Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Коржикова, Светлана Васильевна

• Коржикова, Светлана Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коржикова, Светлана Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стволовые клетки сперматогонии у млекопитающих

1.2. Пролиферация и дифференцировка сперматогоний типа А.

1.3. Факторы, стимулирующие пролиферацию и дифференцировку 21 сперматогоний

1.4. Сперматогенез у различных видов млекопитающих

1.5. Выделение стволовых клеток сперматогоний млекопитающих 28 и культивирование in vitro

1.6. Трансплантация СКС

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение, характеристика и трансплантация сперматогоний типа А хряка»

Благодаря активному развитию клеточной биологии и клеточной инженерии открыт перспективный путь к созданию животных со стабильной интеграцией и экспрессией рекомбинантной ДНК в геноме (трансгенные животные). Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и продуктивности домашних животных (животные, обладающие общей генетической устойчивостью к различным заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды, информационным иммунитетом к возбудителям основных эпизоотий, стресс-устойчивостью и т.д.), а также в качестве источников необходимых человеку фармакологических (эритропоэтин, интерферон, инсулин, альбумин, факторы свертывания крови и др.) и технических (химозин и др.) белков [1,2,6,29].

В настоящее время разработаны новые современные подходы получения трансгенных животных. Широко применяются такие методические приемы как: микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус, использование трансгенной спермы в качестве вектора, получение зародышевых химер с помощью эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), ретровирусная трансфекция эмбрионов [3,17,25,27,30,130]. Перенос генов в геном животных возможен на различных стадиях эмбрионального и постнатального развития организма [10,11].

Особенную актуальность в этом направлении приобретают методы клеточной инженерии, позволяющие получать культуры стволовых клеток. [147,155]. Стволовыми клетками принято считать клетки, способные самообновляться, т.е. неограниченно делиться на протяжении длительного времени, по крайней мере, в течение жизни организма. Из каждой стволовой клетки при делении образуются две дочерние, одна из которых способна самообновляться, а другая обладает определенной потенцией к дифференцировке. Стволовые клетки, дающие начало одному виду дифференцированных клеток называют унипотентными, двум -бипотентными, нескольким видам в пределах одного тканевого вида (например, клеткам крови) - полипотентными. Стволовые клетки, обладающие неограниченными потенциями к цитодифференцировке, способные реализовать генетическую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку, а также развитие до целого организма называют тотипотентными [27].

Единственным источником потенциально тотипотентных диплоидных клеток во взрослом организме млекопитающих являются стволовые клетки сперматогонии (СКС). Уникальное свойство стволовых клеток сперматогоний многократно самообновляться открывает широкие возможности реализации потенциала этих клеток в создании новых видов животных с измененным геномом. У половозрелых самцов популяция диплоидных стволовых клеток сперматогоний постоянно обновляется и производит потомство клеток, которое инициирует комплексный процесс дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - сперматозоидов. Теоретически одна сперматогониальная стволовая клетка способна сформировать 4096 сперматид [48]. После оплодотворения, дополненные женскими гомологами, сперматозоиды участвуют в эмбриогенезе, и в итоге, в дифференцировке каждой клетки организма. В этом случае стволовые клетки сперматогонии могут считаться тотипотентными. И хотя женские ооциты, имеющиеся у половозрелых особей, и принимают генетическое участие в создании потомства, они не являются самообновляющимися - при рождении их имеется конечное количество, которое постоянно уменьшается в течение жизни самки. Поэтому стволовые клетки сперматогонии, по существу, являются единственным самообновляющимся типом клеток у половозрелого животного, способным обеспечить генетический вклад в получение следующего поколения [47].

В настоящее время ряд ученых из ведущих научно-исследовательских институтов мира занимаются изучением различных аспектов, связанных с выделением, культивированием, генетической трансформацией, трансплантацией стволовых клеток сперматогоний млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных и человека [48,50,64,133]. Актуальность этих исследований заключается в том, что наряду с теоретическими изысканиями поднимаются такие важные практические задачи, как лечение бесплодия (например, после курсов химио- и радиотерапии при лечении рака), регулирование рождаемости у людей, получение животных с улучшенными полезно-хозяйственными признаками и др. [133,21,22].

Пролиферация и дифференцировка сперматогоний являются комплексным процессом, который включает в себя многие регуляторные факторы и межклеточные взаимодействия, что создает большие трудности в изучении этих сложных процессов in vivo. В связи с этим выделение СКС из тестикул млекопитающих, манипуляции с ними in vitro и пересадка их в семенники реципиента открывают новые возможности в изучении сперматогенеза и проведении геномных манипуляций у млекопитающих, и представляют собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии.

Ядра стволовых клеток являются ценным материалом для конструирования новых клеточных типов в процессе клонирования. Исследования по клонированию животных путем пересадки ядер развиваются очень интенсивно. Показана возможность клонирования крупного рогатого скота, овец и кроликов путем трансплантации ядер бластомеров в энуклеированные ооциты [14]. При этом исходным материалом служили 4-64-х клеточные эмбрионы. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ППЗК в качестве доноров ядер. Так, в США в 1997 году впервые удалось получить клонированного теленка по кличке «Ген» [148]. Исходным материалом для клонирования послужили ядра ППЗК крупного рогатого скота, полученные из закладок гонад плода теленка в возрасте 30 суток.

Сперматогенные клетки - сперматогонии типа А вполне могут служить источником ядер для реконструирования зигот с целью получения животных с заведомо известными признаками. Первой попыткой использования сперматогоний в качестве источника ядер для трансплантации в энуклеированную клетку, с целью определения их потенций, являются исследования, проведенные на лягушках [39]. На человеческих яйцеклетках показано развитие до стадии морулы после 72 часов культивирования реконструированных клеток, полученных путем трансплантации сперматогоний в энуклеированные созревшие ооциты на стадии метафазы II [160]. Актуальность исследований в данном направлении очевидна, т.к. уникальное свойство СКС - потенциальная тотипотентность дает возможность клонирования самцов млекопитающих с помощью трансплантации ядер сперматогоний, полученных из тестикул [143,142].

Очень перспективный подход для получения трансгенных животных посредством использования мужских стволовых клеток был предложен Бринстером и Авербаком [48]. Они разработали технику, с помощью которой возможна трансплантация клеток, выделенных из семенника донора, в мышиные семенные канальцы стерильных самцов реципиентов. В результате проведенных этими авторами исследований, была показана способность трансплантантов возобновлять нормальный сперматогенез у мышей и крыс.

В данном направлении рядом ученых из разных лабораторий ведутся активные исследования. В основном при изучении СКС используются лабораторные животные - мыши и крысы [133,47,93], однако в последнее время появились публикации, в которых объектами изучения являются СКС сельскохозяйственных животных [90,85].

Стволовые зародышевые клетки млекопитающих могут использоваться в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК в организм животных. Модификации стволовых клеток сперматогоний до пересадки должны повлиять на развитие яиц, оплодотворенных сперматозоидами, полученными из трансформированных стволовых клеток. Возможность введения в стволовые клетки экзогенной ДНК имеет значение для широкого ряда экспериментальных работ, например для развития генной терапии и трансгенезиса [27].

Таким образом, в контексте выше изложенного, и в связи с тем, что данных по изучению СКС крупных сельскохозяйственных животных, в том числе свиней, недостаточно, направление исследований по изучению СКС свиньи является перспективным и актуальным для развития сельскохозяйственной биотехнологии.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось выделение, характеристика и трансплантация стволовых клеток сперматогоний типа А хряков. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• изучить динамику сперматогенеза у местных помесных хряков в образцах фиксированных тканей;

• оптимизировать существующие методические приемы, позволяющие изолировать СКС типа А из семенников хряка;

• подобрать оптимальные условия, влияющие на поддержание СКС в недифференцированной форме при краткосрочном культивировании и охарактеризовать СКС в культуре;

• оптимизировать схему трансплантации СКС свиней в семенники стерильных реципиентов;

• изучить возможность колонизации клетками донора семенных канальцев стерильного реципиента и возобновления в них сперматогенеза.

Научная новизна. Впервые изучена динамика сперматогенеза у местных помесных свиней и установлен возраст хрячков, при котором сбор СКС типа А является максимальным.

Разработан эффективный и недорогой метод выделения стволовых клеток сперматогоний из семенников местных помесных хряков и предпринята попытка создания оптимальных условий для их культивирования. Изучена роль и проведен сравнительный анализ использования различных монослоев и ростовых факторов для поддержания СКС в культуре в недифференцированном виде.

Впервые, с учетом морфо-физиологических характеристик свиней, модифицирована и оптимизирована схема трансплантации донорских клеток в семенники стерильных реципиентов, предложенная ранее для мышей, и разработан метод обработки животных бусульфаном с целью выключения эндогенного сперматогенеза.

Показано на свиньях, что СКС донора возобновляют в семенных канальцах реципиента полноценный сперматогенез с выработкой зрелых сперматозоидов.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по выделению очищенной популяции СКС типа А свиньи, проведении с ними манипуляций in vitro и пересадке их в семенники реципиента представляют практическую ценность в связи с эффективностью и низкой стоимостью разработанных методических приемов, что позволит в будущем использовать стволовые клетки сперматогонии типа А, обладающие уникальным свойством -самообновлением в течение всей жизни животного, в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК в геном реципиентов с целью получения животных с заведомо известными признаками.

Основные положения, выносимые на защиту: -влияние возраста хряков на получение обогащенной культуры СКС типа А;

-метод выделения и очистки стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи;

-характеристика стволовых клеток сперматогоний типа А свиньи; -влияние ростовых факторов и монослоев фидерных клеток на поддержание СКС свиньи в культуре;

-схема обработки самцов свиней бусульфаном с целью подавления эндогенного сперматогенеза;

-потенции СКС свиней возобновлять сперматогенез в семенных канальцах хряков, характеризующихся половой стерильностью, после трансплантации в них донорских клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на 2-ой Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСХБ, г.Москва, октябрь 2000г; на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВНИИЖ, п.Дубровицы, ноябрь 2001 г; на научно-практической конференции, п.Быково, июль 2001; на 7-ом мировом конгрессе генетиков

14

7 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production), Montpellier, France, 2002.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 119 стр., содержит 5 табл., 29 рис. (в т.ч. 23 фотографии, 2диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 162 литературных источников, в т.ч. 129 на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Коржикова, Светлана Васильевна

5. ВЫВОДЫ.

1. Изучена динамика сперматогенеза у 54 местных помесных хрячков: а) Показано, что после рождения и до 80 сут. в семенных канальцах присутствуют только клетки Сертоли и два вида сперматогоний типа А. Полноценный сперматогенез у местных помесных свиней наступает не ранее 119 суточного возраста. б) Впервые установлено, что возраст местных помесных хрячков в интервале 60-80 сут. является оптимальным для максимального сбора стволовых клеток сперматогоний типа А. в) Охарактеризованы 2 вида сперматогоний типа А. Первый тип клеток характеризуется темным крупным ядром и небольшим ободком цитоплазмы. Второй тип имеет светлое крупное ядро и более тонкий ободок цитоплазмы. Размеры обоих типов клеток находятся в пределах 2530 мкм.

2. Оптимизирована схема трансплантации стволовых клеток сперматогоний типа А (ранее предложенная для мышей) с учетом морфо-физиологических характеристик свиней: а) показано, что трехкратная обработка животных-реципиентов бусульфаном позволяет разрушить стволовые клетки сперматогонии типа А; б) предложен метод введения стволовых клеток донора в средостение семенника животных-реципиентов, который обеспечивает равномерное распределение донорских клеток по семенным канальцам.

3. Последовательные механическая, а затем ферментативная обработки ткани семенника (коллагеназа, трипсин) позволяют выделить стволовые клетки сперматогонии типа А, расположенные на базальной мембране семенных канальцев. Дальнейшее инкубирование клеточной популяции в ростовой среде в течение 2-3 часов способствует очистке мужских стволовых клеток от других клеточных типов на 70%.

102

4. Установлено, что основной средой для культивирования стволовых клеток сперматогоний типа А является среда, используемая для культивирования эмбриональных стволовых клеток (среда Игла в модификации Дюльбекко с 4,5 г/л глюкозы), с добавлением 15% сыворотки плода коров, 2мМ альфа-глутамина, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 50 мкг/мл гентамицина.

5. Наличие фидерного слоя, представленного перевиваемыми эмбриональными фибробластами мыши (STO-клетки) или клетками Сертоли позволяет поддерживать СКС в недифференцированной форме в течение 7-10 сут.

6. Показано, что мужские стволовые клетки донора, трансплантированные в семенники стерильного реципиента, сохраняются в семенниках как минимум 29 сут. Более того, они возобновляют сперматогенез в семенных канальцах реципиента и приводят к формированию зрелых сперматозоидов.

7. Установлено, что бусульфан действует как временный контрацептив. В 9-ти месячном возрасте в семенниках реципиентов, обработанных бусульфаном, восстанавливается эндогенный сперматогенез.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коржикова, Светлана Васильевна, 2002 год

1. Биотехнология клеток животных: в 2-х т. /Под ред. Спиера Р.Е., Гриффитса Дж.Б. М.: Агропромиздат. - 1989. - 480,503с.

2. Брем Г., Зиновьева Н.А., Эрнст J1.K. «Генные фермы» новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными. //Сельскохозяйственная биология. - 1993. - №6. - С.3-27.

3. Газарян К.Г. Микроинъекция генов в зиготы и эмбрионы. //Успехи современной генетики. 1985. - Т. 13. - С.75-88.

4. Гилберт С. Биология развития: в 3-х т. М.: Мир. - 1995.

5. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. Л.: «Наука». 1989. - 350с.

6. Гоголевский П.А. Совершенствование биотехнологических приемов получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Автореф дис.канд. биол. наук. М. - 1992. - 20с.

7. Данилова J1.B. Сперматогонии, сперматоциты, сперматиды //В кн.: Современные проблемы сперматогенеза. /М: Наука. 1982. - С.25-72.

8. Данилова JI.B. Ультраструктурное исследование сперматогенеза. М: Наука. - 1978.

9. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Л.:Наука, Лен. Отд. -1988.-228 с.

10. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Генетическая трансформация млекопитающих // Молекулярные механизмы генетических процессов. -М. 1985. -С.84-93.

11. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.: Наука. - 1985. - С.84-93.

12. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. М.: Наука. - 1983. - 180с.

13. Милованов В.К. Достижения современной биологической науки в области размножения с.-х. животных. М: Правда. - 1950. - 31с.

14. Миталипова М.М. Факторы, влияющие на развитие эмбриональных стволовых клеток крупного рогатого скота и мыши в системе in vitro и in vivo. Дис.канд. биол. наук. - М., 1994. - 114с.

15. Пахотин М.В. Справочник по ветеринарной хирургии. М: Колос. -1977.-255с.

16. Пирс Э. Гистохимия. Москва. - 1962. - 963с.

17. Полежаева И.А. Получение, генетическая трансформация и использование эмбриональных стволовых клеточных линий. -Автореф. дис.канд. биол. наук. М., 1993. - 25с.

18. Приданцева Т.А. Выделение и характеристика примордиальныхзародышевых клеток свиньи. Дис.канд. биол. наук. - Дубровицы,2001. 110с.

19. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции. -М.: Наука. 1985. -207с.

20. Райцина С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих //Успехи современной биологии. -1967. Т.63. - С.135-153.

21. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М.: БЭБиМ. - 1998.-200с.

22. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. - 2000. -592с.

23. Ромейс Б. Микроскопическая техника. Москва. - 1953. - 718с.

24. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Москва. - 1946. - 328с.

25. Савченкова И., Фляйшманн М., Булла И, Брем Г. Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши для получения химерных животных //Цитология. 1996. - №38. - С.1118-1123.

26. Савченкова И.П. Введение гена lacZ E.coli в эмбриональные стволовые клетки мыши D3 электропорацией //Докл. РАСХН. 1996. -№ 6. - С.36-37.

27. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. Дубровицы. - 1999. - 95с.

28. Савченкова И.П., Приданцева Т.А., Сергеев Н.И., Эрнст Л .К. Выделение и очистка примордиальных половых клеток зародышей мышей //С.-х. биология. 2000. - №2. - С. 119-121.

29. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир. - 1987. -412с.

30. Серов O.JI. Перенос генов в соматические и половые клетки. -Новосибирск. 1985. - 120с.

31. Соколовская И.И. Биология воспроизведения с.-х. животных. М: Знание. - 1969. - 56с.

32. Филатов Ф.П., Тугизов Ш.М., Савченкова И.П. и др. Рекомбинантный поверхностный белок вируса гепатита В, экспонирующийиммунодоминанту мембранного белка вируса ВИЧ1 //ДАН. 1992. -Т.327(1). - С.172-175.

33. Amann R.P. A critical review of methods for evaluation of spermatogenesis from seminal characteristics //J. Androl. 1981. - V.2. - P.37-58.

34. Amann R.P. Detection of alterations in testicular and epididymal function in laboratory animals //Environ. Health Perspect. 1986. - V.70. - P. 149158.

35. Amann R.P. Sperm production rates //In: Johnson A.D., Gomes W.R., VanDemark N.L. (Eds.). The Testis. Academic Press, New York. 1970. -V.l. -P.433-482.

36. Behr J.P. Cene transfer with synthetic cationic amphiphiles: Prospects for gene therapy //Bioconjugate Chemistry. 1994. - V.5. - P.382-389.

37. Bellve A.R., Cavicchia J.C., Millette C.F., 0"Brien D.H., Bhatnagar Y.M., Dym M. Spermatogenic cells of the prepubertal mouse. Isolation and Morphological characterization //J. Cell boil. 1977. - V.74. - P.68-85.

38. Berardino M., Hoffner M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male germ cells //J.of Exper. Zoology. -1976. V.176(1). - P.61-72.

39. Berndtson W.E., Desjardins C. The cycle of the seminiferous epithelium and spermatogenesis in the bovine testis //Am. J. Anat. 1974. - V.140. -P.167-180.

40. Besmer P., Snyder H.W., Murphy J.E., Hardy W.D., Parodi A. The Perodi-Irgens feline sarcoma virus have homologous oncogenes, but in different contents of the viral genome //J. Virol. 1983. - V.46. - P.606-613.

41. Bonnerot C. et all. Methods in Enzymology. 1993. - V.225. - P.451.

42. Bouffard G.Injection des couleurs de benzidine aux animaux normaux //Ann. Inst. Pasteur. 1906. - V.20. - P.539-552.

43. Brinster R.L. & Avarbock M.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.11303-11307.

44. Brinster R.L. and Zimmerman W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation //Developmental biology. 1994. - V.91. - P.l 129811302.

45. Brinster R.L. et all. 1995.

46. Brinster, R.L., Palmiter, R.D. Harvey Lect. 1986. - V.80. - P. 1-38.

47. Bucci L.R. & Meistrich M.L. Mutat. Res. 1987. - V.176. - P.259-268.

48. Capecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells //Cell. 1980. - V.22(27). - P.9139-9143.

49. Capecchi, R.L. Science. 1989. - V.244. - P. 1288-1292.

50. Chabot В., Stephenson D.A., Chapman V.M., Besmer P., Bernstein A. The protooncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus //Nature. 1988. - V.335. - P.88-89.

51. Chen С., Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA //Mol. and Cell. Biol. 1987. - V.8(8). - P2745-2752.

52. Clermont Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: Seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal //Physiol. Rev. 1972. - V.52. - P.198-236.

53. Clermont Y. The cycle of the seminiferous epithelium in man //Am. J. Anat. 1963. - V.112. -P.35-51.

54. Clermont Y. Two classes of spermatogonial stem cells in thr monkey (Cercopithecus aethiops) //Am. J. Anat. 1969. - V.126. - P.57-72.

55. Clermont Y., Bustos-Obregon E. Re-examination of spermatogonial reneval in the rat by means of seminiferous tubules mounted "in toto'" //Amer. J. Anat. 1968. - V.122. - P.237-248.

56. Clermont Y., Hermo L. Spermatogonial stem cells and their behavior in the seminiferous epithelium of rats and monkeys //In: Stem cells of renewing cell populanions. /Cambridge: Acad. Press. 1976. - P.273-287.

57. Clouthier D.E., Avarbock M.R., Maika S.D., Hammer R.L. Rat spermatogenesis in mouse testis //Nature. 1996. - V.381. - P.418-421.

58. Courot M., Hochereau-de Reviers M.T., Ortavant R. Spermatogenesis //In:The testis (N.Y.). /Acad. Press. 1970. - V.l. - P.339-435.

59. De Rooji D.G., Grootegoed J.A. Spermatogonial stem cells //Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.10. - P.694-701.

60. Dirami G., Ravindranath N., Pursel V., Dym M. Effects of ctem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type A spermatogonia cultured in KSOM //Biol. Reprod. 1999. -V.61. -P.225-230.

61. Dirk G. de Rooij. Proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells //Reproduction. 2001. - V. 121. - P.347-354.

62. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Germ cell transplantation from large domestic animals into mouse testes //Molecular Reproduction and Development. 2000. - V.57(3). - P.270-279.

63. Dobrinski I., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes //Biol. Reprod. 1999. - V.61. -P.1331-1339.

64. Dolci S., Pesce M., Felici M. de. Combined action of stem cell factor, leukemia inhibitory factor and cAMP on in vitro proliferation of mouse primordial germ cells //Mol. Reprod. Dev. 1993. - V.35 - P. - 134-139.

65. Dym M., Clermont Y. Effects of x-rays on type A spermatogonia in the rat //Anat. Rec. 1967. - V.157 - P.238. Abstr.

66. Dym M., Clermont Y. Role of the spermatogonia in the repair of the seminiferous epithelium following X-irradiation of the rat testis //Amer. J. Anat. 1970. - V.128. - P.265-282.

67. Dym M., Jia M.-C., Dirami G., Price J.M. Expression of c-lcit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia //Biology of reproduction. 1995 - V.52. - P.8-19.

68. Dym.M., Fawcett D. Further observations on the numbers of spermatogonia, spermatocytes and spermatids connected by intercellular bridges in the mammalian testis //Biol. Reprod. 1971. - V.4. - P. 195-215.

69. Eagle H., Piez К.A. J. Exp. Med. 1962. - V.l 16. - P.29.

70. Ewing L.L., Davis J.C., Zirkin B.R. Int. Rev. Physiol. 1980. - V.22. -P.41-115.

71. Fawcett D.W. Intercellular bridges //Exp. Cell. Rec. Suppl. 1961. - V.l. -P. 174-181.

72. Fechheimer M., Boylan J.F., Parker S. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.8463-8467.

73. Forster W., Neumann E. Gene transfer by electroporation //In: Electroporation and electrofusion in cell biology. /Press. New York and London. 1989. -P.299-318.

74. Gerssler E.N., Ryan M.A., Housman D.E. The dominant-White Spoting (W) locus of the mouse encodes the c-kit protooncogene //Cell. 1988. -V.55. - P.185-192.

75. Godin I., Deed R., Cooke J. et al. Effects of the steel gene product on mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1991. - V.352. - P.807-809.

76. Goldmann E.E. Die aussere and innere Sekretion des gesungen und kranken Organismus in Lichte der "vitalen Farbung" //Beitr. Klin. Chirurg. 1909. -B.64. - S. 192-265.

77. Hannah-Alava A. Premeiotice studies of spermatogenesis //Adv. Genet. -1965. P.157-226.

78. Higashi Т., Sasai H., Suzuki F. Hamster cell line suitable for transfection assay of transforming genes //Proc. Natl. Sci. 1990. - V.87. - P.2409-2413.

79. Hochreau R. M.-T. de., Lincoln G.A. Seasonal variation in the red deer, Cervus elaphus //J. Reprod. Fertil. 1978. - V.54. - P.209-213.

80. Honaramooz A., Megee S., Dobrinski I. Germ cells transplantation in pigs. -2001.

81. Huckins C. Cell cycle properies of differentiating spermatogonia in adult Spraque-Dawley rats //Cell and Tissue Kinet. 1971. - V.4. - P. 139-154.

82. Huckins C. The spermatogonial stem cell population in adult rats. I. Their morphology, proliferation and maturation //Anat. Rec. 1971. - V.169. -P.533-558.

83. Huckins C., Oakberg E.T. Morphological and quantitative analysis of spermatogonia in mouse testis using whole mounted seminiferous tubules //In:The irradiated testis. /Anat. Rec. 1978. - V.192. - P.529-542.

84. Hyttinen J.-M., Peura Т., Tolvanen M., Aalto J.,Alhonen L., Sinervirta R.,Halmekyto M. Bio/Technology. 1994. - V.12. - P.606-608.

85. Izadyar F., Creemers L.B., Ouden K., Rooij D.G. Culture and transplantation of bovine spermatogonial stem cells. VII Inter. Congress of Andrology, Monreal, Canada. - 2001. - 15-19 June.

86. Izadyar F., van Dissel-Emiliani F., van Pelt A., de Rooij D.G. Spermatogonial stem cell transplantation //Molecular and Cellular Endocrinology. 2000. - V.169. - P.21-26.

87. Jaenisch, R. Science. 1988. - V.240. - P. 1468-1474.

88. Jiang F.X. Behaviour of spermatogonia following recovery from busulfan treatment in the rat. //Anat. Embryol. (Berl.). 1998. - V. 198(1). - P.53-61.

89. Johnson L. Review article: spermatogenesis and aging in the human //J.Androl. 1986. - V.7. - P.331-354.

90. Johnson L. Spermatogenesis //In: Cups P.T. (Ed.). Reproduction in Domestic Animals /4th edn. Academic Press (New York). 1991. - P. 173219.

91. Johnson L., Lebovitz R.M., Samson W.K. Germ cell degeneration in normal and microwave-irradiated rats: potential sperm production rates at different developmental steps in spermatogenesis //Anat. Rec. 1984. -V.209. - P.501-507.

92. Johnson L., Petty C.S., Neaves W.B. A new approach to quantification of spermatogenesis and its application to germinal cell attrition during human spermiogenesis //Biol. Reprod. 1981. - V.25. - P.217-226.

93. Johnson L., Petty C.S., Porter J.C., Neaves W.B. Germ cell degeneration during postprophase of meiosis and serum concentrations of gonadotropins in young adult and older adult men //Biol. Reprod. 1984. - V.31. - P.779-784.

94. Johnson L., Varner D.D., Roberts M.E., Smith T.L., Keillor G.E., Scrutchfield W.L. Efficiency of spermatogenesis: a comparative approach //Anim. Reprod. Sci. 2000. - V.60-61. - P.471-480.

95. Johnson L., Wilker C.E., Cerelli J.S. Spermatogenesis in the bull //Tech. Conf. Artif. Insem. Reprod. 1994. - V.15. - P.9-27.

96. Kennelly J.J., Foote R.H. Sampling boar testes to study spermatogenesis quantitatively and to predict sperm production //J.Anim. Sci. 1964. - V.23. - P.160167.

97. Keulen C.J.G., Rooij M.F. de. The recovery from various gradations of cell loss in the mouse seminiferous epithelium and its implications for thespermatogonia! cell renewal theory //Cell and tissue kinet. 1974. - V.7. -P.549-558.

98. Kietsvenbaum A. Mammalian spermatogenesis in vivo and somatic cell lineages //Endocr. Rev. 1994. - V. 15. - P. 116-134.

99. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. High velocity microprojectiles for delivering nuclei acids into living cells //Nature. 1987. - Y.327. - P.70-73.

100. Leblond C.P.,Clermont Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat //Ann. Y. Acad. Sci. 1952. - V.52. -P.548-573.

101. Mansour S.J., Matten W.T., Hermann A.S. Transformation of mammalian cells by constituvely active MAP kinase //Science. 1994. - V.265. - P.966-970.

102. Marret C., Durand P. Culture of porcine spermatogonia: effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication //Reprod. Nutr. Dev. 2000. - V.40(3). -P.305-319.

103. Morena A.R., Boitani C., Pesce M., Felici M. de, Stefanini M. Isolation of highly purified type A spermatogonia from prepubertal rat testis //J. Androl. 1996. - V.17. -P.708-717.

104. Morgan J.M., Morton H.J., Parker R.C. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1950. -N.73.

105. Nagano M., Avarbock M.R., Leonida E.B., Brinster C.I., Brinster R.L. Culture of mouse spermatogonial stem cells //Tissue Cell. 1998, - V.30. -P.389-397.

106. Nagano M., McCarrey J.R., Brinster R.L. Primate spermatogonial stem cells colonize mouse testes//Biol, of Reprod. -2001. V.64. - P.1409-1416.

107. Oakberg E.F. Spermatogonial stem cell reneval in the mouse //Anat. Rec. -1971. V.169. - P.515-532.

108. Oakberg E.F., Huckins C. Spermatogonial stem cell renewal in the mouse as revealed by H3-thymidine labeling and irradiation //In: Stem cells of renewing cell populations. Ed. A.B. Cairnie et all. N.Y.etc. /Acad. Press. -1976. -P.287-302.

109. Ogawa Т., Arechaga J.M., Avarbock M.R., Brinster R.L. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules //Int. J. Dev. Biol. -1997. -V.41(l).-P.l 11-122.

110. Pari G.A. Uber die verwandbarkeit vitaler Karmineinspritzungen fur die pathologische Anatomie //Frankfurt. Ztschr Pathol. 1910. - B.4. - S.l-20.

111. Pelt A.M.M. van., Morena A.R., Lissel-Emiliani F.M.F. van., Boitani t\, Gaemers I.C., Rooij D.G. de, Stefanini M. Isolation of the synchronized A spermatogonia from adult vitamin A-deficient rat testes //Biol. Reprod. -1996. V.55. -P.439-444.

112. Potter H. Molecular genetic applications of electroporation //In: Electroporation & electrofusion in cell biology /Press. New York & London. 1989. -P.331-341.

113. Pursel, V.G., Pinkert, C.A., Miller, K.F., Bolt, D.J.,Campbell, R.G., Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Hammer, R.E. Science. 1989. - V.244. -P.1281-1288.

114. Rassoulzadegan M., Binetruy В., Gusin F. High frequency of gene transfer after fusion between bacteria and eukaryotic cells //Nature. 1982. - V.295.- P.257-259.

115. Reis M.M.,Tsai M.C., Schlegel P.N., Feliciano M., Raffaelo R., Rosenwaks Z., Palermo D. Xenogeneic transplantation of human spermatogonia //Zygote. 2000. - V.8. - P.97-105.

116. Ribbert M. Die Abschidung intravenous injizierten gelosten Karmins in den Geweben //Ztschr. Allgem Physiol. 1904. - B.4. - S.201-214.

117. Robertson E.J. Using embryonic stem cell to introduce mutations into the mouse germ line //Biol. Reprod. 1991. - V.44. - P.238-245.

118. Romrell I. et al. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Morphological characterization //Developmental Biology. 1976.- V.49(l).-P.119-131.

119. Rooij D.G. de, Grootegoed J.A. Spermatogonial stem cells //Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.l0. - P.694-701.

120. Rooij D.G. de. Transplantation of spermatogonial stem cells. 2002.

121. Roosen-Runge E.C. The Process of spermatogenesis in Animals //Cembridge Univ. Press. 1977.

122. Rose J.K., Buonocore L. and Whitt M.A. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells //Biotechniques. -1991. V.10. -P.520-525.

123. Rossi P., Dolci S., Albanesi C., Ricca R., Geremia R. Follicle-stimulating hormone induction of steel factor (SLF) mRNA in mouse Sertoli cells andstimulation of DNA synthesis in spermatogonia by soluble SLF //Dev. Biol. 1993. - V.155. -P.68-74.

124. Rossi P., Marziali G., Albanesi C., Charlesworth A., Geremia R., Sorrentino V. A novel c-kit transcript, potentially encoding a truncated receptor, originates within a kit gene intron in mouse spermatids //Dev. Biol. 1992. - V.152. - P.203-207.

125. Russel L.D., Ettlin R.A., Hikim A.P., Clegg E.D. Histological and Histopathological Evoluation of the Testis //Cache River Press, Gearwater, FL. 1990.-P. 1-40.

126. Russell L.D., Franca L.R., Brinster R.L. Ultrastructural observations of spermatogenesis in mice resulting from transplantation of mouse spermatogonia//J. Androl. 1996. - V.17(6). - P.603-614.

127. Ruysschaert J.-M., Ouahabi A., Willeaume V. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells //Biochem. and Bioph. Res. Comm. -1994. V.203(3). - P.1622-1628.

128. Savchenkova I.P., Korgikova S.V., Kostereva N.V., Tchaban I.M., Ernst L.K. Culture and transplantation of spermatogonial stem cells 111 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Montpellier, France. -2002. -P.836-840.

129. Seidel G. Embryo transfer: the next 100 years //Theriogenology. 1991. -V.35(l). - P.171-180.

130. Seidel G. Production of genetically identical sets of mammals: Cloning //J.Exp. Zool. 1983. - V.2. - P.228.

131. Smithies, O. Trends Genet. 1993. - V.9. - P. 112-116.

132. Soprano K.J. Use of cloned SV40 DNA fragments to study signals for cell proliferation //In: Recombinant DNA and Cell Proliferation. 1984. - P.4-6.

133. Sorokin L.M., Morgan E.H., Yeoh G.C. et al. A method for infection of cultured myogenic cells with Rous sarcoma virus using polybrene //In vitro Cellular. Devel. Biol. 1989. - V.25(l). - P.63-68.

134. Stewart C.L. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line //Dev. Biol. 1994. - V.161. - P.626-628.

135. Strelchenko N.S. Die Osnabrucker Schwarzbuntzucht. 1997. - V.3. - P.42.

136. Swierstra E.E., Gebauer M.R., Pickett B.W. Reproductive physiology of the stallion: I. Spermatogenesis and testis composition //J. Reprod. Fertil. -1974. -V.40. -P.l 13-123.

137. Tajima Y., Onoue H., Nishimune Y. Biologically active kit ligand growth factor by mouse Sertoli cells and is defective in Sli mutant mice //Development. 1991. - V.l 13. - P. 1031-1035.

138. Takai T. and Ohmori H. DNA transfection of mouse lymphoid cells by the combination of DEAE-dextran-mediated DNA uptake and osmotic shock procedure //Bioch. and Biophs. Acta. 1990. - V.l048. - P. 105-109.

139. Tan J.C., Nocka K., Ray P., Traktman P., Besmer P. The dominant W42 spoting phenotype results from a missence mutation in the c-kit receptor kinase //Science. 1990. - V.247. - P.209-212.

140. Totzke F., Marme D., Hug H. Inducible expression of human phospholipase C-v2 and its activation by platelet-derived growth factor A-chain homodimer in transfected NIH3T3 fibroblasts //Eur. J. Biochem. 1992. -V.203. - P.633-639.

141. Uckert W., Walther W. Retrovirus-mediated gene transfer in cancer therapy //Pharmac. Ther. 1994. - V.63. - P.323-247.

142. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review //Reprod. Fertil. Dev. 1994. - V.6. - P.563-568.

143. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et all. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells //Nature. 1997. - V.385. - P.810-813.

144. Wilmut, I., Hooper, M.L., Simons, J.P. J. Reprod. Fertil. 1991. - V.92. -P.245-279.

145. Zandrum В., Shettles M.D. Diploid nuclear replacement in mature human ova with cleavage //Am J.Obstet. gyncol. 1979. - V.133. - P.222-224.

146. Zelenin A.V., Titomirov A.V., Kolesnikov V.A. Genetic transformation of mouse cultured cells with help of high velocity mechanical DNA-injection //FEBS Letters. 1989. - V.244. - P.65-67.

147. Zimmermann U., Riemann F., Pilwat G. Enzyme loading of electrically homogeneous human red blood cell ghosts prepared by dielectric breakdown //Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.436. - P.460-474.