рак толстой кишки занял 3 -е место как у мужчин, так и у женщин, а в структуре смертности - 3-е место у мужчин и 2-е место у

женщин [4]. Выбор данной нозологии в качестве объекта исследования также был обусловлен существующими доказательствами наличия РСК при данном типе опухолей [5].

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является выявление дифференциальных молекулярных маркеров РСК колоректальной аденокарциномы человека. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить гетерогенность суспензии клеток опухолевой ткани от пациентов с колоректальной аденокарциномой по экспрессии поверхностных маркеров, характерных для раковых клеток, клеток гемопоэтического ряда и фибробластов опухолевой стромы.

2. На основании анализа литературных данных определить поверхностный молекулярный маркер, наиболее эффективно используемый для выявления РСК, и оценить его экспрессию в образцах опухолевой ткани пациентов с колоректальной аденокарциномой.

3. Проанализировать эксклюзию витальных красителей клетками колоректальной аденокарциномы человека (метод «боковой популяции»).

4. Оценить экспрессию специфического поверхностного молекулярного маркера РСК колоректальной аденокарциномы на клетках «боковой популяции».

5. Сравнить профили экспрессии поверхностных молекул на РСК колоректальной аденокарциномы и на дифференцированных раковых клетках.

6. На основании данных об экспрессии поверхностных маркеров, характерных для РСК, изолировать популяции РСК и дифференцированных раковых клеток из опухолевых образцов от пациентов с колоректальной аденокарциномой и произвести их сравнительный протеомный анализ.

7. Произвести сравнительный протеомный анализ РСК и дифференцированных раковых клеток в клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2 и сопоставить полученные данные с

результатами протеомного анализа клеток из опухолевых образцов от пациентов.

Научная новизна работы

Впервые было произведено сравнительное протеомное профилирование РСК и дифференцированных раковых клеток, изолированных непосредственно из образцов колоректальной аденокарциномы человека по признаку наличия или отсутствия экспрессии CD133. В результате было выявлено более 100 белков, экспрессия которых различалась более чем в 2 раза между популяцией РСК и популяцией дифференцированных клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы

В результате данной работы было выявлено повышение экспрессии в РСК колоректальной аденокарциномы человека ряда белков, характерных для злокачественных новообразований кишечника и задействованных в метастазировании, среди которых CD29, CD90, CD117, S100A8, TSPAN8, CEACAM5. Данные белки локализованы на поверхностной мембране клеток и могут быть использованы в качестве мишеней для разработки противоопухолевых препаратов, направленных против РСК.

Также в результате данного исследования были найдены существенные отличия профиля экспрессии РСК, выделенных из образцов от пациентов и выделенных из стабильной клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека Сасо-2. Эти данные указывают на необходимость применения первичного опухолевого материала от пациентов при исследовании молекулярных характеристик РСК.

Методология и методы исследования

В основу методологического подхода, используемого в данной работе, легли методы экспериментальных исследований, обычно применяемые для решения подобных задач. Были использованы методы культуральной работы,

включая методы ферментативной дезагрегации клеток из первичного опухолевого материала, культивирование стабильных клеточных линий, биохимические и цитометрические методы оценки жизнеспособности клеток. Анализ поверхностного фенотипа и сортировку клеток производили с применением проточной цитометрии. Сравнительное протеомное профилирование субпопуляций клеток, полученных с помощью цитометрической сортировки в потоке, производили с применением масс-спектрометрии высокого разрешения с дальнейшим количественным анализом данных без использования изотопных меток. Статистический анализ данных был произведен с применением программы IBM SPSS Statistics 20.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. РСК колоректальной аденокарциномы человека могут быть выявлены с применением маркера эпителиальных клеток ЕрСАМ и маркера стволовых клеток CD133. Численность РСК в образцах от пациентов с колоректальной аденокарциномой варьирует в широком диапазоне и составляет от 0% до 75%.

2. Экспрессия маркера CD133 клетками колоректальной аденокарциномы человека и их способность к эксклюзии витальных красителей не связаны между собой.

3. CD133-позитивные РСК колоректальной аденокарциномы экспрессируют на более высоком уровне по сравнению с дифференцированными раковыми клетками поверхностные маркеры CD29, CD90, CD117, а также ряд белков, вовлеченных в инвазию и метастазирование опухолей, среди которых, S100A8, TSPAN8, CEACAM5.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов была обеспечена применением в работе самых современных инструментальных методов исследования, включая проточную цитометрию и масс-спектрометрию высокого разрешения.

Результаты диссертационного исследования были представлены в виде устного доклада на конференции молодых ученых ФНКЦ ФХМ (Москва, 2014) и на конференции молодых ученых ФГБНУ ИБМХ (Москва, 2015), а также в виде постерного доклада на VII международном московском конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013) и на конференции EMBO «Stem Cells in Cancer and Regenerative Medicine» (Гейдельберг, 2014).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.1 Концепция раковых стволовых клеток (РСК)

1.1.1 Современные представления о возникновении и прогрессии опухолей: теория клональной эволюции и теория раковой стволовой клетки.

В настоящее время не вызывает сомнений, что опухоль состоит из различных субпопуляций клеток, которые имеют различные пролиферативные и дифференцировочные свойства, фенотип, способность к метастазированию, чувствительность к терапевтическим препаратам [1,6]. Клеточные механизмы, лежащие в основе этой опухолевой гетерогенности, являются в настоящее время объектом интенсивных исследований в области биологии рака. На данный момент предложены две теории для обоснования гетерогенности и внутренних различий опухолей: теория клональной эволюции и теория раковой стволовой клетки (РСК)

[7].

Наиболее распространенная и устоявшаяся теория клональной эволюции постулирует, что возникновение опухоли происходит, когда множественные мутации происходят в случайной единичной клетке, придавая ей селективную способность к росту по сравнению с близлежащими нормальными клетками. Согласно данной теории, раковые клетки в опухоли с течением времени претерпевают различные мутации, а последовательный естественный отбор наиболее приспособленных и агрессивных клонов приводит к прогрессированию опухоли. По мере того, как опухоль прогрессирует, генетическая нестабильность и неконтролируемая пролиферация обеспечивают образование новых клонов клеток с дополнительными мутациями и, следовательно, новыми характеристиками, что и приводит к гетерогенности опухоли. В течение этого процесса любая раковая клетка может потенциально стать инвазивной и вызвать метастазирование или стать устойчивой к терапии и вызвать рецидивирование онкологического заболевания [8].

Однако к настоящему моменту уже накопилось значительное количество доказательств того, что способностью формировать опухоль обладает лишь небольшая субпопуляция раковых клеток. Так, в 1971 году Park C.H. и его коллеги обратили внимание, что в культуре миеломных клеток наблюдаются значительные различия в способности к пролиферации. А именно, когда клетки миеломы мыши, полученные из асцитной жидкости мышей, отделяли от нормальных гемопоэтических клеток и тестировали in vitro на способность к образованию колоний, только одна из 100-10000 раковых клеток была способна формировать колонии. Такие клетки назвали «опухолевые стволовые клетки» [9]. Этот результат согласовался с данными другого более раннего эксперимента, в котором при трансплантации лимфомных клеток мыши in vivo, только 1-4% клеток могли формировать колонии в селезенке [10]. В конце 1970-х годов Salmon S.E. и Hamburger A.W. при исследовании опухолевых клеток человека, выделенных из костного мозга и асцитной жидкости пациентов с различными гематологическими и солидными злокачественными заболеваниями, показали, что только маленькая часть клеток является клоногенной в культуре in vitro. Они показали, что лишь одна из 1000-100000 клеток множественной миеломы, неходжкинской лимфомы и хронической лимфоцитарной лейкемии, и одна из 500-5000 клеток рака легких, рака яичников, меланомы и нейробластомы формировали колонии в мягком агаре [11].

Из этих экспериментов можно было сделать два различных вывода: либо большинство опухолевых клеток не обладало колониеобразующей способностью, и только небольшая субпопуляция являлась клоногенной, либо все опухолевые клетки обладали потенциалом к колониеобразованию, но только часть клеток получала преимущество в связи с более подходящими для них условиями эксперимента. Лишь в 90-е годы в связи с разработкой метода исследования способности раковых клеток к клонообразованию in vivo, а также развитием и широким распространением метода проточной цитометрии и сортировки клеток стало возможным разделить различные субпопуляции опухолевых клеток и

показать, что одна субпопуляция обладает сильным клоногенным потенциалом, а все другие клетки лишены клоногенности. В 1994 году группой ученых под руководством Dick J.E. при исследовании острого миелолейкоза было показано, что субпопуляция клеток, которая могла вызывать лейкемию при трансплантации в иммунодефицитных мышей линии SCID, составляла 0,01 -1% от общей популяции клеток, и имела фенотип CD34+CD38-, идентичный фенотипу гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Эти клетки были единственными клетками, способными переносить острый миелолейкоз от пациентов к мышам линии SCID в подавляющем большинстве случаев. Это исключало возможность того, что все клетки острого миелолейкоза обладали низкой исходной клоногенной способностью, и показало, что лишь маленькая субпопуляция клеток обладает способностью пролиферировать и переносить заболевание [12]. Последующие исследования, основанные на серийных трансплантациях в иммунодефицитных мышей клеток лейкемии от пациентов с острой миелоидной лейкемией [13], множественной миеломой [14] или хронической миелоидной лейкемией [15], еще раз подтвердили тот факт, что только небольшая часть клеток способна инициировать соответствующие лейкозы и поддерживать их у мышей-реципиентов.

Вскоре аналогичные данные были получены и для солидных опухолей. В 2003 году группа исследователей, изучавших рак молочной железы, идентифицировали и выделили у восьми из девяти пациенток клетки с фенотипом CD44+CD24-/lowLineage-. Всего лишь около 100 клеток с этим фенотипом были способны образовывать опухоли у мышей линии NOD-SCID, в то время как десятки тысяч клеток с альтернативным фенотипом не формировали опухоли. Они произвели серийное пассирование онкогенных субпопуляций, и каждый раз клетки этой субпопуляции порождали новые опухоли, содержащие новые CD44+CD24-/lowLineage- онкогенные клетки, а также фенотипически разнообразные смешанные популяции неонкогенных клеток, присутствовавших в исходной опухоли [16]. В том же году другая группа исследователей сообщила об

идентификации и выделении опухолеобразующих клеток из опухолей головного мозга человека, которые обладали способностью к самообновлению и дифференцировке. Они заметили, что опухолеобразующие клетки головного мозга, выделенные из самых агрессивных форм медуллобластомы, обладают повышенным потенциалом к самообновлению популяции по сравнению с другими. Эти клетки были выделены в составе клеточной фракции, которая экспрессировала поверхностный клеточный маркер стволовых клеток CD133 [17]. К настоящему времени накопилось достаточно убедительных доказательств существования особой субпопуляции онкогенных клеток в солидных опухолях поджелудочной железы [18], толстого кишечника [19], печени [20], предстательной железы [21], яичников [22], в меланоме [23].

Эти данные в совокупности с данными других более поздних экспериментов послужили основой для формулирования альтернативной теории возникновения и прогрессии опухолей, а именно теории раковой стволовой клетки (РСК). В соответствии с ней определенная субпопуляция клеток опухоли, состоящая из РСК, запускает образование, прогрессию и рецидивирование опухоли. Эти клетки обладают способностью к самовоспроизведению и дифференцировке, подобно нормальным стволовым клеткам. Их самовоспроизведение и дифференцировка приводят к образованию всех клеточных типов опухоли, таким образом, формируя ее гетерогенность. При этом другие клетки опухоли не обладают неограниченной способностью к самовоспроизведению и не могут продуцировать все клеточные типы опухоли. Также, согласно теории РСК, метастазирование опухоли является результатом диссеминации РСК по организму, а рецидивирование онкологического заболевания вызвано их устойчивостью к терапии. Предполагается, что РСК происходят от клеток, обладающих способностью пролиферировать, то есть от нормальных стволовых клеток или от прогениторных клеток органа. Существуют несколько причин полагать, что это так. Во -первых, основное количество мутаций возникает при репликации ДНК. Если повреждение ДНК произошло в одной

цепи, мутация может закрепиться лишь при делении клетки. Во -вторых, стволовые и прогениторные клетки обладают активированными механизмами самовоспроизведения, и поддержание этой активации может быть проще, чем их включение de novo в более дифференцированных клетках. Другими словами, меньше мутаций потребуется, чтобы поддерживать самовоспроизведение, чем для того, чтобы его активизировать [24].

Ниже на рисунке 1 схематически представлены обе концепции возникновения и прогрессии опухоли.

Рисунок 1. Схематичное изображение концепций возникновения и прогрессии опухоли [25]. а - нормальная ткань, б - клональная эволюция опухолевых клеток, в -возникновение и самовоспроизведение раковой стволовой клетки, г - синтез двух моделей возникновения и прогрессии опухоли.

Как известно, иерархия нормальных клеток включает находящуюся на вершине стволовую клетку, которая дает начало имеющим более ограниченный дифференцировочный потенциал клеткам-предшественникам. Последние в свою очередь производят дифференцированные клетки всех типов, которые образуют конкретную ткань (рис. 1а). В рамках теории клональной эволюции раковые

клетки не дифференцированы, опухоль состоит из множества клонов клеток, обладающих одинаковым пролиферативным потенциалом (рис. 1б). В рамках теории раковой стволовой клетки, только РСК может образовать опухоль на основе своих свойств самовоспроизведения и большего пролиферативного потенциала (рис. 1в). Также возможен вариант, когда действуют оба механизма возникновения и прогрессии опухоли. В таком случае, сначала образуется специфическая РСК1, которая запускает рост опухоли и формирует гетерогенность опухолевых клеток. По мере роста опухоли вследствие возникновения дополнительной мутации или эпигенетической модификации может образоваться другая, отличная от первой, РСК2. В случае возникновения нового типа РСК, обладающего более агрессивной способностью к самовоспроизведению, происходит прогрессирование онкологического заболевания (рис. 1г).

Таким образом, важно, что эти концепции не являются взаимоисключающими, так как обе допускают возможность возникновения опухоли из одной единственной клетки -прародительницы, т.е. клональность опухолей, экспериментально доказанную для ряда онкологических заболеваний посредством анализа генетических изменений между первичным очагом и метастазами [26,27]. Кроме того, сами РСК могут претерпевать клональную эволюцию, в результате чего могут образовываться различные типы РСК, каждый из которых способен к самовоспроизведению и дифференцировке.

1.1.2 Основные отличия РСК от дифференцированных раковых клеток

1.1.2.1 Особенности роста in vivo и in vitro

Прорывной работой, доказывающей концепцию РСК, стало исследование с использованием ксенотрансплантационной модели. В этой работе было показано, что острая миелоидная лейкемия человека происходит от специфической

субпопуляции клеток, которые авторы назвали лейкемическими стволовыми клетками. В данном исследовании методом проточной цитометрии разделяли мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с острой миелоидной лейкемией. При дальнейшей трансплантации отсортированных субпопуляций клеток иммунодефицитным мышам линии SCID было выявлено, что клетки с фенотипом CD34+CD38-, сходным с фенотипом нормальных гемопоэтических стволовых клеток, могли приживаться в костном мозге мышей и давать начало большому количеству колониеобразующих прогениторных клеток. В то же время фракции с фенотипом CD34+CD38+ и CD34- не содержали клеток с такими свойствами [12]. Это исследование стало парадигмой для более поздних исследований РСК других онкологических заболеваний. Схема эксперимента по трансплантации и пассированию различных субпопуляций опухолевых клеток in vivo, с помощью которого были показаны отличительные свойства лейкемических стволовых клеток и впоследствии РСК многих других опухолей, представлена на рисунке 2.

Однако минусом данной экспериментальной модели является то, что при ксенотрансплантации нельзя воспроизвести естественное микроокружение опухоли и влияние иммунной системы [28]. С целью обойти это ограничение несколько работ, посвященных лейкемическим стволовым клеткам, были осуществлены на трансгенных мышах. Так, Kelly и соавторы использовали две трансгенные мышиные модели с В- или Т-клеточными лимфомами, индуцированными посредством активации экспрессии онкогенов c-myc и N-ras, соответственно. Клетки, полученные от мышей с лейкемией, затем трансплантировали гистосовместимым мышам. Было выявлено, что опухоль могла образоваться даже при трансплантации 10 клеток. Из этих результатов авторы заключили, что необходимость трансплантации большого числа опухолевых клеток иммунодефицитным мышам в ксенотрансплантационной модели связана с ограниченной способностью клеток опухоли адаптироваться к росту в чужеродном микроокружении. И что, на самом деле, каждая 10 клетка

опухоли способна к опухолеообразованию, что говорит о том, что «рост опухоли не запускается редкими раковыми стволовыми клетками» [29]. Однако другой возможной интерпретацией результатов этого эксперимента может быть наличие высокого процента раковых стволовых клеток в используемых моделях. В другом исследовании авторы использовали трансгенную мышиную модель, в которой делеция гена-супрессора опухолевого роста Р1еп в гемопоэтических стволовых клетках приводила к острой Т-лимфобластной лейкемии. С использованием этой модели исследователи продемонстрировали, что при трансплантации после предельных разведений лишь редкая популяция лейкемических стволовых клеток была способна вызвать образование лейкемии [15].

Применение трансгенной мышиной модели для анализа РСК помогло учесть роль микроокружения и в случае солидных опухолей. В двух исследованиях с применением различных мышиных моделей рака молочной железы, р53-пи11 и ММТУ^пй моделей, производили сингенные трансплантации после предельных разведений. Было продемонстрировано, что лишь маленькая субпопуляция опухолевых клеток обладает свойствами РСК, тогда как основная часть клеток не является опухолеобразующей. Вторичные опухоли, которые происходили от выделенных РСК, фенотипически копировали исходные опухоли и давали начало гетерогенным клеточным типам, присутствующим в первичных опухолях [30,31].

Таким образом, в совокупности эти данные указывают, что относительная частота РСК может значительно варьировать в зависимости от специфической экспериментальной системы, так же, как и от экспрессии конкретных онкогенов или онкосупрессоров. Однако, по крайней мере, при некоторых формах гематологических и солидных опухолей способностью к опухолеобразованию обладает ограниченная субпопуляция клеток опухоли. Такой вывод можно сделать как из экспериментов с использованием ксенотрансплантации человеческих клеток иммунодефицитным мышам, так и сингенной трансплантации.

Рисунок 2. Схематичное изображение экспериментов по трансплантации РСК и их последующему пассированию in vivo [19].

Как альтернатива трудоемким исследованиям с серийной трансплантацией, для выявления и изучения свойств РСК часто используются эксперименты с неадгезивными сферами in vitro. Сущность метода заключается в том, что при культивировании опухолевых клеток в бессывороточной среде с добавлением факторов роста, таких как EGF, FGF, NSF и др., часть клеток формирует сфероидные колонии. Выяснилось, что клетки этих колоний обладают отличным от основной массы опухоли поверхностным фенотипом, а также повышенным пролиферативным потенциалом и способностью к дифференцировке. Так, несколько групп исследователей обнаружили, что CD133+ клетки, выделенные из медуллобластомы, в отличие от CD133- клеток формировали в бессывороточной среде неадгезивные опухолевые сферы, которые при диссоциации и дальнейшем культивировании в среде с сывороткой дифференцировались и начинали

экпрессировать белки дифференцированных раковых клеток в-tub-3 и GFAP [32,33]. В другом исследовании CD133+ клетки, изолированные из рака толстой кишки, могли поддерживаться in vitro в качестве недифференцированных опухолевых сфер в течение более чем 1 года. При этом CD133- клетки неминуемо погибали в таких условиях. Чтобы доказать, что клетки, образующие опухолевые сферы, обладают опухолеобразующим потенциалом, исследователи инъецировали от 50 до 500 таких сфер подкожно SCID мышам. Хотя 106 дифференцированных клеток опухоли толстого кишечника не образовывали опухоль, опухолевые сферы приживались и формировали быстро растущие опухоли [34]. Сфероидные агрегаты опухолевых клеток, обладающие опухолеобразующим потенциалом в иммунодефицитных мышах, были получены и для многих других онкологических заболеваний, например, для меланомы [23], рака легких [35], рака яичника [22], рака поджелудочной железы [36], рака щитовидной железы [37].

1.1.2.2 Экспрессия специфических поверхностных и внутриклеточных маркеров.

В качестве потенциальных маркеров РСК опухоли обычно рассматриваются маркеры нормальных стволовых и прогениторных клеток той же ткани, из которой сформировалась опухоль. Так в случае гематологических опухолей, для выявления РСК используют маркер CD34, который уже на протяжении 30 лет применяют для идентификации гемопоэтических стволовых клеток [38]. Кроме того, недавно было показано, что CD34 является маркером тканеспецифичных стволовых клеток, например, эпидермальных предшественников и мышечных сателлитных клеток. Молекула CD34 является поверхностным гликопротеином. Его предположительными биологическими функциями являются усиление пролиферации и блокирование дифференцировки клеток, регуляция клеточной адгезии, участие в миграции гемопоэтических клеток. Предполагается, что он опосредует прикрепление стволовых клеток к экстрацеллюлярному матриксу в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гисина, Алиса Михайловна, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gay L., Baker A. -M., Graham T.A. Tumour Cell Heterogeneity. // F1000Research. 2016. Vol. 5.

2. Rycaj K., Tang D.G. Cell-of-Origin of Cancer versus Cancer Stem Cells: Assays and Interpretations. // Cancer Res. 2015.

3. Kim Y.S. et al. Molecular markers of cancer stem cells verified in vivo. // Biomed. Khim. 2016. Vol. 62, № 3. P. 228-238.

4. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 г . Статистика. Москва, 2014. с. 52 p.

5. Vaiopoulos A.G. et al. Colorectal cancer stem cells. // Stem Cells. 2012. Vol. 30, № 3. P. 363-371.

6. Heppner G.H. Tumor heterogeneity. // Cancer Res. 1984. Vol. 44, № 6. P. 22592265.

7. Campbell L.L., Polyak K. Breast tumor heterogeneity: cancer stem cells or clonal evolution? // Cell Cycle. 2007. Vol. 6, № 19. P. 2332-2338.

8. Nowell P.C. Mechanisms of tumor progression. // Cancer Res. 1986. Vol. 46, № 5. P. 2203-2207.

9. Park C.H., Bergsagel D.E., McCulloch E.A. Mouse myeloma tumor stem cells: a primary cell culture assay. // J. Natl. Cancer Inst. 1971. Vol. 46, № 2. P. 411-422.

10. Bruce W.R., Van Der Gaag H. A quantitative assay for the number of murine lymphoma cells capable of proliferation in vivo. // Nature. 1963. Vol. 199. P. 79 -80.

11. Hamburger A.W., Salmon S.E. Primary bioassay of human tumor stem cells. // Science. 1977. Vol. 197, № 4302. P. 461-463.

12. Lapidot T. et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice // Nature. 1994. Vol. 367, № 6464. P. 645-648.

13. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. // Nat. Med. 1997. Vol. 3, № 7. P. 730-737.

14. Matsui W. et al. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. // Blood.

2004. Vol. 103, № 6. P. 2332-2336.

15. Guo W. et al. Multi-genetic events collaboratively contribute to Pten-null leukaemia stem-cell formation. // Nature. 2008. Vol. 453, № 7194. P. 529-533.

16. Al-Hajj M. et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 7. P. 3983-3988.

17. Singh S.K. et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. // Cancer Res. 2003. Vol. 63, № 18. P. 5821-5828.

18. Li C. et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 3. P. 1030-1037.

19. O'Brien C. a et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. // Nature. 2007. Vol. 445, № 7123. P. 106-110.

20. Yang Z.F. et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. // Cancer Cell. 2008. Vol. 13, № 2. P. 153-166.

21. Collins A.T. et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. // Cancer Res. 2005. Vol. 65, № 23. P. 10946-10951.

22. Zhang S. et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors // Cancer Res. 2008. Vol. 68, № 11. P. 43114320.

23. Fang D. et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. // Cancer Res. 2005. Vol. 65, № 20. P. 9328-9337.

24. Reya T. et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. // Nature. Nature Publishing Group, 2001. Vol. 414, № 6859. P. 105-111.

25. Visvader J.E., Lindeman G.J. Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence and unresolved questions. // Nat. Rev. Cancer. 2008. Vol. 8, № 10. P. 755-768.

26. Sabatino M. et al. Conservation of genetic alterations in recurrent melanoma supports the melanoma stem cell hypothesis. // Cancer Res. 2008. Vol. 68, № 1. P. 122-131.

27. Liu W. et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. // Nat. Med. 2009. Vol. 15, № 5. P. 559-565.

28. Richmond A., Su Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. // Dis. Model. Mech. 2008. Vol. 1, № 2 -3. P. 78-82.

29. Kelly P.N. et al. Tumor growth need not be driven by rare cancer stem cells. // Science. 2007. Vol. 317, № 5836. P. 337.

30. Zhang M. et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. // Cancer Res. 2008. Vol. 68, № 12. P. 4674-4682.

31. Cho R.W. et al. Isolation and molecular characterization of cancer stem cells in MMTV-Wnt-1 murine breast tumors. // Stem Cells. 2008. Vol. 26, № 2. P. 364371.

32. Hemmati H.D. et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 25. P. 15178-15183.

33. Singh S.K. et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. // Cancer Res. 2003. Vol. 63, № 18. P. 5821-5828.

34. Ricci-Vitiani L. et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. // Nature. 2007. Vol. 445, № 7123. P. 111-115.

35. Eramo a et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. // Cell Death Differ. 2008. Vol. 15, № 3. P. 504-514.

36. Gaviraghi M. et al. Pancreatic cancer spheres are more than just aggregates of stem marker-positive cells. // Biosci. Rep. 2011. Vol. 31, № 1. P. 45-55.

37. Todaro M. et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. // Cancer Res. 2010. Vol. 70, № 21. P. 8874-8885.

38. Nielsen J.S., McNagny K.M. Novel functions of the CD34 family // J. Cell Sci. 2008. Vol. 121, № 24. P. 4145-4145.

39. Stingl J. et al. Phenotypic and functional characterization in vitro of a multipotent epithelial cell present in the normal adult human breast. // Differentiation. 1998. Vol. 63, № 4. P. 201-213.

40. Liu A.Y. et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. Vol. 94, № 20. P. 10705-10710.

41. Trzpis M. et al. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

and adhesion molecule. // Am. J. Pathol. 2007. Vol. 171, № 2. P. 386-395. Dalerba P. et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 24. P. 10158-10163. Fang X. et al. CD24: from A to Z. // Cell. Mol. Immunol. 2010. Vol. 7, № 2. P. 100-103.

Runz S. et al. CD24 induces localization of beta1 integrin to lipid raft domains. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 365, № 1. P. 35-41. Yang X.-R. et al. CD24 is a novel predictor for poor prognosis of hepatocellular carcinoma after surgery. // Clin. Cancer Res. 2009. Vol. 15, № 17. P. 5518-5527. Hurt E.M. et al. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. // Br. J. Cancer. 2008. Vol. 98, № 4. P. 756-765.

Takaishi S. et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, № 5. P. 1006-1020. Prince M.E. et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 3. P. 973-978.

Keysar S.B., Jimeno A. More than markers: biological significance of cancer stem

cell-defining molecules. // Mol. Cancer Ther. 2010. Vol. 9, № 9. P. 2450-2457.

Marhaba R., Zoller M. CD44 in cancer progression: adhesion, migration and

growth regulation. // J. Mol. Histol. 2004. Vol. 35, № 3. P. 211-231.

Tolg C. et al. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability.

// Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21, № 5. P. 1225-1229.

Mizrak D., Brittan M., Alison M.R. CD133: molecule of the moment. // J. Pathol.

2008. Vol. 214, № 1. P. 3-9.

Shmelkov S. V et al. AC133/CD133/Prominin-1. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. Vol. 37, № 4. P. 715-719.

Singh S.K. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. // Nature. 2004. Vol. 432, № 7015. P. 396-401.

Chen Y.-C. et al. Oct-4 expression maintained cancer stem-like properties in lung

cancer-derived CD133-positive cells. // PLoS One. 2008. Vol. 3, № 7. P. e2637.

56. Hermann P.C. et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. // Cell Stem Cell. 2007. Vol. 1, № 3. P. 313-323.

57. Ma S. et al. Aldehyde dehydrogenase discriminates the CD133 liver cancer stem cell populations. // Mol. Cancer Res. 2008. Vol. 6, № 7. P. 1146-1153.

58. Miki J. et al. Identification of putative stem cell markers, CD133 and CXCR4, in hTERT-immortalized primary nonmalignant and malignant tumor-derived human prostate epithelial cell lines and in prostate cancer specimens. // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 7. P. 3153-3161.

59. Matsumoto K. et al. mTOR signal and hypoxia-inducible factor-1 alpha regulate CD133 expression in cancer cells. // Cancer Res. 2009. Vol. 69, № 18. P. 71607164.

60. Irollo E., Pirozzi G. CD133: to be or not to be, is this the real question? // Am. J. Transl. Res. 2013. Vol. 5, № 6. P. 563-581.

61. Zacchigna S. et al. Loss of the cholesterol-binding protein prominin-1/CD133 causes disk dysmorphogenesis and photoreceptor degeneration. // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, № 7. P. 2297-2308.

62. Chute J.P. et al. Inhibition of aldehyde dehydrogenase and retinoid signaling induces the expansion of human hematopoietic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 31. P. 11707-11712.

63. Ginestier C. et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. // Cell Stem Cell. 2007. Vol. 1, № 5. P. 555-567.

64. Cheung A.M.S. et al. Aldehyde dehydrogenase activity in leukemic blasts defines a subgroup of acute myeloid leukemia with adverse prognosis and superior NOD/SCID engrafting potential. // Leukemia. 2007. Vol. 21, № 7. P. 1423-1430.

65. Chen Y.-C. et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. Vol. 385, № 3. P. 307-313.

66. Li T. et al. ALDH1A1 is a marker for malignant prostate stem cells and predictor of prostate cancer patients' outcome. // Lab. Invest. 2010. Vol. 90, № 2. P. 234244.

67. Rasheed Z.A. et al. Prognostic significance of tumorigenic cells with mesenchymal features in pancreatic adenocarcinoma. // J. Natl. Cancer Inst. 2010. Vol. 102, № 5. P. 340-351.

68. Huang E.H. et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis. // Cancer Res. 2009. Vol. 69, № 8. P. 3382-3389.

69. Dylla S.J. et al. Colorectal cancer stem cells are enriched in xenogeneic tumors following chemotherapy. // PLoS One / ed. Gilliland D.G. 2008. Vol. 3, № 6. P. e2428.

70. Schatton T. et al. Identification of cells initiating human melanomas. // Nature. 2008. Vol. 451, № 7176. P. 345-349.

71. Ma J. et al. Isolation of tumorigenic circulating melanoma cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. Vol. 402, № 4. P. 711-717.

72. Wilson B.J. et al. ABCB5 identifies a therapy-refractory tumor cell population in colorectal cancer patients. // Cancer Res. 2011. Vol. 71, № 15. P. 5307-5316.

73. Haeryfar S.M.M., Hoskin D.W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. // J. Immunol. 2004. Vol. 173, № 6. P. 3581-3588.

74. Masson N.M. et al. Hepatic progenitor cells in human fetal liver express the oval cell marker Thy-1. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006. Vol. 291, № 1. P. G45-G54.

75. Nakamura Y. et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. // Br. J. Dermatol. 2006. Vol. 154, № 6. P. 1062-1070.

76. Rege T.A., Hagood J.S. Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis. // FASEB J. 2006. Vol. 20, № 8. P. 1045-1054.

77. Lennartsson J., Rönnstrand L. Stem cell factor receptor/c-Kit: from basic science to clinical implications. // Physiol. Rev. 2012. Vol. 92, № 4. P. 1619-1649.

78. Liang J. et al. The C-kit receptor-mediated signal transduction and tumor-related diseases. // Int. J. Biol. Sci. 2013. Vol. 9, № 5. P. 435-443.

79. Yu F. et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. // Cell. 2007. Vol. 131, № 6. P. 1109-1123.

80. Bao S. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. // Nature. 2006. Vol. 444, № 7120. P. 756-760.

81. Biedler J.L., Riehm H. Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic, and cytogenetic studies. // Cancer Res. 1970. Vol. 30, № 4. P. 1174-1184.

82. Dano K. Active outward transport of daunomycin in resistant Ehrlich ascites tumor cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. Vol. 323, № 3. P. 466-483.

83. Juliano R.L., Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. Vol. 455, № 1. P. 152-162.

84. Kartner N., Riordan J.R., Ling V. Cell surface P-glycoprotein associated with multidrug resistance in mammalian cell lines. // Science. 1983. Vol. 221, № 4617. P. 1285-1288.

85. Kartner N. et al. Detection of P-glycoprotein in multidrug-resistant cell lines by monoclonal antibodies. // Nature. 1985. Vol. 316, № 6031. P. 820-823.

86. Roninson I.B. et al. Amplification of specific DNA sequences correlates with multi-drug resistance in Chinese hamster cells. // Nature. 1984. Vol. 309, № 5969. P. 626-628.

87. Schinkel A.H. et al. Multidrug resistance and the role of P-glycoprotein knockout mice. // Eur. J. Cancer. 1995. Vol. 31A, № 7-8. P. 1295-1298.

88. Benet L.Z. et al. Intestinal MDR transport proteins and P-450 enzymes as barriers to oral drug delivery. // J. Control. Release. 1999. Vol. 62, № 1 -2. P. 25-31.

89. Udomsakdi C. et al. Separation of functionally distinct subpopulations of primitive human hematopoietic cells using rhodamine-123. // Exp. Hematol. 1991. Vol. 19, № 5. P. 338-342.

90. Goodell B.M.A. et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic

stem cells that are replicating in vivo. // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183, № 4. P. 1797-1806.

91. Giangreco A. et al. Molecular phenotype of airway side population cells. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2004. Vol. 286, № 4. P. L624-L630.

92. Chen J. et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early embryonic characteristics. // Endocrinology. 2005. Vol. 146, № 9. P. 3985-3998.

93. He D.-N. et al. Small intestinal organoid-derived SP cells contribute to repair of irradiation-induced skin injury. // Stem Cells Dev. 2005. Vol. 14, № 3. P. 285291.

94. Riou L. et al. The telomerase activity of adult mouse testis resides in the spermatogonial alpha6-integrin-positive side population enriched in germinal stem cells. // Endocrinology. 2005. Vol. 146, № 9. P. 3926-3932.

95. Wulf G.G. et al. Cells of the hepatic side population contribute to liver regeneration and can be replenished with bone marrow stem cells. // Haematologica. 2003. Vol. 88, № 4. P. 368-378.

96. Welm B. et al. Isolation and characterization of functional mammary gland stem cells. // Cell Prolif. 2003. Vol. 36 Suppl 1. P. 17 -32.

97. Challen G. a, Little M.H. A side order of stem cells: the SP phenotype. // Stem Cells. 2006. Vol. 24, № 1. P. 3-12.

98. Kondo T., Setoguchi T., Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 3. P. 781-786.

99. Mitsutake N. et al. Characterization of side population in thyroid cancer cell lines: cancer stem-like cells are enriched partly but not exclusively. // Endocrinology. 2007. Vol. 148, № 4. P. 1797-1803.

100. Haraguchi N. et al. Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system. // Stem Cells. 2006. Vol. 24, № 3. P. 506-513.

101. Hirschmann-Jax C. et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol.

101, № 39. P. 14228-14233.

102. Szotek P.P. et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 30. P. 11154-11159.

103. Patrawala L. et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. // Cancer Res. 2005. Vol. 65, № 14. P. 6207-6219.

104. Patrawala L. et al. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 14. P. 6796-6805.

105. Harris M.A. et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. // Cancer Res. 2008. Vol. 68, № 24. P. 10051-10059.

106. Lichtenauer U.D. et al. Side population does not define stem cell-like cancer cells in the adrenocortical carcinoma cell line NCI h295R. // Endocrinology. 2008. Vol. 149, № 3. P. 1314-1322.

107. Scharenberg C.W., Harkey M.A., Torok-Storb B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors // Blood. 2002. Vol. 99, № 2. P. 507-512.

108. Richard V. et al. Side population cells as prototype of chemoresistant, tumor-initiating cells. // Biomed Res. Int. 2013. Vol. 2013. P. 517237.

109. Wu C., Alman B.A. Side population cells in human cancers. // Cancer Lett. 2008. Vol. 268, № 1. P. 1-9.

110. Burkert J., Otto W.R., Wright N.A. Side populations of gastrointestinal cancers are not enriched in stem cells. // J. Pathol. 2008. Vol. 214, № 5. P. 564-573.

111. Wu C. et al. Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential. // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 17. P. 8216-8222.

112. Chiba T. et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. // Hepatology. 2006. Vol. 44, № 1. P. 240-251.

113. Wang J. et al. Identification of cancer stem cell-like side population cells in

human nasopharyngeal carcinoma cell line. // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 8. P. 3716-3724.

114. Ho M.M. et al. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 10. P. 48274833.

115. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты. СПб: издательский дом СПбМАПО., 2007. С. 32-44.

116. Пальцев М.А., Аничков Н.А. Атлас патологии опухолей человека. 2005. С. 213-231.

117. Sobin L.H. et al. TNM classification of malignant tumours. Wiley-Blackwell, 2009. P. 310.

118. Любченко Л.Н. Варианты семейного рака толстой кишки // Практическая онкология. 2005. Vol. Т.6, № 2. С. 132-136.

119. Houlston R.S. What we could do now: molecular pathology of colorectal cancer. // Mol. Pathol. 2001. Vol. 54, № 4. P. 206-214.

120. Fearon E.R., Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. // Cell. 1990. Vol. 61, № 5. P. 759-767.

121. Ricci-Vitiani L. et al. Colon cancer stem cells. // J. Mol. Med. (Berl). 2009. Vol. 87, № 11. P. 1097-1104.

122. Shmelkov S. V et al. CD133 expression is not restricted to stem cells, and both CD133+ and CD133- metastatic colon cancer cells initiate tumors. // J. Clin. Invest. 2008. Vol. 118, № 6. P. 2111-2120.

123. Kemper K. et al. The AC133 epitope, but not the CD133 protein, is lost upon cancer stem cell differentiation. // Cancer Res. 2010. Vol. 70, № 2. P. 719-729.

124. Vermeulen L. et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105, № 36. P. 13427-13432.

125. Todaro M. et al. IL-4-mediated drug resistance in colon cancer stem cells. // Cell Cycle. 2008. Vol. 7, № 3. P. 309-313.

126. Weiswald L.-B. et al. A short-term colorectal cancer sphere culture as a relevant

tool for human cancer biology investigation. // Br. J. Cancer. 2013. Vol. 108, № 8. P. 1720-1731.

127. Botchkina I.L. et al. Phenotypic subpopulations of metastatic colon cancer stem cells: genomic analysis. // Cancer Genomics Proteomics. 2009. Vol. 6, № 1. P. 19-29.

128. Neumann J. et al. SOX2 expression correlates with lymph-node metastases and distant spread in right-sided colon cancer. // BMC Cancer. 2011. Vol. 11. P. 518.

129. Chang C.-J. et al. Oct4-related cytokine effects regulate tumorigenic properties of colorectal cancer cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011. Vol. 415, № 2. P. 245-251.

130. Botchkina G.I. et al. New-generation taxoid SB-T-1214 inhibits stem cell-related gene expression in 3D cancer spheroids induced by purified colon tumor-initiating cells. // Mol. Cancer. 2010. Vol. 9. P. 192.

131. Van Houdt W.J. et al. Comparative proteomics of colon cancer stem cells and differentiated tumor cells identifies BIRC6 as a potential therapeutic target. // Mol. Cell. Proteomics. 2011. Vol. 10, № 12. P. M111.011353.

132. Zou J. et al. Proteome of human colon cancer stem cells: a comparative analysis. // World J. Gastroenterol. 2011. Vol. 17, № 10. P. 1276-1285.

133. Fang D.D. et al. Expansion of CD133(+) colon cancer cultures retaining stem cell properties to enable cancer stem cell target discovery. // Br. J. Cancer. 2010. Vol. 102, № 8. P. 1265-1275.

134. Mimeault M., Batra S.K. New advances on critical implications of tumor- and metastasis-initiating cells in cancer progression, treatment resistance and disease recurrence. // Histol. Histopathol. 2010. Vol. 25, № 8. P. 1057-1073.

135. Horst D. et al. CD133 expression is an independent prognostic marker for low survival in colorectal cancer. // Br. J. Cancer. 2008. Vol. 99, № 8. P. 1285-1289.

136. Zeppernick F. et al. Stem cell marker CD133 affects clinical outcome in glioma patients. // Clin. Cancer Res. 2008. Vol. 14, № 1. P. 123-129.

137. Maeda S. et al. CD133 expression is correlated with lymph node metastasis and vascular endothelial growth factor-C expression in pancreatic cancer. // Br. J.

Cancer. 2008. Vol. 98, № 8. P. 1389-1397.

138. Mehra N. et al. Progenitor marker CD133 mRNA is elevated in peripheral blood of cancer patients with bone metastases. // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12, № 16. P. 4859-4866.

139. Lin E.H. et al. Elevated circulating endothelial progenitor marker CD133 messenger RNA levels predict colon cancer recurrence. // Cancer. 2007. Vol. 110, № 3. P. 534-542.

140. Wakamatsu Y. et al. Expression of cancer stem cell markers ALDH1, CD44 and CD133 in primary tumor and lymph node metastasis of gastric cancer. // Pathol. Int. 2012. Vol. 62, № 2. P. 112-119.

141. Pohl A. et al. Pharmacogenetic profiling of CD133 is associated with response rate (RR) and progression-free survival (PFS) in patients with metastatic colorectal cancer (mCRC), treated with bevacizumab-based chemotherapy. // Pharmacogenomics J. 2013. Vol. 13, № 2. P. 173-180.

142. Todaro M. et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. // Cell Stem Cell. 2007. Vol. 1, № 4. P. 389-402.

143. Bao S. et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. // Cancer Res. 2006. Vol. 66, № 16. P. 78437848.

144. Eramo A. et al. Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells. // Cell Death Differ. 2006. Vol. 13, № 7. P. 1238-1241.

145. Bertolini G. et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 38. P. 16281-16286.

146. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. // Science. 2007. Vol. 318, № 5858. P. 1917-1920.

147. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. // Cell. 2007. Vol. 131, № 5. P. 861-872.

148. Takebe N. et al. Targeting cancer stem cells by inhibiting Wnt, Notch, and Hedgehog pathways. // Nat. Rev. Clin. Oncol. 2011. Vol. 8, № 2. P. 97-106.

149. Harris P.J., Speranza G., Dansky Ullmann C. Targeting embryonic signaling pathways in cancer therapy. // Expert Opin. Ther. Targets. 2012. Vol. 16, № 1. P. 131-145.

150. Schatton T., Frank N.Y., Frank M.H. Identification and targeting of cancer stem cells. // Bioessays. 2009. Vol. 31, № 10. P. 1038-1049.

151. Wilson B.J. et al. Colorectal Cancer Stem Cells: Biology and Therapeutic Implications. // Curr. Colorectal Cancer Rep. 2011. Vol. 7, № 2. P. 128-135.

152. Curtin J.C., Lorenzi M. V. Drug discovery approaches to target Wnt signaling in cancer stem cells. // Oncotarget. 2010. Vol. 1, № 7. P. 552-566.

153. Subramaniam D. et al. Cancer stem cells: a novel paradigm for cancer prevention and treatment. // Mini Rev. Med. Chem. 2010. Vol. 10, № 5. P. 359-371.

154. Todaro M. et al. Colon cancer stem cells: promise of targeted therapy. // Gastroenterology. 2010. Vol. 138, № 6. P. 2151-2162.

155. Gazouli M. et al. OCT4 spliced variant OCT4B1 is expressed in human colorectal cancer. // Mol. Carcinog. 2012. Vol. 51, № 2. P. 165-173.

156. Saigusa S. et al. Correlation of CD133, OCT4, and SOX2 in rectal cancer and their association with distant recurrence after chemoradiotherapy. // Ann. Surg. Oncol. 2009. Vol. 16, № 12. P. 3488-3498.

157. Matheu A. et al. Oncogenicity of the developmental transcription factor Sox9. // Cancer Res. 2012. Vol. 72, № 5. P. 1301-1315.

158. Mimeault M., Batra S.K. Animal models relevant to human prostate carcinogenesis underlining the critical implication of prostatic stem/progenitor cells. // Biochim. Biophys. Acta. 2011. Vol. 1816, № 1. P. 25-37.

159. Chen W., Chen M., Barak L.S. Development of small molecules targeting the Wnt pathway for the treatment of colon cancer: a high-throughput screening approach. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2010. Vol. 299, № 2. P. G293-G300.

160. de Sousa E.M.F. et al. Targeting Wnt signaling in colon cancer stem cells. // Clin. Cancer Res. 2011. Vol. 17, № 4. P. 647-653.

161. Li Y. et al. HEF1, a novel target of Wnt signaling, promotes colonic cell migration

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

and cancer progression. // Oncogene. 2011. Vol. 30, № 23. P. 2633-2643. Frank N.Y., Schatton T., Frank M.H. The therapeutic promise of the cancer stem cell concept. // J. Clin. Invest. 2010. Vol. 120, № 1. P. 41-50. Stanley P. Regulation of Notch signaling by glycosylation. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2007. Vol. 17, № 5. P. 530-535.

Kemper K. et al. Targeting colorectal cancer stem cells with inducible caspase-9. // Apoptosis. 2012. Vol. 17, № 5. P. 528-537.

Gupta P.B. et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. // Cell. 2009. Vol. 138, № 4. P. 645-659. Lombardo Y. et al. Bone morphogenetic protein 4 induces differentiation of colorectal cancer stem cells and increases their response to chemotherapy in mice. // Gastroenterology. 2011. Vol. 140, № 1. P. 297-309. Wang C.-H. et al. Photothermolysis of glioblastoma stem-like cells targeted by carbon nanotubes conjugated with CD133 monoclonal antibody. // Nanomedicine. 2011. Vol. 7, № 1. P. 69-79.

Dean M., Fojo T., Bates S. Tumour stem cells and drug resistance. // Nat. Rev. Cancer. 2005. Vol. 5, № 4. P. 275-284.

Morrison R. et al. Targeting the mechanisms of resistance to chemotherapy and radiotherapy with the cancer stem cell hypothesis. // J. Oncol. 2011. Vol. 2011. P. 941876.

Li F., Sethi G. Targeting transcription factor NF-kappaB to overcome chemoresistance and radioresistance in cancer therapy. // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1805, № 2. P. 167-180.

Sharma R.A. et al. Phase I clinical trial of oral curcumin: biomarkers of systemic

activity and compliance. // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10, № 20. P. 6847-6854.

Yu Y. et al. Elimination of Colon Cancer Stem-Like Cells by the Combination of

Curcumin and FOLFOX. // Transl. Oncol. 2009. Vol. 2, № 4. P. 321-328.

Sato T. et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a

mesenchymal niche. // Nature. 2009. Vol. 459, № 7244. P. 262-265.

Patel B.B. et al. Curcumin enhances the effects of 5-fluorouracil and oxaliplatin in

mediating growth inhibition of colon cancer cells by modulating EGFR and IGF -1R. // Int. J. Cancer. 2008. Vol. 122, № 2. P. 267-273.

175. Kakarala M. et al. Targeting breast stem cells with the cancer preventive compounds curcumin and piperine. // Breast Cancer Res. Treat. 2010. Vol. 122, № 3. P. 777-785.

176. Majumdar A.P.N. et al. Curcumin synergizes with resveratrol to inhibit colon cancer. // Nutr. Cancer. 2009. Vol. 61, № 4. P. 544-553.

177. Qualtrough D. et al. Hedgehog signalling in colorectal tumour cells: induction of apoptosis with cyclopamine treatment. // Int. J. Cancer. 2004. Vol. 110, № 6. P. 831-837.

178. Mimeault M., Batra S.K. Targeting of cancer stem/progenitor cells plus stem cell-based therapies: the ultimate hope for treating and curing aggressive and recurrent cancers. // Panminerva Med. 2008. Vol. 50, № 1. P. 3-18.

179. Trowbridge I.S., Thomas M.L. CD45: An Emerging Role as a Protein Tyrosine Phosphatase Required for Lymphocyte Activation and Development -annurev.iy. 12.040194.000505 // Annu. Rev. Immunol. 1994. Vol. 12. P. 85-116.

180. Cui L. et al. Prospectively isolated cancer-associated CD10(+) fibroblasts have stronger interactions with CD133(+) colon cancer cells than with CD133(-) cancer cells. // PLoS One. 2010. Vol. 5, № 8. P. e12121.

181. Baeuerle P.A., Gires O. EpCAM (CD326) finding its role in cancer. // Br. J. Cancer. 2007. Vol. 96, № 3. P. 417-423.

182. Lim S.C. CD24 and human carcinoma: tumor biological aspects. // Biomed. Pharmacother. 2005. Vol. 59 Suppl 2. P. S351-S354.

183. Aisen P. Transferrin receptor 1. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36, № 11. P. 2137-2143.

184. Telford W.G. Stem cell side population analysis and sorting using DyeCycle violet. // Curr. Protoc. Cytom. 2010. Vol. Chapter 9. P. Unit9.30.

185. Lu J. et al. Biological characteristics of Rh123(high) stem-like cells in a side population of 786-O renal carcinoma cells. // Oncol. Lett. 2013. Vol. 5, № 6. P. 1903-1908.

186. Simpson C. et al. Out of the blue: a comparison of Hoechst side population (SP) analysis of murine bone marrow using 325, 363 and 407 nm excitation sources. // J. Immunol. Methods. 2006. Vol. 310, № 1 -2. P. 171-181.

187. Xu X.T. et al. MicroRNA expression profiling identifies miR-328 regulates cancer stem cell-like SP cells in colorectal cancer. // Br. J. Cancer. 2012. Vol. 106, № 7. P. 1320-1330.

188. Klonisch T. et al. Cancer stem cell markers in common cancers - therapeutic implications // Trends Mol. Med. 2008. Vol. 14, № 10. P. 450-460.

189. Calloni R. et al. Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells. // Stem Cells Dev. 2013. Vol. 22, № 9. P. 1455-1476.

190. Kuespert K., Pils S., Hauck C.R. CEACAMs: their role in physiology and pathophysiology // Curr. Opin. Cell Biol. 2006. Vol. 18, № 5. P. 565-571.

191. Pro B., Dang N.H. CD26/dipeptidyl peptidase IV and its role in cancer. // Histol. Histopathol. 2004. Vol. 19, № 4. P. 1345-1351.

192. Pang R. et al. A subpopulation of CD26+ cancer stem cells with metastatic capacity in human colorectal cancer. // Cell Stem Cell. 2010. Vol. 6, № 6. P. 603615.

193. Choi D. et al. Cancer stem cell markers CD133 and CD24 correlate with invasiveness and differentiation in colorectal adenocarinoma // World J. Gastroenterol. 2009. Vol. 15, № 18. P. 2258-2264.

194. Smith P.J. et al. Kinetic analysis of intracellular Hoechst 33342-DNA interactions by flow cytometry: Misinterpretation of side population status? // Cytom. Part A. 2013. Vol. 83 A, № 1. P. 161-169.

195. Hemler M.E. Tetraspanin proteins promote multiple cancer stages // Nat. Rev. Cancer. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved., 2013. Vol. 14, № 1. P. 49-60.

196. Ishida H. et al. Ki-67 and CEA expression as prognostic markers in Dukes' C colorectal cancer. // Cancer Lett. 2004. Vol. 207, № 1. P. 109-115.

197. Fang X. et al. CD24: from A to Z. // Cell. Mol. Immunol. Chinese Society of Immunology and The University of Science and Technology, 2010. Vol. 7, № 2.

P. 100-103.

198. Corbo C. et al. Protein cross-talk in CD133+ colon cancer cells indicates activation of the Wnt pathway and upregulation of SRp20 that is potentially involved in tumorigenicity. // Proteomics. 2012. Vol. 12, № 12. P. 2045-2059.

199. Gaiser T. et al. Genome and transcriptome profiles of CD133-positive colorectal cancer cells // Am. J. Pathol. Elsevier Inc., 2011. Vol. 178, № 4. P. 1478-1488.