Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Дышловой, Сергей Анатольевич

• Дышловой, Сергей Анатольевич
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Дышловой, Сергей Анатольевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Морской алкалоид ааптамин и его аналоги. Особенности их химического строения, биологическая активность. Клеточные культуры и некоторые методы, примененные для изучения биологической активности.

2.1. Химическая структура и биологическая активность ранее выделенных аналогов ааптамина.

2.1.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из природных источников

2.1.2. Попытки использовать ааптамин в качестве таксономического маркера губок семейства виЬегШёае.

2.1.3. Возможное бактериальное происхождение ааптаминовых алкалоидов.

2.1.4. Биологическая активность ааптаминовых алкалоидов.

2.1.4.1. Влияние на активность ферментов.

2.1.4.2. Противовирусная активность.

2.1.4.3. Противомикробная активность.

2.1.4.4. Цитотоксическая активность.

2.1.4.5. Антагонистическая по отношению к а-адренорецепторам и гипотензивная активности.

2.1.4.6. Противообрастательная активность.

2.1.4.7. Мутагенная активность.

2.1.4.8. Ингибирование КМБА-рецептора.

2.1.4.9. Ингибирование активности протеасом.

2.1.4.10. Антидепрессантная активность.

2.1.4.11. Антиоксидантная активность.

2.2. Клеточные культуры и некоторые методы, применённые для изучения биологической активности ааптаминовых алкалоидов.

2.2.1. ХВ6 Р+ С141 клетки как модель для изучения канцерпревентивных веществ.

2.2.2. Опухолевые половые клетки.

2.2.2.1. Аберрантное развитие и опухоли половых клеток.

2.2.2.2. Клеточные линии 1ЧТ2 и 1ЧТ2-Ы.

2.2.2.3. Лечение тестикулярной карциномы на основе применения цисплатина.

2.2.3. Протеомика и методы, в ней применяемые.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых алкалоидов.

3.2. Изучение биологической активности выделенных алкалоидов ааптаминового ряда.

3.2.1. Цитотоксическая активность.

3.2.2. Канцерпревентивная активность ааптаминовых алкалоидов.

3.2.3. Влияние исследуемых алкалоидов на фосфорилирование МАРК ЕМСв.

3.2.4. Исследование влияния алкалоидов ааптаминового ряда на АР-1-, ^кВ- и р53-зависимую транскрипционную активность.

3.2.5. Исследование влияния ааптамина на ]ЧТ2 опухолевые клетки человека.

3.2.5.1. Влияние ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность ]ЧТ2 опухолевых клеток человека.

3.2.5.2. Исследование про-апоптотической активности ааптамина.

3.2.5.3. Исследование влияния ааптамина на клеточный цикл в 1ЧТ2 клетках.

3.2.5.4. Выявление белков, регулируемых под действием нецитотоксических концентраций ааптамина в ]\Т2 клетках.

3.2.5.5. Исследование белков, регулируемых под действием ааптамина в ]\Т2 клетках.

3.2.5.5.1. Анализ экспрессии соответствующих генов.

3.2.5.5.2. Анализ экспрессии белков методами Вестерн-блоттинга и 2Б-Вестерн-блоттинга.

3.2.5.5.3. Исследование изменений, происходящих с белком eIF5A

3.2.5.5.3.1. Доказательство увеличения экспрессии гипузинированной формы белка eIF5A под действием ааптамина на NT2 клетки.

3.2.5.5.3.2. Эксперимент по включению 3Н-спермидина.

3.2.5.5.3.3. Исследование влияния ааптамина на уровень содержания ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках.

3.2.5.5.3.4. Исследование влияния ааптамина на активность фермента DHS in vitro.

3.2.5.5.3.5. Исследование влияния сверхэкспрессии деоксигипузин синтазы (DHS) на скорость роста NT2 клеток

3.2.5.5.3.6. Исследование эффекта ингибитора протеасом MG-132 на процесс гипузинирования белка eIF5A в NT2 клетках

3.2.5.6. Обсуждение результатов исследования белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках.

3.2.6. Механизмы канцерпревентивного и цитотоксического действия ааптамина.

3.2.7. Исследование действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R).

3.2.7.1. Сравнение действия ааптаминовых алкалоидов на чувствительные (NT2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R).

3.2.7.2. Изучение индукции апоптоза ааптамином, деметилоксиааптамином и изоааптамином в NT2-R клетках.

3.2.7.3. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием ааптамина.

3.2.7.4. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием деметилоксиааптамина.

3.2.7.5. Белки, регулируемые в 1ЧТ2-К клетках под действием изоааптамина.

3.2.7.6. Обсуждение результатов экспериментов по действию ааптаминовых алкалоидов на чувствительные (1ЧТ2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (№Г2-К).

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Приборы и материалы.

4.1.1. Приборы.

4.1.2. Реагенты.

4.1.3. Клеточные культуры.

4.1.4. Биологический материал.

4.2. Стандартные методики для определения биологической активности веществ.

4.2.1. Определение цитотоксической активности веществ (МТ8!-метод)

4.2.2. Определение способности веществ влиять на пролиферацию клеток (метод трипанового синего).

4.2.3. Определение канцерпревентивной активности веществ.

4.2.4. Люциферазный метод определения АР-1-, ОТкВ- и р53-зависимой транскрипционной активности.

4.2.5. Приготовление белковых экстрактов для Вестерн-блоттинга, 2ТУ-Вестерн-блоттинга и 2Б-РАСЕ.

4.2.6. Определение концентрации белка в экстрактах (метод Бредфорда)

4.2.7. Вестерн-блоттинг.

4.2.8. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2Б-РАСЕ)

4.2.9. Анализ рисунков 2Б-гелей.

4.2.10. Идентификация белков методом масс-спектрометрии.

4.2.11. Двумерный Вестерн-блоттинг (2В-Вестерн-блоттинг).

4.2.12. Метод полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

4.2.12.1. Выделение РНК.

4.2.12.2. Обратная транскрипция (приготовление кДНК).

4.2.12.3. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР).

4.2.13. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

4.2.14. Полимеразно-цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ).

4.2.15. Метод проточной цитометрии для исследования способности веществ индуцировать апоптоз.

4.2.16. Метод проточной цитометрии для исследования влияния веществ на клеточный цикл.

4.2.17. Эксперимент по включению 3Н-спермидина.

4.2.18. Исследование влияния вещества на активность фермента DHS in vitro.

4.2.18.1. Выделение фермента DHS и белка eIF5A.

4.2.18.2. Измерение уровня активности фермента DHS in vitro.

4.2.19. Сверхэкспрессия деоксигипузин синтазы (DHS).

4.2.20. Построение карт белок-белковых взаимодействий.

4.2.21. Статистическая обработка полученных результатов.

4.3. Поиск и выделение ааптамина и его производных.

4.3.1. Скрининг губок.

4.3.2. Выделение ааптаминовых алкалоидов.

4.3.2.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.l

4.3.2.2. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.

4.4. Восстановление 3-(Л^-морфолинил)-9-деметилоксиааптамина (44).

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp.»

Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году онкологические заболевания стали основной причиной смертности в мире, обогнав по количеству летальных случаев сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий по поиску и разработке новых противоопухолевых препаратов следует признать, что на настоящий момент лечение этих заболеваний все еще остается весьма проблематичным. Поэтому поиск и исследование новых противоопухолевых препаратов по-прежнему является актуальной проблемой современной науки.

Известно, что около 50% всех имеющихся лекарственных препаратов было создано на основе природных соединений. Это связано с тем, что природные биологически-активные соединения нередко являются очень активными и малотоксичными. Следует отметить, биологически активные природные соединения были эволюционно отобраны и являются хорошими моделями для дальнейших синтетических модификаций. Как правило, биологически-активные природные соединения являются низкомолекулярными веществами, которые в большинстве своём относятся к так называемым вторичным метаболитам. Вторичные метаболиты образуются из таких широко распространённых предшественников, участвующих в первичном метаболизме, как глюкоза, аминокислоты, уксусная кислота, часто эти метаболиты являются специфичными для отдельных таксонов, а иногда и для отдельных видов или штаммов. Вторичные метаболиты разнообразны как по своему химическому строению, так и по их биологической функции.

Известно, что биохимия вторичного обмена морских организмов существенно отличается от процессов, происходящих в наземных организмах. За последние 25 лет из морских гидробионтов были выделены около 20000 морских природных соединений, несколько десятков из них находятся на различных стадиях клинических испытаний в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов. Первыми из этих соединений, введёнными в клиническую практику, стали противоопухолевые препараты «ara-A» или «видарабин» и «ara-С» или «цитарабин», разработанные на основе необычных, содержащих арабинозу нуклеозидных метаболитов из губки Cryptotethia crypta. В 2007 году для лечения некоторых видов опухолей был разрешён препарат «трабектидин» (джонделис), разработанный на основе алкалоида эктеинасцидина-743 (ЕТ-743), выделенного из асцидии Ecteinascidia turbinata. Недавно еще один противоопухолевый препарат нового поколения «эребулин мезилат» на основе макролидов морских губок был разрешен к производству и применению в США и странах Европы. В настоящее время на различных стадиях клинических испытаний находятся противоопухолевые препараты, созданные на основе таких морских природных соединений как халихондрины, бриостатины, гемиастерлин, дискодермолид, спонгистатин, аплидин, салиноспорамид А и др.

Наиболее богатым источником морских биологически активных соединений продолжают оставаться морские губки. Данный факт связывают с «неподвижным» образом жизни этих животных и, как следствие, необходимостью вырабатывать защитные химические вещества, которые могут не только играть определённую экологическую и физиологическую роль, но и выполнять различные другие биологические функции. Губки и асцидии являются богатым источником азот-содержащих соединений, морских алкалоидов. Эти соединения способны влиять на клеточный цикл, взаимодействовать с ферментами и другими мишенями, и являются перспективными в качестве антибактериальных, антикоагулянтных, противовирусных, противогрибковых, противовоспалительных, а также противоопухолевых агентов.

Таким образом, поиск и выделение вторичных метаболитов морских губок, исследование Pix химических структур, а также молекулярных механизмов биологического действия является актуальным с точки зрения получения новых веществ с уникальной активностью, в том числе противоопухолевой.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было выделение, установление структуры, а также изучение противоопухолевой активности и некоторых аспектов молекулярного механизма действия ааптаминовых алкалоидов из морской губки Aaptos sp. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать схемы и провести выделение в индивидуальном виде ааптаминовых алкалоидов, ответственных за противоопухолевую активность экстракта губки Aaptos sp.;

2. Установить строение выделенных соединений;

3. Исследовать канцерпревентивную, цитотоксическую и цитостатическую противоопухолевую активность выделенных алкалоидов, а также возможные механизмы этой активности;

4. С помощью методов протеомики и молекулярной биологии исследовать влияние выделенных алкалоидов на протеом опухолевых клеток человека и экспрессию некоторых генов;

Научная новизна и практическая ценность работы. Из губки Aaptos sp. выделено 4 новых алкалоида ааптаминового ряда. Изучены ЯМР- и масс-спектры новых соединений, а также их некоторые химические свойства. Впервые выявлена сильная канцерпревентивная активность соединений этого ряда. Получены новые ценные данные о противоопухолевой активности ааптаминовых алкалоидов in vitro, в частности, их про-апоптотической активности, влиянии на клеточный цикл и транскрипционную активность некоторых ядерных факторов. Исследование протеома клеток, обработанных аапаминовыми алкалоидами, выявило некоторые уникальные изменения в белковом составе этих клеток. В частности, в обработанных ааптамином NT2 и NT2-R клетках была зафиксирована активация эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1 (eIF5A), подобный эффект никогда ранее не наблюдался при действии низкомолекулярных веществ на клетки. Впервые были охарактеризованы некоторые особенности механизма действия ааптаминовых алкалоидов. Всё это создаёт основу для дальнейших исследований веществ этого типа как потенциальных хемопревентивных и терапевтических противоопухолевых препаратов.

Публикация результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в журналах «Journal of Proteome Research», «Annals of Oncology», «Natural Products Communications». По результатам исследования получен патент РФ. Результаты работы представлены на международных симпозиумах «Targeted Anticancer Therapies-2012» в 2012 г., Амстердам, Нидерланды, и «Targeted Anticancer Therapies-2011» в 2011 г., Париж, Франция; на Второй международной российско-корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» в 2010 г., Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г., Ханой, Вьетнам; на XII Всероссийской молодёжной школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2009 г., Владивосток, Россия; на Конференции студентов и аспирантов ДВГУ, 2009 г., Владивосток, Россия; на Первом дальневосточном международном симпозиуме, посвященном наукам о жив «Life Science», 2008 г., Владивосток, Россия; на X Международной молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2007 г., Владивосток, Россия.

Всего автором опубликовано 27 работ - 9 научных статей, 1 патент и 17 тезисов докладов. Из них по теме диссертации 13 работ, в том числе 3 научных статьи, 1 патент РФ и 9 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит шести глав: введения, литературного обзора, посвящённого химическому разнообразию и биологической активности ааптаминовых алкалоидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающий 144 цитируемых работы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 35 рисунков и 14 таблиц.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н. Фёдорову С.Н. Автор благодарит также к.х.н. Шубину JI.K. за неоценимый вклад в химическую часть настоящего исследования; академика Стоника В.А. и д.х.н. Макарьеву Т.Н. - за ценные консультации; м.н.с. Кузьмич A.C. и н.с. Радченко О.С. - за помощь в проведении ряда экспериментов; д.х.н. Калиновского А.И. и к.х.н. Дмитренка П.С. - за получение и помощь в обработке спектральных данных; н.с. Красохина В.Б. - за определение видовой принадлежности изученных морских организмов; к.х.н. Ермакову С.П. за ряд советов по организации биологической части исследования и чл.-корр. РАН

Васьковского В.Е. - за помощь в работе с научной литературой и сборе информации. Автор также выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия): доктору Хонекеру и профессору Букамаеру за предоставление возможности работы в лаборатории Экспериментальной онкологии Университетской клиники Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия); доктору Балабанову, доктору Зиверту, доктору Фенц, доктору Крепстакиесу, доктору Пройскасу, а также Ине Нетц, Кристине Якобсен и Тине Рольфинг за обучение методикам и помощь в проведении ряда биологических экспериментов, а также анализе результатов.

Перечень используемых сокращений и обозначений Спектроскопия

ID NOE - ядерный эффект Оверхаузера; метод выявляет межпространственное взаимодействие протонов

COSY - корреляционная спектроскопия (correlation spectroscopy); метод выявляет взаимодействие ядер одного типа, отделённых друг от друга не более чем тремя химическими связями

НМВС - гетероядерная корреляционная спектроскопия; метод выявляет взаимодействие между двумя типами ядер, отделённых друг от друга двумя или более химическими связями

HSQC - гетероядерная корреляционная спектроскопия; метод выявляет взаимодействие между двумя типами ядер непосредственно связанных друг с другом атомов

HRESI-MS - масс-спектрометрия высокого разрешения, с использованием ионизации электроспреем

MALDI - масс-спектрометрия с использованием матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации

MS/MS - тандемная масс-спектрометрия

ToF - времяпролётный метод снятия масс-спектров

Хроматография

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ТСХ - тонкослойная хроматография Единицы измерения g - единица измерения относительной силы центрифугирования (RCF); саму RCF рассчитывали по формуле RCF = 11.18 х (радиус ротора центрифуги [см]) х (скорость центрифугирования [кол-во оборотов в мин] / 1000) v/v — выраженное в процентах количество мл вещества, содержащееся в 1 мл раствора w/v — выраженное в процентах количество грамм вещества, содержащееся в 1 мл раствора ед/мл - единиц активности/мл мкМ - микромоль/л

Исследование биологической активности

20-Вестерн-блоттинг - двумерный Вестерн-блоттинг

2D-PAGE - двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, используемый при анализе протеома клеток

АР-1 - активаторный белок-1, транскрипционный фактор

APS — персульфат аммония

BS А - бычий сывороточный альбумин

CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропенсульфонат CNI-1493 - ЛуУ,-бис[3,5-бис[Лг-(диаминометилиденамино)-С-метилкарбо-нимидоил]фенил] декандиамид тетрагидрохлорид

СРМ - counts per minute, количество радиоактивных распадов в исследуемом образце за 1 мин

CRABP2 - клеточный ретионовая кислота-связывающий белок 2 D-люциферин - (45)-2-(6-гидрокси-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол -4-карбоновая кислота

DEPC-H2O - деионизированная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом DHS - деоксигипузин синтаза dH20 - деионизированная вода dNTP - дезоксинуклеотид трифосфат

Doh-eIF5A - интермедиатная форма белка, содержащая деоксигипузинированный лизин50

DOHH - деоксигипузин гидроксилаза EGF - эпидермальный фактор роста eIF5A - эукариотический фактор инициации трансляции 5А-1 ERKs - киназы, регулируемые внешнеклеточными сигналами FBS - сыворотка крови эмбрионов крупного рогатого скота FITC - изотиоцианат флюоресцеина GC7 - М-гуанил-1,7-диаминогептан

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперизинэтансульфоновая ксилота Hyp-eIF5A - активная форма белка, содержащая гипузинированный лизин50 1С5о - (inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, ингибирующая жизнеспособность клеток на 50%

INCC5o - (inhibition of the number of the colonies C5o) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования (трансформации) JB6 Р+ С141 в мягком агаре на 50%

IEF - изоэлектрическое фокусирование IPG - иммобилизированный рН-градиент

Lys-eIF5A - негипузинированная (неактивная) модификация eIF5A, содержащая свободный лизин50

МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа MG-132 - тУ-(бензилоксикарбонил)лейциниллейциниллейциналь MTS - 5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4,5-диметилтиазолил)-3-(4-сульфо-фенил) тетразолий, внутренняя соль

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид

NFkB - ядерный фактор кВ, транскрипционный фактор

NP-40 - нонилфеноксиполиэтоксилэтанол

PBS - фосфатно-солевой буфер pi - изоэлектрическая точка

PI - пропидиум йодид

PVDF - поливинилиден фторид

SDS - додецилсульфат натрия

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер

TBS - трис-солевой буфер

TEMED - ДД^У^/У-тетраметилэтилендиамин Tris - трис(гидроксиметил)аминометан

Tris/HCl - раствор трис(гидроксиметил)аминометана, титрованный НС1 до соответствующего значения рН

Tween-20 - полиоксиэтилен(20)монолаурат сорбита АТФ - аденозинтрифосфат

Глицин/NaOH - раствор глицина, титрованный NaOH до соответствующего значения рН

ДТТ — дитиотреитол

Противоопухолевая активность - в данной работе - активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации

Пуромицин - 3'-деокси-ЛуУ-диметил-3'-[(0-метил-Ь-тирозил)амино] аденозин

ПЦР - полимеразно-цепная реакция ТХУ - трихлоруксусная кислота Цисплатин - г/мс-диамминдихлорплатина (II) ЭДТА - этилен диамин тетраацетат

Этидий бромид - 3,8-диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Морской алкалоид ааитамии и его аналоги. Особенности их химического строения, биологическая активность. Клеточные культуры и некоторые методы, примененные для изучения биологической активности

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Дышловой, Сергей Анатольевич

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан способ выделения из морской губки Aaptos sp. индивидуальных алкалоидов ааптаминового ряда.

2. Из спиртовых экстрактов губки Aaptos sp. выделены 4 новых и 5 ранее известных ааптаминовых алкалоидов. Строение новых соединений установлено как 3 -(ЛГ-морфол инил)-деметил оксиааптамин, 3 -(метил амино)-демети л оксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин и 6-(У-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин.

3. Показано, что выделенные алкалоиды обладают канцерпревентивной, а также цитотоксической противоопухолевой активностью. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин преодолевают лекарственную устойчивость NT2-R клеток тестикулярной карциномы человека, действуя на них в тех же концентрациях, которые являются активными по отношению к лекарственно-чувствительным NT2 опухолевым клеткам.

4. Установлено, что механизм канцерпревентивного и цитостатического действия ааптамина может включать арест клеточного цикла в фазе G2/M, а также регулирование внутриклеточных уровней и активности белков eIF5A, альфа-энолазы, кофилина-1 и CRABP2.

5. Показано, что механизм цитотоксического действия ааптамина, может включать активирование фосфорилирования ERKs, транскрипционной активности АР-1, NFkB и р53 ядерных факторов, а также индукцию апоптоза опухолевых клеток.

6. Показано, что ааптамин является первым низкомолекулярным активатором процесса гипузинирования эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1 (eIF5A).

7. Установлено, что изученные нами ааптаминовые алкалоиды имеют определенный потенциал для дальнейшего изучения возможности их применения в качестве хемопревентивных противоопухолевых препаратов, а также компонентов терапии лекарственно-устойчивых типов опухолей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Дышловой, Сергей Анатольевич, 2012 год

1. Nakamura Н., Kobayashi J., Ohizumi Y. Isolation and structure of aaptamine a novel heteroaromatic substance possessing alpha-blocking activity from the sea sponge Aaptos aaptos II Tetrahedron Lett. 1982. V. 23, N 52. P. 5555-5558.

2. Ohizumi Y., Kajiwara A., Nakamura H., Kobayashi J. Alpha-adrenoceptor blocking action of aaptamine, a novel marine natural product, in vascular smooth muscle // J Pharm Pharmacol. 1984. V. 36, N 11. P. 785-786.

3. Nakamura H., Kobayashi J., Ohizumi Y., Hirata Y. Aaptamines. Novel benzode.[l,6]naphthyridines from the okinawan marine sponge Aaptos aaptos IIJ Chem Soc Perkin Trans 1. 1987. N 1. P. 173-176.

4. Fedoreev S.A. Prokof eva N.G., Denisenko V.A., Rebachuk N.M. Cytotoxic activity of aaptamines from suberitid marine sponges // Pharmaceut Chem J. 1988. V. 22. P. 615-618.

5. Kashman Y., Rudi A., Hirsh S., Isaacs S., Green D., Blasberger D., Carmely S. Recent development in research on metabolites from Red Sea invertebrates // New J Chem. 1990. V. 14, N 10. P. 729-740.

6. Rudi A., Kashman Y. Aaptosine a new cytotoxic 5,8-diazabenzcd.azulene alkaloid from the Red Sea sponge Aaptos aaptos II Tetrahedron Lett. 1993. V. 34, N 29. P. 4683-4684.

7. Larghi E.L., Bohn M.L., Kaufman T.S. Aaptamine and related products. Their isolation, chemical syntheses, and biological activity // Tetrahedron. 2009. V. 65, N 22. P. 4257-4282.

8. Coutinho A.F., Chanas В., Souza Т., Frugrulhetti I., Epifanio R.D. Anti HSV-1 alkaloids from a feeding deterrent marine sponge of the genus Aaptos 11 Heterocycles. 2002. V. 57, N 7. P. 1265-1272.

9. Calcul L., Longeon A., A1 Mourabit A., Guyot M., Bourguet-Kondracki M.L. Novel alkaloids of the aaptamine class from an Indonesian marine sponge of the genus Xestopongia II Tetrahedron. 2003. V. 59, N 34. P. 6539-6544.

10. Bowden B.F., McCool B.J., Willis R.H. Lihouidine, a novel spiro polycyclic aromatic alkaloid from the marine sponge Suberea n. sp. (Aplysinellidae, Verongida) // J Org Chem. 2004. V. 69, N 23. P. 7791-7793.

11. Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Dyshlovoy S.A., Krasokhin V.B., Stonik V.A. Aaptamine alkaloids from the Vietnamese sponge Aaptos sp. // Nat Prod Commun. 2009. V. 4, N 8. P. 10851088.

12. Shaari K., Ling K.C., Rashid Z.M., Jean T.P., Abas F., Raof S.M., Zainal Z., Lajis N.H., Mohamad H., Ali A.M. Cytotoxic aaptamines from malaysian Aaptos aaptos I I Mar Drugs. 2009. V. 7, N 1. P. 1-8.

13. Utkina N.K., Denisenko V.A., Pushilin M.A. Aaptanone, a novel zwitterionic metabolite of the aaptamine class with an oxygenated 1,6-naphthyridine core from the Vietnamese marine sponge Aaptos aaptos // Tetrahedron Lett. 2009. V. 50, N 21. P. 2580-2582.

14. Takahashi Y., Kubota T., Shibazaki A., Gonoi T., Fromont J., Kobayashi J. Nakijinamines C-E, new heteroaromatic alkaloids from the sponge Suberites species // Org Lett. 2011. V. 13, N 12. P. 3016-3019.

15. Bergquist P.R., Cambie R.C., Kernan M.R Aaptamine, a taxonomic marker for sponges of the order Hadromerida // Biochem Syst Ecol. 1991. V. 19, N 4. P. 289-290.

16. Hymeniacidon sp. and conversion to the phosphate prodrug hystatin 1 // J Nat Prod. 2004. V. 67, N3. P. 506-509.

17. Sova V.V., Fedoreev S.A. Metabolites from sponges as inhibitors of (3-1, 3-glucanase // Chem Nat Compd. 1990. V. 26, N 4. P. 420-422.

18. Ioffina D.I., Volkovitskaya O.E., Gorkin V.Z., Rebachuk N.M., Utkina N.K., Fedoreev S.A. Aaptamine-new selective inhibitor of type a monoamine oxidases // Pharmaceut Chem J. 1990. V. 24, N 7. P. 456-458.

19. Bobzin S.C., Yang S.T., Kasten T.P. Application of liquid chromatography-nuclear magnetic resonance spectroscopy to the identification of natural products // J Chromatogr B. 2000. V. 748, N 1. P. 259-267.

20. Bobzin S.C., Yang S., Kasten T.P. LC-NMR: a new tool to expedite the dereplication and identification of natural products // J Ind Microbiol Biot. 2000. V. 25, N 6. P. 342-345.

21. Floquet N., Richez C., Durand P., Maigret B., Badet B., Badet-Denisot M.A. Discovering new inhibitors of bacterial glucosamine-6P synthase (GlmS) by docking simulations // Bioorg Med Chem Lett. 2007. V. 17, N 7. P. 1966-1970.

22. Jang K.H., Chung S.C., Shin J., Lee S.H., Kim T.I., Lee H.S., Oh K.B. Aaptamines as sortase A inhibitors from the tropical sponge Aaptos aaptos II Bioorg Med Chem Lett. 2007. V. 17, N 19. P. 5366-5369.

23. Shen Y.C., Lin T.T., Sheu J.H., Duh C.Y. Structures and cytotoxicity relationship of isoaaptamine and aaptamine derivatives // J Nat Prod. 1999. V. 62, N 9. P. 1264-1267.

24. Longley R.E., McConnell O.J., Essich E., Harmody D. Evaluation of marine sponge metabolites for cytotoxicity and signal transduction activity // J Nat Prod. 1993. V. 56, N 6. P. 915-920.

25. Aoki S., Kong D.X., Suna H., Sowa Y., Sakai T., Setiawan A., Kobayashi M. Aaptamine, a spongean alkaloid, activates p21 promoter in a p53-independent manner // Biochem Bioph Res Commun. 2006. V. 342, N 1. P. 101-106.

26. Hollstein M., Sidransky D., Vogelstein B., Harris C.C. p53 mutations in human cancer // Science. 1991. V. 253, N 5015. P. 49-53.

27. Vogelstein B., Kinzler K.W. p53 function and dysfunction // Cell. 1992. V. 70, N 4. P. 523-526.

28. Jin M.H., Zhao W.N., Zhang Y.W., Kobayashi M., Duan H.Q., Kong D.X. Antiproliferative effect of aaptamine on human chronic myeloid leukemia K562 cells // IntJMol Sci. 2011. V. 12, N 11. P. 7352-7359.

29. Litvinov V., Roman S., Dyachenko V. Pyridopyridines // Russ Chem Rev. 2001. V. 70, N4.

30. Diers J.A., Bowling J.J., Duke S.O., Wahyuono S., Kelly M., Hamann M.T. Zebra mussel antifouling activity of the marine natural product aaptamine and analogs // Mar Biotechnol. 2006. V. 8, N 4. P. 366-372.

31. Fugmann B., Steffan B., Steglich W. Necatorone, an alkaloidal pigment from the gilled toadstool Lactarius necator (agaricales) // Tetrahedron Lett. 1984. V. 25, N 33. P. 3575-3578.

32. Klamann J.D., Fugmann B., Steglich W. Alkaloidal pigments from Lactarius necator and L. atroviridis II Phytochemistry. 1989. V. 28, N 12. P. 3519-3522.

33. Yoneda Y., Suzuki T., Ogita K., Han D.K. Support for radiolabeling of a glycine recognition domain on the N-methyl-D-aspartate receptor ionophore complex by 5,7-3H.dichlorokynurenate in rat brain // J Neurochem. 1993. V. 60, N 2. P. 634-645.

34. Takamatsu S., Hodges T.W., Rajbhandari I., Gerwick W.H., Hamann M.T., Nagle D.G. Marine natural products as novel antioxidant prototypes // J Nat Prod. 2003. V. 66, N 5. P. 605-608.

35. Utkina N.K. Antioxidant activity of aromatic alkaloids from the marine sponges Aaptos aaptos and Hyrtios sp. I I Chem Nat Compd. 2009. V. 45, N 6. P. 849-853.

36. Bertram J.S. The molecular biology of cancer // Mol Aspects Med. 2000. V. 21, N6. P. 167-223.

37. Surh Y.-J. Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances // Mut Res-Fund Mol M. 1999. V. 428, N 1-2. P. 305-327.

38. Hong W.K., Sporn M.B. Recent advances in chemoprevention of cancer // Science. 1997. V. 278, N 5340. P. 1073-1077.

39. Steele V.E., Sharma S., Mehta R., Elmore E., Redpath L., Rudd C., Bagheri D., Sigman C.C., Kelloff G.J. Use of in vitro assays to predict the efficacy of chemopreventive agents in whole animals // J Cell Biochem Suppl. 1996. V. 26, P. 29-53.

40. Colburn N.H., Gindhart T.D. Specific binding of transforming growth factor correlates with promotion of anchorage independence in EGF receptorless mouse JB6 cells // Biochem Bioph Res Commun. 1981. V. 102, N 2. P. 799-807.

41. Colburn N.H., Former B.F., Nelson K.A., Yuspa S.H. Tumour promoter induces anchorage independence irreversibly // Nature. 1979. V. 281, N 5732. P. 589-591.

42. Colburn N.H., Koehler B.A., Nelson K.J. A cell culture assay for tumor-promoter-dependent progression toward neoplastic phenotype: detection of tumor promoters and promotion inhibitors // Teratog Carcinog Mutagen. 1980. V. 1, N 1. P. 8796.

43. Dong Z.G., Birrer M.J., Watts R.G., Matrisian L.M., Colburn N.H. Blocking of tumor promoter-induced AP-1 activity inhibits induced transformation in JB6 mouse epidermal cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91, N 2. P. 609-613.

44. Hsu T.C., Nair R., Tulsian P., Camalier C.E., Hegamyer G.A., Young M.R., Colburn N.H. Transformation nonresponsive cells owe their resistance to lack of p65/nuclear factor-kappa B activation // Cancer Res. 2001. V. 61, N 10. P. 4160-4168.

45. Li J.J., Westergaard C., Ghosh P., Colburn N.H. Inhibitors of both nuclear factor-kappa Beta and activator protein-1 activation block the neoplastic transformation response // Cancer Res. 1997. V. 57, N 16. P. 3569-3576.

46. Suzukawa K., Weber T.J., Colburn N.H. AP-1, NF kappa B, and ERK activation thresholds for promotion of neoplastic transformation in the mouse epidermal JB6 model // Environ Health Perspect. 2002. V. 110, N 9. P. 865-870.

47. Kunwar P.S., Lehmann R. Developmental biology Germ-cell attraction // Nature. 2003. V. 421, N 6920. P. 226-227.

48. Clark A.T. Establishment and differentiation of human embryonic stem cell derived germ cells // Soc Reprod Fértil Suppl. 2007. V. 63, P. 77-86.

49. Alberts B., Johnson A., Lewis J. et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science. 2002.

50. Honecker F., Oosterhuis J.W., Mayer F., Hartmann J.T., Bokemeyer C., Looijenga L.H.J. New insights into the pathology and molecular biology of human germ cell tumors // World J Urol. 2004. V. 22, N 1. P. 15-24.

51. Ulbright T.M. Germ cell neoplasms of the testis // Am J Surg Pathol. 1993. V. 17, N 11. P. 1075-1091.

52. Port M., Glaesener S., Ruf C., Riecke A., Bokemeyer C., Meineke V., Honecker F., Abend M. Micro-RNA expression in cisplatin resistant germ cell tumor cell lines // Mol Cancer. 2011. V. 10,

53. Gilbert D., Rapley E., Shipley J. Testicular germ cell tumours: predisposition genes and the male germ cell niche // Nat Rev Cancer. 2011. V. 11, N 4. P. 278-288.

54. Bosl G.J., Motzer R.J. Testicular germ-cell cancer // New Engl J Med. 1997. V. 337, N4. P. 242-253.

55. Troost M.M., Sternberg C.N., de Wit R. Management of good risk germ-cell tumours // BJU Int. 2009. V. 104, N 9B. P. 1387-1391.

56. Einhorn L.H. Curing metastatic testicular cancer // Proc Natl Acad Sei U S A. 2002. V. 99, N 7. P. 4592-4595.

57. Oosterhuis J.W., Looijenga L.H.J. Testicular germ-cell tumours in a broader perspective // Nat Rev Cancer. 2005. V. 5, N 3. P. 210-222.

58. Koeberle B., Tomicic M.T., Usanova S., Kaina B. Cisplatin resistance: Preclinical findings and clinical implications // Biochim Biophys Acta. 2010. V. 1806, N 2. P. 172-182.

59. Speicher D.W. Proteome Analysis. Amsterdam: Elsevier. 2004.

60. Farley A.R., Link A.J. Identification and quantification of proteinjposttranslational modifications. Guide to Protein Purification. 2 edition. San Diego: Elsevier Academic Press Inc. 2009.

61. Wijtmans R., Vink M.K.S., Schoemaker H.E., van Delft F.L., Blaauw R.H., Rutjes F. Biological relevance and synthesis of C-substituted morpholine derivatives // Synthesis-Stuttgart. 2004. N 5. P. 641-662.

62. Shubina L.K., Makarieva T.N., Dyshlovoy S.A., Fedorov S.N., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Three new aaptamines from the marine sponge Aaptos sp. and their proapoptotic properties // Nat Prod Commun. 2010. V. 5, N 12. P. 1881-1884.

63. Watts R.G., Huang C.S., Young M.R., Li J.J., Dong Z.G., Pennie W.D., Colburn N.H. Expression of dominant negative Erk2 inhibits AP-1 transactivation and neoplastic transformation // Oncogene. 1998. V. 17, N 26. P. 3493-3498.

64. Huang C.S., Ma W.Y., Young M.R., Colburn N. Dong Z.G. Shortage of mitogen-activated protein kinase is responsible for resistance to AP-1 transactivation and transformation in mouse JB6 cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95, N 1. P. 156161.

65. Dong Z.G., Watts R.G., Sun Y., Zhan S.N., Colburn N.H. Progressive elevation of AP-1 activity during preneoplastic-to neoplastic progression as modeled in mouse JB6 cell variants // Int J Oncol. 1995. V. 7, N 2. P. 359-364.

66. Bernstein L.R., Colburn N.H. APl/jun function is differentially induced in promotion-sensitive and resistant JB6 cells // Science. 1989. V. 244, N 4904. P. 566-569.

67. Amit S., Ben-Neriah Y. NF-kappa B activation in cancer: a challenge for ubiquitination- and proteasome-based therapeutic approach // Semi Cancer Biol. 2003. V. 13, N l.P. 15-28.

68. Beg A.A., Baltimore D. An essential role for NF-kappa B in preventing TNF-alpha-induced cell death // Science. 1996. V. 274, N 5288. P. 782-784.

69. Chiu R., Angel P., Karin M. Jun-B differs in its biological properties from, and is a negative regulator of, c-Jun // Cell. 1989. V. 59, N 6. P. 979-986.

70. Passegue E., Jochum W., Schorpp-Kistner M., Mohle-Steinlein U., Wagner E.F. Chronic myeloid leukemia with increased granulocyte progenitors in mice lacking JunB expression in the myeloid lineage // Cell. 2001. V. 104, N 1. P. 21-32.

71. Leppa S., Eriksson M., Saffrich R., Ansorge W., Bohmann D. Complex functions of AP-1 transcription factors in differentiation and survival of PC 12 cells // Mol Cell Biol. 2001. V. 21, N 13. P. 4369-4378.

72. Fan M.Y., Goodwin M.E., Birrer M.J., Chambers T.C. The c-Jun NH2-terminal protein kinase/AP-1 pathway is required for efficient apoptosis induced by vinblastine // Cancer Res. 2001. V. 61, N 11. P. 4450-4458.

73. Garcia-Bermejo L., Perez C., Vilaboa N.E., de Bias E., Aller P. cAMP increasing agents attenuate the generation of apoptosis by etoposide in promonocytic leukemia cells // J Cell Sci. 1998. V. 111, P. 637-644.

74. Kasibhatla S., Brunner T., Genestier L., Echeverri F., Mahboubi A., Green D.R. DNA damaging agents induce expression of Fas ligand and subsequent apoptosis in T lymphocytes via the activation of NF-KB and AP-1 // Mol Cell. 1998. V. 1, N 4. P. 543551.

75. Manna S.K., Sah N.K., Aggarwal B.B. Protein tyrosine kinase p56(lck) is required for ceramide-induced but not tumor necrosis factor-induced activation of NF-kappa B, AP-1, JNK, and apoptosis // J Biol Chem. 2000. V. 275, N 18. P. 13297-13306.

76. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. 1997. V. 88, N3. P. 323-331.

77. Prives C., Hall P.A. The P53 pathway // J Pathol. 1999. V. 187, N 1. P. 112126.

78. Vousden K.H. p53: Death star // Cell. 2000. V. 103, N 5. P. 691-694.

79. Mueller S., Schittenhelm M., Honecker F., Malenke E., Lauber K., Wesselborg S., Hartmann J.T., Bokemeyer C., Mayer F. Cell-cycle progression andresponse of germ cell tumors to cisplatin in vitro // Int J Oncol. 2006. V. 29, N 2. P. 471479.

80. Park M.H., Wolff E.C., Folk J.E. Is hypusine essential for eukaryotic cell proliferation? // Trends Biochem Sei. 1993. Y. 18, N 12. P. 475-479.

81. Park M.H., Nishimura K., Zanelli C.F., Valentini S.R. Functional significance of eIF5A and its hypusine modification in eukaryotes // Amino Acids. 2010. V. 38, N 2. P. 491-500.

82. Chattopadhyay M.K., Park M.H., Tabor H. Hypusine modification for growth is the major function of spermidine in Saccharomyces cerevisiae polyamine auxotrophs grown in limiting spermidine // Proc Natl Acad Sei USA. 2008. V. 105, N 18. P. 6554-6559.

83. Subramanian A., Miller D.M. Structural analysis of alpha-enolase Mapping the functional domains involved in down-regulation of the c-myc protooncogene // J Biol Chem. 2000. V. 275, N 8. P. 5958-5965.

84. Arber S., Barbayannis F.A., Hanser H., Schneider C., Stanyon C.A., Bernard O., Caroni P. Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase //Nature. 1998. V. 393, N 6687. P. 805-809.

85. Donato L.J., Noy N. Suppression of mammary carcinoma growth by retinoic acid: Proapoptotic genes are targets for retinoic acid receptor and cellular retinoic acid-binding protein II signaling // Cancer Res. 2005. V. 65, N 18. P. 8193-8199.

86. Klier H., Wohl T., Eckerskorn C., Magdolen V., Lottspeich F. Determination and mutational analysis of the phosphorylation site in the hypusine-containing protein Hyp2p // FEBS Lett. 1993. V. 334, N 3. P. 360-364.

87. Park M.H. The post-translational synthesis of a polyamine-derived amino acid, hypusine, in the eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) // J Biochem. 2006. V. 139, N2. P. 161-169.

88. Maier B., Tersey S.A., Mirmira R.G. Hypusine: a new target for therapeutic intervention in diabetic inflammation // Discovery medicine. 2010. V. 10, N 50. P. 18-23.

89. Kobayashi M., Nishita M., Mishima T., Ohashi K., Mizuno K. MAPKAPK-2-mediated LIM-kinase activation is critical for VEGF-induced actin remodeling and cell migration // EMBO J. 2006. V. 25, N 4. P. 713-726.

90. Chua B.T., Volbracht C., Tan K.O., Li R., Yu V.C., Li P. Mitochondrial translocation of cofilin is an early step in apoptosis induction // Nat Cell Biol. 2003. V. 5, N 12. P. 1083-1089.

91. Maier B., Ogihara T., Trace A.P., Tersey S.A., Robbins R.D., Chakrabarti S.K., Nunemaker C.S., Stull N.D., Taylor C.A., Thompson J.E., Dondero R.S., Lewis

92. E.C., Dinarello C.A., Nadler J.L., Mirmira R.G. The unique hypusine modification of eIF5A promotes islet beta cell inflammation and dysfunction in mice // J Clin Invest. 2010. V. 120, N 6. P. 2156-2170.

93. Wolff E.C., Lee S.B., Park M.H. Assay of deoxyhypusine synthase activity // Methods Mol Biol. 2011. V. 720, P. 195-205.

94. Sommer M.N., Bevec D., Klebl B., Flicke B., Holscher K., Freudenreich T., Hauber I., Hauber J., Mett H. Screening assay for the identification of deoxyhypusine synthase inhibitors // J Biomol Screen. 2004. V. 9, N 5. P. 434-438.

95. Hauber I., Bevec D., Heukeshoven J., Kratzer F., Horn F., Choidas A., Harrer T., Hauber J. Identification of cellular deoxyhypusine synthase as a novel target for antiretroviral therapy // J Clin Invest. 2005. V. 115, N 1. P. 76-85.

96. Park M.H., Wolff E.C., Lee Y.B., Folk J.E. Antiproliferative effects of inhibitors of deoxyhypusine synthase inhibition of growth of chinese-hamster ovary cells by guanyl diamines // J Biol Chem. 1994. V. 269, N 45. P. 27827-27832.

97. Park M.H., Wolff E.C., Folk J.E. Hypusine: its post-translational formation in eukaryotic initiation factor 5A and its potential role in cellular regulation // Biofactors. 1993. V. 4, N2. P. 95-104.

98. Tome M.E., Fiser S.M., Payne C.M., Gerner E.W. Excess putrescine accumulation inhibits the formation of modified eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) and induces apoptosis // Biochem J. 1997. V. 328 ( Pt 3), P. 847-54.

99. Hauber J. Revisiting an old acquaintance: role for elF5A in diabetes // J Clin Invest. 2010. V. 120, N 6. P. 1806-1808.

100. Kaiser A. Translational control of eIF5A in various diseases // Amino Acids.2011.

101. Borghi R., Vene R., Arena G., Schubert D., Albini A., Tosetti F. Transient modulation of cytoplasmic and nuclear retinoid receptors expression in differentiating human teratocarcinoma NT2 cells // J Neuroehem. 2003. V. 84, N 1. P. 94-104.

102. Eriksson J.E., He T., Trejo-Skalli A.V., Harmala-Brasken A.S., Hellman J., Chou Y.H., Goldman R.D. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments // J Cell Sci. 2004. V. 117, N 6. P. 919-932.

103. Evans R.M. Vimentin: the conundrum of the intermediate filament gene family // Bioessays. 1998. V. 20, N 1. P. 79-86.

104. Perez-Vargas J., Romero P., Lopez S., Arias C.F. The peptide-binding and ATPase domains of recombinant hsc70 are required to interact with rotavirus and reduce its infectivity // J Virol. 2006. V. 80, N 7. P. 3322-3331.

105. Gotzmann J., Eger A., Meissner M., Grimm R., Gerner C., Sauermann G., Foisner R. Two-dimensional electrophoresis reveals a nuclear matrix-associated nucleolin complex of basic isoelectric point // Electrophoresis. 1997. V. 18, N 14. P. 2645-2653.

106. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976. V. 72, N 1-2. P. 248-254.

107. Junker H., Venz S., Zimmermann U., Thiele A., Scharf C., Walther R. Stage-related alterations in renal cell carcinoma comprehensive quantitative analysis by 2D-DIGE and protein network analysis // Plos One. 2011. V. 6, N 7. P. e21867.

108. Koch S., Mayer F., Honecker F., Schittenhelm M., Bokemeyer C. Efficacy of cytotoxic agents used in the treatment of testicular germ cell tumours under normoxic and hypoxic conditions in vitro // Brit J Cancer. 2003. V. 89, N 11. P. 2133-2139.

109. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., Grignani F., Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J Immunol Methods. 1991. V. 139, N 2. P. 271-279.