Высокочувствительная детекция низкокопийных белков с использованием нанопроволочного биосенсора тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Мальсагова Кристина Ахмедовна

• Мальсагова Кристина Ахмедовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Мальсагова Кристина Ахмедовна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Анализ методов высокочувствительного обнаружения

белков

1.1.1 Непрямые методы обнаружения белков

1.1.2 Прямые методы обнаружения белков

1.2 Нанопроволочные структуры как сенсорные элементы биохимических электронных детекторов

1.3 Методы функционализации нанопроволочных сенсорных элементов

1.4 Концентрационная чувствительность биосенсоров на базе нанопроволочных сенсоров

1.5 Состояние и перспекивы развития нанопроволочных биосенсоров в России 54 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реактивы и биологические объекты

2.2 Нанопроволочный биосенсор

2.3 Функционализация поверхности нанопроволочных сенсорных элементов для биоспецифической детекции белков

2.4 Визуализация молекулярных зондов с помощью атомно-силовой микроскопии

2.5 Методика приготовления образцов

2.6 Регистрация биомолекул с помощью нанопроволочного биосенсора 67 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Результаты функционализации поверхности

нанопроволочного чипа

3.2 Влияние ширины нанопроволок на стабильность регистрируемого сигнала в буферном растворе

3.3 Регистрация белков с использованием КНИ-НП-чипов п-

типа проводимости

3.4 Регистрация белков с использованием КНИ-НП-чипов р-

типа проводимости

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ФИНАНСИРОВАНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

ЛИТЕРАТУРА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

^(М) - минимальная концентрация белка, при которой он обнаружен в растворе;

D-NFATc1 - домен глобулярного белка NFAT 1;

DMSO - диметилсульфоксид (англ. dimethylsulfoxide), кросс-линкер для активации поверхности и последующей иммобилизации молекулярных зондов;

DSC - дисукцинимидилкарбонат (англ. N,N'-disuccinimidyl carbonate), кросс-линкер для активации поверхности и последующей иммобилизации молекулярных зондов;

DSP - дитиобис-сукцинимидилпропионат (англ. dithiobis(succinimidyl propionate), кросс-линкер для активации поверхности и последующей иммобилизации молекулярных зондов;

DTSSP - 3, З'-дитио [сульфосукцинимидилпропионат] (англ. 3,3'-dithiobis (sulfosuccin imidylpropionate)), кросс-линкер для активации поверхности и последующей иммобилизации молекулярных зондов;

EDС - 1-этил-3(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (англ

Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), кросс-линкер для активации

поверхности и последующей иммобилизации молекулярных зондов;

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В;

HCVcoreAg - нуклеокапсидный кор-антиген вируса гепатита С;

Ids - ток, протекающий между стоком и истоком;

Ids (Vg) - зависимость тока стока-истока (Ids) от напряжения (Vg);

NHS - N-гидроксисукциимид (англ. N-hydroxysuccinimide), кросс-линкер

активации поверхности и последующей иммобилизации молекулярных

зондов;

Vds - напряжение между стоком и истоком;

АПТЭС - аминопропилтриэтоксисилан (англ. 3-ammopropyltriethoxysilane, APTES), кремнийорганическое соединение для химической модификации поверхности нанопроволок; АФП - альфа-фетопротеин;

ВАХ - вольт-амперных характеристик нанопроволочных структур; ВГС - вирусный гепатит С; ДСН - додецилсульфат натрия; КФБ - калий-фосфатный буфер;

КНИ - «кремний на изоляторе», трёхслойная структура кремний-диэлектрик-кремний;

КФТ - калий-фталатный буфер;

НП-биосенсор (нанопроволочный биосенсор) - измерительная система, позволяющая проводить детекцию белков в режиме реального времени; КНИ-НП-чип (нанопроволочный чип) - основной структурный элемент КНИ-НП-биосенсора с интегрированной системой кремниевых нанопроволок; НП (нанопроволока) - сенсорный элемент (сенсор), расположеный на поверхности КНИ-НП-чипа и имеющий контактные сток-истоковые области на концах;

Режим реального времени (Ids(t)) - регистрация зависимости величины тока стока-истока (Ids) от времени (t).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Высокочувствительная детекция низкокопийных белков с использованием нанопроволочного биосенсора»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Разработка высокочувствительных систем, предназначенных для

обнаружения белков в растворах при низких концентрациях ( <10-15 М и ниже), является актуальным направлением современных биомедицинских исследований. Необходимость таких исследований обусловлена, прежде всего, потребностью в обнаружении низкокопийных биомаркеров заболеваний в биологических жидкостях. Выявление серологических белковых маркеров онкологических и инфекционных заболеваний на ранней бессимптомной стадии позволит в разы снизить случаи летальных исходов, повысить эффективность лекарственной терапии и качество жизни пациентов [1].

Современные протеомные методы позволили успешно инвентаризовать и охарактеризовать высококопийные (10-9 М и более) по содержанию белки в плазме крови, часть из которых нашли клиническое применение [2]. Однако теоретическая оценка глубины протеома указывает на то, что большая часть низко- (10-9-10-14 М) и ультранизкокопийных (10-15 М и ниже) белков в крови до сих пор не обнаружена [3], в первую очередь, вследствие ограничений по концентрационной чувствительности протеомных методов [4]. Эти ограничения приводят к тому, что в диагностической практике используется только часть потенциально значимых маркерных белков. Поэтому, актуальным является разработка новых высокочувствительных технологий для мониторинга состояния здоровья человека и ранней диагностики заболеваний, позволяющие регистрировать белки в диапазоне ультранизких концентраций [5].

Согласно оценкам ВОЗ, во всем мире хронической инфекцией гепатита С страдают 71 миллионов человек [6]. Вирусный гепатит С (ВГС) является важной проблемой здравоохранения, поскольку имеет широкую распространенность в популяции и способствует развитию острых и хронических поражений печени, таких как, острые гепатиты (20%),

хронические гепатиты (70%), декомпенсированный цирроз печени (40%), гепатоцеллюлярная карцинома (60%) [7, 8]. В целом, от заболеваний печени, связанных с гепатитом С, умирает примерно 400 000 человек ежегодно во всем мире [6, 7]. Заболеваемость хроническими вирусными гепатитами снижает качество жизни пациентов, усложняет выбор эффективной терапии, а также ведет к экономическому ущербу [8-10]. Важно отметить, что по разным оценкам, эффективность терапии гепатита С составляет в среднем 40-95% [1114].

Не менее удручающе выглядит статистика по онкологическим заболеваниям. Онкология является второй из основных причин смертности в мире. Так, в 2012 г. было выявлено около 14 млн. новых случаев [15], а в 2018 г. число летальных исходов от этого заболевания составило 9,6 млн. [16]. Онкологические заболевания являются причиной каждой шестой смерти в мире [17]. Значителен экономический ущерб от онкологических заболеваний, поскольку большая часть расходов по лечению и восстановлению пациентов ложится на государственные структуры [17]. Онкотерапия эффективна в 95% случаях, при выявлении патологии на ранних стадиях. Однако в подавляющем числе случаев больные обращаются за медицинской помощью на поздних стадиях развития заболевания в связи с отсутствием клинически доступных диагностикумов для ранней бессимптомной стадии онкопатологий [16].

К современным методам диагностики онкопатологий являются полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммуноферментный (ИФА), иммуногистохимический (ИГХ) и радиоиммунноый анализ (РИА) и протеомные масс-спектрометрические методы. Однако применение этих методов для ранней детекции биомаркеров ограничено вследствие их

п

недостаточной концентрационной чувствительности (на уровне 10- М -1014 М), специфичности и точности [18].

Существующие на сегодняшний день инструментальные методы

обследования и сопряженные с ними диагностические процедуры не являются

совершенными. Основными методами скрининга являются клинический

7

осмотр и биопсия. В последнее время также находит применение магнитно-резонансная томография [19]. Биопсия, с одной стороны, предоставляет возможность определения типов клеток, подверженных пролиферации, выявления гистологических особенностей, генетических повреждений и другие особенности, связанные с онкологией [20]. С другой стороны метод биопсийного исследования ограничен неопределенной интерпретацией результатов, а также является инвазивным методом, который вызывает дискомфорт у пациента [21].

Помимо этого, молекулярные клинические методы диагностики обладают рядом иных недостатков: длительное время выполнения анализа, высокая стоимость оборудования и расходных материалов, высокий уровень ложноположительных результатов вследствие нецелевой перекрестной чувствительности, и необходимость использования ферментных и флуоресцентных меток для повышения чувствительности. Уровень ложноположительных результатов достигает ~ 10-20% для диагностических систем для инфекционных заболеваний [22-25].

Поэтому, актуальной задачей является разработка высокочувствительных технологий для мониторинга состояния здоровья человека и ранней диагностики заболеваний, позволяющих регистрировать белки в диапазоне ультранизких концентраций (<10-15 М). К таким передовым технологиям относятся подходы, основанные на использовании чипов с наноразмерными сенсорными элементами (наночипы). Измерения с их использованием характеризуются высокой чувствительностью анализа, могут выполняться в режиме реального времени с небольшим количеством анализируемого биологического материала [5, 26, 27].

В данной работе был использован нанопроволочный биосенсор (НП-

биосенсор) с чипами, содержащими наноразмерные кремниевые

нанопроволоки (НП-чип). НП-биосенсор относится к молекулярным

детекторам, которые позволяют регистрировать отдельные биологические

макромолекулы в режиме их счета, что определяет высокую

концентрационную чувствительность анализа. Принцип работы такого биосенсора основан на регистрации тока, протекающего через нанопроволоку. Регистрируемая биологическая молекула при адсорбции на поверхность нанопроволоки меняет ее поверхностный потенциал. Таким образом, биомолекула является локальным «виртуальным» затвором, изменяющим проводимость нанопроволочных сенсорных элементов чипа.

Для биоспецифического анализа необходима функционализация нанопроволок. Наиболее популярна в медико-биологических исследованиях функционализация поверхности сенсорного элемента с использованием молекулярных зондов - антител или аптамеров. В случае такой функционализации на поверхности нанопроволоки за счет аффинного взаимодействия формируется комплекс антитело-антиген или аптамер-антиген. Это событие регистрируется электронной системой нанопроволочного биосенсора. Таким образом, НП-биосенсор позволяет выявлять целевой белок в биоматериале с высокой чувствительностью и, в перспективе, может использоваться для ранней диагностики широкого спектра заболеваний. Привлекательным является то, что в медицинской диагностике, такой биосенсор может быть использован для проведения мультиплексного анализа с высокой чувствительностью при использовании небольшого объема (5 мкл) биологической жидкости [27, 28].

В данной работе была продемонстрирована возможность высокочувствительного обнаружения белков с использованием чипов к НП-биосенсору, содержащих нанопроволоки на основе слоев «кремний-на-изоляторе» (КНИ) (КНИ-НП-биосенсор) и достигнута фемтомолярная чувствительность [5, 28, 29].

Целью настоящей работы стала разработка метода обнаружения белковых молекул в сыворотке крови с использованием чипов с нанопроволочными структурами «кремний-на-изоляторе».

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Разработка методики модификации поверхности чипа с целью формирования слоя силана с терминальными аминогруппами;

2. Разработка методики сенсибилизации поверхности чипа с помощью двух типов молекулярных зондов - антител и аптамеров;

3. Определение чувствительности обнаружения белков в буферных растворах, включая исследование зависимости чувствительности анализа от ширины нанопроволок;

4. Определение возможности обнаружения медицински значимых биомолекул в сыворотке крови на примере детекции поверхностного антигена вируса гепатита С (HCVcoreAg) и D-NFATc1.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность применения КНИ-НП-биосенсора, изготовленного по технологии «top-down» с использованием стандартной литографии (оптической и электронно-лучевой) и плазмохимического травления для регистрации белковых молекул в растворе при концентрации 10-14 М и менее в режиме реального времени без использования меток. В том числе впервые получены следующие результаты:

1. разработана методика функционализации поверхности нанопроволочных сенсоров на основе КНИ. Разработанная методика включает химическую модификацию и сенсибилизацию поверхности нанопроволок двумя типами молекулярных биоспецифических зондов - антителами и аптамерами;

2. работоспособность метода показана на примере детекции в буферном растворе биомаркеров инфекционных заболеваний - поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и кор-антигена вируса гепатита С (HCVcoreAg), и на примере детекции биомолекул, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний - альфа-фетопротеин (АФП) и белок D-NFATc1;

3. показана возможность регистрации белков при использовании аптамеров, иммобилизованных на поверхность нанопроволок в качестве молекулярных зондов;

4. достигнута концентрационная чувствительность анализа на уровне 10-14 М в случае обнаружения HBsAg и 10-15 М при обнаружении HCVcoreAg, АФП и D-NFATc1 в буферном растворе;

5. проведен анализ группы биологических образцов из 20 сывороток крови. Показана возможность обнаружения биомолекул HCVcoreAg в сыворотке крови с помощью КНИ-НП-чипов иммобилизованных аптамерами.

Теоретическая и практическая значимость работы

В результате проведенных исследований разработан метод детекции низкокопийных белков в буферных растворах и в образцах сыворотки крови с использованием КНИ-НП биосенсора. Показана высокая чувствительность анализа на уровне 10-15 М. Основным преимуществом разработанного метода для определения биологических молекул являются быстрота (15-20 мин), простота использования и возможность проведения анализа вне лабораторных условий. Полученные результаты исследований могут быть использованы при разработке аналитических систем для раннего выявления заболевания с продолжительным асимптоматическим периодом. Системы диагностики на основе КНИ-НП-биосенсора могут быть востребованы в фундаментальных исследованиях протеомики и метаболомики с целью обнаружения биомолекул и метаболитов в образцах биологического происхождения, а также в исследованиях, направленных на выявление новых маркеров патологических процессов. Следует подчеркнуть, что в работе были использованы КНИ-НП-чипы, технология изготовления которых ориентирована на масштабное производство. Таким образом, результаты работы могут быть в перспективе использованы для создания устройств, направленных на массовое использование, как в России, так и за рубежом.

Методология и методы диссертационного исследования

Объектами исследования являлись белковые молекулы, ассоциированные с развитием инфекционных и онкологических заболеваний. Теоретическую и методологическую основу диссертационной работы составляли сведения о физико-химических свойствах белков и аптамеров. Также, в работе использовали методы химической модификации поверхностей в комплексе с методами подготовки проб для биохимических анализов.

При анализе результатов применяли стандартные методы статистической обработки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В качестве биоспецифических молекулярных зондов иммобилизованных на поверхность нанопроволок могут быть использованы антитела и аптамеры.

2. Предел обнаружения биомолекул с помощью КНИ-НП-биосенсора достигает концентрационного уровня

10-15 М

в буферном растворе.

3. КНИ-НП-биосенсор может быть использован для обнаружения белков в сыворотке крови.

Степень достоверности и апробация результатов

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:

1. V Всероссийский с международным участием медико-биологический конгресс молодых ученых "Симбиоз-России 2012", г. Тверь, 2012 г.;

2. Научная конференция ИБМХ, г. Москва, 2013г.;

3. Международная научно-практическая конференция «Биотехнология и качество жизни», г. Москва, 2014 г.;

4. V Съезд биохимиков России, г. Сочи-Дагомыс, 2016;

5. XI Конференция и X Школа молодых ученых и специалистов по

актуальным проблемам физики, материаловедения, технологии и диагностики

12

кремния, нанометровых структур и приборов на его основе, КРЕМНИИ 2016, г. Новосибирск, 2016 г.;

6. IX Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2017», г. Москва, 2017 г.;

7. Международная научная конференция «Клиническая протеомика. Постгеномная медицина», г. Москва 2017 г.;

8. VI научная молодежная школа-конференция "Химия, физика, биология: пути интеграции", г. Москва 2018 г.;

9. 22-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2018 г.;

10. Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития. Науки о жизни», г. Москва 2018 г.;

11. Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития. Науки о жизни», г. Москва 2019 г.

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликована 21 работа: 10 статей в российских и международных научных изданиях, а также 11 материалов российских и международных научных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 132 страницы машинописного текста, 2 таблицы и 31 рисунок. Список литературы включает 169 источника.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Анализ методов высокочувствительного обнаружения белков

Детекция белков с высокой чувствительностью представляет собой важную биомедицинскую задачу. Это обусловлено тем, что большая часть в сыворотке крови человека составляют низкокопийные белки, присутствующие

15 18

в концентрационном диапазоне 10- М -10- М [2, 3]. Эти белки могут являтся потенциальными маркерами развития различных заболеваний человека.

По оценке Rissin и соавторов [30] предел концентрационной чувствительности диагностических систем для выявления онкологических [31] и вирусных заболеваний (ВИЧ и гепатит С) [32] должен быть на уровне 10-15 М и ниже. Однако, чувствительность используемых в настоящее время стандартных протеомных методов - масс-спектрометрических с использованием схемразделения на базе одномерного и двумерного

19 1 ^

электрофореза или жидкостной хроматографии составляет 10-12 М - 10-13 М [33]. Однако, для обнаружения низко- и ульранизкокопийных белков в биологическом иатериале такой концентрационной чувствительности может быть недостаточно. Поэтому, в последнее время были предприняты попытки повышения чувствительности масс-спектрометрических методов. Так, использование масс-спектрометрического метода селективного мониторинга множественных реакций (СРМ) для детекции целевых белков позволяет повысить предел чувствительности до 10-14 М до 10-15 М [34]. Научной группой Згоды В.Г. в 2013 году была предложена оригинальная процедура подготовки образцов для проведения масс-спектрометрических измерений методом СРМ путем необратимого фишинга белков на поверхность микрочастиц [35]. Это позволило авторам достичь чувствительности на уровне

-18 -15

10- М для детекции цитохрома СТР102 и на уровне 10- М для дете кции бычьего сывороточного альбумина.

Использование масс-спектрометрических методов зачастую связано с определенными трудностями, к числу которых относятся: (1) низкая эффективность ионизации белков или пептидов в зависимости от их физико-химических свойств, а также (2) проблема стандартизации процедуры интерпретации результатов измерений.

Другие подходы к высокочувствительной детекции белков основаны на использовании аналитических микро(нано)технологических систем. В традиционных аналитических наносистемах, как правило, используются методы концентрирования за счет фишинга белковых молекул из объема анализируемой пробы на поверхность сенсорных зон и методы на основе формирования микрополей, которые позволяют проводить детекцию белков с

12 13

чувствительностью ~10- М - 10- M [36]. Известны аналитические системы для детекции белков и с большей концентрационной чувствительностью [18]. Такие системы также основаны на селективном концентрировании белков путем фишинга с последующей их регистрацией на уровне единичных молекул в цифровом режиме счета [37-39]. В литературе можно условно выделить две схемы фишинга. При реализации первой схемы фишинг целевых белков проводится на ограниченной по площади поверхности микро(нано)частиц. Счет белков в этой схеме может производиться как в режиме прямой регистрации, без меток, при помощи молекулярных детекторов (то есть детекторов, регистрирующих единичные молекулы белков), так и с использованием различных меток для усиления сигнала от выловленных белков. Чувствительность детекции белков при использовании

этого типа схемы фишинга очень высока и достигает в настоящее время

18

10- М в режиме прямой детекции белков, что сравнимо с лучшими достижениями масс-спектрометрической детекции, а в случае использования

меток превышает предел масс-спектрометрической детекции на 1 -2 порядка и

20

составляет ~10- М как это было показано для С-реактивного белка [40].

Во второй схеме фишинга используется развитая поверхность

микро(нано)частиц, а регистрация сигнала от единичных белков проводится с

15

использованием селективных схем усиления сигнала. Использование второй схемы фишинга позволяет проводить детекцию белков с исключительно высокой чувствительностью. Так, с помощью механизма генерации сигнала в

комбинации с ферментативным ростом кристаллов простатический

20

специфический антиген был зарегистрирован при концентрации ~10-20 M [41]. Это указывает на большой потенциал использования микро(нано)размерных аналитических систем для детекции белков не только в субфемтомолярных

15 21

(<10-15 М), но и в субаттомолярных (<10- М) концентрациях, что важно для ранней диагностики. Ниже проводится анализ методов детекции белков с помощью микро(нано)размерных систем как в режиме прямой регистрации, так и с использованием меток. Описаны режимы цифровой регистрации и схемы их реализации.

1.1.1 Непрямые методы обнаружения белков

В этих методах регистрация выловленных молекул аналита осуществляется при помощи обычных детекторов с использованием промежуточных схем усиления сигнала от выловленных молекул, таких как использование реакции ферментативного катализа с наработкой продукта с характерным спектром поглащения использование других меток, например меченых наночастиц с большей поверхностью и т.д.

Одними из наиболее распространенных непрямых методов являются методы цифрового ИФА с использованием микрочастиц и иммуноанализа с использованием плазмонного резонанса на золотых частицах в растворе, которые обладают фемтомолярной чувствительностью.

Цифровой иммуноферментный анализ с использованием микрочастиц

Современными серологическими молекулярными методами диагностики

являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция

(ПЦР). ИФА - универсальный метод определения реакции взаимодействия

16

антиген - антитело [42]. Выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса «антиген-антитело» за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Чувствительность ИФА определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата и позволяет регистрировать малые количества антигена (нанограммы) в пробе [42].

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) широко используется в

протеомном анализе. Чувствительность стандартного метода ИФА с

12

использованием микрочастиц ~10- М [43]. Это концентрационное ограничение обусловлено тем, что в случае стандартного ИФА флуоресцирующие молекулы, генерируемые каждой молекулой фермента, диффундируют в объем исследуемого раствора (обычно 0,1 - 1 мл), и для получения флуоресцентного сигнала выше фонового шума необходимо высвобождение ~105 ферментных меток. Однако было показано, что чувствительность метода ИФА может быть существенно повышена в случае применения детекторов, позволяющих регистрировать отдельные флуоресцирующие молекулы. Так, научной группой Todd [44] для этого использовался детектор в режиме счета фотонов. В этой работе был реализован иммуноанализ с использованием магнитных микрочастиц для вылавливания белка. Авторы зарегистрировали белок тропонин I в плазме крови при его концентрации менее 10-15 М в 150 мкл пробы и времени инкубации 1 мин с использованием проточной микрокапиллярной системы и детектора в режиме счета фотонов. Авторы объясняют высокую чувствительность разработанного метода тем, что сконструированная ими система позволила отсечь фоновый шум, а также тем, что неспецифическое связывание с поверхностью микрочастиц было минимизировано.

В методе цифрового ИФА с использованием микрочастиц, разработанном

научной группой Rissin [30], был достигнут предел чувствительности 10-16 M

17

при использовании объема пробы менее 1 мл. В методе цифрового ИФА реализован принцип иммуноанализа, в котором первичные антитела иммобилизованы на поверхность микрочастиц [45]. Количество микрочастиц, вводимых в пробу, при этом должно превышать количество молекул аналита. После вылавливания аналита из раствора пробы микрочастицы с выловленными молекулами обрабатывались растворами вторичных антител и флуорофора. Далее микрочастицы подаются в матрицу с ячейками так, что каждая микрочастица попадала в отдельную ячейку объемом 50 фемтолитров, в которой и проводилась ферментативная реакция для регистрации и подсчета отдельных флуоресцирующих микрочастиц. Метод цифрового ИФА позволяет регистрировать белки, как в растворах аналита, так и в образцах биологического происхождения.

18

Также высокой чувствительности на уровне 10- М для стрептавидина, меченого ß-галактозидазой, удалось достигнуть научной группой Rissin [30]. Использование метода цифрового ИФА позволило зарегистрировать простатический специфический антиген (ПСА) при концентрации 10-15 М [45], а также фактор некроза опухоли -а и интерлейкин-6 в 200 мкл плазвы крови в концентрациях 10-16 М [46].

Повышение производительности и снижение времени инкубации достигаются в методе ИФА за счет использования большого количества активных микрочастиц (~105-106) в малом (100 мкл-1 мл) объем пробы.

Иммуноанализ с использованием плазмонного резонанса на золотых наночастицах в растворе

Использование метода плазмонного резонанса на золотых наночастицах в

коллоидном растворе описана в работе [47]. В работе [48] предложена схема

усиления сигнала за счет преципитации серебряных наночастиц в коллоидном

растворе золотых нанорезонаторов. В этой работе белок ПСА вылавливали на

поверхность золотых нанорезонаторов размером 60±8 нм, модифицированных

поликлональными антителами против ПСА. Выловленные из сыворотки крови

18

молекулы ПСА детектировали при помощи вторичных моноклональных анти -ПСА и вторичных антител, меченых глюкозооксидазой. Глюкозооксидаза вызывала образование в пробе Н2О2 и восстановление введенных в систему ионов серебра до металлического серебра, которое оседало на поверхности золотых нанорезонаторов. Это вызывало смещение максимума спектра

поглощения в синюю область, что и регистрировалось детектором. В этой

20

работе была достигнута концентрационная чувствительность на уровне 10- M для ПСА при использовании 1 мл пробы и времени инкубации пробы 2 ч.

В другой работе вылавливание целевого белка ПСА и капсид антигена ВИЧ - р24 из биоматериала проводили на поверхность лунок стандарного планшета, функционализированную моноклональными антителами против белков-мишеней [47]. В качестве вторичных антител использовали поликлональные антитела, к которым добавляли анти-антитела, меченые каталазой. После завершения реакции антген/антитело/вторичное антитело в планшеты вводили смесь растворов перекиси водорода, морфолиноэтансульфоновой кислоты и трихлорида золота для проведения колориметрической реакции. В случае отсутсвия в пробе белка-мишени раствор имел малиновую окраску из-за образования коллоидного раствора золотых наночастиц. В присутствии целевого белка происходило изменение цвета раствора с малинового на голубой, вследствие образования агрегатов золотых наночастиц при ускорении разложения перекиси водорода каталазой.

Для белков ПСА и р24 в образцах сыворотки крови объемом 100 мкл была

20

достигнута минимальная концентрация 4x10 М, при этом время инкубации пробы составило 1 ч.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мальсагова Кристина Ахмедовна, 2019 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Snyder M. HUPO-2011 10th world Congress, Oral Presentación OPO15 - full omics profiling reveal extensive dynamic changes during normal and disease states. 2011.

2. Anderson N.L. The clinical plasma proteome: a survey of clinical assays for proteins in plasma and serum // Clin. Chem. 2010. Vol. 56, № 2. Р. 177-185.

3. Лисица А.В., Пономаренко Е.А., Лохов П.Г., Арчаков А.И. Постгеномная медицина: альтернатива биомаркерам // Вестник РАМН. 2016. Т.71, №3. С. 255-260.

4. Liotta L.A, Petricoin E.F. 3rd. -Omics and cancer biomarkers: link to the biological truth or bear the consequences // Cancer Epidemiol. Biomarkers. Prev. 2012. Vol. 21, № 8. Р. 1229-1235.

5. Cho Il-H., Lee J., Kim J., Kang M., Paik J.K, Ku S., Cho H.-M., Irudayaraj J., Kim D.-H. Current Technologies of Electrochemical Immunosensors: Perspective on Signal Amplification // Sensors. 2018. Vol. 18. Р. 207.

6. ВОЗ. Информационный бюллетень №164. 2017.

7. Rodriguez-Lorenzo L., Naghavi M., Foreman K., Lim S., Shibuya K., Aboyans V., Abraham J., Adair T., Aggarwal R., Ahn S. Y. et. al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 // Lancet. 2012. Vol. 380. Р. 2095-2128.

8. Чернобровкина Т.Я., Литвинова О.С., Янковская Я.Д. TTV-инфекция: клинико-эпидемиологические и диагностические аспекты // Архивъ внутренней медицины. 2016. Т. 2, № 28. С. 28-33.

9. Ивашкин В.Т., Ющук Н.Д. Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2013. Т. 2. С. 3-32.

10. Вирусные гепатиты: клиники, диагностика, лечение / Ющук Н.Д., Климова Е.А., Знойко О.О., Кареткина Г.Н., Максимов С.Л., Маев И.В. - М.: «Гэотар Медиа», 2014. 160 с.

11. Сюткин В.Е., Андрейцева О.И., Чжао А.В. Изучение возможностей противовирусной терапии гепатита с трансплантата печени // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2011. Т. 13, № 1. С. 17-26.

12. Фазылов В. Х., Еналеева Д. Ш., Фазульзянова А. И., Гайфуллина Э. Г., Мангушева Я. Р. Эффективность противовирусной терапии хронического гепатита с: результаты десятилетнего исследования // Практическая медицина. 2011. Т. 51. С. 153-157.

13. Rong L., Dahari H., Ribeiro R.M., Perelson A.S. Rapid emergence of protease inhibitor resistance in hepatitis C virus // Sci. Transl. Med. 2010. Vol. 2. Р. 30ra2.

14. Sarrazin C. The importance of resistance to direct antiviral drugs in HCV infection in clinical practice // J. Hepat. 2016. Vol. 64. Р. 486-504.

15. Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D.M., Forman D., Bray F. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 // Int. J. Cancer. 2015. Vol. 136, №5, Р.359-386.

16. ВОЗ. Информационный бюллетень. 2018.

17. Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность) / Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. -М.: МНИОИ им. П.А. Герцена, 2017. 250 с.

18. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. 2007. Vol. 7, № 1. Р. 4-9.

19. Saisho H., Yamaguchi T. Diagnostic imaging for pancreatic cancer: computed tomography, magnetic resonance imaging, and positron emission tomography // Pancreas. 2004. Vol. 28. Р. 273-278.

20. Hu Y., Zuo P., Ye B.C. Label-free electrochemical impedance spectroscopy biosensor for direct detection of cancer cells based on the interaction between carbohydrate and lectin // Biosens. Bioelectron. 2013. Vol. 43. Р. 79-83.

21. Tamkovich S.N, Voitsitskii V.E, Laktionov P.P. Modern approach to breast cancer diagnostics // Biomed. Khim. 2014. Vol. 60, №2. Р.141-60.

22. Schröter M., Feucht H., Schäfer P., Zöllner B., Polywka S., Laufs R. Definition of false-positive reactions in screening for hepatitis C virus antibodies // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, № 1. Р. 233-234.

23. Москалец О.В., Машков А.Е., Друзюк Е.З., Бурдакова Ю.А., Щербина В.И., Манзенюк О.Ю. Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики инфекционной патологии в клинической практике // Педиатрия. 2006. Т. 85, № 5. С. 32-34.

24. Hernandez-Aguado I., Bolumar F., Moreno R., Pardo F.J., Torres N., Belda J., Espacio A. False-positive tests for syphilis associated with human immunodeficiency virus and hepatitis В virus infection among intravenous drug abusers // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998. Vol. 17, №2. Р. 784-787.

25. Sonmez E, Ozerol I.H, Senol M., et al. False-positive reaction between syphilis and hepatitis C infection // Isr. J. Med. Sci. 1997. Vol. 33, №2. Р. 724-727.

26. Noor M.S., Understanding quantum confinement in nanowires: basics, applications and possible laws // J. Phys.: Condens. Matter. 2014. Vol. 26, №42. Р. 423202.

27. Tran D.P., Pham Т.Т.Т., Wolfrum B., Offenhäusser A., Thierry B. CMOS-Compatible Silicon Nanowire Field-Effect Transistor Biosensor: Technology Development toward Commercialization // Materials. 2018. Vol. 11, № 5. Р. E785

28. Zheng G. F., Patolsky F., Cui Y., Wang W. U., Lieber C. M. Multiplexed

electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays // Nat.

Biotechnol. 2005. Vol. 23, №10. Р. 1294-1301.

116

29. He J., Zhu J., Gong Ch., Qi J., Han X., Jiang B., Zhao Y. Label-free direct detection of miRNAs with poly-silicon nanowire biosensors // PLoS ONE. 2018. Vol. 10, №12. P. e0145160

30. Rissin D.M, Kan C.W., Campbell T.G., Howes S.C., Fournier D.R., Song L., Piech T., Patel P.P., Chang L., Rivnak A.J., Ferrell E.P., Randall J.D., Provuncher G.K., Walt D.R., Duffy D.C. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations // Nature Biotech. 2010. Vol. 28. P. 595-599.

31. Dexlin-Melby L., Sandstrom A., Antberg L., Gunnarsson J., Hansson S.R., Borrebaeck C.A.K., Wingren Ch. Design of recombinant antibody microarrays for membrane protein profiling of cell lysates and tissue extracts // Proteomics. 2011. Vol. 11. P. 1550-1554.

32. Archakov A.I., Ivanov Yu.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins // Proteomics. 2009. Vol. 9. P. 1326-1343.

33. Ivanov Yu.D., Govorun V.M., Bykkov VA., Archakov A.I. Nanotechnologies in proteomics // Proteomics. 2006. Vol. 6. P. 1399-1414.

34. Forsgard N., Salehpour M., Possnert G. Accelerator mass spectrometry in the attomolar concentration range for 14 C-labeled biologically active compounds in complex matrixes // J. Anal. At. Spectrom. 2009, Vol. 25. P. 74-78.

35. Kopylov A.T., Zgoda V.G., Lisitsa A.V., Archakov A.I. Combined use of irreversible binding and MRM technology for low-and ultralow copy-number protein detection and quantitation // Proteomics. 2013. Vol. 13. P. 727-742.

36. Lian W., Wu D., Lim D.V., Jin S. Sensitive detection of multiplex toxins using antibody microarray // Anal. Biochem. 2010. Vol. 401. P. 271-279.

37. Malkin A.J., McPherson A., Gershon P.D. Structure of intracellular mature vaccinia virus visualized by in situ atomic force microscopy // J. Virol. 2003. Vol. 77. P. 6332-6340.

38. Huff J.L., Lynch M.P., Nettikadan S., Johnson J., Vengasandra S., Henderson E. Label-free protein and pathogen detection using the atomic force microscope // J. Biomol. Screening. 2004. Vol. 9. Р. 491-497.

39. Patolsky F., Zheng G, Hayden O., Lakadamyali M., Zhuang, X., Lieber C. M. Electrical detection of single viruses // PNAS. 2004. Vol. 101, № 39. Р. 1401714022.

40. Islam Md.Sh., Lee H.G., Choo J., Song J.M., Kang S.H. High sensitive detection of C-reactive protein by total internal reflection fluorescence microscopy on rapidly making nanoarray protein chip // Talanta. 2010. Vol. 81. Р. 1402-1408.

41. Rodriguez-Lorenzo L., de la Rica R., Alvarez-Puebla R.A., Liz-Marzan L.M., Stevens M.M. Plasmonic nanosensors with inverse sensitivity by means of enzyme-guided crystal growth // Nature Materials. 2012. Vol. 11. Р. 604-607.

42. Теория и практика иммуно-ферментного анализа / Егоров А.М., Осипов А.П. Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. - М: Высшая школа, 1991.

43. Siawaya D.J.F., Roberts T., Babb Ch., Black G., Golakai H.J., Stantey K., et al. An Evaluation of Commercial Fluorescent Bead-Based Luminex Cytokine Assays // PlosOne. 2008. Vol. 3. Р. e2535.

44. Todd J., Freese B., Lu A., Held D., Morey J., Livingston R., Goix P. Ultrasensitive flow-based immunoassays using single-molecule counting // Clin. Chem. 2007. Vol. 53. Р. 1990-1995.

45. Lepor H., Cheli D.C., Thiel R.P., Taneja S.S., Laze J., Chan D.W., Sokoll L.J., Mangold L., Partin A.W. Clinical evaluation of a novel method for the measurement of prostate-specific antigen, AccuPSA™, as a predictor of 5-year biochemical recurrence-free survival after radical prostatectomy: results of a pilot study // BJU Int. 2011. Vol. 109. Р. 1770-1775.

46. Song L., Hanlon D.W., Chang L., Provuncher G.K., Kan C.W., Campbell T.G., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor a and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease // J. Immunol. Methods. 2011. Vol. 372. P. 177-186.

47. de la Rica R., Stevens M.M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye // Nature Nanotech. 2012. Vol. 7. P. 821824.

48. Rodriguez-Lorenzo L., de la Rica R., Alvarez-Puebla R.A., Liz-Marzan L.M., Stevens M.M. Plasmonic nanosensors with inverse sensitivity by means of enzyme-guided crystal growth // Nat. Mater. 2012. Vol. 11, № 7. P. 604-607.

49. Malou N., Raoult D. Immuno-PCR: a promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens and antibodies // Trends Microbiol. 2011. Vol. 19. P. 295-302.

50. Sano T. et al. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates // Science. 1992. Vol. 258. P. 120-122.

51. Ruzicka V. et al. Immuno-PCR with a commercially available avidin system // Science. 1993. Vol. 260. P. 698-699.

52. Zhang Z. et al. Cellular immuno-PCR. Detection of a carbohydrate tumor marker // Am. J. Pathol. 1998. Vol. 152. P. 1427-1432.

53. Zhou H. et al. Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21. P. 6038-6039.

54. Adler M. et al. Detection of rotavirus from stool samples using a standardized immuno-PCR (Imperacer) method with end-point and real-time detection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. Vol. 333. P. 1289-1294.

55. Maia M. et al. Development of a two-site immuno-PCR assay for hepatitis B surface antigen. J. Virol. Meth. 1995. Vol. 52. P. 273-286.

56. Monjezi R. et al. Detection of hepatitis B virus core antigen by phage display mediated TaqMan real-time immuno-PCR. J. Virol. Meth. 2013. Vol. 187: 121-126.

57. Houpikian P., Raoult D. Diagnostic methods current best practices and guidelines for identification of difficult-to-culture pathogens in infective endocarditis. Infect. Dis. Clin. N. Am. 2002. Vol. 16. P. 377-392.

58. Ferreira J., Santos M.J.L., Rahman M.M., Brolo A.G., Gordon R., Sinton D.,

and Girotto E.M. Attomolar protein detection using in-hole surface plasmon

resonance // J. Am. Chem. Soc. 2009. Vol. 131. P. 436-437.

119

59. Guo L., Kim D.H. LSPR biomolecular assay with high sensitivity induced by aptamer-antigen-antibody sandwich complex // Biosens. Bioelectron. 2012, Vol. 31. P. 567-570.

60. Truong P.T., Cao C., Park S., Kim M., Sim S.J. Rational aspect ratio and suitable antibody coverage of gold nanorod for ultra-sensitive detection of a cancer biomarker // Lab Chip. 2011. Vol. 11. Р. 2591-2597.

61. Armani A., Kulkarni R.P., Fraser S.E., Flagan R.C., Vahala, K.J. Label-free, single-molecule detection with optical microcavities // Science. 2007. Vol. 317. P. 783-787.

62. Truong P.T., Kim B.W., Sim S.J. Rational aspect ratio and suitable antibody coverage of gold nanorod for ultra-sensitive detection of a cancer biomarker // Lab Chip. 2012. Vol. 12. Р. 1102-1109.

63. Atomic force microscopy: biomedical methods and applications / Braga P.C., Ricci D. - Methods in Molecular Biology, 2003. 242 р.

64. Иванов Ю.Д., Даничев В.В., Плешакова Т.О., Шумов И.Д., Зиборов В.С., Крохин Н.В., Загуменный М.Н., Устинов В.С., Смирнов Л.П., Широнин А.В., Арчаков А.И., Химический необратимый фишинг низкокопийных белков // Биомедицинская химия. 2014. Т. 60. № 1. С. 28-50.

65. Ivanov Yu.D., Pleshakova T., Маlsagovа К., Kozlov A., Kaysheva A., Kopylov A., Izotov A., Andreeva E., Kanashenko S., Usanov S., Archakov A. Highly sensitive protein detection by combination of atomic force microscopy fishing with charge generation and mass spectrometry analysis // FEBS J. 2014. Vol. 281, №20. Р. 4705-4717.

66. Ivanov Yu.D., Bukharina N.S., Pleshakova T.O., Frantsuzov P.A., Andreeva E.Yu., Kaysheva A.L., Zgoda V.G., Izotov A.A., Pavlova T.I., Ziborov V.S., Radko S.P., Moshkovskii S.A., Archakov A.I. Atomic force microscopy fishing and mass spectrometry identification of gp120 on immobilized aptamers // Int. J. Nanomedicine. 2014. Vol. 3, № 9. Р. 4659-4670.

67. Кульбачинский А.В. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням //

Успехи биологической химии. 2006. Vol. 46. Р. 193-224.

120

68. Bukharina N. S., Yu. D. Ivanov, T. O. Pleshakova, P. A. Frantsuzov, E. Yu. Andreeva, A. L. Kaysheva, A. A. Izotov, T. I. Pavlova, V. S. Ziborov, S. P. Radko, and A. I. Archakov. Atomic force microscopy fishing of gp120 on immobilized aptamers and its mass spectrometry identification // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2014. Vol. 8, № 2. P.115-124.

69. Gold L., Ayers D., Bertino J., Bock C., Bock A., Brody E.N., Carter J., Dalby A.B., Eaton B.E., Fitzwater T., Flather D., Forbes A., Foreman T., Fowler C., Gawande B., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery // PLoS ONE. 2010. Vol. 5. Р. e15004.

70. Кайшева А.Л., Иванов Ю.Д., Згода В.Г., Французов П.А., Плешакова Т.О., Крохин Н.В., Зиборов В.С., Арчаков А.И. Визуализация и идентификация вирусных частиц гепатита с при помощи атомно-силовой микроскопии, сопряженной с мс/мс анализом // Биомедицинская химия. 2010. Vol. 56, № 1. Р. 26-39.

71. Ivanov Yu.D., Kaysheva A.L., Frantsuzov P.A., Pleshakova T.O., Krohin N.V., Izotov A.A., Shumov I.D., Uchaikin V.F., Konev V.A., Ziborov V.S., Archakov A.I. Detection of hepatitis C virus core protein in serum by atomic force microscopy combined with mass spectrometry // Int. J. Nanomedicine. 2015. Vol. 25, № 10. Р. 1597-1608.

72. Casuso I., Khao J., Chami M., Paul-Gilloteaux P., Husain M., Duneau J.-P., Stahlberg H., Sturgis J.N., Scheuring S. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy // Nat. Nanotechnol. 2012. Vol. 7, № 8. Р. 525-529.

73. Kowalczyk S. W., Kapinos L., Blosser T. R., Magalhaes T., van Nies P., Lim R. Y. H., et al. Single-molecule transport across an individual biomimetic nuclear pore complex // Nature Nanotech. 2011. Vol. 6, №7. Р. 433-438.

74. Freedman K. J., BastianA. R., Chaiken I., Kim M. J. HIV detection: solidstate nanopore detection of protein complexes: applications in healthcare and protein kinetics // Small. 2013. Vol. 9, № 5. Р. 645-645.

75. Wei R., Gatterdam V., Wieneke R., Tampe R., Rant U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. // Nature Nanotech. 2012. Vol. 7. P. 257-263.

76. Stern E., Klemic J. F., Routenberg D. A., Wyrembak P. N., Turner-Evans D. B., Hamilton A. D., LaVan D. A., Fahmy T. M. Reed M. A. Label-free immunodetection with CMOS-compatible semiconducting nanowires // Nature. 2007. Vol. 445, № 7127. P. 519-522.

77. Ivanov Y. D., Pleshakova T. O., Kozlov A. F., Malsagova K. A., Krohin N. V., Shumyantseva V. V., Shumov I. D., Popov V. P., Naumova O. V., Fomin B. I., Nasimov D. A., Aseev A. L., Archakov A. I. SOI nanowire for the high-sensitive detection of HBsAg and a-fetoprotein // Lab Chip. 2012. Vol. 12, № 23. P. 51045111.

78. Zheng G., Patolsky F., Cui Yi, Wang W.U., Lieber C.M. Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays // Nature Biotech. 2005. Vol. 23. P. 1294-1301.

79. Pui T.S., Agarwal A., Feng Y., Tou Z. Q., Huang Y., Chen P. Ultra sensitive detection of cytokines with CMOS compartible silicon nanowire // Nanoscale. 2009. Vol. 1. P. 159-163.

80. Tian R., Regonda S., Gao J., Liu Y., Hu W. Ultrasensitive protein detection using lithographically defined Si multinanowire field effect transistors // Lab Chip. 2011. Vol. 11. P. 1952-1961.

81. Vu C.-C., Pan T.M., Wu C.-S., Yen L. C., Chuang C. K., Pang S. T., Yang Y. S., Ko F. H. Label-free Detection of Prostate Specific Antigen Using a Silicon Nanobelt Field-effect Transistor // Int. J. Electrochem. Sci. 2012. Vol. 7. P. 44324442.

82. Bergveld P. Development, Operation, and Application of Ion-Sensitive Field-Effect Transistor as a Tool for Electrophysiology // IEEE Trans. Biomedical. Engineering. 1972. Vol. 5. P. 342-351.

83. Patolsky F., Zheng G., Lieber C. M. Nanowire -Based Biosensors // Analyt.

Chem. 2006. Vol. 18, №13. P. 4261-4269.

122

84. Li Z., Rajendran B., Kamins T.I., Li X., Chen Y. and Williams R.S. Silicon nanowires for sequence-specific DNA sensing: device fabrication and simulation // Appl. Phys. A: Mater. Sci. Process. 2005. Vol. 80. Р. 1257-1260.

85. Naumova O.V., Fomin B.I, Nasimov D.A., Dudchenko N.V., Devyatova S.F., Zhanaev E.D., Popov V.P., Latyshev A.V., Aseev A.L., Ivanov Yu.D., Archakov A.I. SOI nanowires as sensors for charge detection // Semicond. Sci. Technol. 2010. Vol. 25. Р. 055004.

86. Cui Yi., Zhaohui Z., Deli W., Wang U., Charles W., Lieber С. M. High Performance Silicon Nanowire Field Effect Transistors // Nano Lett. 2003. Vol. 3, № 2. Р. 149-152.

87. Patolsky F., Timko B.P., Zheng G., Lieber C.M. Nanowire -Based Nanoelectronic Devices in the Life Sciences // MRS BULLETIN. 2007. Vol. 32. Р. 142-149.

88. Kamins T.I., Sharma S., Yasseri A.A., Straznicky Z. Li J. Metal-catalysed, bridging nanowires as vapour sensors and concept for their use in a sensor system // Nanotechnology. 2006. Vol. 17. Р. 291-297.

89. Кузнецов Е.В., Рыбачек Е.Н., Кузнецов А.Е. Подготовка поверхности кремниевых нанопроволочных сенсоров для биохимической диагностики // Инновационная экономика. 2010. Т. 4. С. 104-108.

90. Souteyrand E., Cloarec J.P., Martin J.R., Wilson C., Lawrence I., Mikkelsen S., Lawrence M.F. Direct detection of the hybridization of synthetic homooligomer DNA sequences by field effect // J. Phys. Chem. B. 1997. Vol. 101. Р. 2980-2985.

91. Naumova O.V., Fomin B.I., Malyarenko N.F., Popov V.P. Modification and characterization of the surface of SOI nanowire sensors // J. Nano R. 2012. Vol. 1819. Р. 139-147.

92. Organic Surface Modification of Silicon Nanowire-Based Sensor Devices / de Smet L.C.P.M., Ullien D., Mescher M. and Sudholter E. J. R. - Nanowires -Implementations and Applications, 2011.

93. Patolsky F., Zheng G.F. and Lieber C.M. Fabrication of silicon nanowire devices for ultrasensitive, label-free, real-time detection of biological and chemical species // Nature Protocols. 2006. Vol. 1, №4. P. 1711-1724.

94. Linford M.R., P. Fenter, P.M. Eisenberger and C.E.D. Chidsey. Alkyl monolayers on silicon prepared from 1-alkenes and hydrogen-terminated silicon // J. Am. Chem. Soc. 1995. Vol. 117, № 11. P. 3145-3155.

95. Stern E., Vacic A., Rajan N.K., Criscione J. M., Park J., Ilic B. R., Mooney D. J., Reed M.A., Fahmy T. M. Label-free biomarker detection from whole blood // Nat. Nanotechnol. 2010. Vol. 5. P. 138-142.

96. Yamada K., Yoshii S., Kumagai S., Fujiwara I., Nishio K., Okuda M., Matsukawa N., Yamashita I. High-Density and Highly Surface Selective Adsorption of Protein-Nanoparticle Complexes by Controlling Electrostatic InteractionJpn // J. Appl. Phys. 2006. Vol. 45. P. 4259-4264.

97. Bunimovich Y.L., Shin Y.S., Yeo W.S., Amori M., Kwong G., Heath J.R. Quantitative real-time measurements ofDNA hybridization with alkylated nonoxidized silicon nanowires in electrolyte solution // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128. P. 16323-16331.

98. Carrara S., Cavallini A., Maruyama Y., Charbon E., Giovanni D. M. A new ethylene glycol-silane monolayer for highly-specific DNA detection on Silicon Chips // Surface Sci. 2010. Vol. 604. P. 71-74.

99. Hakim M.M.A., Lombardinia M., Sun K., Giustiniano F.,Roach P. L., Davies D. E., Howarth P.. H., Planque M.R. R., Morgan H., Ashburn P. Thin Film Poly-crystalline Silicon Nanowire Biosensors // Nano Lett. 2012. Vol. 12. P. 1868 - 1872.

100. Marco M.P., Barcelo D. Environmental applications of analytical biosensors // Meas. Sci. Technol. 1996. Vol. 7. P. 1547-1562.

101. Xu F., Zhen G., Yu F., Kuennemann E., Textor M., Knol W. Combined Affinity and Catalytic Biosensor: In Situ Enzymatic Activity Monitoring of Surface-Bound Enzymes // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127, № 38. P. 13084 - 13085.

102. Xie M. Hu J., Long Y.-M., Zhang Z.-L., Xie H.-Y., Pang D.-W. Lectin-modified trifunctional nanobiosensors for mapping cell surface glycoconjugates // Biosens. Bioelectron. 2009. Vol. 24. Р. 1311-1317.

103. Ertl P., Mikkelsen S.R. Electrochemical biosensor array for the identification of microorganisms based on lectin-lipopolysaccharide recognition // Anal. Chem. 2001. Vol. 73, № 17. Р. 4241-4248.

104. Евдокимов Ю.М. Биосенсоры на основе одноцепочечных и двухцепочечных нуклеиновых кислот // Сенсорные системы. 1998. Т. 12, № 1. С. 5-21.

105. Campas M., Katakis I. DNA biochip arraying, detection and amplification strategies // Trends Anal. Chem. 2004. Vol. 23, № 1. Р. 49-62.

106. Yoon H., Lee, S. H., Kwon, O. S., Song, H. S., Oh, E. H., Park, T. H. Polypyrrole Jyongsik Jang Nanotubes Conjugated with Human Olfactory Receptors: High-Performance Transducers for FET-Type Bioelectronic Noses // Angew. Chem. Int. Ed. 2009. Vol. 48, № 15. Р. 2755-2758.

107. Лахин А.В. Тарантул В. З., Генинг Л. В. Аптамеры: проблемы, пути их решения и перспективы // Act. Natur. 2013. Vol. 5, № 4. С. 37-48.

108. Gold L., Ayers D., Bertino J., Bock Ch., Bock A., Brody E., N. et. al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery // PLoS One. 2010. Vol. 5, № 12. Р. e15004.

109. Zhao S, Yang W, Lai RY. A folding-based electrochemical aptasensor for detection of vascular endothelial growth factor in human whole blood // Biosens. Bioelectron. 2011. Vol. 26, № 5. Р. 2442-2447.

110. Иммобилизованные клетки и ферменты / под ред. Дж. Вудворда. М.: Мир, 1988. 215 с.

111. Jason J. D., Karl S. C., Azamian B. R., Bagshaw C. B., Green M. L. H Chemical and Biochemical Sensing with Modified Single Walled Carbon Nanotubes // CHEM-EUR J. 2003. Vol. 9. Р. 3732-3739.

112. Besteman K., Lee J.-O., Wiertz F. G. M, Heering H. A., Dekker C. Enzyme-Coated Carbon Nanotubes as Single-Molecule Biosensors // Nano Lett. 2003. Vol. 3, № 6. P. 727-730.

113. Cella L.N., Chen W., Myung N.V., Mulchandani A. Single-Walled Carbon Nanotube-Based Chemiresistive Affinity Biosensors for Small Molecules: Ultrasensitive Glucose Detection // Am. Chem. Soc. 2010. Vol. 132. P. 5024-5026.

114. Kim J.-H., Heller D. A., Jin H., Barone P. W., Song Ch., Zhang J., Trudel L.J., Wogan G. N., Tannenbaum S. R., Strano M. S. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection // Nature Chemistry. 2009. Vol. 1. P.473-481.

115. Wanekaya A.K., Chen W., Myung N.V., Mulchandani A. Nanowire-Based Electrochemical Biosensors // Electroanal. 2006. Vol. 18, № 6. P. 533-550.

116. Liu J.I. Growth of Si whishkers on Au/Si(111) substrate by gas source molecular beam epitaxy (MBE) // J. Cryst. Growth. 1999. Vol. 2000, № 1-2. P. 106-111.

117. Patel K.R., Tang H., Grever W.E., Ng K.Y.S., Xiang J., Keep R. F., Cao T., McAllister J.P. Evaluation of polymer and self-assembled monolayer-coated silicone surfaces to reduce neural cell growth // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 8. P. 1519-1526.

118. Park J.-W., Jun C.-H. Transition-Metal-Catalyzed Immobilization of Organic Functional Groups onto Solid Supports through Vinylsilane Coupling Reactions // Am. Chem. Soc. 2010. Vol. 132. P. 7268-7269.

119. Hahm J., Lieber C.M. Direct Ultrasensitive Electrical Detection of DNA and DNA Sequence Variations Using Nanowire Nanosensors // Nano Lett. 2004. Vol. 4, № 1. P. 51-54.

120. Li F. Chen W., Dong P., Zhang S. A simple strategy of probe DNA immobilization by diazotization-coupling on self-assembled 4-aminothiophenol for DNA electrochemical biosensor // Biosens. Bioelectron. 2009. Vol. 24. P. 2160.

121. Jordan B.J., Hong R., Gider B., Hill J., Emrick T., Rotello V.M. Stabilization of a-chymotrypsin at air-water interface through surface binding to gold nanoparticle scaffolds. // Soft Matter. 2006. Vol. 2. P. 558-560.

122. Lee M.-H., Lee D.-H., Jung S.-W., Lee K.N., Park Y.S., Seong W.K. Measurements of serum C-reactive protein levels in patients with gastric cancer and quantification using silicon nanowire arrays // Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2010. Vol. 6. P. 78-83.

123. Lin S.P, Pan C.Y, Tseng K.C, Lin M.C, Chen C.D, Tsai C.C, Yu S.H, Sun Y.C, Lin T.W and Chen Y.T. A reversible surface functionalized nanowire transistor to study protein-protein interactions // Nano Today. 2009. Vol. 4. P. 235243.

124. Carrara S, Sacchetto D., Doucey, M.-A. et al. Memristive-biosensors: a new detection method by using nanofabrication memristors // Sensor actuat b-chem. 2012. Vol. 171-172. P. 449-457.

125. Shalev G., Rosenwaks Y., Levy I. The interplay between pH sensitivity and label-free protein detection in immunologically modified nano-scaled field-effect transistor // Biosens. Bioelectron. Vol. 31. P. 510-515.

126. Gong JR. Label-free attomolar detection of proteins using integrated nanoelectronic and electrokinetic devices // Small. 2010. Vol. 6, № 8. P. 967-973.

127. Liu Y., Guo Q., Shuqiang W., Hu W. Electrokinetic effects on detection time of nanowire biosensor // Applied. Physics. Letters. Vol. 100, № 20122. P. 1535021-153502-4.

128. Lee M.-H., Lee K.-N. Quantitative measurements of C-reactive protein using silicon nanowire arrays // Int. J. Nanomed. 2008. Vol. 3. P. 117-124.

129. Kim K., Lee H., Yang J., Jo M., Hahn S. The fabrication, characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors // Nanotechnology. 2009. Vol. 20. P. 235501.

130. http://www.somalogic.com

131. Zhang G.-J., Chai K.T.C., Luo H.Z.H., Huang J.M., Tay I.G., Lim A.E., Je M. Multiplexed detection of cardiac biomarkers in serum with nanowire arrays using readout ASIC // Biosens. Bioelectron. 2012. Vol. 35. Р. 218-223.

132. Rackauskas S., Shandakov S.D., Jiang. H., Wagner. J. B., Nasibulin A.G. Direct observation of nanowire growth and decomposition // Sci. Rep. 2017. Vol. 7, № 1. Р. 12310.

133. Mironov S.V., Mel'nikov A.S., Buzdin A I. Double Path Interference and Magnetic Oscillations in Cooper Pair Transport through a Single Nanowire // PRL. Vol. 114, № 22. Р. 227001(5).

134. Georgobiani V.A., Gonchar K.A., Zvereva E.A., Osminkina L.A. Porous Silicon Nanowire Arrays for Reversible Optical Gas Sensing. // Phys Status Solidi A. 2017. Vol. 215. Р. 1700565.

135. Попов В.П., Антонова И.В., Французов А.А., Наумова О.В., Сапожникова Н.В. Кремний-на-изоляторе: материал и приборные структуры // Микросистемная техника. 2008. Т. 10. С.8.

136. Попов В.П., Антонова А.И., Французов А.А., Сафронов Л.Н., Феофанов Г.Н., Наумова О.В., Киланов Д.В. Свойства структур и приборов на кремний-на-изоляторе // Физика и техника полупроводников. 2001. Т. 35, № 9. С. 10751083.

137. Тысченко И.Е., Попов В.П. Структуры кремний-на-изоляторе с азотированным захороненным слоем SiO2: метод создания и свойства // Физика и техника полупроводников. 2011. Т. 45, №. 3. С. 335-342.

138. Presnov D.E., Amitonov S.V., Krutitskii P.A, Kolybasova V.V., Devyatov I.A., Krupenin V.A., Soloviev I.I. A highly pH-sensitive nanowire field-effect transistor based on silicon on insulator // Beilstein J. Nanotechnol. 2013. Vol. 4. Р. 330-335.

139. Dmitrienko E., Naumova O., Fomin B., Kupryushkin M., Volkova A.,

Amirkhanov N., Semenov D., Pyshnaya I., Pyshnyi D. Surface modification of SOI-

FET sensors for label-free and specific detection of short RNA analyte //

Nanomedicine. 2016. Vol. 11, № 16. Р. 2073-2082.

128

140. Ivanov Yu.D., Malsagova K.A., Pleshakova T.O., Galiullin R.A., Kozlov A.F., Shumov I.D., Ivanova I.A., Archakov A.I., Popov V.P., Latyshev A.V., Rudenko K.V., Glukhov A.V. Ultrasensitive Detection of 2,4-Dinitrophenol Using Nanowire Biosensor // Journal of Nanotechnology. 2018. Vol. 1. P. 9549853.

141. Karpova E.V., Karyakina E.E., Karyakin A.A. Communication - Accessing Stability of Oxidase-Based Biosensors via Stabilizing the Advanced H2O2 Transducer // J. Electrochem. Soc. 2017. Vol. 164, № 5, P. 3056-3058.

142. SOI-Nanowire Biosensors for High-Sensitivity Protein and Gene Detection / Nazarov A., Balestra F., Kilchytska V., Flandre D. Functional Nanomaterials and Devices for Electronics, Sensors and Energy Harvesting. 2014. 446-467 pp.

143. Shi Sh., Yu X., Gao Y., Xue B., Wu X., Wang X., Yang D., Zhua H. Inhibition of Hepatitis C Virus Production by Aptamers against the Core Protein // J. Virol. 2014. Vol. 88, №4. P. 1990-1999.

144. Jolma A., Kivioja T., Toivonen J., Cheng L., Wei G., Enge M., Taipale M., Vaquerizas J.M., Yan J., Sillanpää M.J., Bonke M., Palin K., Talukder S., Hughes T.R., Luscombe N.M., Ukkonen E., Taipale J. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities // Genome Res. 2010. Vol. 20, №6: P. 861-873.

145. http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5991-3207EN.pdf

146. Stern E., Wagner R., Sigworth F. J., Breaker R., Fahmy T. M., Reed M. A. Importance of the Debye screening length on nanowire field effect transistor sensors // Nano Lett. 2007. Vol. 7. P. 3405-3409.

147. Laborde C., Pittino F., Verhoeven H.A., Lemay S.G., Selmi L., Jongsma M.A., Widdershoven F. P. Real-time imaging of microparticles and living cells with CMOS nanocapacitor arrays // Nat Nanotechnol. 2015. Vol. 10, № 9. P. 791-795.

148. Knopfmacher O., Tarasov A., Fu W., Wipf M., Niesen B., Calame M., Schqnenberger C. Nernst limit in dual-gated Si-nanowire FET sensors // Nano Lett. 2010. Vol. 10, № 6. P. 2268-2274.

149. Honda N., Lindberg U., Andersson P., Hoffmann S. and Takey H. Simultaneous multiple immunoassays in a compact disc-shaped microfluidic device based on centrifugal force // Clin. Chem. 2005. Vol. 51, № 11. Р. 1955-1961.

150. Mаlsagovа К.А., Ivanov Y.D., Pleshakova T.O., Kaysheva A.L., Shumov I.D., Kozlov A.F., Archakov A.I., Popov V.P., Fomin B.I., Latyshev A.V., A SOI-nanowire biosensor for the multiple detection of D-NFATc1 protein in the serum // Anal. Meth. 2015. Vol. 7, № 19. Р. 8078-8085.

151. Падучева С. В. Диагностическое значение альфа-фетопротеина в прогрессировании циррозов печени разной этиологии // Пермский медицинский журнал. 2016. Т. 33, №. 5. С. 5-8.

152. Saito S., Ojima H., Ichikawa H., Hirohashi S., Kondo T. Molecular background of alpha-fetoprotein in liver cancer cells as revealed by global RNA expression analysis // Cancer Sci. 2008. Vol. 99, №12. Р. 2402-2409.

153. Carlini P., Ferranti P., Polizio F., Ciriolo M.R., Rotilio G. Purification and characterization of Alpha-Fetoprotein from the human hepatoblastoma HepG2 cell line in serum-free medium // BioMetals. 2007. Vol. 20, №6. Р. 869-878.

154. Carter D. C., Ho J. X. Structure of Serum Albumin // Protein Chem. 1994. Vol. 45. Р. 153-203.

155. Zhao Q, Wang X, Liu Y, He A, Jia R. NFATc1: functions in osteoclasts // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2010. Vol. 42, № 5. Р. 576-579.

156. Arron J.R., Winslow M.M., Polleri A. et al. NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21 // Nature. 2006. Vol. 441. Р. 595-600.

157. Gwack Y., Sharma S., Nardone J. et al. A genome-wide Drosophila RNAi screen identifies DYRK-family kinases as regulators of NFAT // Nature. 2006. Vol. 441. Р. 582-583.

158. Gallois A, Mazzorana M, Vacher J, Jurdic P. Osteoimmunology: an integrated vision of immune and bone systems // Med Sci (Paris). 2009. Vol. 25, №3. Р.259-265.

159. Yiu G. K., Kaunisto A., Chin Y. R. and Toker A. NFAT promotes carcinoma invasive migration through glypican- 6 // Biochem. J. 2001. Vol. 440. Р. 157-166.

160. Мальсагова К.А., Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Козлов А.Ф., Крохин Н.В., Кайшева А.Л., Шумов И.Д., Попов В.П., Наумова О.В., Фомин Б.И., Насимов Д. А. КНИ-нанопроволочный биосенсор для детекции белка D-NFAT 1 // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61, № 4. Р. 462-467.

161. Ivanov Yu.D, Kozlov A.F., Galiullin R.A., Kanashenko S.L., Usanov S.A., Ivanova N.D., Ziborov V.S., Pleshakova T.O. Spontaneous generation of charge in the flow-based AFM fishing system // J. Electrostatics. 2018. Vol. 91. Р. 16-20.

162. Hadziyannis E., Minopetrou M., Georgiou A., Spanou and F. Koskinas J. Is HCV core antigen a reliable marker of viral load? An evaluation of HCV core antigen automated immunoassay // Ann. Gastroenterol. 2013, Vol. 26. Р. 146-149.

163. Soliman H. A., Hozayen W. G., Mahmoud A. M., Abo- Seif M. A. and Fayed N. A., Signi cance of the hepatitis C virus core antigen testing as an alternative marker for hepatitis diagnosis in Egyptian patients // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2015. Vol. 19. Р. 2240-2245.

164. Buket C.A, Ay§e A., Sel?uk K., Suleyman O., Emel S.Q. Comparison of HCV core antigen and anti-HCV with HCV RNA results // Afr. Health Sci. 2014. Vol. 14. Р. 816-820.

165. Morota K., Fujinami R., Kinukawa H., Machida T., Ohno K., Saegusa H., Takeda K. A new sensitive and automated chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of hepatitis C virus core antigen // J. Virol. Methods. 2009. Vol. 157, № 1. Р. 8-14.

166. Pham B.N, Martinot-Peignoux M., Ripault M.P., Boyer N., Levy V., Marcellin P. Quantitative measurement of hepatitis C virus core antigen is affected by the presence of cryoglobulins // Clin. Exp. Immunol. 2006. Vol. 146, № 2. Р. 211-217.

167. Мальсагова К.А., Плешакова Т.О., Галиуллин Р.А., Шумов И.Д.,

Ильницкий М.А., Глухов А.В., Попов В.П., Асеев А.Л., Конев В.А., Учайкин

В.Ф., Арчаков А.И., Иванов Ю.Д. Нанопроводный биосенсор p-типа с

131

иммобилизованными антителами для высокочувствительной регистрации молекул HCVcoreAg - белкового маркера вирусного гепатита С // Патогенез. 2017. Т. 15, № 3. С. 50-57.

168. Maillard P., Lavergne J.P., Siberil S., Faure G., Roohvand F., Petres S., Teillaud J.L., Budkowska A. Fcgamma receptor-like activity of hepatitis C virus core protein // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, №4. Р. 2430-2437.

169. Lee S., Kim Y.S, Jo M., Jin M., Lee D.K., Kim S. Chip-based detection of hepatitis C virus using RNA aptamers that specifically bind to HCV core antigen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. Vol. 358, № 1. Р. 47-52.