Выделение и структурно-функциональная характеристика трипсина камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Кислицын, Юрий Алексеевич

• Кислицын, Юрий Алексеевич
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кислицын, Юрий Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ТРИПСИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.

1. Классификация трипсинов.

2. Современные подходы к выделению трипсиноподобных протеиназ

2.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография и скоростная жидкостная хроматография белков.

2.2. Аффинная хроматография.

2.3. Нестандартные подходы к очистке трипсинов.

3. Молекулярные свойства трипсинов беспозвоночных.

3.1. Физико-химические свойства.

3. 1. 1. Молекулярные массы, изоэлектрические точки.

3.1.2. Аминокислотный состав.

3.2. Энзиматические свойства.

3.2.1. рН-стабильность и рН оптимумы активности.

3.2.2. Субстратная специфичность.

3.2.2.1. Синтетические субстраты.

3.2.2.2. Полипептидные и белковые субстраты.

3.3. Ингибиторы трипсинов.

3.3.1. Синтетические ингибиторы.

3.3.2. Природные ингибиторы.

4. Структурные детерминанты, определяющие каталитические свойства и специфичность трипсинов.

4.1. Активный центр.

4.1.1. Каталитическая триада.

4.1.2. Оксианионная впадина.

4.2. Субстратсвязывающие участки.

4.2.1. Б1 - связывающий участок.

4.2.2. Полипептидсвязывающий участок.

5. Современные представления о механизме катализа сериновыми протеиназами.

6. Первичная структура трипсинов беспозвоночных.

6.1. Сигнальные и активационные пептиды.

6.2. Аминокислотные последовательности зрелых трипсинов.

7. Пространственная структура и эволюция трипсинов.

8. Биологические функции трипсинов беспозвоночных.

8.1. Процессы пищеварения.

8.2. Процессы свертывания гемолимфы.

8.3. Синтез пептидных антибиотиков.

8.4. Процесс полимеризации меланина.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Выделение трипсина РС.

2. Критерии чистоты и молекулярные свойства трипсина РС.

3. Стабильность трипсина РС.

4. А^-концевая последовательность трипсина РС.

5. Аминокислотный состав.

6. Субстратная специфичность трипсина РС.

6.1. Гидролиз хромогенных пептидных субстратов.

6.2. Гидролиз Вг-А^-рИА трипсином РС при различных температурах.

7. Ингибирование трипсина РС.

8. Первичная структура трипсина РС.

8.1. Сигнальные и активационные пептиды трипсина РС.

8.2. Аминокислотная последовательность зрелого трипсина РС.

8.2.1. Консервативные аминокислотные остатки трипсина РС и других трипсинов.

8.2.2.1. Дисульфидные связи.

8.2.2.2. Кальций-связывающий участок.

8.2.2.3. Участки автолиза.

8.2.2.4. Другие каталитически или структурно важные остатки.

8.2.2.5. Петельные структуры трипсинов.

8.2.3. Сравнение первичной структуры трипсина PC с первичными структурами трипсинов психрофильных рыб и первичной структурой трипсина быка.

9. Эволюционное положение трипсина PC.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Субстраты.

1.3. Белковые ингибиторы.

1.4. Белки.

2. Методы.

2.1. Очистка трипсина PC (первая схема).

2.1.1. Ионообменная хроматография на аминосилохроме.

2.1.2 Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе.

2.1.3 Аффинная хроматография на аргинин-агарозе.

2.2. Очистка трипсина PC (вторая схема).

2.1.1 Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе.

2.1.2. Аффинная хроматография на ПТГ-агарозе.

2.1.3. Ионообменная хроматография на колонке Mono Q в режиме FPLC.

2.3. Концентрирование и обессоливание белковых растворов.

2.4. Определение активности фермента по и-нитроанилидному субстрату.

2.5. Определение концентрации белка.

2.6. Определение молекулярной массы фермента.

2.6.1. Гель-электрофорез.

2.6.2. Масс-спектрометрический анализ.

2.7. Определение TV-концевой последовательности белка.

2.8. Определение изоэлектрической точки трипсина.

2.9. Гидролиз синтетических субстратов.

2.10. Ингибиторный анализ.

2.11. Выделение РНК.

2.12. Получение библиотеки кДНК.

2.13. Клонирование кДНК трипсина РС.

2.14. Биоинформатика.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и структурно-функциональная характеристика трипсина камчатского краба (Paralithodes camtschaticus)»

Трипсины являются типичными представителями сериновых протеиназ. В настоящее время трипсины обнаружены в организмах, принадлежащих к различным таксономическим группам. Функции, выполняемые этими ферментами, довольно разнообразны. Основной функцией трипсина в организме человека, млекопитающих и беспозвоночных животных является участие данного фермента в пищеварении и активации других протеолитических ферментов, участвующих в этом процессе. В настоящее время показано, что функции данного фермента в живых организмах значительно шире. Так, например, у человека и млекопитающих показано участие трипсина в процессах клеточной пролиферации, расширении сосудов, развитии воспалительного процесса, а также в различных патологических состояниях: от рака, панкреатита, астмы и артрита до дерматитов и экземы. Физиологические и биохимические процессы, в которых принимают участие трипсины у беспозвоночных животных, изучены слабее. На данный момент показано участие трипсинов в процессах клеточной дифференцировки и иммунного ответа у насекомых и ракообразных.

В настоящее время большой интерес вызывают трипсины, выделенные из психрофильных организмов. Наиболее изучены психрофильные трипсины рыб. Работы по изучению психрофильных трипсинов беспозвоночных малочисленны и содержат сведения либо о физико-химических и энзимологических свойствах, либо о первичной структуре. Для полного понимания эффективности действия психрофильных трипсинов необходимо комплексное изучение структуры и свойств трипсинов беспозвоночных, обитающих при низких температурах. Камчатский краб в этом смысле является подходящим объектом исследования. Данные таких исследований позволяют более полно понять разнообразие биологических функций трипсинов, а также могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами.

В настоящее время имеются сведения о физико-химических, энзиматических свойствах трипсинов, выделенных из млекопитающих [1-5], птиц [6-7], рыб [8-10], насекомых [11-14], ракообразных [15-19] и иглокожих [20-21]. Несмотря на кажущееся обилие информации, следует отметить, что во многих работах описываются свойства смесей, а не индивидуальных ферментов.

В последнее время отмечается повышенный интерес к структуре трипсинов беспозвоночных, имеются работы, посвященные определению первичной структуры трипсинов насекомых [22-25] и ракообразных [26-27]. К сожалению, данные работы не содержат сведений о физико-химических и энзиматических свойствах описываемых ферментов, так как авторы не выделяли исследуемые белки непосредственно, а лишь устанавливали структуру посредством сиквенса к ДНК.

В настоящее время в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений МГУ, ведется изучение трипсина и других протеолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба, совместно с фирмой "Тринита" был создан препарат "Морикраза". Этот препарат включает в себя трипсин, коллагеназу, металлопротеиназу, эластазу и карбоксипептидазу, полученные из гепатопанкреаса камчатского краба. На основе "Морикразы" был создан ряд мазей, успешно проходящих клинические испытания при лечении рубцов, ожогов, пролежней. Трипсин составляет около 1/3 части "Морикразы" и вносит существенный вклад в лечебное действие препарата. Поэтому изучение свойств и структуры трипсина камчатского краба является актуальным и практически важным, а применение данного фермента в медицинских целях более предпочтительно, чем трипсина быка, так как позволяет избежать внесения в препарат вирусов, прионов и других инфекционных агентов, свойственных млекопитающим. Следует отметить, что камчатский краб Рага1Шгос1ез сат18ска1кт как объект ценных протеолитических ферментов изучался в нашей стране ранее [28-29]. Однако литературные данные относительно протеиназ гепатопанкреаса неполны и часто противоречивы.

Настоящая работа посвящена исследованию трипсина камчатского краба. Цель настоящего исследования получение гомогенного препарата фермента, изучение его физико-химических и энзиматических свойств, сравнение первичной структуры трипсина РС с трипсинами, выделенными из других источников, определение эволюционного положения данного фермента.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ТРИПСИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Изучение трипсинов из организмов принадлежащих к различным таксономическим группам имеет большое значение для детального понимания механизмов молекулярной эволюции, специфичности, катализа, для создания биокатализаторов с заданными свойствами. В настоящее время показано, что трипсины выделенные из рыб и беспозвоночных имеют отличия в физико-химических и энзиматических свойствах.

Так, например, трипсины холодноводных рыб более эффективно гидролизуют синтетические и природные субстраты, отличаются некоторыми физико-химическими параметрами от трипсинов млекопитающих. Сериновые протеиназы ракообразных в ввиду своих особых физико-химических и энзиматических свойств, в настоящее время, выделяют в особое подсемейство - брахиурины.

В данном обзоре литературы сделана попытка, собрать воедино и проанализировать современные данные о выделении, физико-химических, энзиматических свойствах, структурах трипсинов беспозвоночных животных, их физиологических функциях.

Обзор состоит из 8 глав и посвящен современной классификации трипсинов (глава 1), физико-химическим, знзиматическим, структурным свойствам трипсинов беспозвоночных и их биологическим функциям (главы 3, 4, 6, 7 и 8). Освещены современные методы и подходы, применяемые в очистке трипсинов из различных природных источников (глава 2). Кроме того, для полного представления о месте и роли трипсинов беспозвоночных в системе протеолитических ферментов в обзор литературы включены современные сведения о механизме катализа, осуществляемого сериновыми протеиназами (глава 5).

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Кислицын, Юрий Алексеевич

выводы

1. Разработан трехстадийный метод очистки трипсина РС, включающий комбинацию ионообменной и аффинной хроматографий.

2. Показано, что трипсин РС отличается от трипсинов млекопитающих аномально низкой изоэлектрической точкой, более узким интервалом рН стабильности, более эффективным гидролизом Вг-А^-рКА в диапазоне 5-35°С. На основании полученных результатов трипсин камчатского краба можно отнести к ферментам психрофильного типа.

3. Создана библиотека кДНК, проведено клонирование полноразмерной кДНК трипсина РС, по нуклеотидной последовательности которой была определена последовательность аминокислот препротрипсина РС.

4. Филогенетический анализ, показал, что трипсины ракообразных группируются в обособленный кластер, который располагается чуть ближе к трипсинам позвоночных, чем к трипсинам насекомых и значительно удален от сериновых коллагеназ членистоногих. Дивергенция между трипсинами и сериновыми коллагеназами произошла, вероятно, до происхождения членистоногих. г

5. На поверхности белковой глобулы трипсина РС в области субстратсвязывающего участка наблюдается концентрация отрицательно заряженных , аминокислотных остатков, которые, вероятно, улучшают связывание субстрата и способствуют эффективному катализу при температуре близкой к 0°С.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кислицын, Юрий Алексеевич, 2007 год

1. Bricteux-Gregoire S, Schyns R, Florkin M, Purification, properties and N-terminal sequence of goat trypsinogen. Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 229, pp. 123-135.

2. Charles M, Rovery M, Guidoni A, Desnuelle P, On porcine trypsinogen and trypsin. Biochim. Biophys. Acta, 1963 v. 69, pp. 115-129.

3. Travis J, Studies on the active site of sheep trypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun.,1968, v. 30, pp 730-734.

4. Louvard M.N, Puigserver A, On bovine and porcine anionic trypsinogens, Biochim. Biophys. Acta, 1974, v. 371, pp. 177-185.

5. Guy 0, Lombardo D, Bartelt D. C, Amie J, Figarella C, Two human trypsinogens. Purification, molecular properties, and N-terminal sequences. Biochemistry, 1978, v 17, pp 1669-1675.

6. Guyonnet V, Tluscik F, Long P. L, Polanowski A, Travis J, Purification and partial characterization of the pancreatic proteolytic enzymes trypsin, chymotrypsin, and elastase from the chicken. J. Chromatography A, 1999, v. 852, pp 217-225.

7. Szenthe B, Frost C, Szilagyi L, Patthy A, Naude R, Graf L, Cloning and expression of ostrich trypsinogen: an avian trypsin with a highly sensitive autolysis site. Biochem. Biophys. Acta, 2005, v. 1748, pp. 35-42.

8. Cohen T, Gertler A, Birk Y, Pancreatic proteolytic enzymes from carp (iCyprinus carpio), Kinetic properties and inhibition studies of trypsin, chymotrypsin and elastase. Сотр. Biochem. Physiol., 1981, v. 69 B, pp. 647653.

9. Martinez A, Olsen R. L, Serra J. L, Purification and characterization of two trypsin-like enzymes from the digestive tract of anchovy Engraulis encrasicholus. Сотр. Biochem. Physiol., 1988, v. 91 B, pp. 677-684.

10. Simpson B.K, Haard N.F, Trypsin from Greenland cod, gadus ogac. Isolation and comparative properties. Comp. Biochem. Physiol., 1984, v. 79 B, №4, pp 613-622.

11. Levinsky H, Birk Y, Applebaum S. W, Isolation and characterization of a new trypsin-like enzyme from Tenebrio molitor L. Larvae, Int. J. Peptide Protein Res, 1977,v. 10, pp 252-258.

12. Lopes A. R, Terra W. R, Purification, properties and substrate specificity of a digestive trypsin from Periplaneta Americana. Insect Biochem. Biol., 2003, v. 33, pp. 407-415.

13. Sakal E, Applebaum S. W, Birk Y, Purification and characterization of trypsins from the digestive tract of Locusta migratoria. Int. J. Pept. Prot. Res, 1989, v. 34, pp. 498-505

14. Elert E, Agrawal M. K, Gebauer C, Jaensch H, Bauer U, Zitt A, Protease activity in gut of Daphnia magna: evidence for trypsin and chymotrypsin enzymes, Comp. Biochem. Physiol., 2004, v.137 B, pp 287-296.

15. Titani K, Sasagawa T, Woodbury RG, Ericsson LH, Dorsam H, Kraemer M, Neurath H, Zwilling R: Amino acid sequence of crayfish (Astacus fluviatilis) trypsin If. Biochemistry, 1983, v.22, pp. 1459-1465.

16. Johnston D., Hermans M., Yellowlees D., Isolation and characterization of a trypsin from the slipper lobster, Thenus orientalis, Arch. Biochem. Biophysics, 1995, v. 324, pp. 35-40.

17. Dendinger J. E, O'Connor K. L, Purification and characterization of a trytpsin-like enzyme from the midgut gland of the atlantic blue crab Callinectes sapidus. Comp. Biochem. Physiol., 1990, v. 95 B, pp. 525-530.

18. Hernandez-Cortes P, Cerenius L, Garcia-Carreno F, Soderhall K: Trypsin from Pacifastacus leniusculus hepatopancreas: purification and cDNA cloning of the synthesized zymogen. Biol. Chem., 1999, v.380 pp. 499-501

19. Kozlovskaya E. P, Elyakova L.A, Purification and propertier of trypsin-like enzymes from the starfish Lysastrosoma anthsticta. Biochem. Biophys. Acta, 1974, v. 371, pp 63-70.

20. Kishimura H, Hayashi K, Isolation and characteristics of trypsin from pyloric ceca of the starfish Asterina pectinifera. Comp. Bochem. Physiol., 2002, v. 132 B, pp. 485-490.

21. Peterson A. M, Barillas-Mury C. V, Wells M. A, Sequence of three cDNAs encoding an alkaline midgut trypsin from Manduca sext, Insect. Biochem. Molec. Biol, 1994, v. 24, pp. 463-471.

22. Wang S, Young F, Hickey D. A, Genomic organization and expression of a trypsin gene from the spruce bud worm, Choristoneura fumiferana. Insect. Biochem. Molec. Biol. 1995, V 25, pp. 899-908.

23. Davis C. A, Riddell D. C, Higgins M. J, Holden J. J. A, White B. N, A gene family in Drosophila melanogaster coding for trypsin-like enzymes, Nucleic acids research, 1985, v. 13, pp.6605-6619.

24. Klein B, Sellos D, Wormhoudt A V, Genomic organization and polymorphism of a crustacean trypsin multi-gene family, Gene, 1998, v. 216, pp. 123-129.

25. Klimova О. A, Borukhov S. I, Solovyeva N.I, Balaevskaya T. 0, Strongin A. Y, The isolation and properties of collagenolytic proteases from crab hepatopancreas. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, v. 166, pp. 1411-1420.

26. Климова О.А, Чеботарев В. Ю, Коллагенолитический комплекс протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба: разделение на индивидуальные компоненты, Бюллетень Эксп. Биол. Мед., 1999, т. 128, сс. 308-313.

27. Rawlings, N.D., Morton, F.R. & Barrett, A.J, MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res, 2005, v. 34, pp 270-272.

28. Krem M. M, Di Cera E, Molecular markers of serine protease evolution, EMBO J, 2001, v 20, pp 3036-3045.

29. Lu P, Liu H, Tsai I, The midgut trypsin of shrimp {Panaeus monodon ). High efficiency toward native protein substrates including collagens. J.Biol. Chem., 1990, v. 371, pp. 851-859.

30. Graf R, Boehlen P, Briegel H, Structural diversity of trypsin from different mosquito species feeding on vertebrate blood, Experientia, 1991, v. 47, pp. 603609.

31. Rypniewski W. R, Hastrup S, Betzel Ch, Dauter M, Dauter Z, Papendorf G, Branner S, Wilson K. S, The sequence and X-ray structure of the trypsin from Fusarium oxysporum, Protein Eng., 1993, v. 6, pp. 341-348.

32. Burton N.P, Lowe C. R, Design of novel affinity absorbents for the purification of trypsin-like proteases. J. Mol. Recognit., 1992, v. 5, pp. 55-68.

33. Burton N. P, Lowe C. R, Design of novel cationic ligands for the purification of trypsin-like proteases by affinity chromatography, J Mol. Recogn, 1993,v. 6, pp. 31-40.

34. Ibrahim-Grant O, Bertrand O, Separation of proteases: old and new approaches. J. Chromatography, Pt. B, 1996, v. 684, pp. 239-263.

35. Lemos F. J. A, Terra W. R, Soluble and membrane-bound forms trypsin-like in Musca domestica larval midgut. Insect Biochem. Mol. Biol., 1992, v. 22, pp. 613619.

36. Morris S. R, Sakanari J. A, Characterization of the serine protease and serine protease inhibitor from the tissue-penetrating nematode Anisakis simplex, J. Biol. Chemistry, 1994, v. 269, № 44, pp. 27650-27656.

37. Flanagan S.D, Barondes S.H, Affinity partitioning. A method for purification of proteins using specific polymer-ligands in aqueous polymer two-phase systems. J. Biol. Chem., 1975, v.250, pp. 1484-1489.

38. Senstad C, Mattiasson B, Precipitation of soluble affinity complexes by a second affinity interaction: a model study. Biotechnol. Appl. Biochem., 1989, v. 11, pp. 41-48.

39. Ling T.G.I, Mattiasson B, Membrane filtration affinity purification (MFAP) of dehydrogenases using cibacron blue. Biotechnol. Bioeng., 1989, v. 34, pp. 13211325.

40. Linne E, Garg N, KAUL R; MATTIASSON.B, Evaluation of alginate as a ligand carrier in affinity precipitation. Biotechnol. Appl. Biochem., 1992, vol. 16, n 1, pp. 48-56.

41. Galaev I. Yu, Mattiasson B, Galaev, I. Yu., Mattiasson, B. Smart polymers and what they could do in biotechnology and medicine. Trends Biotechnol., 1999, v. 17, pp. 335-340.

42. Wunderwald P, Schrenk W.J, J, Port H, Krezse G. B, Removal of endoproteinases from biological fluids by "sandwich affinity chromatography" with alpha 2-macroglobulin bound to zinc chelate-Sepharose. Appl. Biochem., 1983, v.1-2, pp. 31-42.

43. Walker J. E, Keil B, Perification and characterization of different active forms of pork trypsin. Eur. J. Biochem, 1973, v. 32, pp. 486-491.

44. Brun G. L, Wojtowicz M. B, A comparative study of the digestive enzymes in the hepatopancreas of Jonah crab ( Cancer borealis ) and rock crab ( Cancer irroratus ). Comp. Biochem. Physiol., 1976, v. 53B, pp. 387-391.

45. Grant G. A, Sacchettini J. C, Welgus H. C, A collagenolytic serine protease with trypsin-like specificity from the fiddler crab Uca pugilator .Biochemistry, 1983, v 22, p 354-358.

46. Kimoto K, Kusama S, Murakami K, Purification and characterization of serine proteinases from Euphausia superba. 1983, Agric. Biol. Chem., v. 47, pp. 529534.

47. Graf R, Briegel H, Isolation of trypsin isozymes from the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect. Biochem., 1985, v. 15, pp. 611-618.

48. Jany K. D, Haug H, Ishay J, Trypsin-like endopeptidases from the midgets of the larvae from the hornets of Vespa orientalis and Vespa crabo Insect. Biochem., 1978, v. 8, pp. 221-230.

49. Walsh K. A, Trypsinogens and trypsins of various species. In Methods in enzymology, Academic Press, New York, 1970, v 19, pp. 41-63.

50. Amarant T, Burkhart W, Le Vine H, Arocha-Pinango C. L, Parikh, Isolation and complete amino acid sequence of two fibrinolytic proteinases from the toxic Saturnid caterpillar Lonomia achelous. Biochem. Biophys. Acta, 1991, v. 1079, pp. 214-221.

51. Sasaki T, Hishida T, Ichikawa K, Asari S, Amino acid sequence of alkaliphic serine protease from silkworm, Bombyx mori, larval digestive juice. FEBS Lett.,1993, v. 320, pp. 35-37.

52. Bigelow C.C, On the average hydrophobicity of proteins and the relation between it and protein structure. J. Theoret. Biol., 1967, v. 16, pp. 187-211.

53. Read R. J, James M. N. G, Refined crystal structure of Streptomyces griseus trypsin at 1,7 A resolution. J. Mol. Biol., 1988, v. 200 pp. 523-551.

54. Smalas A. 0, Heimstad E.S, Hordvik A, Willassen N.P, Male R, Cold adaption of enzymes: structural comparison between salmon and bovine trypsins, Proteins, 1994, v. 20, pp. 149-166.

55. Winter W. P, Neurath H, Purification and properties of a trypsin-like enzyme from the starfish Evasterias trochelii, Biochemistry, 1970, v. 9, pp. 4673-4679.

56. Grant G. A, Henderson К. O, Eisen A Z, Bradshaw R. A, Amino acid sequence of a collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler crab Uca pugilato, Biochemistry, 1980, v. 19, pp. 4653-4659.

57. Eisen A, Henderson K, Jeffrey J, Bradshaw R, A collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler crab Uca pugilator. Purification and properties. Biochemistry, 1973, v. 12, pp. 1814-1822.

58. Tsai Н, Lu Р, Chuang J, The midgut chymotrypsin of shrimp (Penaeus monodon, Penaeus japonicus and Penaeus penicillatus). Biochem. Biophys. Acta, 1991, v. 1080, pp. 59-67.

59. Zwilling R, Tomasek V, Amino acid composition of crayfish trypsin. Nature, 1970, v. 228, pp. 57-58.

60. Turkiewicz M, Galas E, Kalinowska H, Collagenolytic serine protease from Euphausia superba Dana (Antarctic krill). Comp. Biochem. Physiol, 1991, v. 99B, pp. 359-371.

61. Tsu C. A, Perona J. J, Fletterick R. J, Craik C. S, Structural basis for the broad substrate specificity of fiddler crab collagenolytic serine protease 1. Biochemystry, 1997, v. 36, pp. 5393-5401.

62. Lecroisey A, Keil B, Specificity of the collagenase from the insect Hypoderma lineatum, Eur. J. Biochem., 1985, v. 125, pp. 123-130.

63. Tanizawa K, Kasaba Y, Kanaoka Y, Inverse substrates for trypsin. Efficient" enzymatic hydrolysis of certain esters with a cationic center in the leaving group. J. Am. Chem. Soc., 1977, v. 99, pp. 4485-4488.

64. Sekizaki H, Itoh K, Murakami M, Toyota E, Tanizawa K, Anionic trypsin from chum salmon: activity with p-amidinophenyl ester and comparison with bovine and Streptomyces griseus trypsin. Comp. Bioch. Physiol., 2000, v. 127 B, pp 337346.

65. Sainz J. C, Garcia-Carreno F. L, Hernandez-Cortes P, Penaeus vannamei isotrypsins: purification and characterization. Comp. Biochem. Physiol., 2004, v. 138 B, pp. 155-162.

66. Jiang S. T, Moody M, Chen H. C, Purification and characterization of proteases from digestive tract of grass shrimp {Penaeus monodori), J. Food Sci, 1991, v. 56, pp. 322-326.

67. Gates R.J, Travis J, Isolation and comparative properties of shrimp trypsin (Penaeus setiferus). Biochemistry, 1969, v. 8, pp. 4483-4489.

68. Galgani F. G, Benyamin Y, Ceccaldi H. J, Identofication of digestive proteinases of Penaeus kerathurus: a comparison with Penaeus japonicus bate. Comp. Biochem. Physiol., 1984, v. 78 B, pp. 355-361.

69. Matthews B. E, The source, release and specificity of proteolytic enzyme activity produced by Anisakis simplex larvae (Nematoda: Ascaridida) in vitro, J. Helminthol., 1984, v. 58, pp. 175-185.

70. Glass H. J, Stark J. R, Protein digestion in the European lobster Homarus gammarus. Сотр. Biochem. Physiol., 1994, v. 108 B, pp. 225-235.

71. Purcell J. P, Greenplate J. T, Sammons R. D, Examination of midgat luminal proteinase activities in six economically important insects. Insect. Biochem. Mol. Biol, 1992, v. 22, N 1, pp. 41-47.

72. Мосолов В. В, Протеолитические ферменты, 1971, Изд-во "Наука" Москва.

73. Sanger, F., and Thompson, Е. О. P., Amino acids in the glycyl chain of insulin. II Peptides from enzymic hydrolyzates: Biochemical Journal, 1953, v. 53, p. 366374.

74. Ней M. S, Kim H. R, Pyeun J. H, Comparison of trypsin and chymotrypsin from the viscera of anchovy, Engraulis japónica, Сотр. Biochem. Physiol. 1995, V 112B,n3,pp 557-567.

75. Zwilling R, Neurath H, Methods in enzymology, 1981, v 80, Invertebrate proteases, pp633-643

76. Lecroisey A, Tong N. T, Keil B, Hypodermin B, a trypsin-related enzyme from the insect Hypoderma lineatum. Eur. J. Biochem, 1983,134, pp261-267.

77. Sanger F, Tuppy H, The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. 1951, Biochem J, v. 49, pp 481-490.

78. Hofman H, Fietzek P. P, Kuhn K, The role of polar and hydrophobic interactions for the molecular packing of type I collagen: a Three-dimensional evaluation of the amino acid sequence. J. Mol. Biol., 1978, v. 125, pp. 137-165.

79. Genicot S, Feller G, Gerday C, Trypsin from antarctic fish {Paranotothenia magellanica foster) as compared with trout (salmo salar) trypsin. Comp. Biochem. Physiol., 1988, v 90B, pp 601-609.

80. Laskowski J. M, Qasim M. A, What can the structure of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes?, Biochem. Biophys. Acta, 2000, v. 1477, pp 324-337.

81. Read R. J, James M. N. G, In: proteinase inhibitors, Eds A.J. Barret, G. Salvesen-Amsterdam: Elsevier, 1986, pp. 301-336.

82. Sweet R. M, Wright H. T, Janin J, Chothia C. H, Blow D. M, Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2.6-A resolution. Biochemistry, 1974, v. 13, pp. 4212-4228.

83. Christeller J. T, Shaw B. D, The interaction of a range of serine proteinase inhibitirs with bovine trypsin and Costelytra zealandica trypsin. Insect.Biochem, 1989, v. 19, pp 233-241.

84. Patthy A, Amir S, Malik Z, Bodi A, Kardos J, Asboth B, Graf L, Remarkable phylum selectivity of a Schistocerca gregaria trypsin inhibitor: the possible role of enzyme-inhibitor flexibility. Arch. Biochem. Biophis., 2002, v. 398, pp. 179-187.

85. Huntington J. A, Read R. J, Carrell R.W, Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation. Nature (London), 2000, v. 407, pp. 923-926.

86. Hedstrom L, Serine protease mechanism and specificity, Chem. Rev., 2002, v.102, pp. 4501-4523.

87. Hartley B. S, Kauffman D. L, Corrections to the amino acid sequence of bivine chymotrypsinogen A, Biochem J, 1966, v 101, pp 229-231.

88. Branden C, Tooze J, Introduction to protein structure, 1991, pp238.

89. Jansen E.F, Nutting M.D.F, Balls A.K, Mode of inhibition of chymotrypsin by diisopropyl fluorophosphate. I. Introduction of phosphorus. J.Biol.Chem., 1949, v. 179, pp 201-204.

90. Schoellman G, Shaw E, Direct evidence for the presence of histidine in the active center of chymotrypsin. Biochemistry, 1963, v. 2, pp. 252-255.

91. Blow D.M, Birktoft JJ, Hartley B.S, Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin. Nature, 1969, v. 221, pp. 337-340.

92. Corey D.R, Craik C.S, An investigation into the minimum requirements for peptide hydrolysis by mutation of the catalytic triad of trypsin. J. Am. Chem. Coc., 1992, v. 114, pp. 1784-1790.

93. Carter P, Wells J.A, Engineering enzyme specificity by "substrate-assisted catalysis". Science, 1987, v. 237, pp. 394-399.

94. Corey D.R, Willett W.S, Coombs G.S, Craik C.S, Trypsin specificity increased through substrate assisted catalysis. Biochemistry, 1995, v. 34, pp. 11521-11527.

95. Menard R, Storer A. C, Oxyanion hole interactions in serine and cysteine proteases. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1992, v. 373, pp. 393-401.

96. Menard R, Plouffe C, Laflammme P, Vernet T, Tessier D. C, Thomas D. Y, Storer A. C, Modification of the electrostatic enviroment is tolerated in the oxyanion hole of the cysteine proteinase papain. Biochemistry, 1995, v. 34, pp. 464-471.

97. Perona J.J, Hedstrom L, Rutter W. J, Fletterick R. J, Structural origins of substrate discrimination in trypsin and chymotrypsin. Biochemistry, 1995, v. 34, pp. 1489-1499.

98. Graf L. A, Jancso A, Szilagyi G, Hegyi K, Pinter G, Naray-Szabo J, Hepp K, Medzihradszky K, Rutter W. J, Electrostatic complementary within the substrate-binding poket of trypsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, pp. 4961-4965.

99. Hedstrom L, Szilagyi L, Rutter W. J, Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops. Science, 1992, v. 255, pp. 1249-1253.

100. Hedstrom L, Perona J. J, Rutter W. J, Converting trypsin to chymotrypsin: residue 172 is a substrate specificity determinant. Biochemistry, 1992, v. 33, pp. 8757-8763.

101. Kossiakoff A. A, Spencer S. A, Direct determination of the protonation states of aspartic acid-102 and histidine-57 in the tetrahedral intermediate of the serine proteases: neutron structure of trypsin, Biochemistry, 1981, v. 20, pp. 6462-6474.

102. Bryan P, Pantoliano W, Quill S. G, Hsioa H-Y, Poulos T, Sci. U.S.A, Site-Directed Mutagenesis and the Role of the Oxyanion Hole in Subtilisin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1986, v.83, pp. 3742-3745.

103. Warshel A, Naray-Szabo G, Sussman F, Hwang J. K, Biochemistry, How do serine proteases really work?, 1989, 28,3629-3637.

104. Warshel A Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem, 1998, v. 273, pp. 27035-27038.

105. Gerlt J. A, Gassman P.G, Understanding the rates of certain enzyme-catalyzed reactions: proton abstraction from carbon acids, acyl-transfer reactions, and displacement reactions of phosphodiesters. Biochemistry, 1993, v. 32, pp. 1155211568.

106. Kuhn P, Knapp M, Soltis S. M, Ganshaw G, Thoene M, Bott R, The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. Biochemistry, 1998, v. 37, pp. 13446-13452.

107. Cleland W. W, Frey P. A, Gerlt J.A, The Low Barrier hydrogen bond in enzymatic catalysis. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, pp. 25529-25532.

108. Blow D. M, Birktoft J. J, Hartley B. S, 1969, Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin, Nature, 221, 337-340.

109. Fujinaga M, Delbaere L. T. J, Brayer G. D, James M. N. G, Refined structure of alpha-lytic protease at 1.7 A resolution. Analysis of hydrogen bonding and solvent structure. J. Mol. Biol., 1985, v. 183, pp. 479-502.

110. Bachovchin W. W, Confirmation of the assignment of the low-field proton resonance of serine proteases by using specifically nitrogen-15 labeled enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, v. 82, pp. 7948-7951.

111. Wang J. H, Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A, Directional character of proton transfer in enzyme catalysis. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1970, v. 66, pp. 874881.

112. Satterthwait A. C, Jencks W. P, J. Am. Chem. Soc., The mechanism of the aminolysis of acetate esters. J. Am. Chem. Soc., 1974, v. 96, pp. 7018-7031.

113. Carne T, Scheele G, Amino acid sequences of transport peptides associated with canine exocrine pancreatic proteins. J.Biol. Chem., 1982, v. 257, pp. 4133-4140.

114. Maroux S, Baratti J, Desnuelle P, Purification and Specificity of Porcine Enterokinase. J.Biol.Chem., 1971, v. 246, pp. 5031-5039.

115. MacDonald R.J, Stary S.J, Swift G.H, Rat pancreatic ribonuclease messenger RNA. The nucleotide sequence of the entire mRNA and the derived amino acid sequence of the pre-enzyme. J.Biol.Chem., 1982, v. 257, pp. 14582-14585.

116. Abita J.P, Delaage M, Lazdunski M, Savrda J, The mechanism of activation of trypsinogen. The role of the four N-terminal aspartyl residues. Eur.J.Biochem, 1969, v. 8, pp. 314-324.

117. Chothia C, Conformation of twisted beta-pleated sheets in proteins. J. Mol. Biol., 1973, v. 75, pp. 295-302.

118. McLachlan A. D, Gene duplication in the structural evolution of chymotrypsin. J. Mol. Biol., 1979, v. 128, pp. 49-79.

119. Murzin A. G, Lesk A. M, Chothia C, Principles determining the structure of 13-sheet barrels in proteins: I. A theoretical analysis. J. Mol. Biol., 1994, v.236, pp. 1369-1381.

120. Lesk A. M, Fordham W. D, Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family. J. Mol. Biol., 1996, v. 258, pp. 501537.

121. Birktoft J.J, Blow D. M, Structure of crystalline chymotrypsin. V. The atomic structure of tosyl-chymotrypsin at 2A resolution. J. Mol. Biol., 1972, v. 68, pp. 187-240.

122. Baptista A. M, Jonson P. H, Hough E, Petersen S. B, The origin of trypsin: evidence for multiple gene duplication in trypsins. J. Mol. Biol., 1998, v. 47, pp.353-362.

123. Rogers J, Exon shuffling and intron insertion in serine proteinase genes. Nature,1985, v. 315, pp. 458-459.

124. Kornblihtt A. R, Vibe-Pedersen K, Baralle F. E, Human fibronectin: cell specific alternative mRNA splicing generates polypeptide chains differing in the number of internal repeats. Nucleic. Acids. Res., 1984, v. 12, pp. 5853-5868.

125. G. H. Swift, C. S. Craik, S. J. Stary, C. Quinto, R. G. Lahaie, W. J. Rutter, and R. J. MacDonald, Structure of the two related elastase genes expressed in the rat pancreas. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, pp. 14271-14278.

126. Rypniewski W.R, Perrakis A, Vorgias C, Wilson K. S, Evolutionary divergence and conservation of trypsin. Protein Engineering, 1994, v.7, №1, pp 57-64.

127. Iwanaga S, Kawabata S. I, Muta T, New types of clotting factors and defense molecules found in horseshoe crab hemolymph: their structures and functions. J. Biochem., 1998, v. 123, pp. 1-15.

128. Jiang H, Kanost, M. R, The clip-domain family of proteinases in arthropods. Insect. Biochem. Molec. Biol., 2000, v. 30, pp. 95-105.

129. Iwanada S, Kawabata S, Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front. Biosci., 1998, v. 3 D, pp. 973-984.

130. Levashina E. A, Langley E, Green C, Gubb D, Ashburner M, Hoffmann J. A, Reichhart J. M, Constitutive activation of Toll-mediated antifungal defense in serpin-deficient Drosophila, Science, 1999, v. 285, pp. 1917-1919.

131. LeMosy E. K, Hong С. C, Hashimoto C, Signal transduction by a protease cascade. Trends in Cell Boil., 1999, v. 9, pp. 102-107.

132. Gotz T, Mechanisms of encapsulation in dipteran hosts. Symp. Zool. Soc. Lond., 1986, v. 56, pp. 1-19.

133. Ashida M, Brey P, Recent advances in research on the insect prophenoloxidase cascade. In: Brey P. T, Hultmark D, Molecular mechanisms of immune responses in insects, Chapman and hall, London, 1997, pp. 133-172.

134. Ochiai M, Ashida M, Purification of a (3-1,3-glucan recognition protein in the prophenoloxidase activating system from hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem., 1988, v. 263, pp. 12056-12062.

135. Soderhall K, Cerenius L, Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 1998, v. 10, pp. 23-28.

136. Jiang H, Wang Y, Kanost M. R, Pro-phenol oxidase activating proteinase from an insect, Manduxa Sexta: a bacteria-inducible protein similar to Drosophila easter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, pp. 12220-12225.

137. Satoh D, Horii A, Ochiai M, Ashida M, Prophenoloxidaseactivating enzyme of the silkworm, Bombyx mori: purification, characterization, and cDNA cloning. J.Biol. Chem., 1999, v. 274, pp. 7441-7453.

138. Исаев В. А, Руденская Г. H, Купенко О. Г, Степанов В. М, Попова И. М, Диденко Ю.Г, " Способ получения препарата коллагеназы", патент №2008353 от 5 авг 1991 г,. Бюлл. Изобр., №4, 1994, 18.

139. Grant G. A, Eisen A. Z, Bradshaw R. A, Collagenolytic protease from fiddler crab (Uca pugilator). Metods Enzymol., 1981, v. 80, pp. 722-734.

140. Camacho Z, Brown J. R, Kitto G. B, Purification and properties of trypsin-like protease from the starfish Dermasterias imbricata. J. Biol. Chem., 1970, v. 254, pp. 3964-3972.

141. Sakarov I. Yu, Mar. Biotechnol, 2, pp 259-266, Purification and some properties of two carboxypeptidases from the hepatopancreas of the crab Paralitodes camtschaticus. Mar. Biotechnol. 2000, v. 2, pp. 259-266.

142. Сахаров И. Ю, Джунковская А. В, Эластаза из гепатопанкреаса камчатского краба. Биохимия, 1993, т 58, стр. 1445-1453.

143. Руденская Г. Н, Шмойлов А. М, Исаев В. А, Ксенофонтов А. В, Швец С.

144. В, Аминопептидаза PC гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtshaticus. Биохимия, 2000, т. 65, стр. 1345-1353.

145. Osnes К. К, Mohr V, On the purification and characterization of three anionic, serine-type pepide hydrolases from Antarctic krill, Euphausia superba. Сотр. Biochem. Physiol., 1985, v 82 B, pp. 607-619.

146. Руденская Г.Н, Купенко О. Г, Исаев В. А, Степанов В. М, Дунаевский Я. Е, Выделение и характеристика карбоксипептидазы из камчатского краба Paralithodes camtshaticus., Биоорг. Химия, 1995, т. 21, с 249-255.

147. Liu J-H, Wang Z. X, Kinetic analysis of ligand-induced autocatalytic reactions. Biochem J, 2004, v. 379 pp.697-702.

148. Groppe JC, Morse DE: Molluscan chymotrypsin-like protease: structure, localization, and substrate specificity. Arch Biochem Biophys., 1986, v. 305 pp. 159-169.

149. Papaleo E, Fantucci P, De Gioia L, Effects of calcium binding on structure and autolysis regulation in trypsins. A molecular dynamics investigation, J. Chem. Theoty Comput., 2005, v. 1, pp. 1286-1297.

150. Castro H.C, Silva D. M, Craik C, Zingali R. B, Structural features of a snake venom thrombin-like enzyme: thrombin and trypsin on a single catalytic platform? , Biochem. Biophys. Acta, 2001, v. 1547, pp. 183-195.

151. Leiros H. K, Willassen N. P, Smalas A. O, Residue determinants and sequence analysis of cold-adapted trypsins. Extermophiles, 1999, v. 3 pp. 205-219.

152. Gabriel B, Stubbs M. T, Bergner A, Hauptmann J, Bode W, Sturzebecher J, Moroder L, Design of benzamidine-type inhibitors of factor Xa. J. Med. Chem., 1998, v. 41, pp. 4240-4250.

153. Matsuzaki T, Sasaki C, Okumura C, Umeyama H, X-ray analysis of thrombin inhibitor-trypsin complex. J. Biochem., 1989, v. 105, pp. 949-952.

154. Oliveira M, Rogana E, Rosa J. C, Reinhold B. B, Andrade M. H, Greene L. J, Guia M. M, Tyrosine 151 is part of the substrate activation binding site of bovine trypsin. The J. Biol. Chem., 1993, v. 268, pp. 26893-26903.

155. Miller D. W, Agard D.A, Enzyme specificity under dynamic control: a normal mode analysis of alpha-lytic protease. J. Mol. Biol., 1999, v. 286 pp. 267-278.

156. Leiros H-K. S, Willassen N. P, Smalas A. O, Structural comparison of psychrophilic and mesophilic trypsins, Eur. J. Biochem, 2000, v 267, pp 10391049.

157. Erlanger B. F, Kokowsky N, Cohen W, The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin, Arch. Biochem. Biophys, 1961, v 95, pp 271-278.

158. Bradford M, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem, 1976, v 72, pp 248-254.

159. Laemmli U.K, Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriofage T4, Nature, 1970, v. 227, pp. 680-685.