Выделение и изучение свойств и стабильности α-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Мещеряков, Никита Викторович

• Мещеряков, Никита Викторович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мещеряков, Никита Викторович

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Практическая значимость а-амилазы

1.2 Использование культивируемых тканей в биохимии и биотехнологии

1.3 Структура а-амилаз

1.4 Физико-химические свойства а-амилаз и специфичность их

действия

1.5 Механизм действия фермента

1.6 Молекулярная гетерогенность а-амилазы

1.7 Методы выделения и очистки а-амилазы

1.7.1 Осаждение органическими растворителями и высаливание нейтральными солями

1.7.2 Ионообменная хроматография

1.7.3 Аффинная хроматография

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования и методы культивирования

2.2 Методы получения цитозольной фракции

2.3 Методы определения активности а-амилазы

2.4 Подбор оптимальных условий ферментативной реакции а-амилазы

2.5 Определение концентрации белка

2.6 Выделение и очистка

2.6.1 Фракционное осаждение растворами солей

2.6.2 Гель - хроматография

2.6.3 Аффинная хроматография

2.7 Электрофоретические методы анализа фермента

2.7.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля

2.7.2 Окраска полиакриламидных гелей для выявления белковых полос

2.7.3 Окраска геля для выявления амилолитической активности

2.7.4 Электрофорез с добавлением 8Б8

2.8 Иммунологические методы

2.8.1 Получение антисыворотки к а-амилазе

2.8.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле

2.8.3 Радиоизотопный метод определения обмена а-амилазы и общего белка

2.9 Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Динамика уровня активности а-амилазы, содержания белка и

накопления биомассы культурой ткани И.вегреп^па

3.1.1 Параметры контрольной культуры, выращенной на стандартной

питательной среде

3.1.2 Параметры культуры, выращенной на питательной среде с крахмалом

3.1.3 Исследование влияния гибберелловой кислоты на синтез и секрецию а-амилазы культурой ткани раувольфии змеиной

3.2 Определение изоферментного спектра а-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina на разные сроки культивирования

3.3 Выделение а-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina

3.3.1 Выделение а-амилазы методом гель-хроматографии

3.3.2 Получение высокоочищенной а-амилазы методом аффинной хроматографии

3.4 Влияние диметилсульфоксида на активность а-амилазы

3.5 Влияние ингибиторов на активность а-амилазы раувольфии змеиной

3.6 Изучение физико-химических свойств а-амилазы

3.6.1 Влияние температуры и рН среды на активность фермента

3.6.2 Кинетические параметры а-амилазы из культуры ткани раувольфии змеиной

3.6.3 Определение молекулярной массы изоферментов а-амилазы

3.7 Изучение кругооборота а-амилазы и общего белка в культивируемых клетках раувольфии змеиной

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

93

Список сокращений

1. ААЭ - ацетилаймалинэстераза,

2. Дак -декстриногенная амилолитическая активность,

3. Е - концентрация фермента,

4. Ка - константа скорости деградации фермента,

5. к8 - константа скорости синтеза фермента,

6. Т1/2 - время полужизни фермента,

7. ПААГ - полиакриламидный гель,

8. ТРИС - трис-(оксиметил)-аминометан,

9. - додецилсульфат натрия,

10.ПХМБ - парахлормеркурийбензоат,

11 .МР8 - метилфенилсульфофлуорид.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и изучение свойств и стабильности α-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth»

Введение.

Актуальность темы. Амилолитические ферменты были известны человеку уже в бронзовом веке . Первые упоминания о продуктах, полученных путем сбраживания крахмалсодержащего сырья, относятся к VI - VII векам до н.э. В настоящее время амилазы и родственные им ферменты широко используются в промышленности, медицине и биотехнологии.

Несмотря на тот факт, что именно растительные амилазы положили начало науке о ферментах, в последнее время амилолитическим ферментам растений уделяется значительно меньше внимания, чем грибным или бактериальным. Гидролазы культур растительных клеток вообще изучены недостаточно и в современной литературе имеются лишь единичные сведения о структурно - функциональных особенностях а-амилаз каллусных тканей.

Получение растительных гидролаз перспективно, прежде всего, для пищевой и медицинской промышленности. К сожалению, содержание амилаз в тканях взрослого растения невелико, а использование солода требует жесткого контроля зерна, как по микробиологическим показателям зараженности, так и по физико-химическим свойствам ферментативного комплекса. Одним из решений данной проблемы является использование высокопродуктивных культур клеток растений. Методами генной инженерии и целенаправленной селекции можно получать линии растительных клеток -суперпродуцентов, как по первичным метаболитам, например ферментам, так и по вторичным, таким как углеводы или алкалоиды.

Получение а-амилазы из раувольфии змеиной интересно еще и тем, что данная культура является продуцентом спектра алкалоидов, обладающих антиаритмическим действием. Таким образом, разработка оптимальных схем разделения и очистки ферментов и низкомолекулярных БАВ может

значительно повысить экономическую эффективность промышленного культивирования каллусных клеток этого растения.

Таким образом, изучение обмена амилолитических ферментов в культурах растительных клеток не только пополнит скудную копилку знаний в данной области, но и сыграет немаловажную роль в промышленном использовании растительных гидролаз.

Задачи исследования.

1. Изучение динамики активности а-амилазы в культуре ткани R.serpentina, динамики накопления белка, биомассы ткани, обводненности клеток.

2. Разработка методов выделения и очистки а-амилазы из культуры ткани R.serpentina.

3. Изучение физико-химических и кинетических свойств фермента, разработка и оптимизация метода определения амилолитической активности применительно к культурам ткани.

4. Изучение изоферментного спектра а-амилазы из культуры ткани R.serpentina.

5. Изучение обмена а-амилазы в культуре ткани R.serpentina.

Научная новизна. Амилазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма, как растений, так и клеточных культур растительного происхождения. Таким образом, фундаментальные исследования в этой области представляют несомненный научный интерес. Кроме того, незначительное количество литературных данных по изучению гидролаз именно растительных клеточных культур заставляет обратить пристальное внимание на обмен амилазы в дедифференцированных клетках растений.

В настоящей работе представлены данные по кругообороту а-амилазы в штамме К-27 каллусной культуры ткани R.serpentina, определены

константы синтеза и деградации, время полужизни и концентрация фермента в пассируемой культуре.

Кроме того, проведен ряд работ, направленных на увеличение синтеза а-амилазы культурой клеток Я.зегрепйпа путем субстратной индукции. Отмечена интересная особенность культуры к секреции в окружающую среду белка, обладающего декстриногенной активностью, предприняты попытки увеличения количества секретируемого белка.

Модифицирован и оптимизирован к особенностям а-амилазы из клеточных культур метод определения декстриногенной активности ферментов (метод Каравея).

Разработан ряд методов высокой очистки а-амилазы растительного происхождения, в том числе и с помощью колоночной хроматографии на аффинном сорбенте.

Теоретическая и практическая значимость. Наряду с теоретическим, диссертация имеет также и практическое значение. Первое связанно, прежде всего, с исследованиями метаболизма а-амилазы в штамме К-27 культуры ткани Я-Бегрепипа в плане изучения биохимии и молекулярной биологии клетки. Впервые было проведено исследование обмена а-амилазы в пассируемой культуре раувольфии, результаты которого углубляют наши знания об обмене индивидуальных белков в культурах растительных тканей. Результаты исследования физико-химических и кинетических свойств а-амилазы - одного из ключевых ферментов метаболизма растений, -дополняют наши представления о путях деградации крахмалоподобных полисахаридов в организмах растительного происхождения, а изолирование и изучение свойств гидролаз может стать необходимой предпосылкой для осуществления внеклеточных реакций по биотрансформации ряда биологически-активных веществ различного происхождения.

Практическая значимость работы заключена, прежде всего, в тех перспективах, которые открывает промышленное использование

■'> .' - .'>>.--л , ,

культивируемых растительных клеток - продуцентов гидролаз. Исследование способов увеличения синтеза амилаз растительными клетками способно свести на нет одно из главных преимуществ грибов и бактерий - более высокую амилолитическую активность в клетке, а разработка методов увеличения секреторной способности растительной клетки нанесет удар и по второму преимуществу суспензионных культур микроорганизмов. Кроме того, высокие органолептические показатели даже плохо очищенных препаратов амилаз растительного происхождения позволяют использовать их в производственном цикле, например пищевой промышленности, тогда как амилазы микробного и бактериального происхождения нуждаются в тщательной, и, зачастую, дорогостоящей очистке.

Установлено, что растительная а-амилаза является менее иммунотоксичной для человека, чем амилаза микробного происхождения, а методы выделения растительных амилаз из клеточных культур обходятся дешевле, чем получение высококачественной а-амилазы из тканей животного происхождения. Это является мощным стимулом для внедрения в медицину препаратов растительных амилаз, как для внутривенного введения, так и для создания мультиферментных препаратов для перорального использования.

Предложенные в данной работе методы выделения и очистки ос-амилазы позволяют существенно уменьшить число операций, требующих применения вредных органических растворителей, а так же повысить выход конечного продукта.

1. Обзор литературы.

1.1 Практическая значимость а-амилазы.

Человечество с давних пор использовало амилазы при получении пищевых продуктов. Амилазы проросших зерен злаков (пшеницы, ржи, ячменя, овса, сорго и др.) были активным началом при изготовлении солода, о производстве которого имеются сведения за 7000 лет до н.э. Амилазы ячменного солода играли основную роль в пивоварении за 5000 лет до н.э. К древнейшим отраслям промышленности, в которых использовался гидролиз крахмала амилазами, относят хлебопечение, виноделие, производство спирта и др. Специфика климата и демографии стран Востока (Китай, Япония, Корея) определила направление развития таких традиционных технологий, как виноделие и переработка зернопродуктов, в сторону использования грибных и микробных амилаз, в отличие от Европы и Америки, где в качестве источника амилаз преимущественно применяли солод или проросшее зерно злаков. [35, 40]

Амилазы вошли в историю энзимологии, как первые научно описанные ферменты.

30 ноября 1814 года академик К.С.Кирхгофф на заседании Петербургской Академии наук сделал доклад "О получении сахара при осолаживании злаков и при обваривании муки кипятком", в котором изложил некоторые идеи по получению сахара из крахмала. В то время этот вопрос имел большое значение для России в связи с поисками замены импортируемому сахарному тростнику. Изучая различные виды крахмалов, Кирхгофф обнаружил, что в пшеничной муке содержится "некое клейковатое вещество" - белковая компонента зерна, нагревание с которым крахмала при 40 - 60°С в течение 10 часов, без минеральной кислоты, приводит к гидролизу крахмала с образованием сахара. В результате

последующих экспериментов было выяснено, что гидролиз крахмала осуществлялся именно белком [43], который был назван диастазой, а затем, амилазой. Таково было открытие первого фермента, положившее начало науке о биологических катализаторах.

Сейчас к амилазам относят несколько ферментов: а-амилазу, (3-амилазу, экзо-1,4-а-глюкозидазу (глюкоамилазу, или у-амилазу), олиго-1,6-глюкозидазу, амило-1,6-глюкозидазу, пуллуланазу, изоамилазу [32, 67, 69]. Установлено, что они гидролизуют а-1,4- и(или) а-1,6-глюкозидные связи в крахмале, гликогене и родственных им олиго- и полисахаридах. По номенклатуре ферментов они относятся классу гидролаз, подклассу гликозидаз. Растительные ткани, как правило, содержат только а- Р- и у-амилазу. В настоящей работе внимание будет уделено только первой из них.

По интенсивности использования в различных отраслях промышленности амилазы занимают первое место среди других ферментов, ибо во многих производственных процессах при обработке различных видов сырья возникает необходимость в более или менее глубоком расщеплении крахмала.

Несмотря на то, что в последние годы наиболее широко используются амилазы бактериального и грибного происхождения, растительные амилазы прочно занимают свою нишу, прежде всего в пищевой промышленности, корнями своими уходящую в прошлое, и опирающуюся на традиции. Кроме того, растительные амилазы более безопасны для человека, в отличие от ферментного комплекса микроорганизмов, требующего тщательной очистки от токсичных продуктов метаболизма, что позволяет широко использовать растительные амилазы в медицине.

Помимо хлебопечения, спиртовой и пивоваренной промышленности амилазы применяют в кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), при производстве крупяных изделий, овощепродуктов, изделий из фруктов (соков, варений, экстрактов, пектина),

детской пищи, а так же в текстильной (крашение, расшлихтовка волокна), бумажной промышленности, и при производстве моющих средств [6, 35, 42].

1.2 Использование культивируемых тканей в биохимии и

биотехнологии.

В последние годы все большее значение стало приобретать развитие новых биохимических методов в исследовании молекулярных механизмов жизнедеятельности различных организмов, протекании биохимических процессов на клеточном уровне. Большие перспективы в изучении широкого круга проблем открывает метод культуры in vitro изолированных органов, тканей и клеток высших растений.

Зарождение метода культивирования растительных тканей и клеток относится к середине XIX века, когда Шлейден [119] и Шванн [120] независимо друг от друга создали основу клеточной теории и постулировали тот факт, что клетка способна к автономии, что она тотипотентна. Но после этого прошло почти 130 лет, прежде чем была продемонстрирована способность соматических клеток трансформироваться в целостные организмы. Первые попытки получить каллус на основе эксплантов из растительного материала были предприняты в 1893 году Рехингером [113]. Однако принципы клеточной культуры были сформулированы Габерландтом лишь спустя 9 лет. На основе клеточной теории он предположил, что не может быть ограничений в делении клеток in vitro. Им были проделаны успешные эксперименты по поддержанию процесса митоза единичных изолированных клеток. Подобные эксперименты проводились и в последующие 15 лет [53, 61, 80,132], однако, только в 1929 году Ulehla [139] впервые удалось показать целесообразность культивирования тканей на твердой агаризованной питательной среде. Kotte [79] и Robins [114] в 1922 году практически одновременно установили, что истинная культура in vitro может быть легко получена из меристемных клеток, таких, как кончики

корней и почек. Наиболее широко метод культуры тканей получил развитие с 1934 года, когда Kogel [77] обнаружил, что найденное ранее Went [140] ростовое вещество оказалось индолилуксусной кислотой, a Snow [126] продемонстрировал, что данный фитогормон способен значительно стимулировать каллусную активность. Позднее были найдены еще два ростовых вещества, значительно ускоряющих пролиферацию каллусных тканей - кинетин и ауксин [122]. Мурасиге и Скуг [103] предложили питательную среду с фитогормонами для культивирования растительных тканей.

Развитие нового метода культивирования растительных органов и тканей открыло широкие возможности в исследованиях по физиологии и биохимии растений, цитологии, генетике, фармацевтической промышленности и сельскому хозяйству. Культура in vitro дает хорошую возможность оценить потенции изолированных из целого организма клеток и тканей, а так же исследовать обмен веществ растений на клеточном уровне, возможность изменения метаболизма и структуры тканей в зависимости от действия различных химических и физических факторов.

Реконструкция органов и целого растения из тканей и отдельных клеток открыла перспективы получения новых растительных форм для селекции.

Методы культуры тканей имеют так же большое значение для оздоровления растений от вирусов, так как меристемные клетки зараженного растения не обнаруживают следов вирусной инфекции, и при культивировании дают здоровые растения [99, 100, 101]

Особая важность этого метода заключается в решении одной из основных биологических задач - проблеме злокачественного роста и борьбы с ним. Также метод может быть использован в целях стимуляции быстрого размножения и роста клеток ткани вне организма для получения из них ценных продуктов метаболизма [8].

Метод культур тканей и клеток растений сделал возможным получение специфических продуктов растительного происхождения, химический синтез которых слишком дорог. К ним можно отнести ферменты, алкалоиды, полифенолы, эфирные масла, воски, витамины. Некоторые из них являются ценными лекарственными препаратами.

Кроме того, культивируемые клетки способны создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные, или открывающие новые области применения, а так же биотрансформировать дешевые предшественники в ценные конечные продукты [21, 22, 82].

Очевидными преимуществами культур растительных клеток перед традиционными видами сырья являются:

- Возможность круглосуточного выращивания биомассы клеток и тканей.

- Независимость от климатических и географических условий.

- Освобождение земельных площадей.

- Стандартизация и более высокое качество сырья.

- Возможность автоматизации технологических процессов.

- Отказ от импорта лекарственного сырья и препаратов.

Особенностью культивируемых in vitro клеток является существенное отличие их генетического аппарата от генетического аппарата клеток интактного растения. Эти различия могут быть обусловлены тем, что клеточное де дифференцирование и возникновение каллуса имеют в своей основе деятельность генома. При этом происходит репрессия одних и активация ряда других генов, отвечающих за синтез специфических ферментов, свойственных эмбриональным клеткам, что, в целом, ведет к существенному изменению метаболизма [17,105]. Так, методом рестрикционного анализа было показано, что митохондриальная ДНК, выделенная из проростков Vicia fabi существенно различается от митохондриальной ДНК суспензионной культуры тех же клеток [31]. В культуре популяция кольцевых митохондриальных ДНК была более

гетерогенной, также, как и популяция миникольцевых ДНК. В суспензионной культуре клеток табака тоже были выявлены значительные различия в структуре ДНК молодой и старой клеточных линий [62]. Перестройка клеточного метаболизма в результате генетических изменений, наблюдаемая в культивируемых клетках растений, оказывает существенное влияние и на скорость образования и кругооборот первичных метаболитов, и, в первую очередь, ферментов.

Перевод клеток в культуру приводит в ряде случаев к изменению их биосинтетической способности, по отношению к интактным растениям. В этом отношении интересен пример исследования инвертазы в каллусной культуре и корнеплодах сахарной свеклы [27].

Существенные изменения биосинтеза и обмена ферментов с одной стороны, и изменение биологической активности и сродства к субстрату с другой - приводит к модификации ряда биологических процессов, что в значительной мере влияет на образование вторичных метаболитов. Часто спектр синтезируемых веществ одной группы бывает выше, чем в исходном растении, но возможна и репрессия синтеза некоторых веществ, например алкалоидов [7, 24, 33, 49, 109,130].

В последние годы метод культуры тканей находит все больше применений во многих областях наук [21,7]. Однако, и в настоящее время остается проблема изучения физиологических и биохимических процессов, протекающих в дедифференцированных клетках.

1.3 Структура а-амилаз.

Первые упоминания в литературе о рентгеноструктурном анализе амилаз встречаются в 1979 году [93]. В то время полная аминокислотная последовательность исследуемого фермента (а-амилаза Азр.огугае) еще не была известна, поэтому модель включала в себя лишь часть основной полипептидной цепи. Позже, в 1981 году, Тода и соавт. [135] опубликовали

данные по первичной структуре и картам электронной плотности, на основании которых была создана молекулярная модель фермента и установлены пространственные координаты всех атомов, за исключением атомов водорода. Исследования структуры растительных амилаз начаты в 90-х годах нашего века. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области определения третичной структуры гидролитических ферментов, до сих пор невозможно достоверно определить все центры связывания субстрата, каталитически активные остатки аминокислот в полипептидной цепи, а так же их индивидуальную роль в процессах расщепления субстрата [94, 128, 55, 112,51,76].

На сегодняшний день известно, что все амилазы являются мономерными металлоферментами, принадлежащими к подклассу так называемых (оф)8-бочкообразных энзимов [72, 12]. По данным японских исследователей [94, 95] а-амилаза некоторых грибов - гликопротеин. Растительные амилазы не содержат в своем составе небелковых компонентов, за исключением ионов Са2+.

Полипептидная цепь амилазы условно делится на 3 (для а-амилаз) или 4 и более (до 7 для [3- и у-амилаз) домена, обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита. Самый большой из них - домен А, состоит из параллельных оф-бочкообразных суперструктур второго порядка. У растительной а-амилазы, выделенной из ячменя, в его состав входят 285 аминокислотных остатка (1-88 и 153-350). В отличие от триозофосфатизомеразы (первого фермента, в котором была обнаружена подобная структура, названная TIM-бочкой), где ос-спирали идут антипараллельно Р-структурам, в амилазе ячменя присутствуют три дополнительные ос-спирали (оСба, ос7а, а8а), как продолжение (^-структур, тогда как остальные ос-спирали и Р-бочка схожи с TIM, за исключением осбб- На С-терминальном конце аР-бочки находится активный центр фермента.

Углеводный

мппоншнт

Рис. 1 Пространственная структура амилазы из гриба Авр.огугае

Домен В (64 аминокислотных остатка), отвечающий за связывание ионов Са2+ и субстрата, образован полипептидной петлей между р3-структурой и а3-спиралью домена А, которая уложена в антипараллельный |3-лист [117]. Петля А-р2а2 также выступающая из домена А, может считаться логическим продолжение домена В. Конформация домена поддерживается тремя ионами кальция. Центральная полипептидная цепь с основными водородными связями показана на Рис. 3 .

Ионы кальция (в амилазе ячменя их 3, в микробных амилазах до 7-10, в животных - 1) играют существенную роль в поддержании активной конформации фермента [56, 141, 81]. Полное удаление кальция, например, при диализе против ЭДТА, ведет к полной потере амилазой активности. Добавление ионов кальция к инактивированной вышеописанным способом а-амилазе в концентрации 1 моль/моль фермента ведет к более или

Рис. 2 Общая структура ячменной а-амилазы (нзоэнзим 2). Ионы кальция в домене В показаны

звездочками.

Рис. 3 Основная полипептидная цепь домена В и петля А-р2(Х2с тремя ионами кальция. Водородные

связи показаны пунктирами.

менее полному восстановлению первоначальных свойств. Показано, что добавление ионов стронция, магния, бария вызывает восстановление амилолитической активности ферментом практически в той же степени, что и добавление кальция, а ионы цинка и кадмия не оказывают положительного эффекта [134]. В той же работе отмечалось, что стронций и магний могут замещать прочно связанные ионы кальция в нативной амилазе.

На Рис. 5 схематично показаны три сайта связывания ионов кальция в молекуле растительной амилазы.

Домен С растительной а-амилазы состоит из пяти Р-структур, прочно сшитых водородными связями и образующих антипараллельный Р-лист. Водородные связи в так называемых "Р-шишках", расположенных на каждой из фланговых Р-структур (С-Р] и С~р4) отсутствуют, из-за значительного их искривления. Связь между третьей и четвертой Р-структурами осуществляется длиннои поперечной петлей, выступающей за плоскость р-листа. При этом р5-структура лежит между р4-структурой и р3-структурой и антипараллельна им обеим. Принципиальная схема растительной а-амилазы показана на Рис. 4

Ос этей п В

1 «р ? "р 1 Ы^егтта! 1 3 о 14 Оотайп А ^^ 3 Р4 <Д4 В5 ЯД ее СГ ос7а 1 ОС 8» Ш± 2 В7 СГ?Ь В8 «8Ь У

С-1егт1па1 1 «и Оотат О

Рис. 4 Принципиальная схема растительной а-амилазы ячменя, а-спирали показаны цилиндрами, |3-

структуры - стрелками.

с)

Рис. 5 Сайты связывания молекул кальция 500(с), 501 (а), 502(в) в а-амилазе ячменя. Сайт связывания Са500 показан вместе с сайтом связывания Са502.

1.4 Физико-химические свойства а-амилаз и специфичность их

действия.

Естественными субстратом амилаз является крахмал, состоящий из двух полисахаридов глюконового типа: линейного (амилозы) и разветвленного (амилопектина). Различные виды крахмала содержат 15-20% амилозы и 85-75% амилопектина. Амилоза обусловливает йодкрахмальную реакцию, т.е. синее окрашивание крахмала йодом, легко агрегирует в растворе и вызывает выпадение осадка. Она содержит от нескольких сотен до нескольких тысяч остатков глюкозы, соединенных а-1,4-связями. В отличие от амилозы, амилопектин сильно разветвлен, и кроме линейных участков с а-1,4-связями в местах ветвления содержит, в основном а-1,6- и, возможно, другие глюкозидные связи.

Специфичность действия амилолитических ферментов рассматривается в многочисленных работах, обзорах, монографиях [15, 18, 23]. Тем не менее, в настоящее время еще до конца не объяснены различия в характере действия и широкая субстратная специфичность отдельных амилолитических ферментов на основе строения их активных центров и пространственных структур их молекул. Перекрывающаяся специфичность часто затрудняет классификацию амилаз.

а-Амилазы гидролизуют в полисахаридах или продуктах их деградации внутренние а-1,4-глюкозидные связи, приводя к образованию крупных декстринов. Среди них различают нормальные а-декстрины, содержащие 6-13 глюкозных остатков, и аномальные конечные декстрины с большим количеством а-1,6-связей. В связи с этим а-амилазы называют декстринирующими или эндоамилазами. а-1,6-Связи не только не расщепляются а-амилазой, но и являются стерическим препятствием для гидролиза находящихся в непосредственной близости к ним а-1,4-связей.

Отщепление декстринов, содержащих 15 и более остатков глюкозы, на начальных этапах амилолиза идет с большой скоростью, которая существенно уменьшается при дальнейшем действии фермента на более низкомолекулярные фрагменты полисахаридных субстратов. Конечные продукты реакции а-амилаз (чаще всего декстрины, мальтоза, мальтотриоза, изомальтоза, глюкоза) определяются индивидуальными особенностями а-амилаз различного происхождения.

По характеру продуктов гидролиза, а-амилазы можно условно разделить на два типа - сахарифицирующие и разжижающие. Сахарифицирующие . а-амилазы проявляют большую редуцирующую способность, чем разжижающие, и гидролизуют мальтоолигосахариды с нередуцирующего конца мальтотриозными единицами. В то же время, разжижающие а-амилазы отщепляют от субстрата мальтогексозные и мальтопентозные единицы [129]. Однако, строгого разграничения между этими амилазами провести нельзя, и можно лишь говорить о преобладающем типе действия у тех или иных ферментов.

По другой классификации [5], основанной на воздействии а-амилаз на линейные олигосахариды с наименьшим числом остатков глюкозы, к первой группе относятся так называемые декстринирующие амилазы, не действующие на мальтопентозу и мальтогексозу. Во вторую группу входят сахарогенные а-амилазы атакующие мальтопентозу, мальтотетрозу, и, возможно, мальтотриозу.

Некоторые виды грибов и бактерий продуцируют а-амилазы, способные к расщеплению наиболее простых мальтосахаридов - мальтозы и а-фенилмальтозида [51], однако большинство растительных, животных и микробных амилаз не могут расщеплять низкомолекулярные продукты гидролиза крахмала, а так же более высокомолекулярные олигосахариды, имеющие одну или более точек ветвления.

Молекулярная масса а-амилаз различного происхождения лежит в пределах 30-70 к Да.

Для кислотостабильной а-амилазы Азр.ш^ег принята молекулярная масса 61 кДа [51], Азр.о^ае продуцирует а-амилазу с массой 51 кДа [104], молекулярные массы животных амилаз, выделенных из различных источников [115, 118, 116, 60, 48] лежат в пределах 50 - 54 кДа. Растительная амилаза из кукурузы имеет молекулярную массу 44 - 47 кДа [58], сходными параметрами обладают изоэнзимы из ячменя [73, 74, 90]. Особое положение занимает только а-амилаза Вас.тасегаш - ее вес составляет 139.3 кДа [129].

Исследования ряда ученых [64, 129] показали, что ионы цинка вызывают димеризацию а-амилазы. Большая концентрация этих ионов может вызвать образование даже более высокомолекулярных агрегатов [98], однако, при рН ниже 5.0 они быстро распадаются на составные мономеры. Полимеризация а-амилаз сопровождается частичной потерей активности, вызванной, по всей видимости, конформационными затруднениями связывания субстрата.

За исключением кислотостабильных амилаз, продуцируемых некоторыми видами грибов и имеющих оптимум рН около 2.0, оптимум рН для всех а-амилаз составляет 5.5 - 7.5 [131, 38]. Температурный оптимум амилаз животного происхождения составляет 37 - 45°С, растительных амилаз - 50 - 60°С. Некоторые виды термофильных бактерий способны продуцировать а-амилазу с оптимумом температуры 94 и даже 104°С.

1.5 Механизм действия фермента.

На сегодняшний день имеется несколько теорий расщепления субстрата а-амилазами.

Наиболее вероятным считается механизм двойного замещения, предложенный Кошландом [78] в 1953 году и модифицированный Маккартером-Уитерсом [96] в 1994 и Дэвисом [63] в 1995. По этому

механизму пара остатков аминокислот позиционируется напротив друг друга на расстоянии 4.5 - 5.5 А, в зависимости от природы энзима. После образования фермент-субстратного комплекса за счет ковалентного связывания полисахаридного фрагмента со вторым аминокислотным остатком (каталитическим нуклеофиллом), первый аминокислотный остаток дает протон для расщепления глюкозидной связи. Затем фермент-субстратный комплекс гидролизуется водой в реакции вторичного замещения. Доказано, что оба замещения протекают через образование промежуточного оксокарбониевого иона.

Однако в 1967 году Филипсом было показано, что образующийся на расщепляемой связи оксокарбониевый ион скорее образует долгоживущую двойную связь с энзимом, нежели чем вступит с ним в ковалентное взаимодействие. Подтверждение этого факта было сделано в 1995 году Стринданой и Джеймсом [127].

В последнее время предложено еще несколько механизмов, но все они как подтверждаются одними экспериментами, так и опровергаются другими.

Исследования последних лет, связанные с рентгеноструктурными исследованиями комплексов а-амилаз и конкурентных ингибиторов показали наличие нескольких центров связывания полисахаридного субстрата ферментом. Помимо поверхностного сайта связывания в домене С, в а-амилазе ячменя один дисахаридный фрагмент субстрата притягивается двумя остатками триптофана (Трп276 и Трп277) абь-спирали домена А, являющимися якорным участком полипептидной цепи фермента. Кроме того, формируется ряд водородных и Ван-дер-ваальсовых связей с Гли226, Вал229, Асп233 из пятой а-спирали домена А.

На Рис. 6 показана акарбоза, являющаяся одним из конкурентных ингибиторов а-амилаз, связанная активным центром фермента. На роль каталитической пары донор протона - нуклеофил прекрасно подходит пара

','е88-С=0

Аб р87—Ос12----ОН—Ту г51

Ж

ЫН

/

Ос19

С

и

О

.-НоО

627

С—Аэр-^о—С и

Р--Н20б54 ,-Ос!-|

о

II

С

С=0--

I

А\ат

О

II

С НгОеоо -МН—Агд177—1ЧН2-... _

у062 Азр87-Сч

Ос!.,

I

ОН-'-Мвг-^заг-!«!.....ОсН

Аэрэ!

N¿2

I

ЬИ!—Нвгвв С

II / О—Ыео

I

Ое-! С1П294

I

С1п5

/ ч1 / \ ,Ое2 Ое-,

\ / \ \ / \ С н20 607 Q

I I

ЫН-Аэргвд С1и204

С=0—N4

Ос!..

I

АЭР287

М^296 Я.

..—ОН

\ \

Н20-635 \ О 4 \

1ЧН—РИе180

С II О

1ЧН

......он

/ \ ' 1 ..!-----" '

ж НРе^]^06! I Ые-] "Н /

А1а

181

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мещеряков, Никита Викторович

Выводы

1. Был разработан новый метод выделения а-амилазы из культуры ткани раувольфии змеиной, позволяющий получить 2.5 мг высокоочищенного фермента из 100 г сырой биомассы.

2. Изучена динамика изменения амилолитической активности в культуре ткани раувольфии змеиной, выращенной на коллекционной среде, и средах с различной степенью замещения сахарозы на крахмал.

3. Установлен факт секреции а-амилазы клеткам ткани раувольфии и изучено влияние некоторых веществ на секрецию а-амилазы клетками ткани в окружающую среду.

4. Предложены методы культивирования раувольфии змеиной на средах, содержащих в качестве источника углеродного питания частично гидролизованный крахмал.

5. Изучены физико-химические и кинетические свойства а-амилазы раувольфии змеиной, в том числе и молекулярная гетерогенность фермента. Установлено изменение молекулярной гетерогенности фермента в зависимости от срока культивирования. Максимальное количество изоформ ( 5) наюлюдалось на 39 сутки .

6. изучены синтез и стабильность а-амилазы на 60-е сутки культивирования. Определены константы скорости образования, распада и фремя функционирования фермента к клетках ткани раувольфии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мещеряков, Никита Викторович, 1999 год

Список литературы

1. А.с. 1084297 СССР, МКИ С 12 N 1/20, 15/00 . Штамм Bac.subtilis-82 -

продуцент а-амилазы и питательная среда для культивирования Bac.subtilis-82. / И.Э.Бурцева, Е.А.Двадцатова и др. - Опубл. 07.04.84, Бюл.№13.

2. А.с. 118674 СССР, МКИ С 12 N 9/34. Способ стабилизации

глюкоамилазы, продуцируемой Aspergillus awamori в процессе хранения / Б.А.Устинникова, Е.А.Двадцатова и др. - Опубл. 15.10.84, Бюл.№38.

3. А.с. 1214755 СССР, МКИ С 12 N 9/28. Способ выделения ферментов с

протеолитической и амилолитической активностью из Aspergillus oryzae / И.П.Галич, Р.Я.Бейнарович и др. - Опубл. 28.02.86, Бюл.№8.

4. А.с. 933707 СССР, МКИ С 12 N 15/00. Штамм плесневого гриба

Aspergillus oryzae-3 - продуцент а-амилазы / Р.В.Зуева, Н.М.Павлова и др. - Опубл. 07.06.82, Бюл.№21.

5. Беленький Д.М. Особенности ферментативного гидролиза а-1,4-

глюкозидных связей // Успехи биол.химии. 1971. 12. с.164-181

6. Билай В.И. Биологически активные вещества грибов, и их применение.

Киев : Наук. Думка , 1979, 266с.

7. Бутенко Р.Г. Клеточная технология для получения экономически

важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и Биотехнология. М: Наука. 1986. с.3-20.

8. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиологоия

морфогенеза. М. : Наука, 1964, с212.

9. Вайнер JI.M. Получение препарата амилазы и разделение

амилолитического и протеолитического комплекса ферментов сорбцией крахмалом. Автореф.дисс....канд.биол. наук. М. 1972. 27с.

10. Воллосович А.Г. Культура ткани раувольфии, как продуцент

противоаритмических алкалоидов: автореф.дисс....докт.фарм.наук, СПб, 1992, 38 с.

11. Воллосович А.Г., Бутенко Р.Г. Культура ткани раувольфии змеиной, как

продуцент алкалоидов // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. 1970. с.253-264.

12. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. Киев. 1987.

13. Глемжа A.A. Использование аффинной хроматографии в очистке

микробных гидролаз // Прикл.Биохим.Микробиол. 1982. 18. №6. с. 1517.

14. Горбатова К.К.,Соломахин В.А., Погулина Г.Н. Фотометрический метод

определения активности а-амилазы // Изв.высш.уч.завед. пищ.техн. 1969, 4, с.169.

15. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.

Пищ.Промышленность, 1975.

16. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М. : Мир, 1982. Т.1, 899с.

17. Долежл И., Новак Ф.И. Кариологические изменения в ходе

дифференцировки клеток чеснока. // Культура клеток растений и биотехнология, 1986, с.20-25

18. Жеребцов H.A. Амилолитические ферменты в пищевой

промышленности.. М. Пищ.Промышленность, 1984.

19. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культуре

клеток и тканей растений // Культура клеток растений. 1981. с. 167-175

20. Иванова Г.П., Миргородская O.A., Москвичев Б.В. Стабильность ос-

амилазы Bac.subtilis обратимо иммобилизованной гелем ионита КМТ // Прикл.Биохим.Микробиол. 1985. 57. №1. с.33-36.

21. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей

в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980, 488 с.

22. Калинин Ф.Л., Полищук В.Е. Культивирование тканей растений //

Биохимический Журнал. Киев. 1981. с.24-40.

23. Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы. Тбилиси.: 1984.

24. Комов В.П. Образование и обмен метаболитов в культуре клеток

растений // Культура клеток и тканей растений : тез.док. Кишинев. 1983 с.86.

25. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: 1986.

26. Кунах В.А., Каухова И.Е. Особенности поведения клеток в культуре

ткани раувольфии змеиной // Цитология и генетика. 1982. 16. №5. с.6-12.

27. Курсанов A.JI. , Дубинина И.М., Кудрявцева Л.Ф., Бураханова Е.А.

Некоторые особенности углеводного обмена в культуре дифференцированных тканей сахарной свеклы // Физиология растений 1976. Т.23. 6. с.6-12.

28. Миронова В.Ф., Таганкина П.П. Амилазы млекопитающих // Вестник

Биохимика. 1966. 5. №2. с. 10-24

29. Михайловская В.Ц. Получение и биохимическая характеристика

очищенных ферментных преваратов из плесневых грибов. : Автореф.дисс....канд.биол. наук. М. 1966. 24с.

30. Молодова Г.А. Выделение амилазы Asp.oryzae. и изучение ее

структурных и функциональных особенностей.

Автореф.дисс....канд.биол. наук. М. 1966. 24с.

31. Негрук В.И., Эйстер Г.И., Редичкина Т.Д. Перестройка

митохондриального генома в длительно культивируемой суспензионной культуре клеток Vicia fabiio. // Физ. Раст., 1987, 34, N1, с.179-191.

32. Номенклатура ферментов. Под редакцией А.Е. Браунштейна. - М. :

ВИНИТИ, 1979, 320с.

33. Носов А.Н., Пауков В.Н., Китя П.И. Исследование стероидных фракций

культуры клеток дискореи дельтовидной // // Культура клеток растений и Биотехнология. М: Наука. 1986. с.79-83.

34. Орещенко Л.И. Разделение и очистка амилолитических и

протеолитических ферментов гриба Asp.oryzae. : Автореф.дисс....канд.биол. наук. М. 1964. 24с.

35. Пронин С.И. Амилолитические ферменты и их роль в пищевой

промышленности. -М. : Наука, 1964, с. 158-169.

36. Рухлядева А.П. Полыгалина Г.В Методы определения активности

гидролитических ферментов // М. Легк.и пищ. Пром., 1981, 288.

37. Трайнина Т.И. Условия культивирования грибов рода Aspergillus в

производстве ферментных препаратов. Автореф.дисс....канд.биол. наук. Харьков. 1969. 22с.

38. Хорлин А .Я. Активные центры карбогидраз // Структура и функции

активных центров ферментов. М.: 1974. с.39-69.

39. Циперович А.С., Галич И.П. Кристалл1защя а-амшази з радянских

ферментних препарат1в // Укр.бюх1м. журн. 1968. 40. N2. с. 14-22.

40. Цыперович А.С. , Галич И.П. Биология и технический прогресс.

Настоящее и будущее. Киев : Наук. Думка, 1976, 233с.

41. Цыперович А.С. , Галич И.П. Исследование молекулярной

гетерогенности кристаллической а-амилазы // Биохимия. 1967. 32. N6. с.1186-1194.

42. Цыперович А.С. Ферменты. (Основы химии и технологии). - Киев :

Техника, 1971, 351с.

43. Шамин А.Н. Биокатализ и биокатализаторы : Ист.очерк, - М.: Наука,

1971, 196с.

44. Шульман М.С. Сорбция амилолитических ферментов. М. Пищ.пр-ть.

1966. 52с.

45. Akabori S., Ikenaka T., Hagihara B. Isolation of crystalline Taka-amylase A

from Takadiastase sankyo // J.Biochem. 1954. 41. N5. p.577-582.

46. Andjik J., Hagem A., Carlier A., Boute M. Isolement des isoenzymes de

l'amylase salyivare par isoelectrofocalisation // C.r.Acad.Sci. 1970. 270. N2. p.407.

47. Areas I.M., Doile D.Shimke R. Studies of endoplasmic reticulum of rat liver

//J.Biol.chem. 1969, №12, p.3303-3315.

48. Aw S.E., Hobbs J.E., Wootton J.D. Chromatographic purification of isosimes

of human a-amylase // BBA. 1968. 168. N2. p.362-370.

49. Ball E. Differentiation in callus culture cells of sequoila sempervirens //

Groeth. 1950. V.14 p.295-325

50. Bernfeld P. Methods of enzymology. N.-Y 1955,1, p.149

51. Boel E., Brady L.,Derewenda Z.S., Brzozowski A., Dodson G.G. Solution of

the structure of Asp.niger acid a-amylase by combined molecular replacement and multiple isomorphus replacement methods // Acta Crystallogr. N47. p.527-535.

52. Bog-Hansen T.C., Humo F., Raendel H. Immunochemical quantitation of

isoenzymes. Alpha-amylase isoenzymes in barley malt // Anal Biochem. 1974. 61. N2. p.522-527.

53. Borger H. Uber die Kultur von isolierten Zellen und Gewebefragmenten. //

Arch, f .exp. Zellif, 1926, s.123-190.

54. Bradford M.M. a rapid and sensitive method for the quontitation of

microgramm quontaties of protein, using the principle of protein - dying binding // Anal.bioch. 1976. N72 p.248-254.

55. Buisson C., Duee E., Hasser R., Rayan F. Three - demensional structure of

porcine pancreatic a-amylase at 2.9 A resolution. Role Ca in structure and activity // EMBO J. 1987. N6. p.3909-3916.

56. Bush D.S., Norman G., The calcium requirement for stability and enzymatic

activity of two isoforms of barley aleurone alpha-amylase // J Biol Chem. 1989. 264 N32. p.19392-19398.

57. Caldwell M.L., Chester. R.M., Doebelling A.H. Furthet studies of the

purification and properties of the amylase of Asp.oryzae // J.Biol.Chem. 1945. 161. N1. p.361-365.

58. Chao S.E., Moritz D.A., Alpha-amylase of maize: differential allelic

expression at the Amy-1 gene locus, and some physiochemical properties of the isozymes // Genetics. 1971. 69 N1. p.47-61.

59. Chen X, Kuo A, Matsuura H. A gibberellin-stimulated ubiquitin-conjugating

enzyme gene is involved in alpha-amylase gene expression in rice aleurone // Plant Mol Biol. 1995. 29. N 4. p. 787-795.

60. Cozzone P., Pasero L., Beomfoil B. Characterisation of porcine pancreatic

isoamylase // BBA. 1970. 207. N3. p.1940-1970.

61. Czech H. Kultur von pflanzlichen Gewebezellen. // Arch, f .exp. Zellif., N3,

1926, s. 176-179.

62. Dale R.M.K., Duesing J.M., Keen D, Supercoiled mittohondrial DNA from

plant tissue culture cell.// Nucl. Acids Res., 1981, 9, N12, p.4583-4593.

63. Davis A.B. Hydrolysis of sorghum grain starch by rumen microorganisms and

purified porcine alpha-amylase as observed by scanning electron microscopy // J Anim Sci. 1995. 138. N.4. p. 900-907.

64. Fisher E.H., Stein E.A. a-Amylases // The Enzymes. N.Y. Acad.Press. 1960.

4. p.313-343.

65. Gilroy S., McKidney F.T Gibberellic acid and abscisic acid coordinately

regulate cytoplasmic calcium and secretory activity in barley aleurone protoplasts. // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89. N 8. p. 3591-3595.

66. Gotz H., Wast H., Raies F. Agarelectrophretische studien zur Frage von

isaenzymen der Amylase//Clin.Chim.Acta. 1968. 19. N2. p.935-943.

67. Harada W., Tokuya N. Bacterial isoamylase and pullulanase. //

J.Jap.Soc.Starch Sci., - 1984, 31, №2, p.38-47

68. Heck G.R., Rott G.F., Gibberellin-repressible gene expression in the barley

aleurone layer // Plant Mol Biol. 1996. 30. N3. p. 611-623.

69. Hiromi K., Ohnishi M. Some comments about amylase classification // Ibid. -

1984, 31, №2, p.74-82

70. Hooley R.G. Gibberellin perception and the Avena fatua aleurone: do our

molecular keys fit the correct locks? // Biochem Soc Trans. 1992 20 N1. p. 85-89.

71. Jacobsen J.V. Control of transient expression of chimaeric genes by

gibberellic acid and abscisic acid in protoplasts prepared from mature barley aleurone layers // Plant Mol Biol. 1991. 16. N4. p.713-724.

72. Jespersen H.M., Johnson F.A. Comparison of the domain-level organization

of starch hydrolases and related enzymes // Biochem J. 1991. V.280. N1 p.51-55.

73. Juge N, Smith H. Overexpression, purification, and characterization of

recombinant barley alpha-amylases 1 and 2 secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Protein Expr Purif. 1996. 8. N2. p. 204-214.

74. Juge N, Snob A. Isozyme hybrids within the protruding third loop domain of

the barley alpha-amylase (beta/alpha)8-barrel. Implication for BASI sensitivity and substrate affinity // FEBS Lett. 1995. 363. N3. P.299-303.

75. Jun-Jei Sheu, Tien-Shin Yu, Wu-Fu Tong, Su-May Yui Carbohydrate

Starvation Stimulates Differential Expression of Rice A-Amylase Genes That Is Modulated through Complicated Transcriptional and Posttranscriptional Processes // The journal of biological chemistry 1996. 271. N43. p. 26998-27004.

76. Kadziolla A., Jun-Iche A., Svensson B., Hasser R. Crystall and molecular

structure of barley a-amylase // JMB. 1994. V.239. N1. p.104-130.

77. Kogel F., Haagen-Smith A.L, Erxleben M. Uber ein neues Auxin aus Harn. //

Z. Phusiol. Chem., 1934, 228, s.90-103.

78. Koshland M.C. On the mechanism of the glucosidic bondclearage in the

enzyme hidrolisis of starch // BBA. 1953. 36. N.29. p.234-245.

79. Kotte W. Kulturversuche mit isolierten Wurzelspitzen. // Beitz. Z. Allgem.

Bot., 1922, 2, s.413-434.

80. Kunkel W. Uber die Kultur von perianthgewebe. // Arch. f. exp. Zellif., N3,

1926, s.405-428.

81. Kuo A, Jung S. Okadaic acid, a protein phosphatase inhibitor, blocks calcium

changes, gene expression, and cell death induced by gibberellin in wheat aleurone cells // Plant Cell. 1996 8 N2. p.259-269.

82. Kutney J.P., Awerin B., Chei L.S., Honda T., Lewis N.G. Studies in plunt

tissue culture synthesys and biosythesis of indole alkaloides. // Tetrahedron, 1983, 39, N22, p.3781-3795.

83. Laude F.A., Boetter B. Electrophoretic examination of human serum amylase

isoenzymes // Enzymologia. 1969. 37. N5-6. p335-342.

84. Lavodszky P., Elodi P. Structural investigation on pancreatic a-amylase //

Acta Bioch.Biophys. 1970. 5. N2. p.225-229.

85. Levitzky A., Heller J., Schramm M.S. Specific precipitation of enzyme by its

substrate: the a-amylase-maltodextrin complex // BBA. 1964. 81. N1. p.101-107.

86. Livesley M.A., Khond F.G. alpha-Amylase isoenzymes in aged wheat

aleurone layers // Biochem Soc Trans. 1991. 19. N4. p. 360.

87. Lowry O.H., Rosenberg F., Farr A. Randall R. Protein mesurement with the

folin phenol reagent // J.biol.chem 1951. 193. p.165

88. Loyter A., Schramm M.S. The glycogen-amylase complex as a means of

obtaining highly purefied a-amylases // BBA. 1962. 65. N2. p.200-206.

89. Lue M.Y., Dawis G.F. Protein phosphatase inhibitors enhance the expression

of an alpha-amylase gene, alpha Amy3, in cultured rice cells // Biochem Biophys Res Commun. 1994. 205. N1. p. 807-816.

90. MacGregor E.A., Kadziolla A., Svensson B. Models for the action of barley

alpha-amylase isozymes on linear substrates // Carbohydr Res. 1994. 257. N2. p.249-268.

91. Markowitz A., Klein H.P. Purification, crystallization and properties of the a-

amylase of Pseudomonas saccharofilla// BBA. 1956. 19. N2. p.267-273.

92. Marshall D., Voloschuk F.G. Glycogen as biospecific sorbent of amylases //

Postepy Biochem. 1981. 27. N2. p. 181-196.

93. Matsuura Y., Kusunoki M. Data W. Low esolution crystall structure of taka-

amylase A and its complexes with inhibitors // J.Biochem. 1979. 86. N6. p.1773-1783.

94. Matsuura Y., Kusunoki M., Harada W., Kakudo M. Structure and possible

catalitic residues of Taka-amylase A // Ibid. 1984. 95. N3. p.697-702.

95. Matsuura Y., Kusunoki M., Tanaka H. X-Ray structure and catalitic

mechanism of Taka-amylase A // J.Jap.Soc.Starch.Sci. 1983. 30. N2. p.141-147.

96. McKarter D, Witters N.C. Modification of starch clevage mechanisme by

different hidrolases // Biochim Biophys Acta. 1994 1206. N.2. P.289-291.

97. Mirkov T.E. Syida D.D. Location of the active site of the bean alpha-amylase

inhibitor and involvement of a Trp, Arg, Tyr triad // Glycobiology. 1995. 5. N.l.p. 45-50.

98. Mitchell E.D., Riquetti P., Loring R.H. Quaternaru structure of Bac. subtilis

a-amylase // BBA 1973. 295. N1. p.314-322

99. Morel G. La culture in vitro du meristeme apical de certaines Orchidees. // C.

R. Ac. Sc. 1963. 256. p.4955-4957.

100. Morel G., Martin C., Guersion de dahlias atteintes d'une maladie a virus. //

C. R. Ac. Ac. 1950. 235. p.1324-1325.

101. Morel G., Martin C., Guersion de pommes de terre atteintes demaladies a

virus. // C. R. Ac. Agric. 1955. 41. p.470-475.

102. Mulimani V.H., Homistrak A.S. Alpha amylase inhibitors in sorghum

(Sorghum bicolor) // Plant Foods Hum Nutr. 1993. 44. N3. p. 261-266.

103. Murachige T., Skoog F.A. Revised medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue cultures. // Phys. Plant. 1962. 15. p.23-26.

104. Narita K., Murakami H., Ikenaka T. Reinvestigation on the amino acid

composition and C-terminal group of taka-amylase A // J.Biochem. 1966. 59. N2. p.170-175

105.Nilson K. Mosbach K. General methodh for entrapment of cells in beaded polymers. // Biotech. 84 World Biotech. Rep. Proc. Conf. USA, Pinner, 1984. 2. p.217-231.

106. Oakley B.R, Kirch D.R., Morris N.R. // Anal.bioch. 1980, 105, p.361-366

107. Ono K, McGragor J. Purification of glucoamylase by acarbose (BAY g-5421)

affinity chromatography // Biotechnol Appl Biochem. 1986. 8. N2-3. p. 201-209.

108. Ouchterlony O. Recent progress in microbioligy. Simp. Hels. VIII Inter.

Congr. for Microbiology. 1958. Stocholm. p.163-169

109. Overton K.H. Biosynthesis of mevaloniod - derived compounds in cell

cultures // Plant Tissue Culture and its biological application. B.: N.Y. 1977 p.66-75.

110. Pat.4217415 US IC C 12 N 9/34 Starch-degrading anzymes from

Cladosporum resinae / J.J.Marshall - Publ 09.03.82.

111. Pen J., Smith D. Direct screening for high-level expression of an introduced

alpha-amylase gene in plants // Plant Mol Biol. 1992. 18. N6. p. 11331139.

112. Quian M., Hasser R., Rayan F. Structere and molecular model refinement of

pig pancreatic a-amylase at 2.1 A resolution // JMB. 1993. N231. p.785-799.

113. Rechinger C. Untersuchungen über die Grenzen der Teilbarkeit im

Pflanzenreichen. //Abh. d. Zool. Bot. Ges. Wien. 1893. 43. p.310-334.

114. Robbins W.J. Effect of autolized yest and peptons on grows of excised

cornroot tipsin the dark. // Bot. Gaz., 1922. 74. p.59-79.

115.Robyt J.F., Lee C.T. Separation of rat parotid isoamylase by preparative PAAG electrophoresis // Arch.Ozal.Biol. 1970. 15. N12. p.1381-1384.

116. Robyt J.F., Lee C.T. Structure and functions of amylase //

Arch.Bioch.Biophys. 1971. 144. N1. p. 160-167.

117. Rodenburg K.W., Hasser R. Domain B protruding at the third beta strand of

the alpha/beta barrel in barley alpha-amylase confers distinct isozyme-specific properties // Eur J Biochem. 1994. 221. N1. p.277-284.

118. Sanders T., Rutter W. Molecular properties of rat pancreatic an parotid a-

amylase // Biochem. 1972. 11. N1. p.130-140.

119. Schleiden M.J. Beitrage zur phytogenesis. // Muller. Arch. Anat. Phys., 1838.

p.137-176.

120. Schwann T. Mikroskopische Untersuchungen über die Ubereinstimnung in

der Struktur und Wachstum der Tire und pfranzen. // Nz. Oswalds. Berlin. 1939. 176p.

121. Schwimmer S., Balls A.K. Starch and their derivatives as adsorbents for malt

a-amylase // J.Biol.Chem. 1948. 180. N1. p.883-894.

122. Scoog F., Mitter C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in

plant tissuescultured in vitro. // Symp. Soc. Exp.Biol. "The Biological action of Growth substances". 1957. 11. p. 118-131.

123. Shimke R.T. Control of enzyme levels in mammalian tisues // Achv.enzymol.

1973. v.37. p.135-137.

124. Sidenius U, Marcell F. Stopped-flow kinetic studies of the reaction of barley

alpha-amylase/subtilisin inhibitor and the high pi barley alpha-amylase // FEBS Lett. 1995. 361 N.2-3. p. 250-254.

125. Silvanovich M.P., Hill R.D. Affinity chromatography of cereal a-amylase //

Anal.Biochem. 1976. 73. N2. p.430-433.

126. Snow R. Activation of cambial growth by purehormones. // New phytol.

1935. 35. N5. p.347-360.

127. Strindama A, James M.G. Characterization of the maize gene sugary 1, a

determinant of starch composition in kernels // Plant Cell. 1995. N.7. p. 417-429.

128. Swift H.J., Brady L.,Derewenda Z.S., Dodson E.J., Dodson G.G. Structure

and molecular refinement of taka-amylase: fn application of the simulated - annealing method // Acta Crystallog. 1991. N47. p.535-544.

129. Takagi T., Toda H., Isemura T. Bacterial and miod amylase // Enzymes. 1971.

5. p.235-271.

130. Telle J., Gautheret R.J., Sur la culture indefinie des tissus de la racine de

Jusguiame (Hyoscyamus niger L.) // C.R. Ac.Sc. 1949. V.224 p. 1653-1654.

131. Thama J., Wakim J., Steart L. Comparision of the active sites of a- and p-

amylase//Biochem.And Biophys.Res.Commun. 1963. 12. p.350-361.

132. Thielman N.M. Uber Kulturversuche mit Spalffnungszellen. // Ber. Dtsch.

Bot. Gesell.. 1924. 4. s.429-433.

133. Tkachuk R. Competitive affinity chromatography of wheat alpha-amylase //

FEBS Lett. 1975. 52. N1. p. 66-68.

134. Toda H., Narita K. Replacement of the essential calcium in Taka-amylase A //

Ibid. 1967. 62. N6. p.767-769.

135. Toda H., Narita K., Kondo H. The complete amino acid sequence of Taka-

amylase A // Proc.Jap.Acad. 1982. 588. p.208-212.

136. Ueda S., Koba Y., Chaen H. Amylase absorbtion on raw starch and its

relation to raw starch digestion // J.Jap.Soc.Starch.Sci. 1978. 25. N2. p. 124131.

137. Veber H.G. Completly separation of a- P- and y-amylases by affinity

chromatography on cross-linked amylose // Enzymes. 1983. 35. N4. p.321-329.

138. Vretblad P. Immobilisation of ligand for biospecific affinity chromatography

via their hydroxyl group // FEBS Letters. 1974. 47. N1. p.86-89.

139. Wakhloo J.L. Variation in the total alkaloid content of Rauwolfia serpentina

roots: a concentration from ecological points of view. // J. Ind. Bot. Soc., 1963. 18. N3. p.374-392.

140. Went F.W. On growth accelerating substances in the coleoptile of Avena

sativa. // Proc. Kon. Nedel. Acad. Weten. Amsterdam. 1926. 30. p. 10-23.

141.Whitaker J.R., Bush D.S., Norman G. Parameters involved in binding of porcine pancreatic alpha-amylase with black bean inhibitor: role of sulfhydryl groups, chloride, calcium, solvent composition and temperature // Biochimie. 1988. 70 N9. p.l 153-1161.

142. Zenin C.T., Park Y.K. Purification and characterisation of acid amylase from

Paecilomyces sp. // J.Ferment.Tecnology. 1983. 61. N1. p.109-112.