Выделение и свойства изоформ УДФ-Д-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-Д-глюкозопирифосфорилазы из Pisum sativum и Caldieria sulphuraria тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Проселков, Павел Владимирович

• Проселков, Павел Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Проселков, Павел Владимирович

I. ВВЕДЕНИЕ

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Метаболизм галактозы у животных и микроорганизмов

Глава 2. Пути метаболизма галактозы у растений и её токсичность

Глава 3. УДФ-0-галактозо-4-эпимераза - ключевой фермент галактозного метаболизма растительной клетки

Глава 4. Роль У Д Ф-Б-глюкозопирофосфо рилазы в метаболизме галактозы

Глава 5. Галактаны как продукт галактозного метаболизма

Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 6. Объекты и методы исследований

6.1. Объекты исследований

6.2. Методы исследований

6.2.1. Определение активности галактокиназы

6.2.2. Определение активности УДФ-галактозопирофосфорилазы

6.2.3. Определение активности галактозо-1-Ф-уридилтрансферазы

6.2.4. Определение активности УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы

6.2.5. Определение активности УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы

6.2.6. Определение активности фосфоглюкомутазы

6.2.7. Определение активности фосфоглюкозоизомеразы

6.2.8. Определение активности фосфоманнозоизомеразы

6.2.9. Определение активности фосфоманномутазы

6.2.10. Определение активности глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы

6.2.11. Определение активности малатдегидрогеназы

6.2.12. Определение активности пероксидазы

6.2.13. Определение активности альдолазы

6.2.14. Определение активности каталазы

6.3. Выделение, очистка и исследование свойств ферментов

6.3.1. Получение гомогената

6.3.2. Ионообменная хроматография на DEAE-фрактогеле

6.3.3. Адсорбционная хроматография на гидроксилапатите

6.3.4. Гидрофобная хроматография

6.3.5. Аффинная хроматография

6.3.6. Гель-фильтрация

6.3.7. Жидкостная хроматография низкого давления (LPLC)

6.3.8. Определение К , V ,К К. m max 1' si

6.3.9. Определение K^ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы

6.3.10. Исследование термостабильности и выяснение оптимальных условий хранения УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы

6.3.11. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы

6.3.12. Электрофорез на пластинках

6.4. Жидкостная хроматография высокой разрешающей способности (HPLC)

6.5. Определение концентрации белка

6.7. Статистическая обработка экспериментальных данных

6.8. Фирменная принадлежность реактивов 55 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 7. Активность ферментов при выращивании Galdieria sulphurаria на среде с различными углеводами

Глава 8. Очистка и свойства УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы из

Galdieria sulphuraria

8.1. Выделение стабильной изоформы

8.2. Активация в ходе очистки нестабильной изоформы

Глава 9. Выделение и характеристика УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из Galdieria sulphuraria

Глава 10. Активность ферментов галактозного метаболизма у Pisum sativum

Глава 11. Нестабильность фермента - УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из Pisum sativum

11.1. Характеристика первой изоформы

11.2. Свойства второй изоформы

11.3. Субстратное ингибирование УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из проростков Pisum sativum

Глава 12. Исследование свойств УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из проростков Pisum sativum

Глава 13. Изучение транспорта галактозы в клетки корня Pisum sativum

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и свойства изоформ УДФ-Д-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-Д-глюкозопирифосфорилазы из Pisum sativum и Caldieria sulphuraria»

Актуальность проблемы. От 20 до 30 различных моносахаридов и до 17 сахарных спиртов присутствует в различных количествах в растениях (Lewis D. Н., 1984). Метаболизм этих соединений детально изучен только для глюкозы и фруктозы. Главная причина ограниченности знаний об участии Сахаров в метаболизме, транспорте, хранении и осмотическом контроле -низкая активность вовлечённых в данные процессы ферментов. У высших растений их активность может быть определена только на определённых стадиях развития или в специальных тканях. Так, например, до сих пор отсутствует целостная картина относительно метаболизма такого важного для клетки углевода как галактоза. Существует также и проблема галактозной токсичности, которая более или менее решена для животных, человека и микроорганизмов (Berry G. Т. et al., 1995; Szczypka М., 1996; Landt М. et al., 1997; Greber-Platzer S. et al., 1997 и мн. др.), однако, для высших растений её причина остаётся невыясненной уже на протяжении восьмидесяти лет (Knudson L., 1917; White P. R., 1940; Reinholz Е., 1954; Farkas G. L., 1954; Ferguson J. D. et al., 1958; Maretzki A., Thom A., 1978; Dressler K. et al., 1982; Frick H., 1991; Frick H., Morley K., 1995 и мн. др.). Из всех ферментов, принимающих непосредственное участие в метаболизме галактозы, особая, ключевая роль принадлежит двум: УДФ-0-галактозо-4-эпимеразе и УДФ-D-глюкозопирофосфорилазе. Продукты этих ферментов являются составляющими многочисленных клеточных компонентов: целлюлозы (Wright В. Е., 1959; Zetsche К., 1968), клеточных полисахаридов как у высших растений (Feingold D. S. et al., 1958; Goldemberg S. H., Maréchal L. R., 1963; Павлинова О. A., Прасолова M. Ф., 1970), так и y микроорганизмов (FukasawaT. et al., 1962; Lieberman M. et al., 1970), трегалозы (RothR., Sussman M., 1968), гликозидов (Franz G., Meier H., 1969), гликолипидов (Curtino J. A. et al., 1968), гепарина (Danishefsky I., Héritier-Watkins O., 1957), бактериальных антигенов (Bernstein R. L., Robbins P. W., 1965), лактозы (Steelman V. S., Ebner К. E., 1966), глюкуронидов (Shikamura M., Tsuboi К. К., 1961; Roberts R. M., Rao К. M. К., 1971), рамнозы (Sundararajan T. A. et al., 1962; Barber G. A., 1971), рафинозы и стахиозы (Hasegawa M. et al., 1951; Shiroya T., 1963), D- и L-галактанов (Aspinall G. O., 1970; Morvan D. R. et al., 1989; Goubet F. et al., 1993; Goubet F., Morvan G, 1994). Таким образом, получив достоверные сведения относительно свойств эпимеразы и пирофосфорилазы, представляется возможным не только выяснить регуляторные механизмы галактоз-ного метаболизма клетки, но и, возможно, найти ответ на вопрос о причине токсичности галактозы для высших растений. Воспроизведнение полной картины данного процесса позволило бы раскрыть ещё один слабо изученный аспект всего многообразия процессов, происходящих в живой клетке. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение свойств ферментов, занимающих ключевые позиции в галактозном метаболизме клетки, УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-0-глюкозопиро-фосфорилазы, исследование их физико-химических, каталитических и регуляторных характеристик. С целью выяснения причин токсичности галактозы для высших растений предполагалось осуществить сравнение эпимеразы и пирофосфорилазы из галактозо-чувствительного и галактозорезистентного объектов и предположить возможный механизм, объясняющий токсичность.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Очистить, охарактеризовать и сравнить УДФ-0-галактозо-4-эпимеразу из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентного объектов.

2. Очистить, охарактеризовать и сравнить УДФ—Б-глюкозо-пирофосфорилазу из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентного объектов.

3. Исследовать в гомогенате активность основных ферментов галактозного метаболизма у нечувствительного к галактозе растения.

4. Исследовать в гомогенате активность основных ферментов галактозного метаболизма у чувствительного к галактозе растения.

5. Изучить транспорт галактозы в клетки корня гороха, подверженного влиянию галактозы. Затруднение транспорта галактозы может быть одной из причин токсичности.

6. Представить гипотетическую модель молекулярных механизмов, лежащих в основе токсического действия галактозы на высшие растения. Научная новизна работы. Проведённые исследования расширяют представления о свойствах ферментов галактозного метаболизма клетки и позволяют сделать предположение относительно возможной причины токсичности галактозы для высших растений.

Впервые у термоацидофильной красной водоросли ОсйскеНа зи1ркигапа обнаружено наличие двух изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, которые отличаются как по своим свойствам, так и по стабильности. Активация в ходе очистки одной из изоформ предполагает увеличение её роли в метаболизме поступающей извне галактозы.

В проростках гороха УДФ-О-галактозо-4-эпимераза также представлена в виде двух изоформ. Обе подвергаются субстратному ингибированию УДФ-О-галактозой.

Недостаток знаний относительно свойств растительной УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы был восполнен характеристикой и получением гомогенного препарата фермента из красной водоросли, а также выделением двух его изоформ из гороха. Способность пирофосфорилазы метаболизиро-вать галактозо-1-Ф указывает на его существенную роль во всём галактозном метаболизме, однако, это же свойство является одним из ведущих аспектов галактозной токсичности. Данное наблюдение подтверждает предположение об отсутствии у растений УДФ-Б-галактозопирофосфорилазы, которой ранее приписывалась одна из ведущих ролей в метаболизме галактозо-1-Ф и функционировании альтернативного пути кяе1Ьаскег. Данный фермент у растений отсутствует, что вполне объясняет невозможность его выделения и получения какой-либо чёткой характеристики, а его функция опосредуется неспецифической активностью УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы, роль которой значительно возрастает при увеличении потока экзогенной галактозы.

Из всех девяти ферментов галактозного пути только для УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы обнаружена индукция в два с лишним раза при выращивании красной термоацидофильной водоросли СакИепа $и1ркигапа на среде с галактозой, что свидетельствует о непосредственном вовлечении данного фермента в метаболизм избытка галактозы. Остальные ферменты, в том числе и из проростков разного возраста Pisum sativum, не показали заметного изменения своей активности. Никем ранее все ферменты галактозного метаболизма в комплексе не рассматривались.

Впервые экспериментально показано, что скорость транспорта и последующего метаболизма галактозы при её попадании внутрь клеток корней гороха очень высока и вполне сопоставима со скоростью потребления клеткой глюкозы и фруктозы.

Обнаружена изначальная причина токсичности галактозы для высших растений. Ею является субстратное ингибирование УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы, которое приводит к накоплению УДФ-Б-галактозы и последующему вовлечению в метаболизм УДФ-Э-глюкозопиро-фосфорилазы. Данное субстратное ингибирование обнаружено только для эпимеразы из проростков гороха, для которых галактоза токсична, но оно отсутствует у Galdieria sulphuraria, для которой галактоза не является ингибитором роста.

Впервые предлагается обобщающая гипотетическая модель молекулярных механизмов, лежащих в основе токсического действия галактозы на высшие растения.

Практическая значимость исследования. Сведения, полученные в ходе выполнения данной работы имеют как фундаментально-теоретическую, так и непосредственную практическую ценность.

Разработанная схема очистки и получения электрофоретически гомогенного препарата УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Высокая термостабильность эпимеразы делает перспективным её применение в лабораторных тестах на содержание в крови УДФ-Б-галактозы в клинической диагностике при таком широко распространённом во всём мире заболевании, как галактоземия.

Метаболизм галактозы самым тесным образом связан с процессом формирования галактанов растениями, так как субстратами для их синтеза являются именно галактозо-производные. Применение же галактанов в народном хозяйстве распространяется от их использования в качестве заменителей сахара для больных диабетом до очистителей нефти от кислых загрязнителей.

В сельском хозяйстве морские водоросли широко используются в качестве удобрений и стимуляторов роста. Чаще всего это бурые водоросли, но могут быть и зелёные, и красные. Полисахаридами бурых водорослей являются альгинаты, а красных - галактаны, которые подвергаются в почве действию гидролитических ферментов, экскретируемых бактериями, например, Pseudomonas carrageenovora. Освобождаемая при этом галактоза влияет на рост корней большинства высших растений, поэтому, на основании данной работы, рекомендуется проводить предварительный тест на устойчивость УДФ-В-галактозо-4-эпимеразы к избытку УДФ-Б-галактозы у культивируемых растений во избежание токсикоза галактозой и их последующей гибели.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на конференции Progress in Plant Sciences (Masonmagyarovar, Hungary, 1996). Результаты были сообщены в виде четырёх докладов на Progress-seminar (Freie Universitaet, Berlin, 1995-1998). Они также являются материалами конференций американского общества физиологов растений

Vancouver, Canada, 1997), NATO ARW (Kolymbari, Crete, 1998) и европейского фитохимического общества Bioactive Plant Carbohydrates (Sandoya, Norway, 1998). Данная работа в сентябре 1998 года удостоена премии европейского фитохимического общества.

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья и 5 тезисов, подготовлены к печати 3 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает 13 глав; 122 страницы; 27 рисунков; 10 таблиц и 5 фотографий. Использовано 272 литературных источника.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Метаболизм галактозы у животных и микроорганизмов

Галактоза необходима для всех живых организмов. Структурно она представляет собой С-4 эпимер глюкозы (Рис. 1). н о Н О * \ У/ с 1 С ■

1 н- с -он 1 н - 1 С - ОН

1 НО - с - н 1 НО - 1 с - н 1

1 н- с-он но - 1 с - н

1 н- с - он н- 1 с - он

1 СН2ОН 1 СН2ОН

Глюкоза Галактоза

Рис. 1. Структурные формулы глюкозы и галактозы.

Метаболизм галактозы детально изучен у дрожжей и млекопитающих, особенно у человека, так как некоторые наследственные заболевания связаны с отсутствием ферментов, метаболизирующих галактозу (Рис. 2). Недостаток или пониженная активность ферментов приводят к ряду аномалий, в совокупности называемых галактоземия (Beutler Е., 1991; Petry К. et al., 1991; Reichardt J. К. V. et al., 1992; Reichardt J. К. V., 1992; Ng W. G. et al., 1994; Elsas К. et al., 1994; Ashino J. et al., 1995; Segal S., 1995; Schweitzer S., 1995; Szczypka M., 1996; Landt M. et al., 1997; Greber-Platzer S. et al., 1997; Berry G. T. et al., 1997; Landley S. D. et al., 1997). Больные новорождённые проявляют неспособность к интенсивному росту, увеличение печени и селезёнки, рвоту, желтуху, протеиноурею, аминоацидоурею, повышенный уровень содержания галактозы в крови и последующую экскрекцию больших количеств данного углевода в моче, диарею, катаракту и недостаточность умственного развития (Schwarz V. et al., 1956; Segal S. et al., 1963). Также одно из последствий галактоземии - ранняя менопауза (Cramer D. W. et al., 1995). галактоза галакто-киназа

АТФ галактозо-1-Ф

УТФ

УДФ-О-галактозопирофосфорилаза о

УДФ-Б-глюкоза галактозо-1-Ф-уридилтрансфераза ГЛЮКОЗО-1-Ф 1

УДФ-0-галактоза

Рис. 2. Два альтернативных пути метаболизации галактозы.

Было показано, что причиной галактозной токсичности у питающихся галактозой животных является аккумуляция галактозо-1-Ф, ингибирующего фосфоглюкомутазу (Ginsburg V., Neufeld Е. F., 1957; Sidbury J. В., 1957; Sidbury J. В., 1960), УДФ-О-глюкозопирофосфорилазу (Oliver I. T., 1961), глюкозо-6-Ф-дегидрогеназу (Lerman S., 1959) и глюкозо-6-фосфатазу (Kalckar H. M., Maxwell E. S., 1958); и УДФ-Б-галактозы (Schwarz V., Golberg L., 1955; Hansen R. G. et al., 1956; Klethi J., Mandel P., 1962), ингибирующей УДФ-D-глюкозодегидрогеназу (Salitis G., Oliver I. T., 1964). Молодые животные аккумулируют галатозо-1-Ф в своих тканях как результат диеты с высоким содержанием галактозы (Kosterlitz H. W., 1943; Schwarz V., Golberg L., 1955; Schwarz V. et al., 1956), хотя имеется и сообщение о том, что не известно, играет ли роль диета в уровнях УДФ-О-глюкозы и УДФ-О-галактозы

Palmieri M. J. et al., 1991). Для микрорганизмов характерно разнообразие путей метаболизма галактозы, так, например, физиологически значимый путь у Staphylococcus aureus - тагатозо-6-фосфатный, ферменты которого являются индуцибельными. Его существование связано с тем, что при транспорте галактозы внутрь клетки формируется галактозо-6-Ф (Simoni J. L., Roseman S., 1973; Bissett D. L., 1974), синтез которого детально изучено для Е. сой, где транспорт галактозы осуществляется фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системой (Roseman S., 1975). Совершенно иной путь метаболизма галактозы характерен для Pseudomonas saccharophila (Doudoroff М. et al., 1956; De Ley J., 1957). У Aspergillus nidulans изучена конститутивная пермеаза для галактозы, которая также отвечает за транспорт и глюкозы (Roberts R. М., Rao К. М. К., 1971). У Е. coli три фермента, формирующие оперон (Buttin G., 1963; Adler J., Kaiser A. D., 1963; Davison J. et al., 1967; Pfeifer D., Oellerman R., 1967) и пермеаза, опосредующая метаболизм галактозы, индуцируются в 15 раз добавлением в среду этого углевода (Epstein W., Beckwith J. R., 1968). У Bacteroides thetaiotaomicron система транспорта галактозы также индуцибельна (Degnan В. A., Macfarlane G. Т., 1995). Таким образом, если у животных и микроорганизмов и встречаются проблемы метаболизма галактозы, то они опосредованы либо отсутствием главных метаболизирующих её ферментов, либо нарушением механизма их индукции.

Глава 2. Пути метаболизма галактозы у растений и её токсичность

Различают два альтернативных пути метаболизма галактозы - Lelior и Isselbacher, ключевыми ферментами которых являются галактозо-1-Ф-уридилтрансфераза (КФ 2.7.7.12) и УДФ-О-галактозопирофосфорилаза (КФ 2.7.7.10), соответственно. Несмотря на то, что оба пути присутствуют у человека (Рис. 2), путь Leloir, по-видимому, является главным для галактозного метаболизма (Isselbacher С., 1958). У растений галактозо-1-Ф-уридилтрансфераза была очищена и полностью охарактеризована только из красной термоацидофильной водоросли Galdieria sulphuraria (Gross W., Schnarrenberger С., 1996). Другой фермент - УДФ-О-галактозопирофосфорилаза не был никогда ни очищен, ни охарактеризован, и до сих пор не ясно, присутствуют ли у высших растений оба пути и Isselbacher, и Leloir или же только один Leloir .

Галактоза токсична для большинства высших растений, и только некоторые водоросли (например, Galdieria sulphuraria), Cucumis sativus и немногие другие высшие растения или их изолированные ткани и органы могут использовать галактозу для своего роста (Таблица 1). Farkas G. L (1954) утверждает, что галактозная токсичность носит универсальный характер для всех высших растений, хотя имеются сведения и о её нетоксичности. Позже Neish А. С. (1958), Loewus F. A., Jang R. (1958) и Neufeld Е. et al. (1960) показали, что высшие растения способны к утилизации галактозы. Для Chlorella vulgaris были тестированы 11 Сахаров для гетеротрофного роста, однако, метаболизироваться могли только глюкоза и галактоза (Endo Н. et al., 1974). Сама токсичность является как видоспецифичной, так и органо- и онтогенозависимой. Порой, один и тот же объект ведёт себя по отношению к галактозе различным образом на разных этапах онтогенеза (Таблица 1).

Таблица 1.

Токсичность галактозы для высших растений и присутствие галактозо-1-Ф-уридилтрансферазной и УДФ-Б-галактозопирофосфорилазной активностей.

Токсичность Галактозо-1- УДФ-D-ra

Растение (орган) галактозы Ф-уридил- лактозопиротрансфераза фосфорилаза

Avena sativa (колеоптили1) токсична1 '2 да1

Betula (каллус) не токсична3

Brassica napus (интактные токсична4 корни проростков)

Callitriche stagnalis токсична5

Callitriche stagnalis (каллус) не токсична5

Cardamine (проростки) не токсична6

Chrysantenum frutescens токсична7

Cucumis melo (интактные и не токсична4 изолированные корни )

Cucumis sativus (интактные и не токсична2-4 изолированные корни )

Cucumis sativus (каллус) не токсична8

Cucumis sativus (плодоножки) нет9-10 да9-10

Cucurbita реро (интактные токсична4 корни проростков)

Daucus carota (каллус) нетоксич.11»12

Galdieria sulphuraria не токсич.1314 да 13,14 нет 13Д4

Gossipium herbaceum не токсична15 котиледонии семян)

Helianthus annuus токсична416 интактные корни) не токсична17

Helianthus annuus (культура ткани) Hordeum vulgare Isalis tinctoria (интактные и изолированные корни) Lemna gibba Lemna minor Lemna minor (каллус) Lepidium sativum (проростки) Lepidium sativum (интактные корни проростков) Lepidium sativum (изолированные корни проростков) Linum usitatissimum (корни, листья) Lycopersicon esculentum (корни)

Medicago sativa (листья, корни) Nicotiana glauca (культура ткани) Petunia hybrida (листья) Phaseolus vulgaris (семена) Pisum sativum (проростки, корни) Saccharum Saccharum (каллус) Seeale cereale

Sinapis alba (интактные корни проростков) Spirodella punctata Tagetes erecta (культура ткани) токсична7 токсична2-18 токсична4 токсична5'19

ТОКСИЧ.3'5'20"22 нетоксич.5'21'22 не токсич.2'6-23 не токсична4 токсична4 нет

22 да

22 не токсична17 токсична2'24-25 токсична26'25 токсична16 токсична7 не токсична27 токсична13 токсична2-13'28 токсична29 не токсична29 2 токсична токсична4 да27 нет13 да29 не токсична5 токсична7

Trifolium pratense токсична2

Triticum (листья, корни) токсична17-28'30

Vicia sativa токсична2

Vigna (эпикотели) не токсична1 да1

Vinca rosea (культура ткани) не токсична7

Wolffia arrhiza не токсична3

Wolffia brasiliensis токсична5

Zea mays токсична2'18

1- Inouhe M. et al., 1987; 2- Stenlid G., 1959; 3- 1гамбердиев А., неопубликова- но;4- Stenlid G., Dauckwordt-Liliestroem С., 1961;5- Frick Н., 1994; 6- Wachtel Н. К., 1943; 7- Hüdebrandt А. С., Riker A. L., 1949; 8- Gross К. С. et al., 1981; 9-Gross К. С., Pharr D. М., 1982;10- Smart Е. L., Pharr D. М. , 1981; п- Verma D. С., Dougall D. К., 1977; 12- Gautheret R. J., 1945; 13- Prosselkov P. V. et al., 1996; 14- Gross W., Schnarrenberger C., 1995;15- Shiroya T. ,1963;David S. В., 1954; 17- Burstroem H., 1948; l8- Roberts R. M. et al., 1971; l9- Hubald M., Augsten H., 1977; 20. De Kock P. С. et al., 1979; 21- Frick H., 1991; 22- Frick H. , Morley K, 1995; 23- Reinholz E., 1954; 24. Farkas G. L., 1954; 25. Ferguson J. D. et al., 1958; 26- White P. R., 1940; 27- Dressler K. et al., 1982; 28- Knudson L., 1917; 29- Maretzki A., Thom A., 1978;30- Stenlid G., 1957; токсич. - токсична.

Концентрация галактозы с 5 мМ и выше может быть токсичной для растений (Burstroem Н., 1948; Ordin L., Bonner J., 1957; Ferguson J. D. et al., 1958; Roberts R. M. et al., 1971) и минимальная отмеченная концентрация её токсичности - 0.1% (Street Н. Е., 1969) и 0.2 мМ (Ferguson J. D., Street H. E., 1958). Сообщения о наличии свободной галактозы внутри клетки противоречивы. Галактоза не обнаружена у Phaseolus vulgaris на какой-либо стадии развития (Cooper R. A., Greenshields R. N., 1961), Voandzeia subterrania (Amuti К. S., Pollard С. J., 1977), колеоптилей Avena и эпикотелей Vigna (Inouhe M. et al., 1987) и других растениях (Nigam V. N., Giri К. V., 1961; Cooper R. A., Greenshields R. N., 1961; Pazur J. et al., 1962; Shiroya Т., 1963; Meideil G. E., 1964; Gould M. F., Greenshields R. N., 1964; Shadaksharaswamy M., Ramachandra

G., 1968; Pridham J. В. et al., 1969; Loewus F. A., Tanner W., 1982). При прорастании семян хлопка не было обнаружено ни галактозы, ни галактозосодержащих олигосахаридов (Shiroya Т., 1963). Не обнаружено галактозы и в клетках Galdieria sulphuraria (Nagashima H., Fukuda J., 1983), хотя о её малом количестве сообщение сделал Reed R. H. (1983). Пул этого углевода не определяем бумажной хроматографией во фракции растворимых Сахаров (Gross К. С. et al., 1981; Pazur J., Shadaksharaswamy M., 1962; Pharr D. M. et al., 1977). Но, тем не менее, плодоножки огурца содержат галактозу, однако при концентрации, которая выходит за пределы разрешающей способности бумажной хроматографии (Gross К. С. et al., 1981; Gross К. С., Pharr D. M., 1982). Свободная галактоза обнаружена у Gleditsia (Courtois J. Е., Le Dizet P., 1966), карубабе, белой акации и люцерне (McCleary В. V., Matheson N. К., 1976). Галактоза входит в запасные продукты, транпортные углеводы, и, чаще всего, в материал клеточных стенок растений (Loewus F. A., Tanner W., 1982) (Рис. 3). Её метаболизм начинается с формирования галактозо-1-Ф под влиянием галактокиназы (КФ 2.1.7.6). Далее подключается галактозо-1-Ф-уридил-трансфераза (КФ 2.7.7.12), фермент пути Le loir, который занимает одну из центральных позиций во всём галактозном метаболизме клетки, так как связывает между собой нуклеозиды и фосфаты галактозы и глюкозы. Формируемая УДФ-Б-галактоза либо обратимо превращается в УДФ-D-глюкозу УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразой (КФ 5.1.3.2), либо идёт на синтез D-или Б^-галактанов. УДФ-Б-глюкоза подвергается действию УДФ-D-глюкозопирофосфори-лазы (КФ 2.7.7.9), в результате чего расходуется неорганический пирофосфат и формируется УТФ. Далее фософглюкомутаза (КФ 5.4.2.2) превращает глюкозо-1-Ф в глюкозо-6-Ф, который, в свою очередь, изомеризуется до фруктозо-6-Ф фосфоглюкозоизомеразой (КФ 5.3.1.9) и маннозо-6-Ф ферментом фосфоманнозоизомеразой (КФ 5.3.1.8). Маннозо-6-Ф обратимо превращается фосфоманномутазой (КФ 5.4.2.8) в маннозо-1-Ф, из которого под влиянием ГДФ-О-маннозо-пирофосфорилазы формируется ГДФ-й-манноза. Из ГДФ-О-маннозы реакцией эпимеризации образуется ГДФ-Ь-галактоза, которая идёт на синтез L- или D,L - галактанов. Через гексокиназную и полиолдегидрогеназную реакции возможно включение в состав галактанов клетки других, отличных от галактозы углеводов, таких как глюкоза и маннитол. (Рис. 3).

В свободном виде галактоза в клетке формируется в результате ферментативного гидролиза стахиозы и рафинозы. Так, например, в семенах Pinus Thunbergii, Pinus densiflora, подсолнухе, Robinia pseudoacacia рафиноза используется при прорастании (Hasegawa М. et al., 1951; Shiroya Т., 1963). Поступление галактозы в ткани имеет место при деградации и обращении растительных гликозидов, первичной клеточной стенки, запасных полисахаридов, рафинозных олигосахаридов и галактолипидов клеточной мембраны. Освобождающаяся при гидролизе рафинозы галактоза всегда ниже порога токсичности (Maretzki A., Thom А., 1978). Чёткая картина токсичности отсутствует, но имеется ряд наблюдений и предположений. Например, было отмечено, что галактозо-1-Ф может вызывать токсичность у растений, так как он ингибирует фосфоглюкомутазу (Roberts R. М. et al., 1971) и УДФ-О-глюкозопирофосфорилазу (Yamamoto R. et al., 1988).

Рис. 3. Обшая схема метаболизма галактозы и биосинтеза галактанов растениями. Показано также включение углеродных скелетов глюкозы, галактозы и маннитола.

Неадаптированные к галактозе клетки Засскагит Бр. аккумулируют

УДФ-Б-галактозу, что приводит к понижению активности УДФ-Огалактозо-4-эпимеразы (Maretzki A., Thom А., 1978). Галактоза ингибирует дыхательный метаболизм сахарозы (Morgan D. R., Street Н. Е., 1959) и ИУК-индуцированную клеточную элонгацию у злаковых (Ordin L., Bonner J., 1957; Ray M., 1962; Yamamoto R. et al., 1981; Inouhe M. et al., 1987a), но слабо, или вообще не влияет, на двудольные, в том числе, и на эпикотили Vigna (Yamamoto R. et al., 1981; Masuda Y. et al., 1985; Inouhe M. et al., 1987b). Экзогенная галактоза вызывает сильное повышение уровня галактозо-1-Ф, но не оказывает влияния на уровень свободной галактозы внутри клетки (Inouhe М. et al., 1987). У колеоптилей Avena происходит быстрое уменьшение количества УДФ-Б-глюкозы и аккумуляция УДФ-Б-галактозы, в то время, как у эпикотелей Vigna уровень УДФ-0-галактозы уменьшается в меньшей степени и, фактически, без влияния на уровень УДФ-Б-глюкозы (Inouhe М. et al., 1987). Roberts R. M. et al. (1971) обнаружили, что в корневой ткани при выращивании на галактозе происходила аккумуляция галактозо-1-Ф и УДФ-D-галактозы, однако, при увеличении концентрации внешней галактозы наблюдалось увеличении концентрации первого фосфоуглевода, а не УДФ-D-галактозы. Галактоза ингибирует включение радиоактивной глюкозы в целлюлозу (Ordin L., Bonner J., 1957) и также вызывает выделение этилена, в результате чего происходит скручивание стебля, нарушается синтез пигментов и элонгация гипокотилей. Галактоза и ауксин по отношению к индукции этилена действуют синергично (Colclasure G. С., Yopp J. Н., 1976). Галактоза замедляет скорость роста корней (Burstroem Н., 1948; Farkas G. L., 1954; Stenlid G., 1957; Ferguson J. D. et al., 1958; Goering H., Reckin E. 1968; Roberts R. M. et al., 1971), ингибирует элонгацию ствола (Thimann К. V. et al., 1958; Ordin L., Bonner J., 1957; Goering H., Reckin E., 1968; Roberts R. M. et al.,

1971), препятствует регенерации чехликов в декапитированных колеоп-тилях (Anker L., 1974) и способствует опаду листьев. Интересно отметить, что точно такие же физиологические нарушения возникают и под влиянием этилена. Токсичность галактозы предотвращается добавлением глюкозы или сахарозы (Knudson L., 1917). Галактоза поглощается в течение 8 часов, и ингибирующий эффект развивается в течение 24 часов (Hughes R., Street Н. Е., 1974). После инкубации только 10 % галактозы идёт на дыхание, или даже менее того (Morgan D. R, Street Н. Е., 1959), остальные 90% включаются в клеточную стенку (Thimann К. V. et al., 1958).

Итак, выделяют следующие причины галактозной токсичности для высших растений: 1. Аккумуляция свободной галактозы, галактозо-1-Ф, УДФ-О-галактозы, ингибирующих ферменты галактозного метаболизма (Goering Н., Reckin Е., 1968; Roberts R. М. et al., 1971; Feingold D. S., Avigad G., 1980; Inouhe M. et al., 1987). 2. Пониженный уровень эпимеразы у галактозо-чувствительных объектов (эффективное превращение УДФ-О-галактозы в УДФ-О-глюкозу, вероятно, элиминирует потенциальный ингибитор ферментов) (Inouhe М. et al., 1987). 3. Галактоза занимает место глюкозы в целлюлозных предшественниках, что и приводит к нарушению синтеза клеточной стенки (Street Н. Е., 1966; Hughes R. , Street Н. Е., 1973; Yamamoto R., Masuda Y., 1984а,b; Goering H., 1968; Ordin L., Bonner J., 1957). 4. Галактоза влияет на синтез ИУК (Anker L., 1974), которая, в свою очередь, влияет на активность УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы (Inouhe М. et al., 1987). 5. Стимуляция выделения этилена (Colclasure G. С., Yopp J. Н., 1976). 6. Те же причины, что и для животных (Roberts R. М. et al., 1971). 7. Ингибирование формирования УДФ-О-глюкозы - ключевого интермедиата клеточной стенки (Inouhe M. et al., 1986; Inouhe M. et al., 1987). 8. Низкая скорость транспорта галактозы внутрь клетки и её метаболизма (Colclasure G. С., YoppJ. H., 1976).

Глава 3. УДФ-Б-галактозо-4-эпимераза - ключевой фермент галактозного метаболизма растительной клетки

УДФ-0-галактозо-4-эпимераза (КФ 5.1.3.2) катализирует обратимое превращение УДФ-Э-галактозы и УДФ-О-глюкозы (Рис. 3). Leloir L. F. (1951) был первым, кто продемонстрировал этот фермент в экстракте выращенных на галактозе дрожжей. Впоследствии эта эпимераза стала прототипом всех ферментов, катализирующих 4-эпимеризацию нуклеотидов Сахаров (Feingold D. S., 1982). Фермент был очищен из различных источников, в том числе, из коровы (Maxwell Е. S., 1957, Tsai С. Y. et al., 1970, Langer R., Glaser L., 1974, Geren С. R., Ebner К. E., 1977), E. coli ( Wilson D., Hogness D. S., 1964), Saccharomyces fragilis (Maxwell E. S., de Robichon-Szulmajster H., 1960) и Saccharomyces cerevisiae (Fukasawa T. T. et al., 1980). У высших растений он тестировался в камбиальных и ксилемных тканях различных деревьев (Rubery Р. Н., 1973, Dalessandro G., Northcote D. H., 1977), проростках гороха (Dalessandro G., Northcote D. H., 1977), культуре клеток сахарного тростника (Maretzki A., Thom А., 1978) и Trigonella foenum-graecum (Clermont S., Percheron F., 1979). 4-эпимераза была частично очищена из зародышей пшеницы (Fan D.-F., Feingold D. S., 1969), Petunia hybrida (Dressler К. et al., 1982) и семян Vicia faba (Dey P., 1984). Главная функция фермента в высших растениях -продукция УДФ-О-галактозы для синтеза компонентов клеточной стенки и других производных Сахаров (Рис. 4). УДФ-Б-галактозо-4-эпимераза обнаружена у золотистой водоросли - Poterioochromonas malhamensis (Thomson К. S. et al., 1984) и является частью системы превращения крахмала и изофлоридозидов, которые производятся Poterioochromonas при осмотическом стрессе и функционируют как осмопротекторы (Kauss H., 1973). Субстратами фермента могут служить: УДФ-2-диоксиглюкоза, УДФ-6-диоксигалактоза (Spencer M. et al., 1973), ТДФ-глюкоза (Ray M. , Bhaduri A., 1976; Adair W. L., Gabriel O., 1973), УДФ-К-ацетил-О-глюкозамин, УДФ-галактуроновая кислота (Ray M. , Bhaduri A. , 1976).

Ингибиторы эпимеразы: УДФ-6-диоксигалактоза (Spencer M. et al., 1973), уридиновые нуклеотиды (Ray M., Bhaduri A., 1973; Ray M., Bhaduri A., 1975; Lee L. et al., 1978; Geren С. R. et al., 1977), галактозо-6-Ф, глюкозо-1-Ф,

УДФ-О-галактоза (высокие концентрации) (Ray M., Bhaduri А., 1973), NADH (Ray M. , Bhaduri A., 1976; Geren С. R. et al., 1977; Day P., 1984), 2-гидрокси-5-нитробензил бромвд (Geren С. R. et al., 1978), NaBH4, АДФ-рибоза (Ray M., Bhaduri A., 1976), УДФ-О-фруктоза + D-фруктоза, УДФ-О-фруктоза + L-арабиноза, УДФ-О-глюкуроновая кислота + D-фруктоза или + L-арабиноза (Blackburn P., Ferdinand W., 1976), сульфгидрильные реагенты (Lee L. et al., 1978; Geren С. R. et al., 1977; Fukasawa T. et al., 1980; Fukasawa T. et al., 1982), фруктозо-1.6-диФ (LeeL. et al., 1978), 5.5-дитиобис-(2-нитробензоат) (Ray M. , Bhaduri A., 1978), аргинин-специфичные реагенты (Mukheiji S. , Bhaduri A., 1986), редуктивные компоненты (Blackburn P., Ferdinand W., 1976; Ray M. , Bhaduri A., 1976; Arabschahi A. et al., 1988). Фермент из ряда источников является NAD-зависимым (Adair W. L., Gabriel О., 1973; Ray M. , Bhaduri A., 1973; Gabriel O. et al., 1975; Ray M. , Bhaduri A. , 1976; Fukasawa T. et al., 1982; Geren C. R., Ebner К. E. , 1982). NaCl (Darrow R. A., Rodstrom R., 1966) и MgCl2 (Fukasawa T. et al., 1982) активируют фермент. Число оборотов фермента: 300000 (Wilson D., Hogness D. S., 1966) и 3890 (Fukasawa T. et al., 1982; Fukasawa T. et al., 1980). Установлено, что фермент локализован в цитозоле (Wilson D., Hogness D. S., 1966; Ray M., Bhaduri A., 1973; Clermont S., Percheron F., 1979; Bilisics et al., 1982). Человеческий ген фермента кодирует белок в 348 аминокислот длиной и молекулярной массой в 38 кДа. Он показывает 87% идентичности с белком крысы, 53% с белком из Kluyveromyces lactis и 51% гомологии с белком из Е. coli (Daude N. et al., 1995). В состав активного центра эпимеразы из Kluyveromyces fragilis входят 2 триптофановых остатка (Ray M. et al., 1995). Ген, кодирующий фермент у Pachysolen tannophylus, индуцируется ксилозой (Skrzypek M., Maleszka R. A.

А., 1994). Молекулярная генетика фермента изучалась также Swanson В. А. (1993), Mukheiji S., Bhaduri А. (1992), De Troch Р. et al. (1994).

Глава 4. Роль УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы в метаболизме галактозы

УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза (КФ 2.7.7.9) катализирует обратимое пирофосфорилирование УДФ-О-глюкозы, что приводит к формированию глюкозо-1-Ф (Рис. 3). Фермент был открыт Kalckar Н. М., Cutolo Е (1952) и Munch-Peterson A. et al. (1953), после чего его присутствие было показано ещё у ряда организмов. Помимо растительных объектов он был очищен и кристаллизован из ряда других: телёнка (Albrecht G. J. et al., 1966), человека (Knop J., Hansen R. G., 1970), печени ягнёнка, козла и кролика (Knop J., 1969), человеческой печени (Steelman V. S., Ebner К. E., 1966) и мозга (Basu D. К., BuchhawatB. К., 1961), эритроцитов человека (Tsuboi К. К. et al., 1969), Dictyostellium discoideum (Franke J., Sussman M., 1971), молочной железы крысы (Emery R. S., Baldwin R. L., 1967), мышцы кролика (Villar-Palasi С., Larner J., 1960), плесневого гриба (Gustafson G., Wright В. E., 1971), бактерий (Kamogawa A., Kurahashi K., 1965; Chojnaki T. et al., 1968; Nikaido H., Nakae Т., 1970) и дрожжей (Munch-Peterson A., Kalckar H. M., 1955). Фермент преобладает в тканях, показывающих высокий уровень полисахаридного синтеза (Turnquist R. L., Hansen R. G., 1973). У высших растений его уровень обычно связан с изменениями скоростей синтеза крахмала и сахарозы (Turner J. F., 1969а; Turner J. F., 1969b; Pressey R., 1969; Tsai C. Y. et al., 1970; Tovey К. С., Roberts R. M., 1970). У низших растений ферментативная активность может коррелировать с формированием целлюлозы и трегалозы (Wright В.

Е., 1959; Zetsche К., 1968). УДФ-0-глюкозопирофосфорилаза участвует в синтезе многочисленных клеточных компонентов, включая различные клеточные полисахариды как у высших растений (Feingold D. S. et al., 1958; Goldemberg S. H., Maréchal L. R., 1963; Павлинова О. A. и Прасолова M. Ф., 1970), так и у микроорганизмов (Fukasawa T. et al., 1962; Lieberman M. et al.,

1970); a также трегалозы (Roth R., Sussman M., 1968), гликозидов (Franz G., Meier H., 1969), гликолипидов (CurtinoJ. A. et al., 1968), гепарина (Danishefsky I., Heritier-Watkins O., 1957), микробиальных антигенов (Bernstein R. L., Robbins P. W., 1965), лактозы (Steelman V. S., Ebner К. E., 1966), глюкуронидов (Shikamura M., TsuboiK. K., 1961; Roberts R. M., Rao K. M. K.,

1971) и рамнозы (Рис. 5) (Sundararajan T. A. et al., 1962; Barber G. A., 1971) (Рис. 5). В растительных клетках фермент обнаруживается чаще всего в цитозоле. Пирокатехол стимулирует увеличение активности фермента у свёклы (Singh R., Wort P., 1970). Пирофосфорилаза ингибируется собственными продуктами (Turnquist R. L, Hansen R. G., 1973). ИУК также оказывает влияние на фермент (Inouhe M. et al., 1987). Молекулярная характеристика гена осуществлена у стрептококков и других организмов (Daran N., 1995). Ген клонирован из человеческой (Peng J., Chang К., 1993) и бычьей печени (Konishi D. et al., 1993), ячменя (Eimert N. et al., 1996), клубней картофеля (Spychalla R., 1994); организация и механизм транскрипции гена изучены у картофеля (Borovkov N. et al., 1997), Bacillus subtilis (Soldo W. et al., 1993), человеческой печени (Chang К. et al., 1996). УДФ-О-глюкозопирофос-форилаза необходима для метаболизма галактозы (Turnquist R. L. , Hansen R G., 1973). Она обладает способностью синтезировать УДФ-О-галактозу даже в отсутствие галактозо-1-Ф-уридилтрансферазы (Зашска Т., ОюрасЫ Н., 1969).

Без УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы галактоза не будет включаться в клеточные стенки микроорганизмов (Sundararajan Т. А. & а1., 1962; Биказахуа Т. а1., 1962; Рика8а\уа Т. е1 а1., 1963). Галактозо-1-Ф в высоких концентрациях (50 раз выше глюкозо-1-Ф) конкурентно ингибирует пирофосфорилазу (№кае Т., 1971). Ингибирование фермента замедляет продукцию УДФ-Б-глюкозы и вызывает дальнейшую аккумуляцию галактозо-1-Ф, который, в свою очередь, далее ингибирует фермент.

Ингибиторами для фермента из Lilium longiflorum являются УДФ-Б-глюкоза, УДФ-глюкуроновая кислота, УДФ-галактуроновая кислота, УДФ-ксилоза, УДФ-манноза. Особо стоит отметить ингибирование УДФ-Б-галактозой, которое носит смешанный между конкурентным и неконкурентным характер, Ki составляет 4.8 mM (Hopper J. Е., Dickinson D. В., 1972). Ингибирование УДФ-О-галактозой отмечается также и для фермента из гороха (Ray М., Abdul-Baki А. А., 1968). Из плодоножек огурца было получено два пика пирофосфорилазной активности с глюкозо-1-Ф, причём второй мог осуществлять превращение и галактозо-1-Ф (Smart Е. L., Pharr D. М., 1981). Из сорго было также получено два пика, но только первый (главный) из них был охарактеризован (Gustafson G., Gandler, 1972).

УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза из телёнка (Albrecht G. J. et al., 1966) и человека (Knop J., Hansen R. G., 1970) катализирует фосфорилиро-вание УДФ-Э-галактозы, причём скорость реакции составляет всего лишь 2% от скорости обращения УДФ-Э-глюкозы при их равных концентрациях и может быть увеличена до 10% при более высоких концентрациях (Knop J., Hansen R. G., 1970). Некоторые исследователи вообще не наблюдали какого-либо превращения УДФ-Б-галактозы, что вполне достоверно может быть объяснено более низкими концентрациями УДФ-Б-галактозы, использованной для измерений (Soldo W., Chojnachi Н., 1969; Ng W. G. et al., 1964; Ng W. G. et al., 1967). При галактоземии уровень галактозо-1-Ф достигает порогового значения Кщ, когда он может метаболизироваться УДФ-Б-глю-козопирофосфорилазой. Данное явление свидетельствует о важности этого фермента при галактоземии, что, в свою очередь, привело к спекуляции о существовании УДФ-О-галактозопирофосфорилазы в человеческой крови

Abraham F., Howell Т., 1969). Существование этого фермента, катализирующего обратимое превращение галактозо-1-Ф в УДФ-О-галактозу, до сих пор вызывает сомнения. Его активность была описана для микроорганизмов (Zancan С., 1971), крыс, голубей и человека (Abraham F., Howell Т., 1969; Isselbacher С., 1958). Фермент впервые был продемонстрирован у проростков бобовых (Neufeld Е. et al., 1957). Считалось, что у следующих объектов галактозная утилизация непосредственно связана с деятельностью именно этого фермента: листья конопли и проростки пшеницы (Hassid W. Z. et aL, 1956); колеоптили Avena (Ordin L., Bonner J., 1957); проростки бобов (Cooper R. A., Greenshields R. N., 1961); проростки хлопка (Shiroya Т., 1963); корни пшеницы и колеоптили ячменя (Goering Н. et al., 1968; Roberts R. M., Butt F., 1969; Roberts R. M., 1971); котиледонии Voandzei subterránea (Amuti K. S., Pollard C. J., 1977); культура клеток сахарного тростника (Maretzki A., Thorn А., 1978) (Таблица 1). У растений УДФ-О-галактозо-пирофосфорилаза продемонстрирована у Petunia hybrida (Dressler К. et al., 1982) и была хорошо охарактеризована в огурце (Gross К. С., Pharr D. М., 1982). У Galdieria sulphuraria данный фермент не обнаружен (Gross W., Schnarrenberger С., 1996). Остаётся непонятным, однако, как авторы промеряли активность УДФ-О-галактозопирофосфорилазы у Petunia hybrida (Dressler К. et al., 1982), так как её функционирование определялось по количеству формируемого УТФ, который сразу бы поглощался УДФ-D-глюкозопирофосфорилазой, уровень которой в клетке очень велик. Фактически, не было осуществлено ни одной успешной попытки отделить УДФ-О-галактозопирофосфорилазу от УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы (Ting К., Hansen R. G. 1968). Более того, соотношение обоих активностей оставалось постоянным при очистке фермента из челевеческой печени. Lee L et al. (1977) показали, что УДФ-Б-галактозопирофосфорилаза из Bifidobacterium bifidum очищалась вместе с УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазой. А Turnquist R. L. et al. (1974) предположили, что обе активности из человеческой печени принадлежат одному и тому же ферменту, в равной степени как и из Bifidobacterium bifidum (Lee L. et al., 1978). He было опубликовано ни одного детального исследования свойств данного фермента, и он ни разу не был очищен. Gross К. С., Pharr D. М. (1982) вообще считают, что не все растительные ткани, которые содержат УДФ-О-глюкозопирофосфорилаз-ную активность, обязательно содержат УДФ-Б-галактозопирофосфорилазу

На основании всего вышеизложенного возникают сомнения относительно существования УДФ-О-галактозопирофосфорилазы в природе вообще. Отсутствие какой-либо характеристики фермента, неопределённость относительно его универсальности в живом мире, абсолютная параллельность в свойствах с УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазой при очистке ферментов, невозможность отделения одного от другого и, наконец, осуществление УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазой реакции с галактозо-1-Ф, как нельзя лучше свидетельствуют об отсутствии пути Isselbacher в живой природе и об универсальности пути Leloir.

Глава 5. Галактаны как продукт галактозного метаболизма

Самым непосредственным продуктом всего галактозного метаболизма растительной клетки являются галактаны, построенные из (5-l.3-oc-l.4связанной D- и L-галактозы (Aspinall G. О., 1970; Morvan D. R. et al., 1989; GoubetF. et al., 1993; Goubet F., Morvan D. R., 1994). Включение D-галактозы в материал клеточной стенки происходит из глюкозо-6-Ф через УДФ-О-глюкозу и УДФ-О-галактозу, образуя D-галактаны (Panayatotos N., Villemez С. L., 1973). Включение L-галактозы идёт из фруктозо-6-Ф, маннозо-1-Ф, ГДФ-О-маннозы и ГДФ-Г-галактозы (Рис. 3), формируя D,L-галактаны (Su J. С., Hassid W. Z., 1962, Barber G. A., 1971). ГДФ-О-манноза является важным сахарным нуклеотидом в растениях. Она служит как общий донор маннозы для синтеза гликолипидов, гликопротеинов и полисахаридов, таких как маннаны и галактаны. Синтез ГДФ-О-маннозы не до конца понятен (Herold A., Lewis D. Н., 1977), хотя очевидно, что он начинается от маннозо-1-Ф, присходящего из маннозо-6-Ф (Su J. С., Hassid W. Z., 1962). Её метаболизм изучался у красных водорослей (Su J. С., Hassid W. Z., 1962), проростках бобовых (Gregoire J. et al., 1963), Chlorella (Пахомова М. В. et al., 1965; Sanwal G. G., Preiss J., 1969), бурых водорослей (Lin Т. Y., Hassid W. Z., 1966), листьев клубники (Selvendran К. R., Isherwood F. A., 1967; Isherwood F. A. , Selvendran K. R., 1970), клубней иерусалимского артишока (Taniguchi H. et al., 1967), камбии лиственницы (Cumming D. F., 1970), семенах Trigonella foenum-graecum (Sioufi A. et al., 1970), корнеплодах Amorphophallus konjac (Murata Т., 1975).

L-галактоза, относительно редкая альдогексоза, является составляющим компонентом полисахаридов некоторых немногих эукариотов. Она присутствует в яйцах съедобных улиток Helix pomatia (Bell D. J., Baldwin E., 1940; Bell D. J. , Baldwin E., 1941), а также у рода морских ежей (Vasseur Е., 1950). Данный компонент был также выделен из слизи семян льна Linum usitatissimum (Anderson К. L., Lowe H. J., 1947) и сложных водорастворимых галактанов из Rhodophyceae (Percival Е., 1970). ГДФ-Е-галактоза была обнаружена у красной водоросли Porphyra perforata (Su J. С. , Hassid W. Z., 1962) и в альбуминовой железе Helix pomatia (Goudsmit E. M., Neufeld E., 1966). Данный нуклеотидный сахар является предшественником в формировании L-галактозы как потенциального компонента L-галактозосодержащих полисахаридов. Растения, которые содержат L-галактозу как составляющий компонент полисахаридов, вероятно, оборудованы дополнительным путём реутилизации L-галактозы, освобождающейся во время метаболических трансформаций, так как обычный путь метаболизирует только D-галактозу (Рис. 3). Однако ни присутствие такого пути, ни предполагаемой L-галактокиназы и ГДФ-L-галактозопирофосфорилазы, которые могли бы быть вовлечены, обнаружено не было. Водорастворимые галактаны из-за своих гелевых свойств находят применение, как в пищевой промышленности в качестве добавок и заменителей, так и в нефтеперерабатывающих сферах, где служат эффективными адсорбентами наиболее трудно регенерируемых нефтяных загрязнителей. Ввиду своей промышленной значимости галактаны являются предметом самого интенсивного исследования (Кочетков Н. К. и др., 1967; Усов А. И., Кочетков Н. К., 1968; Усов А. И. и др., 1969; Усов А. И., Рехтер М. А., 1969; Кочетков Н. К. и др., 1970; Усов А. И. и др., 1971; Кочетков Н. К. и др., 1971; Кочетков Н. К. и др., 1973; Усов А. И., 1974; Усов А. И. и др., 1974; Усов А. И., Козлова Е. Г., 1975; Усов А. И., Яроцкий С. В., 1975; Шашков А. С. и др., 1981; Усов А. И. и др., 1985; Усов А. И. , Добкина И. М., 1988; Усов А. И., Вергунова Г. И., 1989; Усов А. И., Чижов А. О., 1989; Усов А. И. и др.,

1989; Торгов В. И. и др., 1990; Торгов В. И. и др., 1991; Усов А. И., Элашвили М. Я, 1991; Усов А. И., 1993; Ат О. А. и др., 1995; Усов А. И., Билан М. И., 1996; Павлова 3. Н. и др., 1996).

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 6. Объекты и методы исследований 6.1. Объекты исследований

В качестве объектов исследований были выбраны красная термоацидофильная водоросль Galdieria sulphuraria (Galdieri) Merola, использующая галактозу в качестве источника углерода, и проростки зелёного гороха Pisum sativum L. cv. Kleine Rheinlaenderin, для которых галактоза очень токсична.

Штамм Galdieria sulphuraria был собран в местечке Mt. Lawu (Indonesia) профессором R. Taddei (University Naples, Italy). Штамм 074 W был изолирован из этой культуры позже (Gross W., Schnarrenberger С., 1995). Клетки выращивали на среде по Ford Т. W. (1979). 1 литр среды культивирования содержал: 1.5 г (NH4)2S04, 300 мг MgS04 • 7 Н20, 300 мг КН2Р04, 20 мг СаС12 • 2 Н20, 20 мг NaCl, 1.5 мл Fe-EDTA (690 мг FeS04 + 930 мг EDTA на 100 мл Н20; кипятить при температуре 100°С), 2 мл раствора микроэлементов (2.86 г Н3В03, 1.82 г МпС12 • 4 Н20, 220 мг ZnS04 • 7 Н20, 130 мг (NH4)6Mo7024 • 4 Н20, 80 мг CuS04 • 5 Н20, 40 мг NaV03 • 4 НаО, 40 мг СоСЦ • 6 Н20 на 1000 мл Н20). pH среды доводили 1 N H2S04 до 2. При автотрофных условиях 1% С02 подавали через отверстие в дне 1 литровой колбы для культивирования. При миксотрофных условиях среда содержала 50 мМ глюкозы, галактозы или маннитола (Фото 1), и культивирование осуществлялось в 2 л колбах Эрленмейера на роторе при 120 об/мин. Температура составляла 25 °С и интенсивность белого света - 6,000 люкс (Osram-L40W/30-l). Плотность клеток определяли на спектрофотометре

Uvikon 810 (Kontron Instruments, Gosheim, Germany) при 800 им. Суспензии клеток были разбавлены водой, чтобы обеспечить поглощение между 0.1 и 0.15. Клетки собирались на центрифуге при 3,000 g (Laborfuge 400 R mit Ausschwingrotor; 8179 (Heraus, Osterode, Germany) или Minifuge-2 mit Ausschwingrotor: 980 (Heraus Christ, Osterode, Germany)) в течение 5 минут, после чего вымывались 50 мМ Трис/HCl, pH 8.0 н замораживали при -20°С. Посевы культуры осуществляли при стерильных условиях, обеспечиваемых автоклавом HST 32/25 (Zirbus, Osterode/Harz, Germany) и ламинаром BSB 4А (Gelaire Flow Laboratories, Meckenheim, Germany).

Фото 1, Красная термоацидофильная водоросль Guidieria sulphuraria и её культивирование при Миксотрофных условиях.

Проростки гороха Pisum sativum (возраста 10-25 дней) выращивали в оранжерее. Температура составляла 22°С и интенсивность белого света -3,500 люкс (Osram-L40W/30-l). Их обрезали возле корешков, собирали и замораживали при -20 °С. Этиолированные растения выращивали в абсолютной темноте с использованием слабого зелёного света для периодического контроля за их ростом.

6.2. Методы исследований 2.2.1. Определение активности галактокиназы

Активность ферментов определяли при комнатной температуре на спектрофотометрах Uvikon 930 (Kontron Instruments, Gosheim, Germany) или llOlMmit Schreiber (Eppendorf, Hamburg, Germany). Единица ферментативной активности (ФЕ) соответствовала превращению 1 микромоля субстрата в 1 минуту в 1 мл среды измерения.

Активность галактокиназы определяли по Ballard F. J. (1966). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl pH 7.5, 5 мМ MgCl2? 1 ФЕ пируваткиназы, 1 ФЕ лактатдегидрогеназы, 0.02 мМ фосфоенолпирувата, 0.02 мМ АТФ, 0.05 мМ NaF и 0.01 мМ NADH. Реакцию запускали внесением в среду 5 мМ галактозы. О скорости реакции судили по падению оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.2. Определение активности УДФ-О-галактозопирофосфорилазы

Активность фермента определяли по Smart Е. L., Pharr D. М. (1981). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl рН 7.2, 5 мМ MgCl2, 0.05 ФЕ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, 0.05 ФЕ УДФ-Б-глюко-зодегидрогеназы, 0.5 мМ УТФ и 0.5 мМ NAD. Реакцию запускали внесением в среду 5 мМ галактозо-1-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.3. Определение активности галактозо-1-Ф-уридилтрансферазы

Активность фермента определяли по Mayes J. S. (1976). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl рН 7.5, 5 мМ MgCl2? 1 ФЕ фосфоглюкомутазы, 1 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы, 0.01 мМ глюкозо-1.6-диФ, 0.5 мМ УДФ-О-глюкозы и 0.5 мМ NADP. Реакцию запускали внесением в среду 1 мМ галактозо-1-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.4. Определение активности УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы

Среда спектрофотометрирования содержала 20 мМ Трис/HCl рН 8.5, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ EDTA, 0.5 мМ Na пирофосфата, 0.4 ФЕ фосфоглюкомутазы, 0.4 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы, 0.4 ФЕ УДФ-О-глюкозопиро-фосфорилазы, 0.03 мМ глюкозо-1.6-диФ и 0.2 мМ NADP. Реакцию запускали внесением в среду 0.3 мМ УДФ-Б-галактозы. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.5. Определение активности УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы

Активность фермента определяли по Ginsburg V. (1958). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl рН7.5, 1.0 мМ MgCl2? 0.5 EDTA, 0.03 мМ глюкозо-1.6-диФ, 2 мМ NannpoO, 0.1 ФЕ фосфоглюкомутазы, 0.15 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы и 5 мМ NADP. Реакцию запускали внесением в среду 1.0 мМ УДФ-Б-глюкозы. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.6. Определение активности фосфоглюкомутазы

Активность фермента определяли по Najjar V. А. (1955). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl рН 7.0, 1.0 мМ MgCl2; 0.5 EDTA, 0.03 мМ глюкозо-1.6-диФ, 1 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы и 0.3 мМ NADP. Реакцию запускали внесением в среду 1.3 мМ глюкозо-1-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.7. Определение активности фосфоглюкозоизомеразы

Активность фермента определяли по Harloff Н. J., Wegmann К. (1993). Среда спектрофотометрирования содержала 25 мМ Трис/HCl рН 8.0, 7.5 мМ

МяС1 1 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы и 1.7 мМ МАЭР. Реакцию запускали внесением в среду 2 мМ фруктозо-6-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.8. Определение активности фосфоманнозоизомеразы

Активность фермента определяли по Наг1о1£ Н. К., (1993).

Среда спектрофотометрирования содержала 25 мМ Трис/НС1 рН 8.0, 7.5 мМ 1У^С12, 1 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы, 1 ФЕ фосфоглюкозоизоме-разы и 170 мМ ИАОР. Реакцию запускали внесением в среду 10 мМ маннозо-6-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.9. Определение активности фосфоманномутазы

Активность фермента определяли по Мига1а Т. (1976). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/НС1 рН 7.0, 1.0 мМ 1У^С12, 0.5 ЕБТА, 0.03 мМ глюкозо-1.6-диФ, 1 ФЕ глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы, 0.25 ФЕ фосфоглюкозоизомеразы, 0.25 ФЕ фосфоманнозоизомеразы и 0.3 мМ КАЭР. Реакцию запускали внесением в среду 0.4 мМ маннозо-1-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.10. Определение активности глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы

Активность фермента определяли по Schnarrenberger С. et al. (1973). Среда спектрофотометрирования содержала 100 мМ Трис/HCl рН 8.0, 1.0 мМ MgCl2, 0.5 EDTA и 0.2 мМ NADP. Реакцию запускали внесением в среду 2 мМ глюкозо-6-Ф. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.11. Определение активности малатдегидрогеназы

Активность фермента определяли по Stabenau Н. (1974). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl рН 7.5, 5.0 мМ MgCl2, 0.5 EDTA, 5 мМ DTT и 0.5 мМ NADH. Реакцию запускали внесением в среду 2 мМ оксалоацетата. О скорости реакции судили по падению оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.12. Определение активности пероксидазы

Активность фермента определяли по Hrybb D. J., Hogg J. F. (1979). С реда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl рН7.5, 2.5 мМ р-гидроксибензоата, 1.2 мМ аминоантипирина. Реакцию запускали внесением в среду 0.075% Н202. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 500 нм.

6.2.13. Определение активности альдолазы

Активность фермента определяли по Wu Н., Racker К. (1959). Среда спектрофотометрирования содержала 50 мМ Трис/HCl pH 7.5, 5 мМ MgCl2,1 ФЕ глицеролфосфатдегидрогеназы, 1 ФЕ триозофосфатизомеразы, 0.5 мМ NADH. Реакцию запускали внесением в среду 10 мМ фруктозо-1.6-диФ. О скорости реакции судили по падению оптической плотности при длине волны 340 нм.

6.2.14. Определение активности каталазы

Активность фермента определяли по Aebi Н. Е. (1983). Реакцию запускали внесением в среду 0.15% Н202. О скорости реакции судили по росту оптической плотности при длине волны 240 нм.

6.3. Выделение, очистка и исследование свойств ферментов 6.3.1. Получение гомогената

Все этапы очистки ферментов осуществляли при температуре от 0 до 4°С. От 10 до 20 грамм Galdieria sulphur aria разрушали в гомогенизаторе (Bead Beater, Biospec Products, Bartesville, OK, USA) со стеклянными шариками в присутствие 50 мл среды выделения, состоящей из 20 мМ Трис/HCl pH 8.5, 1 мМ DTT, 0.5 ¡аг/мл пепстатина, 0.7 (ir/мл леупептина, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ

EDTA и 0.5 мМ PMSF. Гомогенизация продолжалась в течение 7 мин с перерывами по 20 секунд для эффективного охлаждения в ледяной бане.

60-70 грамм проростков Pisum sativum гомогенизировали в блендоре (Warring Blender, Germany) с высокой скоростью в присутствие 200 мл среды выделения, как и в случае с Galdieria sulphuraria, за исключением того, что был добавлен 0.02 мМ МВТ. Гомогенизацию осуществляли в течение 1 минуты в два цикла по 30 секунд с 20 мин паузой для ледяной бани. Образуемую суспензию центрифугировали в течение 60 мин при 37,000 g m центрифуге Centricon Н-401 mit Festwinkelrotor: А8.24 (Kontron Hermle, Gosheim, Germany) или Sorwall RC-5B mit Festwinkelrotor: SS 34 (Du Ponts Instruments, Bad Nauheim, Germany).

6.3.2. Ионообменная хроматография на DEAE-фрактогеле

После центрифугирования супернатант разбавляли буфером до примерно 150 мл и помещали на колонку с DEAE-фрактогелем с адаптером (22 см * 25 мм; BioRad, Muenchen, Germany), уравновешенную 10 мМ Трис/HCl pH 8.5, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ EDTA, 0.5 мМ DTT. После промывки 50 мл колоночного буфера белки элюировали линейным градиентом 2 * 100 мл 0-500 мМ KCl в исходном буфере. Отбор фракций осуществляли коллектором Modell 2110 (BioRad, Muenchen, Germany). Концентрацию KCl контролировали кондуктометром (CG 855 mit Leitfaehigkeitsmesszelle, Schott, Mainz, Germany), фактор пересчёта 6.93. Для восстановления колонки использовали следующую процедуру: I этап 3-5 объёмов 2% раствора детергента с 0.25 M NaCl; П этап 3 объёма 25% изопропанола с 12.5 мл 25% HCl; III этап 2 объёма 1.0-1.5 M NaCl.

6.3.3. Адсорбционная хроматография на гидроксилапатите

Фракции, содержащие активность исследуемых ферментов, подвергали хроматографии на колонке с гидроксилапатитом и адаптором (16 см * 15 мм; BioRad, Muenchen, Germany), уравновешенной тем же буфером, что и для DEAE-фрактогеля, но без EDTA. После промывки 30 мл колоночного буфера белки элюировали линейным градиентом 2 * 50 мл 0-500 мМ фосфатного буфера. При кондуктометрии фосфатов использовали фактор пересчёта 5.25. Для восстановления колонки применяли следующую процедуру: I этап интенсивное ресуспендирование с 1 М КН2Р04; П этап избыток дистиллированной воды.

6.3.4. Гидрофобная хроматография

Для проведения гидрофобной хроматографии использовали колонки Butyl HIC и Phenyl HS-Sepharose (HiTrap HIC Test Kit, Pharmacia Freiburg, Germany). Для осуществления данного вида хроматографии использовали систему LPLC (см. раздел 6.3.7.). Образец ферментативного препарата разводили в соотношении 1:1 с 1 M (NH4)2S04 и помещали на колонку, предварительно уравновешенную следующим буфером: 50 мМ MOPS pH 7.0, 30% насыщения (NH4)2S04, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ DIT. Элюция белков происходила за счёт создания обратного линейного градиента 30 - 0% (NH4)2S04 в исходном буфере. Восстановление колонок осуществляли в несколько этапов: I этап 5 мл 70% С2Н5ОН; П этап 5 мл 0.5 M NaOH; III этап

5 мл дистиллированной воды. Все растворы были предварительно продегазированы и профильтрованы.

6.3.5. Аффинная хроматография

Использовали колонки Dyematrex Orange A, Dyematrex Green, (8 * 0.5 см, Amicon, Lexington, MA, USA). Матрикс колонок промывали 30 мМ Трис/HCl pH 8.0, 1 мМ MgCl, и 0.5 мМ DTT. Ферменты элюировали ступенчатым градиентом 1.5 М NaCl в исходном буфере, за исключением одной из изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, которая проходила сквозь колонку Dyematrex Green без взаимодействия с её матриксом. Восстановление колонок осуществляли в несколько этапов: I этап 2 объёма 10 мМ Трис/HCl pH 7.7, 1 мМ DTT, 6 М гуанидин-НС1, 1.2 М HCl; П этап промывка избытком дистиллированной воды.

6.3.6. Гель-фильтрация

Молекулярная масса ферментов определяли посредством гель-фильтрации (система LPLC) на колонке Superdex-200 HiLoad (16 * 600 мм, Pharmacia, Uppsala, Sweden). Колонка уравновешивали 10 мМ Трис/HCl pH 7.5, содержащим 1 мМ MgCl2 и 0.25 мМ NaCl. Скорость потока составляла 1 мл/мин. В качестве маркерных ферментов использовали карбоангидразу (29 кДа), пероксидазу (40кДа), БСА (66 и 132 кДа), малатдегидрогеназу (70 кДа), каталазу (240 кДа), ферритин (440 кДа) и ß-галактозидазу (540 кДа). При последующих экспериментах по определению молекулярной массы

УДФ-О-глкжозопирофосфорилазы использовали очищенный препарат У ДФ-D-rai 1актозо-4-эпимеразы (83 кДа) из Galdieria sulphuraria.

6.3.7. Жидкостная хроматография низкого давления (LPLC)

Данный метод использовали как для очистки белков, так и для определения их молекулярной массы. Схема конструкции прибора (Pharmacia, Freiburg, Germany); коллектор фракций GradiFrac, насос Р-50, Control Unit UV-1, Optical Unit UV-1, 2-х канальный самописец Ree 102 (Фото 2),

Фото 2. Жидкостной хроматограф низкого давления (LPLC),

Все пробы перед, тем как быть помещёнными на колонки, фильтровали через бактериальный фильтр при помощи шприца, а все растворы дегазировали вакуумным насосом.

6.3.8. Определение К , Y , К К

1 m' max' 1» si кт и Vmax, Ksi определяли посредством прямого линейного графика (EisenthalR., Cornish-Bowden А., 1974). К. расчитывали из графика Диксона.

6.3.9. Определение К УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы ecj

Для расчёта Keq УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы фермент инкубировался на протяжении всей ночи при комнатной температуре с определённым количеством УДФ-Б-глюкозы. После эпимераза была инактивирована нагреванием на водяной бане в течение 30 мин при 90°С. Количество УДФ-В-глюкозы определяли добавлением УДФ-О-глюкозодегидрогеназы и NAD. УДФ-О-галактоза измеряли при сходных условиях, за исключением того, что УДФ-0-талактозо-4-эпимераза была включена в раствор. Данную процедуру осуществляли в несколько этапов:

1. 200 микромоль УДФ-О-глюкозы в 140 микролитров буфера (40 микролитров 3 мг/мл) + 20 микролитров УДФ-О-галактозо-4-эпимеразы (0.150 ФЕ/мл). Инкубирование в течение ночи при комнатной температуре. Водяная баня в течение 30 мин при 90°С.

2. 50 микролитров вышеприведённого раствора + 30 микролитров NAD + 910 микролитров буфера.

X = 340 нм; получаем Ег

3. + 10 микролитров У Д Ф-О-глюкозодегидрогеназы; подождать в течение 15 мин.

X = 340 нм; получаем Е2; АЕ = Е2 - Е,.

4. 990 микролитров буфера +10 микролитров УДФ-Э-глюкозодегидро-геназы; 1 = 340 нм; получаем Е"

5. АЕ = АЕ - Е".

УДФ-Б-глюкозы

6. 50 микролитров вышеприведённого раствора + 30 микролитров NADP + 0.1 мг глюкозо-1.6-диФ + 0.1 мг № пирофосфата + 1 тл УДФ-О-глю-козопирофосфорилазы + 1 микролитров фосфоглюкомутазы + 1 микролитр глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы + 917 микролитров буфера.

X = 340 нм; получаем Е3.

7. + 20 микролитров УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы; подождать в течение 15 мин.

X = 340 нм; получаем Е4; АЕ°= Е4 - Е3.

8. 980 микролитров буфера + 20 микролитров УДФ-О-глюкозодегидрогеназы. X = 340 нм; получаем Е'.

9. АЕ = АЕ° - Е'.

УДФ-О-галактозы

10. К =АЕуптп eq УДФ-Б-глюкозы УДФ-О-галактозы

6.3.10. Исследование термостабильности и выяснение оптимальных условий хранения УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы

Термостабильность УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы определяли инкубированием фермента при 46, 50 и 54°С в водяной бане при различных временных интервалах и измерением активности при 22°С. Влияние температуры на ферментативную активность изучали в диапазоне 24 и 35°С температурно-контролируемой кюветы. Энергия активации УДФ-Б-галакто-зо-4-эпимеразы рассчитывалась по Сийгешк! Н. (1972): где Еа - энергия активации (ккал/моль); Уп и Тп - скорость реакции и температура в градусах Кельвина.

Для выяснения оптимальных условий сохранения ферментативной активности препараты помещали в 2-х мл эпендорфы с дистиллированной водой или 50% глицеролом и содержались при -20, 4 и 22°С. Остаточную активность определяли через определённое количество дней при обычных для данного фермента условиях.

6.3.11. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы

Относительная молекулярная масса УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы была рассчитана по скорости седиментации в градиенте плотности сахарозы (Martin R. G., Ames В. N., 1961). где - скорость седиментации; М\¥п - молекулярная масса. Шесть линейных градиентов (9 мл общего объёма каждый) от 5 до 17% были приготовлены при помощи градиентата, капилляра и небольшого компрессора в 10 мМ натрий фосфатном буфере рН 7.5, содержащем 0.5 мМ

DTT и 0.5 мМ EDTA. На данные градиенты были нанесены по 0.1 мл двух маркерных белков или эпимеразы на градиент. Градиенты центрифугировали в течение 20 часов при 210,000 g на ультрацентрифуге (Du Ponts Instruments, Bad Nauheim, Sorwall Combi Plus mit Ausschwingrotor Beckman SW 41 Ti, Germany). 3-мл фракции отбирали со дна пробирок используя перистальтический насос и коллектор. Маркерными белками служили пероксидаза (3.48 S; 40 кДа), БСА (4.49 S; 66 кДа), малатдегидрогеназа (5.0 S; 70 кДа), глюкозо-6-Ф-дегидрогеназа (6.14 S; 102 кДа), фосфоглюкоизомераза (7.2 S; 135 кДа), альдолаза (7.3 S; 161 кДа) и каталаза (11.3 S; 240 кДа). Плотность сахарозы определяли на рефрактометре (Abbe Refractometer, Zeiss, Jena, Germany).

6.3.12. Электрофорез на пластинках

Для определения молекулярной массы фермента, выяснения его субъединичного состава и доказательства гомогенности ферментативного препарата осуществляли SDS- и гель-электрофорезы на пластинках (Laemmli U. К., 1970). В качестве маркеров использовали карбоангидразу (29 кДа), овальбумин (45 кДа), БСА (66 кДа), фосфорилазу b (97.4 кДа), ß-галактозидазу (116 кДа) и миозин (205 кДа) (Sigma Chemical Co.). Белки на геле окрашивали либо серебром (Blum H. et al., 1987), либо бриллиантовым Coomassie R-250.

6.4. Жидкостная хроматография высокой разрешающей способности (HPLC)

Данный высокоэффективный метод хроматографии использовали с целью изучения транспорта галактозы в клетки корня гороха. Схема конструкции прибора: Knauer HPLC pump 64 (Typ 364,000, Knauer, Berlin, Germany), Injektor Model 7725 (Rheodyne Incorporates, USA), Soeulenofen (Knauer, Berlin, Germany), дифференциальный рефрактометр (Laboratomi Pristroje, Prague, Czech Republic), интегратор (Hewlett Packard, Bad Homburg, Germany) (Фото 3).

Фото 3. Жидкостной хроматограф высокой разрешающей способности (HPLC).

Использовали HPLC-колонку ВС-100 (7.8 * 300 мм, Benson Co., Reno, USA). Проростки Pisum sativum были взяты из оранжереи, тщательно отмыты под струёй водопроводной воды, чтобы удалить с корней землю. После чего целые растения были помещены в пробирку Falcon со средой Agro

Gro Carolina с 25 мМ определённого углевода или же их комбинаций. В качестве контроля эксперимента выступала среда без углевода. Время экспозиции составляло 1.5 часа, после чего корень отрезали, размельчали на мелкие кусочки, гомогенизировали в ступке с пестиком, 70% этанолом и песком и центрифугировали в течение 5 мин при 10,000 об/мин. Супернатант высушивали до совершенно сухого состояния на вакуумном концентраторе (Univapo 150 H mit Festwinkelrotor fyr Eppendorfreaktiongefaesse, Uni Equip, Martinsried, Germany) в течение ночи. В каждый эппендорф добавляли по 200 микролитров дистиллированной воды, осадок растворяли, и полученную суспензия заново центрифугировалась. Осадок выбрасывался, супернатант фильтровали через нейлоновый фильтр (0.2 микрометров) и аликвоту анализировал и на колонке. Компоненты идентифицировали по времени ретенции стандартных углеводов.

6.5. Определение концентрации белка

Белок определяли методом окрашивания Coomassie G-250 (Bradford M. M. A., 1976) или по Warburg О., Christian W. (1941) на заключительных этапах очистки.

6.7. Статистическая обработка экспериментальных данных

Все эксперименты в данной работе проводили не менее 4-5 раз, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трёх повторностях. В таблицах и рисунках приведены данные типичного эксперимента. Обсуждению подвергаются только воспроизводимые данные. Отличия в контрольных и опытных сериях анализировали традиционными способами с использованием t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку результатов осуществляли на Power Macintosh 7200/90 с помощью прикладных программ Cricket Graph.

6.8. Фирменная принадлежность реактивов

Галактоза и Coomassie G-250 были получены из Serva FeinBiochemica (Heidelberg, Germany), глюкоза, DEAE-фрактогель и Tentacle - Е. Merck (Darmstadt, Germany), гидроксилапатит - BioRad (Munich, Germany), фосфоглюкомутаза, глюкозо-1.6-диФ - Boeringer (Mannheim, Germany). Bee остальные реактивы были приобретены из Sigma Chemie (Deisenhofen, Germany) или Roth (Karlsruhe, Germany).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 7. Активность ферментов при выращивании Са1(Иепа т1ркигапа на среде с различными углеводами

По уровню возрастания активности в гомогенате СаШкпа ж1ркигапа при выращивании данной водоросли на среде с глюкозой, галактозой и маннитолом ферменты распределились следующим образом: галактокиназа, фосфоманнозоизомераза, фосфоманнозомутаза, галактозо-1 -Ф-уридилтранс-фераза, УДФ-Б-галактозо-4-эпимераза, глюкозо-6-Ф-дегидрогеназа, УДФ-Б-глюкозопирофосфорилаза, фосфоглюкомутаза, фосфоглюкозоизомераза (Рис. 6). Только у двух ферментов: у УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы и фосфоманномутазы активность увеличивалась в два раза при использовании галактозы и маннитола, соответственно, в качестве источника углерода. Активность остальных ферментов на различных средах оставалась без изменений, что говорит об отсутствии каких-либо регуляторных эффектов глюкозы, галактозы и маннитола на активность ферментов галактозного метаболизма, за исключением УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы и фосфоманномутазы.

Глава 8. Очистка и свойства УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из Са1сИепа 5и1ркигапа

В ходе очистки фермента обнаружено наличие двух изоформ УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы, которые были охарактеризованы и

S о и вЗ © л н о о в

РЭ К н

UÍ <

28 24 20" 16 12 8 4 глюкоза

1.07 1-35 0.25 рЗЬИ^Т!

10.00

0.19

0 1 28

27.20

24 ч 2а

Нн е 16 А

8 12 я

РЗ я о н 8 < 4 0 маннитол

11.33

РЗ

LÓ7 л

16.00

1.33 L£i

1 - Галактокиназа

2 - Галактозо-1-Ф-уридилтрансфераза

3 - УДФ-0-галактозо-4эпимераза

4 - УДФ-Б-глюкозопирофосфорилаза

5 - Фосфоглюкомутаза

6 - Фосфоглюкозоизомераза

7 - Фосфоманнозоизомераза

8 - Фосфоманнозомутаза

9 - Глюкозо-6-Ф-дегидрогеназа

10 - Белок (мг/(г с м))

23456789 10

Рис. 6. Активность ферментов галактозного метаболизма в гомогенате Galdieria sulphur aria культивируемой на среде с глюкозой, галактозой и маннитолом. очищены до гомогенного состояния и условно названы как стабильная и нестабильная изоформы.

8.1. Выделение стабильной изоформы

Данная изоформа была очищена в 350-раз с суммарным выходом 38% хроматографией на DEAE-фрактогеле, гидроксилапатите и аффинном геле Dyematrex Orange А. Достигнутая удельная активность составила 42 ФЕ/мг белка (Таблица 2).

Таблица 2.

Очистка УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из Galdieria sulphuraria.

Этап Объём Активность Белок Удельная Очистка Выход, очистки (мл) (ФЕ) (мг) активность -раз %

ФЕ/мг белка)

Гомогенат 126 18.5 176 0.12 1 100

DEAE-фрактогель 37 15.9 20 0.8 7 86 гидроксилапатит 17.5 11.7 5 2.4 22 63

Dyematrex Orange А 3 7.1 0.17 42 350 38

Электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие только одной полосы с молекулярной массой белка в 42 к Да, что свидетельствует о гомогенности полученного препарата (Фото 4). Гель-фильтрация (Рис. 7, 8) и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (Рис. 9) дали значения в

83 и 76 кДа, соответственно. Константа Сведберга равнялась 5.0 8. На основании полученных в ходе выполнения работы данных, была предположена гомодимерная структура белка. Активность УДФ-О-галакто-зо-4-эпимеразы из СаШепа Бхйркигапа чрезвычайно стабильна. Даже после хранения в течение 6 месяцев при -20°С в 50% глицероле или инкубации при 46°С в течение нескольких часов очищенный фермент не терял своей активности (Рис. 10). Частично очищенные препараты были более лабильны, но они могли быть стабилизированы добавлением 50 % глицерола (Рис. 11). кйа] М ЕР1

205 -

116 - ммМИЦ

97.4"

66 - щвтщ у

45 - я^Щш ЩгЩ

Г * » » ' <

29 -

Фото 4. БОБ-электрофорез УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы изСаШепа 5и1р1шгапа после очистки. М = маркерные белки; ЕР1 = УДФ-Б-галактозо-4-эпимераза. св ч: з о о стЗ эН О я & >> и с: о ад

2.0

1.8

1.6

1.4

БСА (димер)

УДФ-1)-галакто5а-4-эпимера:!а малатдегидрогеназа

БСА (мономер) пероксидаза карбоангидраза

20 40 60

Время элюции (мин)

80

100

Рис. 7. Определение молекулярной массы УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы гель-фильтрацией на колонке 8ирегс1ех-200. 2 к я л с; о о а ^ я з, со ей а и я в л

4 Н О о я я я н « с о

Время элюции (мин)

Рис. 8. Элюционный профиль гель-фильтрации УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы на колонке Бирегёех - 200. 0 со я I и §

0 о Я н и л в я о

12 10 8 6 4

Катал аза^б

УДФ-Э -галактозо- - 4-эпимераза (в = 5) \ Фосфоглюкозо-изомераза о ) о Альдолаза д, &Глюкозо-6-Ф-Малатдегид- Т/ дегидрогеназа рогеназа 7 БСД

0 / Пероксидаза / . 1 . 1 .

0 1 2 3 4 5 6

Вершина Дно

Величина миграции (см)

Рис. 9. Определение молекулярной массы УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы.

II-1-1

О 50 100

Время (мин)

Рис. 10. Термостабильность УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы. Ферментативный преперат был инкубирован при указанных температурах, и активность фермента определялась при 22°С при различных временных интервалах.

О 10 20 30 40

Время (дни)

Рис. 11. Влияние условий хранения на активность УДФ-D-ra-лактозо-4-эпимеразы. Был использован ферментативный препарат после колонки гидроксилапатита.

Ранее в литературе сообщалось (FanD.-F. , Feingold D. S. , 1969; Dey P., 1984), что УДФ-0-галактозо-4-эпимераза из ткани млекопитающих и высших растений нуждается в NAD для активности и сильно ингибируется NADH (Таблица 3, 4).

Таблица 3.

Сравнение УДФ-О-галактозо-4-эпимеразы из Galdieria sulphur aria с ферментом из других растительных источников.

Удельная Молекулярный

Икточник pH- активность (ФЕ/мг белка) Очистка вес (кДа) Km (микромоль) Keq Активирование NAD Ингиби-рование NADH белка оптимум Гомо- Достигнутая (-раз) холо субъ- УДФ-D- УДФ-D- генат очистка фермент единица галактоза глюкоза

Galdieria ] sulphuraria 8.0 0.12 42 350 83 42 64 dn 3.5 нет нет

Poterioochromonas malhamensis 2 8.7 0.022 38 710 120 59 260 1670 dn нет dn

Vicia faba3 9.5 0.01 7.9 790 78 dn 120 250 dn нет Да

Petunia 4 7.7 0.0014 0.02 16 dn dn dn dn dn dn dn hybrida

Triticum 9.0 0.0005 0.75 500 dn dn 100 200 dn да да vulgaris 5 dn - данные отсутствуют;1 - данная работа;2 - Thomson и др., 1984;3 - Dey, 1984;4 - Dressler и др., 1984;5 - Fan and Feingold, 1969.

Таблица 4.

Сравнение нестабильной изоформы УДФ-В-галактозо-4-эпимеразы из СсЛсИепа т1ркигапа с подобным ферментом из животных источников.

Источник белка

Удельная активность (ФЕ/мг белка)

Молекулярный

Очистка (кДа) кш (МИКР0М0ЛЬ) Стабильность Активи- Ингибипрепарата рование рование после очистки NAD NADH

Гомо- Достигнутая хол°- субъ- УДФ-Dфермент единица галактоза генат очистка

Galdieria f sulphuraria 2 0.12 246 2050 dn 34 и 46 dn нестабилен есть dn печень телёнка 0.009 25.8 2980 70 37, две dn нестабилен есть есть

3 печень коровы 0.016 66 4125 40 37 17 нестабилен есть dn молочная железа 0.23 210 9130 40 37 8 нестабилен есть есть о\

-Рь коровы dn - данные отсутствуют;1 - данная работа?

- Langer and Glaser, 1974;3 - Geren and Ebner, 1977.

Попытки стабилизировать фермент из Galdieria sulphuraria инкубацией с 1мМ NAD не дали положительного результата, однако, преинкубация фермента с данным кофактором перед этапом очистки на гидроксилапатите значительно снизила потери активности фермента на колонке. В целом, без предварительного инкубирования с 1мМ NAD очистка не имела успеха (Таблица 5): фермент слабо прикреплялся к гидроксилапатиту и вымывался градиентом уже в самых начальных фракциях. В обычном случае пик активности был более смещён к концу (Рис. 12).

Таблица 5.

Очистка УДФ-0-галактозо-4-э1шмеразы из Galdieria sulphuraria без предварительного инкубирования с 1 mM NAD.

Этап Объём Активность Белок Удельная Очистка Выход, очистки (мл) (ФЕ) (мг) активность -раз %

ФЕ/мг белка)

Гомогенат 104 15.2 145 0.11 1 100

DEAE-фрактогель 36 13.0 17 0.8 7.3 86 гидроксилапатит 40 2.6 5 0.5 4.5 17

По всей видимости, в ходе очистки на колонке DEAE происходило либо нарушение структуры активного центра, либо дестабилизация фермента. К сожалению, установить истинную роль NAD так и не удалось, хотя тот факт, что он не является кофактором для данной эпимеразы из Galdieria sulphuraria, очевиден. Следует ещё раз подчеркнуть, что ни NAD, ни NADH влияния на активность не показали. я я

03 W о а, я ю к

D &

СЛ <Ц

VO

60С

40С

600

200

W я £ я м са о и н о сЗ л я о ю о ф я W я я

D Я л сЗ к ft и Н с; о о к Я о Я" я о

0 20 40 60

Номер фракции

80

Рис. 12. Активность УДФ-О-галактозо-4-эпимеразы (наномоль ■ мин ■ мл"1) в градиенте гидроксилапатита без и после преинкубирования с 1 мМ NAD.

В процессе харатеристики фермента была также отвергнута гипотеза о влиянии галактозы и её производных (галактозо-1-Ф и галактозо-6-Ф) на активность эпимеразы. Ни активации, ни ингибирования данные компоненты не вызывали. рН оптимум фермента был около 8.0 с 50% потерей активности около рН 6.6 и 9.2 (Рис. 13). Для субстрата УДФ-О-галактозы Кт составила

64 микромоль (Рис. 14). Энергия активации очищенного фермента 42 кДж/моль (Рис. 15), а К^ (УДФ-О-глюкоза/УДФ-О-галактоза) 3.5. В выращенных на галактозе клетках Galdieria sulphuraria эпимераза, очевидно, принимает участие в превращении внешней галактозы в глюкозо-6-Ф. Однако, данный фермент присутствует с высокой степенью активности и в автотрофно выращеных клетка.х Здесь его функция может быть связана с биосинтезом галактолипидов, а также компонентов клеточной стенки, таких как пектины и галактаны (Рис. 3).

Рис. 13. Влияние рН на активность УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы. Кроме того, УДФ-Б-галактозо-4-эпи-мераза может быть вовлечена в метаболизм флоридозидов при осмотическом стрессе (Reed R. Н., 1983), также как и для Poterioochromonas malhamensis. Однако, так как у Poterioochromonas отсутствует клеточная стенка, осморегуляция через (изо-) флоридозиды является в ней более важной, чем у Galdieria sulphuraria. Ввиду того, что свойства ферментов этих двух представителей различных таксонов (Chrysophyta и Rhodophyta) очень сходны, можно предположить, что это очень гомологичные ферменты. После перемещения культуры Galdieria sulphuraria из автотрофных под миксо- или гетеротрофные условия скорость роста увеличивалась примерно в 10 раз. Однако, специфическая активность УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы значительно не менялась, когда клетки были выращены либо микео-, либо гетеротрофно на глюкозе, галактозе или маннитоле (Рис. 6). г -1

V, микромоль • мин • мл концентрация субстрата, микромоль

Рис. 14. Определение К УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы для УДФ-Э-галактозы методом прямого линейного графика.

Поэтому говорить о наличии какого-либо механизма регуляции или индукции фермента не представляется возможным. к

Ен О О в со 13 н св ЗД

3.3 3.4

1/Т) х 1000 [К]

Рис. 15. Влияние температуры на скорость УДФ-В-галактозо-4-эпимеразной реакции.

8.2. Активация в ходе очистки нестабильной изоформы

При использовании более короткого времени преинкубации с 1 мМ NAD - 1 часа, по сравнению с обычными 18 часами, обнаружено наличие ещё одного пика УДФ-О-галактозо-4-эпимеразы (Рис. 16). Пик не имел чётко выраженной формы, но показал очень высокий уровень активности. Он был изолирован от пика стабильной эпимеразы и в дальнейшем очищен при помощи той же колонки, что и в обычном случае, - Dyematrex Orange А.

1200

3 ^ о, 2 К s Е в 5

I ^ л ¡а н ^ о °

§ I

- э и

1000800600400200пик стабильном изоформы пик нестабильной изоформы о 4-оо-о-о,о-о-ю£>ю 30 50

Номер фракции

Рис. 16. Два пика УДФ-0-галактозо-4-эпимеразной активности на колонке с гидроксиапатитом после преинкубации с 1 мМ NAD в течение 1 часа.

Данная изоформа оказалась крайне нестабильной и, буквально, через 2-3 часа полностью теряла какую-либо активность, что сделало невозможным измерение её воспроизводимых кинетических параметров. Попытки стабилизировать фермент оказались безуспешными. Очищенная изоформа имела удельную активность 246 ФЕ/мг белка и была очищена в 2000 раз (Таблица 6).

Таблица 6.

Очистка нестабильной изоформы УДФ-С-галактозо-4-эпимеразы из СакИепа 8и\рЬигапа.

Этап Объём Актив- Белок Удельная Очистка Выход очистки (мл) ность (мг) активность -раз %

ФЕ) (ФЕ/мг белка)

Гомогенат 108 16.3 141 0.12 1 100

ОЕАЕ-фрактогель 36 13.5 15.8 0.85 7 83 идроксилапатит (1пик) 39 28.3 7.6 3.72 31 174

Буета^ех Orange А 6 89.1 0.36 246 2050 547 дальнейшие расчёты приводятся относительно активности обоих изоформ в гомогенате

Гомогенность полученного препарата была доказана электрофоретически, однако 808-электрофорез продемонстрировал, что данная форма является дигетеромером, состоящим из субъединиц в 46 и 34 кДа (Рис. 17; Фото 3). Вполне возможно, что данная форма эпимеразы является исключительно ЫАБ-зависимой и после потери кофактора на БЕАБ-фрактогеле становится крайне нестабильной, вплоть до полной инактивации, что делало невозможным её определение. В ходе же процедуры очистки происходила кратковременная активация фермента, но это его ш стабилизировало. Следует отметить, что присутствие данной изоформы обнаруживается только в варианте использования более короткого времени

7 1 преинкубации с 1 мМ NAD - 1 час - на колонке с гидроксилапатитом. 3 со 3 й 2 Он . 1> 1500 s

S' к р п I д

4 О S о

Он « К Я

1000

- 500 vvnv

1 01 91 П к-«ww-' маркеры U сЗ ъ к

Он н к U а в о * а) распределение УДФ-О-галактозо-4-эпимеразной активности по фракциям после очистки нестабильной изоформы фермента на колонке Dyematrex Orange А. б)гель-электрофорез фракций № 2 - 6 с УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразной активностью после колонки Dyematrex Orange А. субъединица в 46 кДа в) SDS-электрофорез фракций NQ 2 - 4 с УДФ-О-галактозо-4-эпимеразной активностью после колон-ки Dyematrex Orange А. к Да] субъединица в 34 кДа Фото 5. Доказательство гомогенности ферментативного препарата нестабильной изоформы УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, очищенной при помощи колонки Dyematrex Orange А.

Наличие данной изоформы имеет аналогию с фактом присутствия УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы в животной ткани, когда очищенный препарат имел те же свойства, что и обсуждаемая здесь изоформа: высокая степень нестабильности, зависимость от NAD, достигнутая высокая степень очистки (Таблица 4). л о о

СЗ

SS эК о и а « t; ¡4

4) Ч О вд

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

• \ Р-галактозидаза фосфорилаза b субъединица в 46 кДа

БСА®Ч субъединица в 34 кДа овальбумин карбоангидраза \ 1 1 1 X

5 Ю 15

Величина миграции, мм

20

Рис. 17. Определение молекулярной масы двух субъединиц нестабильной изоформы УДФ-О-галактозо-4-эпимеразы при помощи БОБ-электрофореза.

Глава 9. Выделение и характеристика УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из

Galdieria sulphuraria

УДФ-Б-глюкозопирофосфорилаза была очищена до гомогенного состояния включая следующую серию колонок: DEAE-фрактогель, гидроксилапатит, Butyl HIC, Superdex-200. Препарат был стабилен в течение недели и после всей процедуры очистки показал удельную активность в 100 ФЕ/мг белка, что соответствовало очистке фермента в 152 раза и суммарном выходе 10% (Таблица 7).

Таблица 7.

Очистка УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из Galdieria sulphuraria.

Этап Объём Актив- Белок Удельная Очистка Выход, очистки (мл) ность (мг) активность -раз %

ФЕ) (ФЕ/мг белка)

Гомогенат 108 91.3 141 0.65 1 100

DEAE-фрактогель 38 53.4 32 1.7 2.6 59 гидроксилапатит 21 34.5 13 2.7 4.2 38

Butyl HIC 26 24.0 0.17 31.4 48 23

Superdex-200 7.5 9.00 0.09 100 152 10

Полученные данные сопоставимы со свойствами фермента из других источников (Таблица 8). Молекулярная масса холофермента, определённая при помощи гель-фильтрации, составил 330 кДа (Рис. 18). Кт для субстрата УДФ-Б-глюкозы равнялась 115 микромоль(Рис. 19), а достигнутая Vmax -0.97 ФЕ/мг белка. Влияния NAD, NADH, галактозы, галактозо-1-Ф (при соспоставимых концентрациях с глюкозо-1-Ф), галакто-зо-б-Ф на активность фермента не обнаружено. Пик активности АДФ-О-глюкозопирофосфо-рилазы (КФ 2.7.7.27) отличен от пика УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы всего на 6-7 фракций (Рис. 20). Данное наблюдение подтверждает наблюдения других авторов, что УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза часто обнаруживается вместе с АДФ-О-глюкозопирофосфорилазой в тканях, которые производят или деградируют крахмал.

Таблица 8.

Сравнение УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из растительных источников. pH- Удельная Очист- Молеку-

Источник опти- активность ка лярная Km (микромоль) белка мум (ФЕ/мг белка) -раз масса (кДа) гомо- достиг- УТФ pp 1 УДФ- глюко генат нутая очистка глюкоза 30-1- Ф

Cucumis 6.0- 1.1 3.9 3.6 dn 320 dn dn 1000 sativus1 7.5 и 2.8* и 2.6 и120 и 750

Galdieria dn 0.65 100 152 330 dn dn 115 dn sulphuraria2

Lilium lon- dn 0.96 33 34 dn 140 dn 460 dn giflorum 3

Phaseolus 8.0 1.04 815 815 dn dn 230 110 160 aureus 4

Pisum sativum 7.5- 0.65 0.68 проростки)2 9.05 0.96 и 0.12* и 0.13 dn dn dn dn dn

Solanum dn dn dn 177 53 120 130 140 80 tuberosum 6

Sorghum 8.0- 8.7 1200 138 50 30 54 56 48 vulgare1 9.0

Triticum 8-9 dn dn 65 72 dn 660 220 dn aestivum 8

Zea mays 9 8.0 dn dn dn dn dn dn dn dn dn - данные отсутствуют; *- авторы получили 2 пика активности; !- Smart Е. L. , Pharr D. М., 1981; 2 - данная работа; з - Hopper J. Е., Dickinson D. В., 1972; 4 -Ginsburg V., 1958;5 - Turner J. F. , Turner M. P., 1958; 6 - Sowokinas J. R. et al, 1993; ^ - Gustafson G., Gander J. E., 1972;« - Kumar V. et al., 1995; * - Vidra J. D., LoerchJ. D., 1968.

Это было показано ранее для листьев риса (Nomura U. et al., 1967) и его развивающихся зёрен (Perez С. М. et al. 1975), семян гороха (Turner J. F., 1969а), хлоропластов обкладки пучков кукурузы (Huber W. et al., 1969), кукурузного эмбриона и эндосперма (Vidra J. D., Loerch J. D. , 1968; Ozbun J. L. et al., 1973; Dickinson D. B. et al., 1977), зёрен пшеницы (Turner J. F„ 1969b; Tovey К. С., Roberts R. M., 1970), проростков бобов (Delmer D. P., Albersheim P., 1970), пыльцы лилии (Dickinson D. В., Davies M. D., 1971) и каллуса Nicotiana tabacum (Palmer С. E., 1976).

Время элюции (мин)

Рис. 18. Определение молекулярной массы УДФ-D-глюкозопирофосфорилазы гель-фильтрацией на колонке Superdex-200.

Факт совместного присутствия обоих пирофосфорилаз теперь справедлив и для проростков гороха. Однако, активность УДФ-О-глюк озо-пирофосфорилазы обычно в 30-50 раз выше (Feingold D. S., Avigad G., 1980), что и подтверждается результатом данного эксперимента.

V, микромоль • мин • мл концентрация субстрата, микромоль

Рис. 19. Определение КтУДФ-0-глюкозопирофосфорилазы для УДФ-О-глюкозы методом прямого линейного графика. о &

К' в о

СО

0 ы 2 с; и 1 р © „

Ь5

В • л Ч о о о. к д н о о аз га я н л со ее с; я о л о о

10000

8000

6000

4000

2000 0

О—-О-О—О-О-О-ОО^

10

-о—о

200

150

100

50 0

60 номер фракции о

Он

Я ' с о со

0 ¡4 2 4 и 1

О © ~

5 я й я

А § о л X я

Л н о о я И я н я

СО л с; я оо

•9« и я Я" се о,

Ен я <и а" я

0 «

1 I

Рис. 20. Распределение пиков активностей УДФ-Б-глюкозопиро-фосфорилазы и АДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы по фракциям после Е)ЕАЕ-фрактогел я.

Интересно отметить, что в гомогенате клеток, выращенных на глюкозе и маннитоле, фермент показал примерно одинаковый уровень активности, в клетках же на среде с галактозой его уровень в два раза выше (Рис. 6). Определённо, УДФ-й-глюкозопирофосфорилаза принимает самое непосредственное участие в метаболизме галактозы, в частности, одного из его производных - УДФ-0-галактозы. Здесь же следует отметить, что при неоднократных попытках обнаружить присутствие УДФ-О-галактозопиро-фосфорилазной реакции отмечена неспецифическая активность УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы с обоими субстратами: галактозо-1-Ф и УДФ-D-галактозой, растущая при увеличении концентрации данных неспецифических для этого фермента субстратов. Каких-либо измерений данного наблюдения не проводилось, но этот факт как нельзя лучше коррелирует с сообщениями других авторов о метаболизме УДФ-О-глюкозопирофосфорилазой из растений УДФ-О-галактозы и галактозо-1-Ф (Hopper J. Е, Dickinson D. В., 1972; Ray М., Abdul-Baki А. А., 1968; Smart Е. L., Pharr D. М., 1981).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Проселков, Павел Владимирович

V. ВЫВОДЫ

1. Токсичность галактозы для высших растений связана с субстратным ингибированием УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы УДФ-Б-галактозой, что приводит к замедлению работы данного фермента и прекращению метаболизма галактозы. Данное явление представляет собой регуляторный механизм, так как позволяет клетке экономно расходовать поступающую при гидролизе рафинозы галактозу в время прорастания семян.

2. Показано, что неспецифическая активность УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из красной водоросли и проростков гороха с УДФ-Б-галактозой и галактозо-1-Ф приводит к накоплению галактозо-производных и последующему усилению ингибирования эпимеразы и данной пирофосфорилазы собственными продуктами галактозного обмена.

3. Обнаружено, что проблема токсичности галактозы не связана с её транспортом внутрь клеток корня. Данный углевод поглощается так же быстро, как глюкоза и фруктоза.

Рис. 27. Предполагаемая схема токсичности галактозы для высших растений.

4. Впервые из красной термоацидофильной водоросли Galdieria sulphuraria получены в гомогенном состоянии две изоформы УДФ-D-галактозо-4-эпимеразы. Стабильная изоформа имела удельную активность 42 ФЕ/мг белка, её выход при очистке составил 38 %, а степень очистки равнялась 350. Нестабильная изоформа, подверженная активации NAD и активированная данным кофактором в ходе очистки, имела удельную активность 246 ФЕ/мг белка, её выход при очистке составил 547 %, а степень очистки равнялясь 2050.

5. Из проростков гороха удалось выделить также две изоформы УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы, однако очистить их удалось только частично.

6. УДФ-Б-глюкозопирофосфорилаза из Galdieria sulphuraria была очищена до гомогенного состояния. Она имела удельную активность 100 ФЕ/мг белка, её выход при очистке составил 10 %, а степень очистки равнялась 152.

7. Установлено, что в проростках гороха также имеются две изоформы УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы, которые были частично очищены.

8. У обоих растений отсутствует индукция ферментов галактозного метаболизма, за исключением УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы, активность которой возрастает в два раза при выращивании Galdieria sulphuraria на среде с галактозой.

9. Обнаружено отсутствие у Galdieria sulphuraria и в проростках Pisum sativum активности фермента пути Isselbacher - УДФ-D-галактозопирофосфорилазы. Метаболизм галактозы у этих объектов протекает через ключевой фермент пути Leloir - галактозо-1-Ф-уридилтрансферазу.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

УДФ-0-галактозо-4-эпимераза и УДФ-Б-глюкозопирофосфорилаза занимают ключевые позиции не только в галактозном, но и во всём углеводном метаболизме клетки. Их продукты служат предшественниками синтеза галактанов, гликопротеинов, гликолипидов, галактолипидов, олигосахаридов, галактинола, крахмала, сахарозы, пектинов, пентозанов, каллозы, целлюлозы, глюкуроната, рафинозы, стахиозы и многих других компонентов метаболизма. Однако, при экзогенном применении галактозы происходит ингибирование активностей данных ферментов, что, в конечном итоге, приводит к гибели всего организма.

Экзогенная галактоза, используемая в качестве экзогенного источника углерода, повышает внутриклеточный пул УДФ-Э-галактозы. УДФ-Б-галактозо-4-эпимераза у галактозо-чувствительных растений подвергается субстратному ингибированию, что вызывает накопление и аккумуляцию УДФ-Б-галактозы и истощение пулов УДФ-Э-глюкозы, УТФ и фосфата. Далее происходит подключение фермента УДФ-Б-глюкозопирофос-форилазы, который, взаимодействуя с УДФ-Б-галактозой, приводит к формированию избытка галактозо-1-Ф, в свою очередь, метаболизируемым галактозо-1-Ф-уридилтрансферазой, что приводит к формированию новых количеств УДФ-Б-галактозы. Формируется замкнутый цикл, результатом которого является прекращение метаболизма галактозы, аккумуляция галактозо-1-Ф и УДФ-Б-галактозы, ингибирующих как поступление субстратов для протекания катаболических реакций, так и биосинтез промежуточных, строительных и запасающих компонентов, элиминация УТФ и фосфата. Всё это имеет физиологические последствия, что выражается в иигибировании роста стебля и его сручиваиии, нарушении синтеза пигментов, прекращении элонгации гипокотиля и регенерации чехлика, опадении листьев, и гибели всего организма (Рис. 27). Данная схема предлагается впервые и включает в себя как экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения поставленных перед работой задач, так и сведения, ранее опубликованные другими авторами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Проселков, Павел Владимирович, 1998 год

1. Ат О. А., Лоскутова Н. А., Павлова 3. Н. Новые физиологические эффекты олигосахаридных фрагментов растительного ксилоглюкана // Журн. общ. биол. 1995. - Т. 340, N 3. - С. 427-429.

2. Герасименко Л. М., Миллер Ю. М. Газовый обмен термофильного и ацидофильного фототрофа Cyanidium caldarium И Микробиол. 1985. -Т. 54, N 5. - С. 693 - 698.

3. Герасименко Л. М., Пушева М. А., Горюнова С. В. Цикл развития и ультратонкое строение Cyanidium caldarium II Микробиол. 1972. - Т. 41, N 2. - С. 324 - 328.

4. Ацидофильная водоросль Cyanidium caldarium из термальных источников Дальнего Востока/Б. В. Громов, И. А. Авилов, Л. В. Андреев, Сенцова О. Ю. // Научн. докл. высш. школы, сер. биол. науки. 1979. - Т. 10, N 1. - С. 78-82.

5. Игнатьевская М. А., Минеева Л. А. Влияние кислотности среды на рост и пигментный состав Cyanidium caldarium в зависимости от способа существования // Физиол. раст. 1982. - Т. 29, N 3. - С. 586 - 590.

6. Кочетков Н. К., Усов А. И., Мирошникова Л. И. Полисахариды водорослей. I. Водорастворимые полисахариды красной водоросли Laingia pacifica II Журн. общ. хим. 1967. - Т. 37, N 4. - С. 792-796.

7. Кочетков Н. К., Усов А. И., Мирошникова Л. И. Полисахариды водрослей. IV. Фракционирование и метанолиз сульфированного полисахарида из Laingia pacifica Yamada // Журн. общ. хим. 1970. - Т. 40, N 11.-С. 2469-2473.

8. Кочетков Н. К., Усов А. И., Рехтер М. А. Полисахариды водорослей. VIII. Ацетолиз ^-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) // Жури, общ. хим. -1971. Т. 41, N 5. - С. 1160-1165.

9. Полисахариды водорослей. XII. Частичный гидролиз полисахарида из Laingia pacifica Yamada / Н. К. Кочетков, А. И. Усов, Л. И. Мирошникова и др. // Журн. общ. хим. -1973. Т. 43, N 8. - С. 1832-1839.

10. Павлинова О. А., Прасолова М. Ф. Сахаросинтезирующие ферменты корня сахарной свёклы // Физиол. раст. 1970. - Т. 17, N 2. - С. 295 - 298.

11. Ксилоглюкановые олигосахарины элиситоры защитных реакций растений / 3. Н. Павлова, Н. А. Лоскутова, В. А. Внучкова и др. // Физиол. раст. -1996. - Т. 43., N 2. - С. 279-284.

12. Пахомова М. В., Зайцева Г. Н., Альбитская О. Н. Изучение кислото-растворимых фосфорных компонентов в зелёной водоросли Chlorella vulgaris по отношению к скорости деления клеток на источнике азота // Биохим. 1965. - Т. 30, N 6. - С. 1204-2121.

13. Селях И. О., Минеева, Л. А., Гусев, М. В. Особенности ультраструктуры клеток Cyanidium caldarium на разных стадиях роста периодической культуры // Изв. АН СССР. сер. биол. 1984. - Т. 1, N 1. - С. 74 - 80.

14. Выявление мембранных структур клеток Cyanidium caldarium. при разныхметодах фиксации / И. О. Селях, М. А. Романова, О. И. Баулина и др. // Физиол. раст. -1981. Т. 28, N 6. - С. 1210-1217.

15. Сенцова О. Ю. О разнообразии одноклеточных ацидотермофильных водорослей рода Galdieria (Rhodophyta, Cyanidiophyceae) // Бот. журн. -1991.-Т. 76, N 1.-С. 69-79.

16. Синтез трисахаридного и пентасахаридного фрагментов растительного ксилоглюкана потенциальных ингибиторов ауксина / В. И. Торгов, О. А. Нечаев, А. И. Усов и др. // Биоорг. хим. - 1990. - Т. 16, N 6. - С. 854857.

17. Синтез фрагмента растительного ксилоглюкана тетрасахарида Xylal6Glc (31 -4(Xylal -6)Glc и его три- и тетрасахаридных аналогов / В. И. Торгов, О. А. Нечаев, А. И. Усов и др. // Биоорг. хим. -1991. Т. 17, N 3. - С. 424-426.

18. Усов А. И., Кочетков Н. К. Полисахариды водорослей. П. Полисахаридыкрасной водоросли Odontalia corymbifera (Gmel.) J. Ag. Выделение 6-0-метил-Б-галактозы // Журн. общ. хим. 1968. - Т. 38, N 2. - С. 234-238.

19. Усов А. И., Рехтер М. А., Кочетков Н. К. Полисахариды водорослей. Ш. Выделение и предварительное изучение ^.-полисахарида из Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr // Журн. общ. хим. 1969. - Т. 39, N 4. - С. 905-911.

20. Усов А. И., Рехтер М. А. Обнаружение невосстанавливающих Сахаров при хроматографии на бумаге // Журн. общ. хим. 1969. - Т. 39., N 4. - С. 912-913.

21. Усов А. И., Лотов Р. А., Кочетков Н. К. Полисахариды водорослей. VII. Предварительное исследование полисахаридов красной водоросли

22. Rhodomelia Larix (Turn.) С. AG 11 Журн. общ. хим. 1971. - T. 41, N 5. -С. 1154-1160.

23. Усов А. И. Полисахариды водорослей. XIII. Моносахаридный состав полисахаридов некоторых красных водорослей японского моря // Журн. общ. хим. 1974. - Т. 44, N 1. - С. 191-196.

24. Полисахариды водорослей. XIV. Выделение сульфатированного маннана и нейтрального ксилана из красной водоросли Nemalion vermiculare Sur. / А. И. Усов, К. С. Адамянц, С. В. Яроцкий и др. // Журн. общ. хим. -1974. т. 44, N 2. С. 416-420.

25. Усов А. И., Козлова Е. Г. Полисахариды водорослей. XX. Изучение одонталана сульфатированного полисахарида из красной водоросли Odonthalia corymbifera (Gmel.) J. Ag. // Биоорг. хим. - 1975. - T. 1, N 7. -С. 912-918.

26. Усов А. И., Яроцкий С. В. Полисахариды водорослей. XXI. Щелочная деградация сульфатированного маннана из краной водросли Nemalion vermiculare Sur. // Биоорг. хим. 1975. - Т. 1, N 7. - С. 919-922.

27. Усов А. И., Кошелева Е. А., Яковлев А. П. Полисахариды водорослей. XXXV. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Японского моря // Биоорг. хим. 1985. - Т. 11, N 6. - С. 830-836.

28. Усов А. И., Добкина И. М. Полисахариды водорослей. XXXVIII. Полисахаридный состав красной водросли Liagora sp. и строение сульфатированного ксиломаннана // Биоорг. хим. 1988. - Т. 14, N 5. - С. 642-651.

29. Усов А. И., Вергунова Г. И. Полисахариды водорослей. XXXIX. Изучение сульфатированного галактана из красной водоросли Palmiria stenogona Perest. // Биоорг. хим. 1989. - Т. 15, N 2. - С. 198-207.

30. Усов А. И., Чижов А. О. Полисахариды водорослей. XL. Углеводный состав бурой водоросли Horda filum II Биоорг. хим. 1981.- Т. 15, N 2. -С. 208-216.

31. Усов А. И., Иванова Е. Г., Элашвили М. Я. Полисахариды водорослей. 41. Характеристика водорастворимых полисахаридов нескольких представителей рода Laurencia (Ceraminales, Rhodophyta) // Биоорг. хим. -1989. Т. 15, N 9. - С. 1259-1267.

32. Усов А. И., Элашвили М. Я. Количественное определение производных 3,6 ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красных водрослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорг. хим. -1991. - Т. 17, N 6.-С. 839-848.

33. Усов А. И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях // Успехи хим. - 1993. - Т. 62, N 11. - С. 1119-1144.

34. Определение абсолютной и аномерной конфигурации Сахаров в олиго- и13полисахаридах по эффектам гликозилирования в спектрах С-ЯМР / А. С. Шашков, А. И. Усов, Ю. А. Книрель и др. // Биоорг. хим. -1981. Т. 7, N 9. - С. 1364-1370.

35. Adair W. L., Gabriel O. 4-Uloses as intemediates in enzymenieotinamide Adenine Dinucleotide-mediated Oxidoreduetase Mechanisms. I. Uridine Diphosphate Galactose-4-Epimerase // J. Biol. Chem. 1973. - Vol. 248, N 1. - P. 4635-4639.

36. Adler J., Kaiser A. D. Galactose operon in Escherichia coli II Virol. 1963. -Vol. 19, N 1.-P. 117-120.

37. Aebi H. E. Catalase // Meth. enzym. anal. 1983. - Vol. 3. - P. 273-286.

38. Purification, cristallization, properties of UDP-glucose pyrophosphorylase from calf liver tissue / G. J. Albrecht, S. T. Bass, L. L. Seifert et al. // J. Biol. Chem. -1966. Vol. 241, N 8. - P. 2968-2974.

39. Amuti K. S., Pollard C. J. The metabolism of galactose, the raffinose oligosaccharides by germinating bambarra ground nut seeds // Phytochem. -1977. Vol. 16, N 5. - P. 533-537.

40. Anderson E., Lowe H. J. The composition of flaxseed mucilage // J. Biol. Chem. 1947. - Vol. 168, N 2. - P. 289-297.

41. Anker L. Auxin synthesis inhibition by sugars, notably by galactose // Acta Bot. Nederlandica. 1974. - Vol. 23, N 7. - P. 705-714.

42. Arabschahi A., Flentke G. R., Frey P. A. Studies on properties of UDP-D-galactose 4-epimerase // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263, N 9. - P. 26382643.

43. Molecular characterization of galactosemia (type 1) mutations in Japanese / J. Ashino, Y. Okano, I. Suyama et al. // Hum. Mutat. 1995. -Vol. 6., N 1. - P. 36-43.

44. Aspinall G. O. Polysaccharides. New York: Pergamon Press, 1970. P. 178.

45. Ballard F. J. Purification, Properties of Galactokinase from Pig Liver // Biochem. J. 1966. - Vol. 98, N 3. - P. 347-352.

46. Barber G. A. The synthesis of L-galactose by plant enzyme systems // Arch. Biochem. Biophys. 1971. - Vol. 147, N 6. - P. 619-623.

47. Basu D. K., Buchhawat B. K. Crystallization of UDP-D-glucose pyro-phosphorylase from human brain // J. Neurochem. 1961. - Vol. 7, N 1. - P. 174-179.

48. Bell D. J., Baldwin E. L-galactose as a component of animal origin // Nature.1940. Vol. 146, N 5. - P. 559-560.

49. Bell D. J., Baldwin, E. The chemistry of galactogen from Helix pomatia. L-galactose as a component of a polysaccharide of animal origin // J. Chem. Soc.1941. Vol. 76, N 1. - P. 125-132.

50. Bernstein R. L., Robbins P.W. UDP-D-glucose pyrophosphorylase, its role in bacterial antigens synthesis // J. Biol. Chem. 1965. - Vol. 240, N 3. - P. 391396.

51. Quantitative assessment of whole body galactose metabolism in galactosemic patients / G. T. Berry, I. Nissim, J. B. Gibson et al. // Eur. J. Pediatr. 1997. -Vol. 156, Suppl. 1. - P. 43-49.

52. Beutler E. Galactosemia: Screening, diagnosis //Clin. Biochem. 1991. - Vol. 24, N 2. - P. 293-300.

53. Bilisics L., Karacsonyi S., Kubackova M. The cytosol location of UDP-glucose 4-epimerase // Collect. Czech. Chem. Commun. 1982. - Vol. 47, N 9. - P. 1530-1536.

54. Bissett D. L.„erson K. L. Genetic Evidence for the Physiological Significance of the D-Tagatose 6-Phosphate Pathway of lactose, D-Galactose Degradation in Staphylococcus aureus II J. Bacteriol. 1974. - Vol. 119, N 6. - P. 698-704.

55. Blackburn P., Ferdinand W. The Concerted Inactivation of Escherichia coli Uridine Diphosphate Galactose 4-Epimerase by Sugar Nucleotide together with a Free Sugar // Biochem. J. 1976. - Vol. 155, N 2. - P. 225-229.

56. Blum H., Beier H., , Gross H. J. Improved silver staining for plant proteins, RNA,, DNA in Polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1987. - Vol. 8, N 1. -P. 93-99.

57. Bradford M. M. A rapid, sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72, N 2. - P. 248-254.

58. Burstroem H. Observations on the influence of Galactose on Wheat Roots // Plant Physiol. 1948. - Vol. 1, N 2. - P. 209-215.

59. Buttin, G. Properties of galactokinase in Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1963.- Vol. 7, N 1.-P. 164-170.

60. Chojnaki T., SawickaT. Korzybski T. Uridine diphosphoglucose pyrophospho-rylase from bacteria // Acta Biochim. Pol. 1968. - Vol. 15, N 2. - P. 293-298.

61. Clermont S., Percheron F. Uridine diphosphogalactose-4 epimerase de fenugrec: essais de purification et quelques properetes // Phytochem. 1979. - Vol. 18, N 10. - P. 1963-1965.

62. Colclasure G. C. Yopp J. H. Galactose-induced Ethylene Evolution in Mung Been Hypocotils: A Possible Mechanism for Galactose Retardation by Plant Growth // Physiol. Plant. 1976. - Vol. 37, N 2. - P. 298-302.

63. Cooper R. A., Greenshields R. N. Hydrolitic enzymes of Phaseolus vulgaris acting oh the raffinose family of oligosaccharides (including sucrose) // Biochem. J. -1961. Vol. 81, N 1. - P. 6-13.

64. Courtois J. E. Le Dizet P. Cell wall composition in Gleditscia macracanta II Bull. Soc. Chim. Biol. 1966. - Vol. 48, N 1. - P. 190-196.

65. Cramer D. W., Xu H. J., Harlow B. L. Family history as a predictor of early menopause // Fertility, Sterility. 1995. - Vol. 64, N 7. - P. 740-745.

66. Cumming D. F. Separation, identification of soluble nucleotides in cambial, young xylem tissue of Larix decidua Mill // Biochem. J. 1970. - Vol. 16, N 1. -P. 189-198.

67. Curtino J. A., Calderon R. O. Caputto R. Uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase, its role in glycolipids formation // Fed. Proc., Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. 1968. - Vol. 27, N 3. - P. 346-350.

68. Dalessandro G., Northcote D. H. Changes in enzymic activities of nucleoside diphosphate sugar interconversions during differentation of cambium to xylem in pine, fir // Biochem. J. 1977a. - Vol. 162, N 2. - P. 281-288.

69. Dalessandro G.„ Northcote D. H. Changes in enzymic activities of nucleoside diphosphate sugar interconversions during differentation of cambium to xylem in sycamore, poplar // Biochem. J. 1977b. - Vol. 162, N 2. - P. 267-279.

70. Dalessandro G., Northcote D. H. Possible control sites of polysaccharide synthesis during cell growth, wall expansion of pea seedlings // Planta. 1977c. -Vol. 134, N 1. - P. 39-44.

71. Danishefsky I., Heritier-Watkins O. Heparine biosynthesis // Biochem. Biophys. Acta. 1957. - Vol. 139, N 3. - P. 349-356.

72. Darrow R.A., Rodstrom R. Subunit Association, Catalitic Activity of Uridine Diphosphate Galactose-4-Epimerase from Yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1966. Vol. 55, N 2. - P. 205-212.

73. Molecular cloning, characterization,, mapping of a full-length cDNA encoding human UDP-galactose 4'-epimerase / N. Daude, T. K. Gallaher, M. Zeschnigk et al. // Biochem. Mol. Med. 1995. - Vol. 56, N 1. - P. 1-7.

74. David S. B. Studies on the Nutrition of Excised Roots of Medicago sativa L University of Manchester: PhD Thesis, 1954. P. 156.

75. Davison J., Frame R., Bishop J. Galactose metabolizing gene of Escherichia coli II Genet. Res. 1967. - Vol. 10, N 1. - P. 107-115.

76. The effect of galactose on the growth of Lemna / P. C. De Kock, M. V. Cheshire, C. M. Mundie et al. // New Phytol. 1979. - Vol. 82, N 6. - P. 679685.

77. De Ley J., Doudoroff M. The Metabolism of d-galactose in Pseudomonas saccharophila II J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 227, N 7. - P. 745-757.

78. De Troch P., Keijers V., Vanderleyden J. Sequence analysis of the Azospirillum brasilense exoB gene, encoding UDP-glucose 4CD-epimerase // Gene. -1994. -Vol. 144, N 1.-P. 143-144.

79. Degnan B. A., Macfarlane G. T. Carbohydrate utilization patterns, sub-strate preferences in Bacteroides thetaiotaomicron II Anaerobe.- 1995. Vol. 1, N 1. - P. 25-33.

80. Delmer D. P., Albersheim P. The biosynthesis of sucrose, nucleoside diphosphate glucoses in Phaseolus aureus II Plant Physiol. 1970. - Vol. 45, N 7. - P. 782-786.

81. Dey P. M. UDP-galactose 4-epimerase from Vicia faba seeds // Phytochem.1984. Vol. 23, N 7. - P. 729-732.

82. Dickinson D. B., Davies M. D. Metabolism of germineting My pollen: Pollen enzymes// Pollen, development, physiology. London. -1971.-N l.-P. 190193.

83. Dickinson D. B., Hyman D., Gonzalez J. W. Isolation of uridine 5'32pyrophosphate glucoronic acid pyrophosphorylase, its assay using P-pyrophosphate // Plant Physiol. 1977. - Vol. 59, N 10. - P. 1082-1084.

84. Doudoroff M., De Ley, Palleroni N. J., Weimberg R. A new galactose metabolizing route in Pseudomonas saccharophila II Fed. Proceed. 1956. -Vol. 15, N 2. - P. 244-252.

85. Galactose metabolism in Petunia / K. Dressier, S. Biedlingmaier, H. Grossberger, J. Kemmner, U. Noelle, A. Rodmanis-Blumer, D. Hess // Z. Pflanzenphysiol. 1982. - Vol. 107, N 4. - P. 409-418.

86. Eisenthal R., Cornish-Bowden A. The direct linear plot. A new graphical procedure for estimating enzyme kinetic parameters // Biochem. J. 1974. -Vol. 139, N 7. - P. 715-720.

87. Emery R. S., Baldwin R. L. Uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase from the rats mammary // Biochim. Biophys. Acta. 1967. - Vol. 136, N 2. - P. 223230.

88. Growth characteristics, cellular components of Chlorella vulgaris, heterotrophic fast growing strain / H. Endo, K. Nakajima, R. Chino et al. // Agric. Biol. Chem. 1974. - Vol. 38, N l.-P. 9-18.

89. Enzyme Nomenclature. Recommendations of the Nomenclature Committee of the1.ternational Union of Biochemistry, Molecular Biology. San Diego: Academic Press. 1992. - 243 p.

90. Epstein W., Beckwith J. R. Regulation of gene expression // Ann. Rev. Biochem. 1968. - Vol. 37, N 4. - P. 411-436.

91. Fan D.- F., Feingold D. S. Nucleoside diphosphate-sugar 4-epimerases. I. Uridine diphosphate glucose 4-epimerase of wheat germ // Plant Physiol. -1969. Vol. 44, N 5. - P. 599-604.

92. Farkas G. L. Die toxiche Wirkung einiger Zucker auf die Wurzeln der Pflanzen. Zuckerautogonismen // Biol. Zentralblatt. 1954. - Vol. 73, N 5. -P. 506-521.

93. Feingold D. S. Aldo(and Keto) Hexoses, Uronic Acids // Plant Carbo-hydrates. I. Intracellular Carbohydrates. Berlin. 1982. - P. 32 -71.

94. Feingold D. S., Avigad G. Sugar Nucleotide Transformations // The Biochemistry of Plants. 1980. - Vol. 3. - P. 132-170.

95. Feingold D. S., Neufeld E. F., Hassid W. Z. Role of UDP-glucose pyro-phosphorylase in cell wall polysaccharides biosynthesis // J. Biol. Chem. -1958. Vol. 233, N 7. - P. 783-780.

96. Ferguson J. D., Street H. E. The Carbohydrate nutrition of Tomato Roots. VI. The inhibition of excised root growth by galactose, mannose, its reversal dextrose, xylose // Ann. Bot. 1958. - Vol. 22, N 5. - P. 523-525.

97. Ferguson J. D., Street H. E., David S. B. The Carbohydrate nutrition of Tomato Roots. V. The Promotion, Inhibition of Excised Root Growth by varios Sugars, Sugar Alcohols // Ann. Bot. 1958. - Vol. 22, N 5. - P. 513-523.

98. Ford T. W. Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase from the thermo-philic acidophilic alga Cyanidium caldarium Geitler. Purification, caracterisation, thermostability of the enzyme // Biochim. Biophys. Acta. - 1979. - Vol. 569, N 2. - P. 239-248.

99. Franke J. Sussman M. Uridinediphosphate glucose pyrophosphorylase of Dictyostellium discoideum II J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246, N 12. - P. 6381-6390.

100. Franz G., Meier H. Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase, its role in glycosides synthesis // PlantaMed. 1969. - Vol. 17, N 3. - P. 396-405.

101. Frick H. Callogenesis, Carbohydrate Utilization in Lemna minor II J. Plant Physiol. 1991. - Vol. 137, N 3. - P. 397-401.

102. Frick H. Heterotrophy in the Lemnaceae II J. Plant Physiol. 1994. - Vol. 144, N 1. - P. 189-193.

103. Frick H., Morley K. Metabolism of Lactose by Lemna minor L. (Duckweed) Callus // Proc. Biochem. 1995. - Vol. 30. - N 1. - P. 57-62.

104. Fukasawa T., Jokura K. Kurachashi K. Incorporation of polysaccharides into the cell wall // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1962. - Vol. 7, N 1. - P. 121131.

105. The enzymes of the galactose cluster in Saccharomyces cerevisiae. II. Purification, characterization of uridine diphosphoglucose 4-epimerase / T. Fukasawa, K. Obonai, T. Segawa, Y. Nogi // J. Biol. Chem. 1980. - Vol. 255, N 13. - P. 2705-2707.

106. Fukasawa T., Segawa T., Nogi Y. Uridine Diphosphate Glucose-4-epi-merase, galactose-1-phosphate Uridyltransferase from Saccharomyces cerevisiae II Meth. Enzymol. 1982. - Vol. 89. - P. 584-592.

107. Gabriel O., Kalekar H. M., Darrow R. A. Characterization, properties of UDP-glucose 4-epimerase from microbial sources // Subunit Enzymes: Biochemistry, Function. New York. 1975. - P. 85-135.

108. Gautheret R. J. Une voje nouvelle en biologie vegetale. La culture des tissues. Paris. 1945. - P. 234.

109. Geren C. R., Ebner K. E. Purification, characterization of UDP-ga-lactose-4-epimerase from bovine tissue // J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252, N 11. - P. 2082-2088.

110. Geren C. R, Geren L. M. Ebner K. E. Inhibition, Inactivation of Bovine Mammary, Liver UDP-galactose-4-epimerase // J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252, N 11.-P. 2089-2094.

111. Ginsburg V. Purification of uridinediphosphate glucose pyrophosphorylase from mung been seedlings // J. Biol. Chem. 1958. - Vol. 232, N 1. - P. 55-61.

112. Ginsburg V., Neufeld E. Animals phosphoglucose mutase // Abstracts of the American Chemical Society Meeting, New York. 1957. - P. 27.

113. Goldemberg S. H., Marechal L. R. The role of uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase in plant cell wall polysaccharides biosynthesis // Biochem. Biophys. Acta. 1963. - Vol. 71, N 7. - P. 743-748.

114. Goering H. Reckin E. Einfluss von D-Galactose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe // Flora. 1968. - Vol. 159, N 1.- P. 82-103.

115. Goubet F., Morvan C. Synthesis of Cell Wall Galactans from Flax (Linum usitatissimum L.) Suspension Cultured Cells // Plant Cell Physiol. - 1994. -Vol. 35, N 7.-P. 719-727.

116. Incorporation of D-U-I4C. glucose, ' C02 into the Cell-Wall Polymers of Flax Hypocotil, in the Course of the Fibre Differentiation / F. Goubet, F. Martini, B. Thairon et al. // Plant Cell Physiol.-1993. -Vol. 34, N 8. P.841-848.

117. Goudsmit E. M., Neufeld E. F. Isolation of GDP-L-galactose from the albumen gland of Helix pomatia II Biochim. Biophys. Acta. 1966. - Vol. 26, N 7. - P. 730-735.

118. Gould M. F., Greenshields R. N. Carbohydrate composition of plant cell wall // Nature. 1964. - Vol. 202, N 1. - P. 108-113.

119. Greber-Platzer S., Guldberg P., Scheibenreiter S. et al. Molecular heterogeneity of classical Duarte galactosemia: mutation analysis by denaturing gradient gel electrophoresis // Hum. Mutat. 1997. - Vol. 10, N 1. - P. 49-57.

120. Gregoire J., Limozin N., Van L.V. Sur la presence de guanosine diphosphate-mannose et d'uridine diphosphate N-acetylgalactosamine dans les germes de Phaseolus aureus // CR Acad. Sei. 1963. - Ser. D. - Vol. 257, N 15. - P. 3508-3511.

121. Gross K. C., Pharr D. M. A potential pathway for galactose metabolism in Cucumis sativus L., a stachyose transporting species // Plant Physiol. 1982. -Vol. 69, N 1.-P. 117-121.

122. Gross K. G, Pharr D. M., Locy R. D. Growth of callus initiated from Cucumber Hypocotyls on Galactose, Galactose-Containing Oligosaccha-rides // Plant Sei. Let. 1981. - Vol. 20, N 3. - P. 333-341.

123. Gross W., Schnarrenberger C. Heterotrophic growth of two strains of the acido-thermophilic red alga Galdieria sulphuraria II Plant Cell Physiol. 1995. -Vol. 36, N 6. - P. 633-638.

124. Gustafson G., Wright B. E. Uridine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylase from mould // Fed. Proc., Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. -1971. Vol. 30, N 9. -P. 1069-1075.

125. Gustafson G. L., Gander, J. E. Uridine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylase from Sorgum vulgare // J. Biol. Chem. 1972. - Vol. 247, N 11. - P. 1387-1397.

126. Gutfreund H. Enzymes: Physical Principles. London. -1972.-N 1. -P. 161-162.

127. Hansen R. G., Freeland R. A., Scott, H. M. Galactose-1-phosphate accumulation in animals // J. Biol. Chem. 1956. - Vol. 219, N 3. - P. 391-398.

128. Harloff H. J., Wegmann K. Evidence for a mannitol cycle in Orobranche ramosa, Orobranche crenata II J. Plant Physiol. 1993. - Vol. 141, N 5. - P. 513-520.

129. Hasegawa M., Takayama T. Shiroya T. Raffinose degradation during the seeds germination // Kagaku. 1951. - Vol. 21, N 5. - P. 593-562.

130. Herold A., Lewis D. H. Mannose in green plants: Occurence, physiology, metabolism,, use as a tool to study the role of orthophosphate // New Phytol. -1977. Vol. 79, N 1. - P. 1-40.

131. Hildebrandt A. C., Riker A. L. The influence of various carbon compounds on the growth of marigold, paris-daisy, periwinkle, sunflower, tobacco tissue in vitro II Amer. J. Bot. 1949. - Vol. 36, N 1. - P. 74-85.

132. Hopper J. E, Dickinson D. B. Partial Purification, Sugar Nucleotide Inhibition of UDP-Glucose Pyrophosphorylase from Lilium longiflorum Pollen // Arch. Biochem. Biophys. 1972. - Vol. 148, N 5. - P. 523-535.

133. Hrybb D. J., Hogg J. F. Chain length specification of peroxisomal, mitochondrial ß-oxidation in rat liver // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1979. Vol. 87, N 10. - P. 1200-1206.

134. Hubald M., Augsten H. Einfluss vershiedener Zucker und Stickstoffverbindungen auf Washstum und Entwicklung von Lemna gibba L. // Beitr. Biol. Pflanzen. 1977. - Vol. 53, N 1. - P. 91-102.

135. Huber W., de Fekete M. A. R., Ziegler H. Enzyme des Staerkeumsatzes in Buendelscheiden- und Polisadenchloroplasten von Zea mays II Planta. -1969. -Vol. 87, N 3. P. 360-364.

136. Hughes R., Street H. E. Galactose as an Inhibitor of the Expansion of Root Cells // Ann. Bot. 1974. - Vol. 38, N 5. - P. 555-564.

137. Inouhe M., Yamamoto R., Masuda Y. Effects of indolacetic acid, galactose on the UTP level, UDP-glucose formation in Avena coleoptile, Vigna epicotyl segments // Physiol. Plant. 1987. - Vol. 69, N 5. - P. 579-585.

138. Inouhe M., Yamamoto R., Masuda Y. UDP-glucose level as a limiting factor for IAA-induced cell elongation in Avena coleoptile segments I I Physiol. Plant. 1987. - Vol. 69, N 1. - P. 49-54.

139. Isherwood F. A., Selvedran R. R. A note of the occurence of nucleotides in strawberry leaves // Phytochem. 1970. - Vol. 9, N 13. - P. 2265-2269.

140. Kalckar H. M., Cutolo E. The discovering of UDP-glucose pyrophosphoroly-sis // 2nd International Congress of Biochemistry.- Paris. -1952. P. 76-89.

141. Kalckar H. M., Maxwell G. S. Galactose-6-phosphatase inhibition by galactose-1-phosphate // Physiol. Revs. 1958. - Vol. 33, N 1. - P. 77-83.

142. Kamogawa A., Kurahashi K. Uridine Diphosphate Glucose Pyrophosphorylase from bacteria // J. Biochem. (Tokyo) 1965. - Vol. 57, N 7. - P. 758-765.

143. Kauss H. Turnover of galactosylglycerol, osmotic balance in Ochromonas. II Plant Physiol. 1973.- Vol. 52, N 6. - P. 613-615.

144. Klethi J., Mandel P. Inhibition of UDP-D-glucose dehydrogenase by UDP-D-galactose // Biochim. Biophys. Acta. 1962. - Vol. 57, N 3. - P. 379-384.

145. Knop J. UDP-D-glucose pyrophosphorylase of mammals. Michigan: Michigan State University, Master's Thesis. 1969. - P. 176

146. Knop J., Hansen R. G. Purification, properties of human UDP-D-glucose pyrophosphorylase // J. Biol. Chem. 1970. - Vol. 245, N 16. - P. 2499-2509.

147. Knudson L. The toxicity of galactose, mannose for green plants, antagonistic action of the sugars toward these // Am. J. Bot. 1917. - Vol. 4. - N 4. - P. 430-437.

148. Kosterlitz H. W. Galactose-1-phosphate accumulation in tissue of young animals // Biochem. J. 1943. - Vol. 37, N 3. - P. 318-323.

149. Kumar V., Batra V. I. P., Singh R. Partial purification, characterization of UDP-glucose pyrophosphorylase from immature grains of wheat (Triticum aestivum L) // J. Plant Biochem., Biotechnol. 1995. - Vol. 4. - N 1. - P. 97100.

150. LaemmliU. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227, N 6. - P. 680-685.

151. Black children deficient in galactose-1-phosphate uridyltransferase: correlation of activity, immunoreactive protein in erythrocytes, leukocytes / M. Landt, D. Ritter, K. Laiet al. // J. Pediatr. 1997. - Vol. 130, N 9. - P. 972-980.

152. Langer R., Glaser L. Interaction of nucleotides with liver uridine diphosphate glucose-4-epimerase // J. Biol. Chem. -1974. Vol. 249, N 10. - P. 1126-1132.

153. Molecular basis for Duarte, Los Angeles variant galactosemia / S. D. Landley, K. Lai, P. P. Dembure et al. // Am. J. Genet. 1997. - Vol. 60, N 3. - P. 366372.

154. Lee L., Kimura A., Tochikura T. Presence of a single enzyme catalyzing the pyrophosphorolysis of UDP-glucose, UDP-galactose in Bifidobacterium bifidum II Biochim. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 527, N 3. - P. 301-304.

155. Leloir L. F. Ezymatic reversible conversion of UDP-glucose, UDP-ga-lactose in cell extract // Phosphorus Metabolism. -1951. N 7. - P. 731-786.

156. Lerman S. Glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibition by galactose-1-phosphate // Nature. 1959. - Vol. 184, N 12. - P. 1406-1415.

157. Lewis D. H. Occurence, distribution of storage carbohydrates in vascular plants // Storage carbohydrates in Vascular Plants. 1984. - N 1. - P. 1-52.

158. Lieberman M., Buchanan C., Markovitz A. Role of UDP-glucose pyro-phosphorylase in microbial sources // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1970. -Vol.65, N 6.-P. 625-630.

159. Lin T. Y., Hassid W. Z. Isolation of guanosine diphosphate uronic acids from a marine brown alga, Fucus gardneri Silva// J. Biol. Chem. 1966. - Vol. 241, N 18.-P. 3283-3293.14

160. Loewus F. A., Jang R. The conversion of C -labeled sugars to L-ascorbic acid in ripening strawberries. III. Labeling patterns from berries administeredpentose-1-14C // J. Biol. Chem. 1958. - Vol. 232, N 2. - P. 521-532.

161. Loewus F. A., Tanner W. Plant carbohydrates I. Intracellular carbohydrates. Berlin. 1982. - P. 340.

162. Maretzki A., Thom A. Characteristics of a Galactose-adapted Sugarcane Cell Line Grown in Suspension Culture // Plant Physiol. 1978. - Vol. 61, N 5. - P. 544-548.

163. Martin R. G., Ames B. N. A method for determining the sedimentation behavior of enzymes: Application to protein mixtures // J. Biol. Chem. 1961. - Vol. 236, N 11.-P. 1372-1379.

164. Maxwell E. S. The enzymatic interconversion of uridine diphosphogalactose, uridine diphosphoglucose // J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 229, N 1. - P. 139151.

165. Maxwell E. S., de Robichon-Szulmajster H. Purification of uridine diphosphate galactose-4-epimerase from yeast,, the identification of protein-bound diphosphopyridine nucleotide // J. Biol. Chem. 1960. - Vol. 235, N 3. - P. 308-312.

166. Mayes J. S. Purification, properties,, isozyme pattern of galactose-1-phosphate uridyltransferase from calf liver // Arch. Biochem. Biophys. 1976. - Vol. 172, N 7. - P. 715-720.

167. McCleary B. V., Matheson N. K. Galactomannan utilization in germinating legume seeds // Phytochem. 1976. - Vol. 15, N 1. - P. 43-47.

168. Meidell G. E. Galactose metabolism of plants // Dissert. Abstr. 1964. - Vol. 24, N 13.-P. 3085-3123.

169. Morgan D. R., Street H. E. The Carbohydrate Nutrition of Tomato Roots. VII. Sugars, Sugar Phosphates,, Sugar Alcohols as Respiratory Substrates for Excised Roots // Ann. Bot. 1959. - Vol. 23, N 1. - P. 89-105.

170. Morvan C., Abdul-Hafez A., Morvan O. et al. Etude physicochimique et biochimique de polysaccharides extraits de lin sous-roui. // Plant Physiol. Biochem. 1989. - Vol. 27, N 4. - P. 451-459.

171. Mukheiji S., Bhaduri A. Properties of UDPglucose 4-epimerase from Kluyve-romyces fragilis II J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, N 19. - P. 4519-4524.

172. Mukheiji S., Bhaduri A. An essential histidine residue for the activity of UDPglucose 4-epimerase from Kluyveromyces fragilis II J. Biol. Chem. 1992.- Vol. 267, N 23. P. 11709-11713.

173. Munch-Peterson A., Kalckar H. M. UDPglucose pyrophosphorylase of Saccharomyces fragilis II Meth. enzym. 1955. - Vol. 2. - P. 675-676.

174. The dis-covering of an enzyme catalyzing the glucose-1-P formation from UDPglucose / A. Munch-Peterson, H. M. Kalckar, E. Cutolo, E. E. B Smith. // J. Biol. Chem. 1953. - Vol. 172, N 9. - P. 1036-1043.

175. Murata T. Composition of soluble nucleotides in growing corms of Amorphophallus konjac C. Koch. // Agric. Biol. Chem. 1975. - Vol. 39, N 12. - P. 1401-1406.

176. Nagashima H., Fukuda J. Carbohydrate composition of red algae // Phytochem.- 1983. Vol. 22, N 16. - P. 1949-1951.

177. Najjar V. A. Phosphoglucomutase from muscle // Meth. enzym. 1955. - Vol. 1. - P. 294-299.

178. Neish A. C. Galactose utilization by higher plants // Can. J. Biochem. Physiol.- 1958. Vol. 36, N 1. - P. 187-196.

179. Neufeld E. F., Feingold D. S., Hassid W. Z. Phosphorylation of D-Galactose, L-Arabinose by Extracts from Phaseolus aureus Seedlings // J. Biol. Chem. -1960. Vol. 235, N 9. - P. 906-909.

180. Biochemical, molecular studies of 132 patients with galactosemia / W. G. Ng, Y.-K. Xu, F. R. Kaufman et al. // Hum. Genet. 1994. - Vol. 94, N 3. - P. 359-363.

181. Nigam V. N., Giri K. V. Free carbohydrates pool of higher plants // Can. J. Biochem. Physiol. 1961. - Vol. 39, N 14. - P. 1847-1852.

182. Nikaido H., Nakae T. Purification, some properties of UDP-glucose pyrophosphorylase from bacteria // Fed. Proc., Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. -1970. Vol. 29, N 5. - P. 598-609.

183. Biosynthesis of starch in chloroplasts / U. Nomura, N. Nakayama, T. Murata, T. Akazawa // Plant Physiol. 1967. - Vol. 42, N 3. - P. 327-332.

184. Oliver I. T. Galactose-1-P inhibition of UDP-glucose pyrophosphorylase // Biochim. Biophys. Acta. 1961. - Vol. 52, N 1. - P. 75-82.

185. Ordin L., Bonner J. Effect of galactose on growth, metabolism of Avena coleoptile sections // Plant Physiol. 1957. - Vol. 32, N 1. - P. 212-215.

186. Osmond C. B., ap Rees T. Regulation by auxin of carbohydrate metabolism in pea stem tissue // Biochim. Biophys. Acta. 1969. - Vol. 184, N 1. - P. 35-42.

187. Starch syn-thesis, phosphorylase, ADPglucose pyrophosphorylase, UDPglucose pyrophosphorylase in developing maize kernels / J. L. Ozbun, J. S. Hawker, E. Greenberg, L. Lammel, J. Preiss // Plant Physiol. 1973. - Vol. 51, N l.-P. 1-5.

188. Palmer C. E. ADPGlucose pyrophosphorylase, UDPglucose pyrophosphorylase activity in acllus during shoot initiation, callus growth // Z. Pflanzenphysiol. 1976. - Vol. 77, N 1. - P. 345-349.

189. The Concentration of Red Blood Cell UDPGlucose, UDPGalactose Determined by High-Performance Liquid Chromatography / M. J. Palmieri, G. T. Berry, D. A. Player et al. // Anal. Biochem.-1991. -Vol. 194, N 3.- P.388-393.

190. Panayatotos N., Villemez C. L. The formation of a (3-(l-4)-D-galactan chain catalyzed by a Phaseolus aureus enzyme // Biochem. J. 1973. - Vol. 133, N 2. - P. 263-271.

191. Pazur J., Shadaksharaswany H. M., Meidell G. E. The metabolism of oligosaccharides in germinating soybeans Glycine max II Arch. Biochem. Biophys. 1962. - Vol. 99, N 1. - P. 78-85.

192. Percival E. Algal polysaccharides. // The carbohydrates. 1970. - V. IIB. - P. 537-568.

193. Enzymes of carbohydrate metabolism in the developing rice grain / C. M. Perez, A. A. Perdon, A. P. Resurrecion, R. M. Villareal, B. D. Juliano // Plant Physiol. 1975. - Vol. 56, N 5. - P. 579-583.

194. Pfeifer D., Oellerman R. 4-Uloses as intermediates in enzyme-nicotinamide adenine dinucleotide-mediated oxidoreductase mechanisms // Mol. Gen. Genet. 1967. - Vol. 99, N 2. - P. 248-255.

195. Identification, distribution of solubile saccharides in pickling cucumber plants, their fate in fermentation / D. M. Pharr, H. N. Sox, E. L. Smart et al. // J. Am. Soc. Hort. Sci. 1977. - Vol. 102, N 4. - P. 406-409.

196. Pressey R. Catalytic aspects of enzymatic racemization // Plant Physiol. 1969. - Vol. 44, N 7. - P. 759-765.

197. Pridham J. B., Walter M. W., Worth H. G. Properties of potato lectin, the nature of its glycoprotein linkages // J. Exp. Botany. 1969. - Vol. 20, N 3. -P. 317-323.

198. Purification, characterization of UDP-D-galactose 4-epimerase from the red alga Galdieria sulphuraria / P. V. Prosselkov, W. Gross, A. U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger // Physiol. Plantarum. 1996. -Vol. 298, N 7. - P. 753-758.

199. Ray M., Bhaduri A. UDPglucose 4-epimerase from Saccharomyces fragilis: Desensitization with heat.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. - Vol. 67. - P. 877-882.

200. Ray M., Bhaduri A. Uridine-diphosphate-glucose 4-epimerase from Saccharomyces fragilis. Inactivation by Heat, Reconstitution of the Inactive Enzyme // Eur. J. Biochem. 1976. - Vol. 70, N 3. - P. 319-323.

201. Ray M. Bhaduri A. UDP-glucose 4-epimerase from Saccharomyces fragilis: Assymetry in allosteric properties leads to underectional catalysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. - Vol. 85, N 2. - P. 242-248.

202. Ray M., Bhaduri A. Two forms of UDPglucose-4-epimerase from mammalian liver// Biochim. Biophys. Acta. 1973. - Vol. 302, N 1. - P. 129-134.

203. Ray P. M. Cell wall synthesis, cell elongation in oat coleoptile tissue // Am. J. Bot. 1962. - Vol. 49, N 9. - P. 928-939.

204. Ray P. M., Abdul-Baki A. A. Some aspects of the growth in culture tissue // Biochemistry and Physiology of Plant Growth Substances. -1968. P. 647.

205. Ray P. M., Mukherji S., Bhaduri A. Two tryptophans at the active site of UDP-glucose 4-epimerase from Kluyveromyces fragilis II J. Biol. Chem. 1995. -Vol. 270, N 9. - P. 11383-11390.

206. Reed R. H. Taxonomic implications of osmoacclimation in Cyanidium caldarium (Tilden) Geitler // Phycologia. 1983. - Vol. 22, N 3. - P. 351-354.

207. Characterization of two missence mutations in human galactose-1-phosphate uridyltransferase: molecular mechanisms for galactosemia / J. K. V. Reichardt, J.W. Belmont, H. L. Levy, S. L. C. Woo // Genomics. -1992. Vol. 12, N 5. -P. 596-600.

208. Reinholz E. Ein das Wurzelwachstum fordender Faktor im Diffusat keimender DIgitalissamen // Die Naturwissenschaftlisch. 1954. - Vol. 41, N 2. - P. 233245.

209. Roberts R. M., Rao K. M. K. The biosybthesis of cell wall carbohydrates // Fed. Proc., Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. -1971. Vol. 30, N 9. - P. 1117-1123.

210. Roberts R. M., Heishman A., Wicklin C. Growth Inhibition, Metabolic Pool Levels in Plant Tissues Fed D-Glucosamine, D-Galactose // Plant Physiol. -1971.-Vol. 48, N 1.-P. 36-42.

211. Roberts R. M., Heishman A., Wicklin C. Growth inhibition, metabolic pool levels in plant tissues fed D-glucosamine, D-galactose // Plant Physiol. 1971. -Vol. 48, N 1.-P. 36-42.

212. Roseman S. Biogenesis of plant cell wall polysaccharides // Ciba Found Symp.-1975. Vol. 31, N 2. - P. 225-132.

213. Roth R., Sussman M. Presence, separation of nucleotide glucose pyrophosphorylases in plants // J. Biol. Chem. 1968. - Vol. 243, N 20. - P. 5081-5087.

214. Molecular genetics of glucose-6-phosphate dehydrigenase (G6PD) deficiency in Spain: Identification of two new point mutations in the G6PD gene / A. Rovira, T. Vulliamy, M. A. Pudjades et al. // British J. Haematology. 1995. - Vol. 91, N 1.-P. 66-71.

215. Rubery P. H. The activity of uridine diphosphate-D-glucose-4-epime-rase in cambial tissue, differentiating xylem isolated from sycamore {Acer pseudoplatanus) trees // Planta. 1973. - Vol. Ill, N 2. - P. 267-269.

216. Salitis G., Oliver I. T. Intracellular localization of hexokinase // Biochim. Biophys. Acta. 1964. - Vol. 81, N 1. - P. 55-60.

217. Sanwal G. G., Preiss J. The enzymic synthesis of uridine diphosphate L-rhamnose // Phytochem.- 1969. Vol. 8, N 7. - P. 707-723.

218. Schnarrenberger C., Oeser A., Tolbert N. E. Two isoenzymes each of glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase in spinach leaves // Arch. Biochem. Biophys. 1973. - Vol. 154, N 4. - P. 438-448.

219. Schwarz V., Golberg L. Human Galactosemia // Biochim. Biophys. Acta. -1955. Vol. 18, N 3. - P. 310-318.

220. Some Disturbances of Erythrocyte Metabolism in Galactosemia / V. Schwarz, L. Golberg, G. M. Komroweret al. // Biochem. J.- 1956. -Vol. 62, N 1.- P. 3440.

221. Schweitzer S. Newborn mass screening for galactosemia // Eur. J. Pediatrics. -1995. V.154, Suppl. 2. - P. 37-39.

222. Segal S. Galactosemia unsolved. // European Journal of Pediatrics. 1995. V. 154. - Suppl. 2. - P. 97-102.

223. Segal S., Roth H., Bertoli D. Galactose Metabolism in Rat Liver Tissue. Influence of Age // Science. 1963. - Vol. 142, N 10. - P. 1311-1313.

224. Selvendran K.R., Isherwood F.A. Catabolism of endogenous, exogenous compounds by plant cell cultures // Biochem. J. 1967. - Vol. 105, N 7. - P. 723-738.

225. Shadaksharaswamy M., Ramachandra G. Enzymes of carbohydrate metabolism in developing grain // Phytochem. 1968. - Vol. 7, N 7. - P. 715-721.

226. Sherman J. R., Adler J. Galactokinase from Escherichia coli II J. Biol. Chem. -1963. Vol. 238, N 8. - P. 873-878.

227. Shikamura M., Tsuboi K. K. The acid-soluble nucleotides of wheat plants // Amer. J. Dis. Child. -1961. Vol. 102, N 6. - P. 600-608.

228. Shiroya T. Metabolism of raffinose in cotton seeds // Phytochem. 1963. - Vol. 2, N 1.-P. 47-60.

229. Shiroya T. Reversible changes of ordered plypeptide structures in oxidized, reduced epimerase // Phytochem. 1963. - Vol. 2, N 1. - P. 33-46.

230. Sidbury J. B. Purification properties of galactokinase from human red blood cells // Abstracts of the American Chemical Society Meeting.- New York. -1957. P. 27.

231. Sidbury J. B. Genetics of galactosemia // Molecular Genetics, Human Disease. -1960. Vol.3. - P. 61.

232. Simoni J. L., Roseman S. Sugar transport. VII. Lactose transport in Staphylococcus aureus II J. Biol. Chem. 1973. - Vol. 248, N 9. - P. 966-976.

233. Sioufi A., Percheron F., Courtis J. E. The path of carbon in photosynthesis // Phytochem.- 1970. Vol. 9. - N 9. - P. 991-999.

234. Skrzypek M., Maleszka R. A. A gene homologous to that encoding UDPga-lactose-4-epimerase is inducible by xylose in the yeast Pachysolen tannophilus II Gene. 1994. - Vol. 140, N 1. - P. 127-129.

235. Smart E. L., Pharr D. M. Separation, characteristics of galactose-1-phosphate, glucose-1-phosphate uridyltransferase from fruit peduncles of cucumber // Planta. -1981. Vol. 153, N 3. - P. 370-375.

236. Sowokinas J. R., Shychalla J. P., Desborough S. L. Guanosine diphosphate mannose // Plant Physiol. 1993. - Vol. 101, N 9. - P. 1073-1080.

237. Competitive inhibition, substrate activity of uridine diphosphate 6-deoxygalactose for Escherichia coli uridine diphosphate galactose 4-epimerase / M. Spencer, P. Blackburn, W. Ferdinand et al. // Biochem. J. 1973. - Vol. 131, N 4. - P. 412-423.

238. Stabenau H. Verteilung von Microbody-Enzymen aus Chlamydomonas in Dichtergradienten // Planta. 1974. - Vol. 118, N 1. - P. 35-42.

239. Steelman V. S., Ebner K. E. Nucleotides assotiated with potato starch grains // Biochem. Biophys. Acta. 1966. - Vol. 128, N 1. - P. 92-98.

240. Stenlid G. A. Comparison of the toxic Effects of Some Sugars upon Growth, Chloride Accumulation in Young Wheat Roots // Physiol. Plant. 1957. - Vol. 7, N 7. - P. 713-723.

241. Stenlid G. Species Differences between Plant Roots in the Reaction to Inhibitory Sugars // Physiol. Plant. 1959. - Vol. 12, N 2. - P. 218-235.

242. Stenlid G., Dauckwordt-Liliestroem C. Galactose as a Possible Source of Carbon for the Growth of Isolated Roots of Cucumber // Plant Physiol. 1961. -Vol. 14, N 6. - P. 671-675.

243. Street H. E. Growth in organized, unorganized systems // Plant Physiology. -1969. P. 3-188.

244. Su J. C., Hassid W. Z. Carbohydrates, nucleotides in the red alga Porphyra perforata. I. Isolation, identification of carbohydrates // Biochem. 1962. - V. 1, N 4. - P. 468-474.

245. Sundararajan T. A., Rapin A. Kalckar H. M. Pyrophosphorylase reaction in Bifidobacterium bifidum 11 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1962. - Vol. 48, N 14. -P. 2187-2194.

246. Swanson B. A., Frey P. A. Identification of lysine 153 as a functionally important residue in UDP-galactose 4-epimerase from Escherichia coli // Biochem. 1993. - Vol. 32., N 23. - P. 13231-13236.

247. Szczypka M. Galactosemia: a problem still unsolved // Pediatr. Pol. 1996. -Vol. 71, N 4. - P. 487-492.

248. Taniguchi H., Umemura Y., Nakamura M. Rapid increase in UDP-glucose during early wheat embryo germination // Agric. Biol. Chem. 1967. - Vol. 31, N 2.-P. 231-239.

249. The levels of soluble nucleotides in wheat aleurone tissue / K. V. Thimann, J. Craigie, G. Krotkov, L. Cowie // Am. J. Botany. 1958. - Vol. 45, N 2. - P. 295-301.

250. Thomson K. S., Jung C., Kauss H. UDP-glucose-4-epimerase from Po-terioochromonas malhamensis II Phytochem. 1984. - Vol. 23, N 9.- P.979-981.

251. Tovey K. C. Roberts R. M. Fructokinase of pea seeds // Plant Soil. 1970. -Vol. 46, N 4.-P. 406-411.

252. Tsai C. Y., Salamini F., Nelson O. E. The synthesis of polysaccharides from glucose-1-P // Plant Physiol. -1970. Vol. 299. - N 5. - P. 543-549.

253. Tsuboi K. K., Fukunaga K., Petricciani J. C. Hexokinase from maize endosperm// J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244, N 9. - P. 1008-1115.

254. Turner J. F. Isolation of sugar nucleotides from sweet corn grains // Aust. J. Biol. Sci. 1969a. - Vol. 22, N 10. - P. 1145-1151.

255. Turner J. F. Isolation of sugar nucleotides from sweet sugar beet // Aust. J. Biol. Sci. 1969b. - Vol. 22, N 9. - P. 1321-1327.

256. Turnquist R. L., Hansen R. G. UDP-glucose pyrophosphorylase // The Enzymes. 1973. - Vol. 8. - P. 51 -71.

257. Vasseur E. A study of pollen enzymes // Acta Chem. Scand. 1950. - Vol. 4, N 8. - P. 1144-1145.

258. Verma D. C., Dougall D. K. Influence of carbohydrates on Quantitative Aspects of Growth Embryo Formation in Wild Carrot Suspension Cultures // Plant Physiol. 1977. - Vol. 59, N 1. - P. 81-85.

259. Vidra J. D., Loerch J. D. Chloroplast inorganic pyrophosphatase // Biochim. Biophys. Acta. 1968. - Vol. 159, N 5. - P. 551-553.

260. Villar-Palasi C., Larner J. Glycoprotein synthesis in plants // Acta Biochem. Biophys. 1960. - Vol. 86, N 1. - P. 61-67.

261. Wachtel H. K. Inhibition action of mannose upon the growing plant // Arch. Bioch. 1943. - Vol. 2, N 3. - P. 395-403.

262. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gaerungsfer-ments Enolase // Biochem. Zeitschrift. 1941. - Vol. 310, N 3. - P. 384-421.

263. White P. R. Sucrose versus Dextrose as Carbone Source for Excised Tomato Roots // Plant Physiol. 1940. - Vol. 15, N 3. - P. 355-403.

264. Wilson D., Hogness D. S. The enzymes of the galactose operon in Escherichia coli. I. Purification, characterization of uridine diphosphogalactose 4-epimerase // J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239, N 15. - P. 2469-2481.

265. Wilson D., Hogness D. S. Galactokinase, Uridine Diphosphogalactose 4-Epimerase from Escherichia coli II Meth Enzymol. -1966. -Vol. 8.- P. 229-235.

266. Wright B. E., ,ersonM. L. Galactose incorporation into cell wall compounds // Biochim. Biophys. Acta. 1959. - Vol. 31, N 3. - P. 310-317.

267. Yamamoto R., Inouhe M., Masuda Y. Galactose inhibition of auxin-in-duced growth of mono-, dicotyledonous plants // Plant Physiol. 1988. - Vol. 86., N 12. - P. 1223-1227.

268. Yamamoto R., Sakurai N., Masuda Y. Inhibition of auxin-induced cell elongation by galactose // Physiol. Plantarum.- 1981,- Vol. 53, N 5. P. 543 - 547.

269. Zetsche K. Changes in cell wall polysaccharides of germinating grains // Z. Naturforsch. 1968. - Vol. 23, N 3. - P. 369-374.