Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Андреева, Ирина Сергеевна

• Андреева, Ирина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андреева, Ирина Сергеевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

БИОРАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ - ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ)

1.1. Основные направления в использовании микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в науке и народном хозяйстве

1.2. Особенности и преимущества микроорганизмов экстремальных условий обитания в качестве продуцентов биологически активных веществ

1.3. Сайт-специфические эпдонуклеазы рестрикции (ЭР) - этимологический инструментарий молекулярной биологии

1.4. Микроорганизмы в процессах деградации и трансформации веществ

1.5. Антагонистическая активность микроорганизмов

1.6. Инсектицидная активность микроорганизмов

1.7. Антимикробная активность штаммов Bacillus thuringiensis

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Источники отбора образцов для выделения микроорганизмов

2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов

3. Условия культивирования штаммов-продуцентов БАВ

4. Определение наличия и специфичности ЭР в штаммах микроорганизмов

5. Скрининг микроорганизмов па продукцию полисахаридгидролаз

6. Геномный анализ штаммов микроорганизмов

7. Анализ профиля жирных кислот

8. Идентификация, определение инсектицидной и антимикробной активностей штаммов Bacillus thuringiensis (Bt)

2.8.1. Определение инсектицидной активности штаммов В

2.8.2. Определение антимикробных свойств водорастворимых метаболитов штаммов Bl

2.8.3. Определение антимикробной активности растворенных дельта-эпдотоксипов

2.8.4. Определение противовирусной активности штаммов Bt

2.8.5. Определение состава белков параспоральных включений штаммов Bt

2.9. Определение патогеппости штаммов микроорганизмов

2.10. Храпение и поддержание штаммов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА. 3. РАЗНООБРАЗИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ

3.1. Разнообразие, ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, воды и осадков Долины гейзеров (Камчатка)

3.2. Разнообразие, ферментативная и антибиотичекая активность микроорганизмов аэрозолей воздуха

3.3. Психрофильные бактерии льда Антарктиды, выделение, идентификация, ферментативная активность

3.4. Разнообразие и ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов осадков глубокого бурения дна оз. Байкал

3.5. Новые виды микроорганизмов, выделенные из природных образцов

3.5.1. Грамотрицательные, образующие эндоспоры, бактерии рода Paenibacillus, выделенные из почвы и источников Долины гейзеров

3.5.2. Образующая эндоспоры грамотрицательная эубактерия Brevibacillus barguzinii sp. nov., выделенная из термального источника

3.5.3. Roseomonas baikalica sp. nov. - новый вид микроорганизма, выделенного из образца керпа глубокого бурения дна озера Байкал

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭН

ДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ (ЭР)

4.1. Штамм Paenibacillus sp. Dg-1009 - продуцент изошизомера ЭР Psp 10091, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC -3'

4.2. Азотофиксирующие микроорганизмы рода Rhizobium, продуценты ЭР

4.2.1. Идентификация штаммов, скрининг на наличие ЭР

4.2.2. Штамм R.leguminozarum R-69, продуцент ЭР Rle

4.2.3. Штамм R. trifolii R-63, продуцент ЭР Rtrl

4.2.4. Штамм R. meliloti 21, продуцент ЭР Rme21I

4.2.5. Штамм R. trifolii 20, продуцент ЭР Rtr20I

4.3. ВтеЗбП — новая сайт-специфическая ЭР II типа из штамма Bacillus megaterium

4.4. Психрофильный штамм Acinetobacter sp. ОК-ЮЗр - продуцент ЭР

Asp 1031, узнающей нуклеотидную последовательность 5'- GGATCC-3'

4.5. Штамм Klebsiellae pneumoniae 378- продуцент ЭР Крп

4.5.1. Идентификация штамма К. pneumoniae 378, определение специфичности

4.5.2. Селекция штамма К. pneumoniae 378 по технологически важным признакам

4.6. Штаммы термофильных бактерий вида Bacillus stearothermophilus - продуценты изошизомеров ЭР BstEII и BsiYI

4.6.1. Штаммы В. stearothermophilus Т-10 и Т-9 - продуценты изошизомера ЭР BstEII

4.6.2. Штамм В. stearothermophilus Т-22 - продуцент изошизомера ЭР BsiYI.

ГЛАВА 5. АНТИМИКРОБНАЯ И ИНСЕКТИЦИДНАЯ АКТИВНОСТИ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS

5.1. Идентификация и биотестирование штаммов В(, выделенных из аэрозолей воздуха и осадков Байкала

5.2. Атипичные штаммы Bt, выделенные из почвы, воды и осадков горячих источников Долины Гейзеров

5.2.1. Идентификация штаммов

5.2.2. Антимикробная активность штаммов

5.2.3. Противовирусная активность штаммов.

5.2.4. Гспотипирование штаммов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала»

Актуальность исследования. Микроорганизмы и продуты их жизнедеятельности являю 1ся наиболее доступными и рентабельными источниками ферментов и многих других биологически активных веществ (БАВ), необходимых для промышленности и научных исследований. Продуцируемые микробными клетками ферменты, такие как липазы, протеазы, амилазы, эидопуклеазы рестрикции, экзонуклеазы, фосфатазы и др., находят широкое применение в биотехнологии. Экстремофильпые микроорганизмы обладают ферментными системами, продуцирующими биологически активные вещества, проявляющие активность в более широком диапазоне температур 11 рП среды по сравнению с мезофильными прототипами, благодаря чему имеют особое значение для биотехнологии (Бонч-Осмоловская, 2004; Бопч-Осмоловская, Мирошниченко и др., 2004; Гальченко, 2005). Экетремофилы являются также цепным источником генов, обеспечивающих возможность создания рекомбинантных супсрпродуцентов с расширенными возможностями (Pecigou et al., 2001: Bell et al., 2002; Robertson, Steer, 2004).

Успешное развитие молекулярной биологии, генной инженерии и их прикладных направлений невозможно без наличия ондопуклеаз рестрикции (ЭР) - энзимологического инструментария, способного специфически фрагментировать и модифицировать нуклеиновые кислоты (Roberts et al., 2002). Большое внимание уделяется поиску новых продуцентов сайт-специфических ЭР, легко культивируемых, высокопродуктивных штаммов, продуцирующих ферменты с новой специфичностью, или же более технологичных продуцентов ЭР известной специфичности.

Микроорганизмы применяются для защиты и очистки окружающей среды от нефтяных и других загрязнителей с использованием аборигенных или привнесенных микроорганизмов-деструкторов (Стабпикова и др., 1995; Коропелли, 1996; Барышникова и др., 2001; Киреева н др., 2004), а также для борьбы с насекомыми-вредителями сельского и лесного хозяйства. Более всего, как основа биопрепаратов инсектицидного назначения, используются штаммы Bacillus thuringiensis (Bt) (Шехурина, 1963; Grimont et al., 1998; Глупов, 2001; Rampersad, Amnions, 2005). Энтомопатогепная активность, а также действующее начало биоипсектицидов на основе Bt обусловлены, преимущественно, присутствием параспоральных включений, состоящих из белков, известных как инсектицидные Cry-белки или дельта-опдотоксины. Эндотоксины отличаются между собой по спектру инсектицидной активности. Различные подвиды Bt обладают избирательным действием не чолько в отношении насекомых, по и микроорганизмов.

Несмотря на известное разнообразие Cry-белков обнаружение новых продуцентов эптомопатогенных токсинов актуально, так как значительное число вредителей не контролируются доступными Cry-белками (Глупов, 2001; Rampersad, Amnions , 2005).

Для обеспечения прикладных и фундаментальных исследований чрезвычайно важным является своевременное сохранение полученных продуцентов и пополнение генофонда коллекций культур новыми охарактеризованными штаммами микроорганизмов, депонирование и гарантированное хранение производственно важных штаммов. По данным 5-го издания Всемирного справочника коллекций культур микроорганизмов (Sugawara et al., 1999) в мире уже насчитывалось около 500 зарегистрированных коллекций различного профиля и содержания. Коллекции являются центрами сохранения и изучения микробного разнообразия, депонирования штаммов, имеющих значение для производства медицинских и ветеринарных препаратов, разработки штаммов, перспективных для биотехнологического применения (Ившнпа, 1994; Родичева и др., 1998; Синеокий, Агранович, 2001).

Из выше сказанного следует, что создание базовой коллекции природных микроорганизмов в качестве основы для разработки новых препаратов БАВ является своевременной и актуальной задачей.

Цель и задачи исслсдопании. Цель настоящей работы состояла в выделении и изучении микроорганизмов из различных природных источников, создании базовой коллекции микробных изолятов для выявления новых продуцентов БАВ, перспективных для разработок биотехнологических препаратов. Задачи исследования:

1. Выделить микробное разнообразие образцов почвы, воды и донных осадков водоемов различных природных территорий, включая экстремальные, создать коллекцию термофильных, мезофильных и психрофильных природных микробных изолятов.

2. Провести скрининг выделенных микроорганизмов на наличие ферментативной и антибиотической активностей.

3. Выявить активные продуценты БАВ, перспективные для биотехнологии, определить их таксономическую принадлежность.

4. Провести селекцию по выделению наиболее активных субкультур продуцентов, оптимизировать условия культивирования.

5. Составить коллекцию штаммов Bacillus thuringiensis, провести оценку их инсектицидной и антибиотической активностей.

Научная новизна работы. Из природных образцов, отобранных из различных экологических ниш, выделено 6938 новых микробных изолятов, представленных мезофильпыми, термофильными и психрофильными бактериями. Обнаружены и идентифицированы новые виды микроорганизмов родов Paenibacillus, Brevibacillus, Roseomonas, не имеющие аналогов в доступных базах данных. В результате скрининга выделенных изолятов на наличие амилолитической, фосфатазпой, эндопуклеазпой и другой ферментативной активности, выявлены высоко продуктивные штаммы, сохраняющих способность к росту и продукции БАВ в широком диапазоне температур и рН среды. Среди бактерий родов Rhizobium, Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Micrococcus и др. обнаружены новые продуценты эндонуклеаз рестрикции (ЭР), имеющие преимущества относительно ранее известных прототипов и их изошизомеров. Выделены новые штаммы, относящиеся к Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, В. thwingiensis ssp. galleria, обладающие высокой активностью относительно ряда патогенных микроорганизмов и комаров Aedes aegypti. Обнаружены атипичные, пеипсектицидные штаммы В. thuringiensis, проявляющие выраженный антагонизм по отношению к патогенным бактериям кишечной группы и Candida albicans, эффективно подавляющие размножение вируса A/(H5N1) на клетках MDCK. Выявленные признаки позволяют считать их подвидами Bl, ранее не представленными в базах данных.

Практическая значимость. Основная часть полученной коллекции представлена микроорганизмами экстремальных условий обитания, что позволяет прогнозировать выделение новых продуцентов БАВ, активных в широком диапазоне рН и температуры культивирования. Исследование и использование генов выделенных микрооргапнзмов-экстремофилов имеет значение для конструирования штаммов с более широкими возможностями применения в биотехнологии. Вновь выделенные изошизомеры ЭР, обладающие рядом преимуществ, в сравнении с ранее известными ферментами-прототипами и их изошизомерами, могут заменить эти ЭР в проводимых генно-инженерных работах. Выделенные из аэрозолей воздуха и осадков Байкала высоко инсектицидные штаммы В. thuringiensis ssp. kurstaki и В. thuringiensis ssp. galleria пригодны в качестве основы энтомопатогенных препаратов токсичных для комаров Aedes aegypti и для разработки антимикробных средств, направленных против ряда патогенных микроорганизмов. Атипичные штаммы В. thuringiensis Долины гейзеров интересны как для фундаментальных исследований в области систематики бацилл, так и для разработки эффективных антимикробных и противовирусных препаратов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены па 28 Всероссийских и Международных конференциях, в том числе: Fourth USA/CIS Joint

Confcrcnce on Environmental Hydrology and Hydrogeology (San Francisco, California, 1999), 23d Biotechnological Symposium for Fuels and Chemicals (Breckenridge, 2001), 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), International Conference «Microbial diversity: current situation, conservation strategy and biotechnological potentialities ICOMID-2005» (Perm-Kazan-Perm, 2005), 9lh International Colloquium in Invertebrate Pathology and Microbial Control, 391'1 Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 811' International Conference on Bacillus thuringiensis (China, 2006), II International conference «Biospheere Origin and Evolution» (Loutraki, 2007), Международной научпо-практичсской конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008), IV Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008) и др.

Публикации- По материалам диссертации опубликованы 26 статей, получено 9 патентов РФ.

Вклад автора. Автору принадлежат постановка задач, выполнение работ по выделению и идентификации природных микроорганизмов, культивированию и селекции продуцентов, определению факторов пагогсппости штаммов, чувствительности к антибиотикам, антагонистической активности. Коллекция штаммов В. thuringiensis (Bt), продуцентов БАВ, штаммов, исследуемых в качестве новых видов, создана, охарактеризована и поддерживается автором лично. Инсектицидная активность штаммов Bt исследована на базе ИСиЭЖ СО РАН совместно с к.б.и. Бурцевой Л.И. и к.б.п. Калмыковой Г.В. Молекулярное типирование (RABD-апализ) штаммов Bt Долины гейзеров выполнен совместно с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребпадзора Мокеевой А.В. и к.б.н. Орешковой С.Ф. Анализ биохимической активности штаммов проведен автором совместно с научным сотрудником «Вектора» Печуркиной II.И., скрининг штаммов на продукцию ферментов - совместно с к.б.н. Пучковой Л.И., к.б.п. Лебедевым Л.Р., Афиногеновой Г.Н. Электронная микроскопия ультратопкнх срезов клеток выполнена сотрудником «Вектора» д.б.н. Рябчиковой Е.И. Анализ пуклеотидных последовательностей 16S рРНК штаммов выполнен д.б.н. Морозовой О.В. и Пилипепко А.С. в Межинститутском Центре секвенировапия ДНК СО РАН (г. Новосибирск). Исследование противовирусной активности препаратов проведены совместно с к.б.н. Мазурковой И.А. на базе отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребпадзора.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах, содержит 38 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трех глав собственных исследований, заключения, выводов, двух приложений и списка использованной литературы, включающего 115 отечественных и 171 зарубежный источник.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Андреева, Ирина Сергеевна

Выводы

1. При исследовании 744 образцов, собранных в различных экологических нишах, выделено 6938 термофильных, мезофильпых и психрофильных микроорганизмов. Получены первичные данные по основным морфологическим и биохимическим признакам изолятов, имеющим значение для их идентификации и дифференцированного подхода к использованию.

2. Обнаружены и идентифицированы новые виды уникальных бактерий: Brevibacillus barguzinii sp. nov., Paenibacillus inaequabilis sp. nov., Paenibacillus formosus sp. nov., Roseomonas baikalica sp. nov. (номера доступа пуклеотидпых последовательностей 16S рРНК в базе данных GenBank EF467658, EU4975637, EU497638 и DQ508813, соответственно).

3. Выявлены высокоактивные штаммы, обладающие жизнеспособностью и ферментативной активностью в широком диапазоне температурных условий и рП среды, перспективные для биотехнологического применения, в том числе:

• 36 термофильных штаммов спорообразующих бактерий Долины гейзеров родов Anoxybacillus, Aneurinibacillus, Calorbacillus, Geobacillus и др., продуцирующих протеазы, высоко активные при диапазоне рН среды от 5,0 до 9,0, включая галотолераптпые бактерии, проявившие высокую активность протеаз при повышенной засоленности срсды;

• 35 термофильных штаммов Долины гейзеров, продуцирующих липазы, отличающихся специфичностью действия по отношению к используемым субстратам, высокоактивные при температуре 60°С, и более 20 психрофильных штаммов Антарктиды с высокой активностью липаз при 4-6°С;

• 47 термофильных и мезофильных бактерий Долины гейзеров, обладающих комплексом тестируемых ферментных активностей (амилазиой, протеазной, липазпой и лецитиназной);

• 280 термофильных и мезофильных штаммов, секрегирующих полисахарид-деградирующие ферменты: бета-глюканазу, 1,4-бета-галактапазу, эпдоцеллюлазу, пуллулапазу и эндоксиланазу в разных сочетаниях, что может позволить использовать их избирательно по отношению к полисахаридсодержащим субстратам;

• 24 психрофильных штамма Антарктиды, отнесенные к родам Pseudomonas, Duganella, Flavobacterium, Janthinobacteriwn, показавшие высокий уровень продукции щелочной фосфатазы при температуре 4-6°С, а также - ряд термофильных бацилл Долины гейзеров, секретирующих щелочные фосфатазы, высокоактивные при 60°С;

• 36 новых продуцентов изошизомеров ЭР: Bell, PstI, MSpR9I, SacII, Clal, SalGI, BspRI, Ball, BstEII, Bgll, BbvII, ScrFI, BsiYI, Hae III, в том числе штаммы-продуценты ЭР, имеющие ряд преимуществ, заключающихся в основном в более высокой продуктивности, иных температурных условиях роста или, в отличие от прототипа, наличием в штамме одной ЭР;

4. Путем направленной селекции выявлены более активные и технологичные субкультуры, подобраны условия культивирования для штаммов-продуцентов ЭР: Rhizobium leguminozarum R-69, продуцента изошизомера ЭР Есо 311; R. trifolii R-63, продуцента изошизомера ЭР SalGI, В. megaterium В-361, продуцента изошизомера ЭР НасШ, К. pneumoniae В-378, продуцирующего изошизомер ЭР SacII и ряда других.

5. Из аэрозолей воздуха и осадков Байкала выделены и охарактеризованы 15 штаммов Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki и 3 штамма В. thuringiensis ssp. galleriae, высокотоксичныс к комарам Aedes aegypti и обладающие выраженной антибиотической активностью к ряду патогенных микроорганизмов кишечной группы и Candida albicans, перспективные для использования в качестве основы инсектицидных и противомикробных препаратов.

6. Обнаружены 18 атипичных штаммов Bt Долины гейзеров, не проявляющих энтомопаго генную активность по отношению к представителям отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, обладающих высокой антимикробной активностью против патогенных микроорганизмов S. thyphimurium, S. aureus, S. sonnei и С. albicans, эффективно подавляющих размножение вируса гриппа птиц A/(H5N1) на клетках MDCK, пригодных для разработки как антимикробных, так и противовирусных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При микробиологическом исследовании 744-х образцов, отобранных из различных природных источников, создана базовая коллекция микроорганизмов, насчитывающая около 7000 мезофильпых, термофильных и пепхрофильных микробных изолятов: 2200 изолятов выделены из образцов воды и осадков Байкала; 1480 - из почвы, воды и осадков источников Долины Гейзеров; 2360 изолятов - из аэрозолей воздуха, 83 - изо льда Антарктиды, 815 изолятов - из проб почвы и образцов воды, взятых на различных территориях Сибири и Алтая, включая нефтезагрязненные. В настоящей работе изложены результаты трех основных направлений исследования: первое - выделение, первичная идентификация и скрининг микроорганизмов на наличие продукции биологически активных веществ (глава 3); второе - идентификация перспективных продуцентов эндонуклеаз рестрикции, определение специфичности ферментов (глава 4); третье -выделение, идентификация, тестирование на антибиотическую и инсектицидную активность штаммов Bacillus thuringiensis (глава 5).

При исследовании свойств изолятов, выделенных из образцов Долины гейзеров, обнаружены микроорганизмы, принадлежащих к родам Streptomyces, Calorbacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Wantersia, Paenibacillus, Thermits, Geobacillus, Bacillus, Pseuclomonas, Micrococcus. В числе спорообразующих бактерий рода Bacillus выявлены относящиеся к видам В. stearothermophilus, В. cereus, В. coagulans, В. circulans, В. thuringiensis. При тестировании микробных изолятов на наличие ферментативной активности у 149 изолятов из 450 исследованных обнаружена протеолитическая активность. Высоко активные протеазы продуцировали в основном бактерии рода Bacillus, около сорока из которых проявили активность протеаз при всех трех использованных значениях рН среды (5,0, 7,0, 9,0). К этой же группе относятся термофильные бактерии родов Anoxybacillus sp. Dg-326 и Gi-621, Aneurinibacillus sp. Dg-4801, Calorbacillus sp. Dg-382t и Dg-383t, Geobacillus sp. Dg-321l и Dg-491 и др. Обнаружены также галотолсрантные штаммы Dg-397, Dg-784, Dg- 637, Dg-324, Dg-542 и ряд др., секретирующне высокоактивные протеазы при повышенной засоленности среды.

Выяснено, что 114 изолятов (Dg-365, Dg-653, Dg-574 и др.) содержали липазы, 35 из них были перспективны в качестве продуцентов, в том числе — термофильный штамм Geobacillus sp. Gi-385t и штамм Anoxybacillus sp. Кш-999. Выявлено 72 бактерии обладающих лецитиназной активностью (Dg-700, Dg-367, Dg-404, Dg-630 и др.). Амилолитические ферменты обнаружены у 151 изолята, наиболее активными были -актииомицеты и бациллы, как термофильные (Dg-6111, Dg-324t и др), так и мезофильиые штаммы (Dg-719, Dg-869, Dg-718 и др). При этом 47 микроорганизмов содержали 4 из тестируемых ферментных активностей (амилазную, протеазную, липазную и лецитиназную). Среди них: изоляты Dg-815 и Dg-404, характеризующиеся обильным ростом и ферментативной активностью при рН среды 5,0, изоляты Dg-630 и Dg-367 - при рП 9,0, изоляты Dg-878, Dg-843, Dg-784 — при повышенной засоленности среды и рН среды от 5,0 до 9,0.

С применением селективной среды, содержащей AZCL-полисахариды, у 280 из 450 исследованных изолятов Долины гейзеров обнаружена способность к секреции полисахарид-деградирующих ферментов. Из них 50 микроорганизмов были активны при рН среды 5,0; 136 - при рН 7,0 и 94 изолята - при рП 9,0. Микроорганизмы отличались по составу и числу выявляемых ферментов. Максимальное количество гидролитических ферментов, выявленное на средах с хромогенпыми полисахаридами — до пяти, обнаружено у 2,5% изолятов от числа исследованных. Наиболее представительной оказалась группа бактерий, продуцирующих три фермента в разных сочетаниях (40,3%). Изоляты, продуцирующие два фермента из тестируемых, составили 17,1%, один фермент - 29,6%, четыре фермента - 10,3%. Показано, что наиболее распространенными ферментами полисахарид-деградирующих микроорганизмов оказались: бета-глюканаза (190 изолятов). 1,4-бета-галактапаза (163 изолята), эндоцеллюлаза (145 изолятов), в меньшем количестве обнаружены штаммы, содержащие нуллуланазу (96 изолятов) и эпдоксилапазу (63 изолята).

Проведен скрининг микроорганизмов коллекции на содержание ферментов обмена нуклеиновых кислот. На наличие ЭР изучено 844 изолята, на экзопуклеазпую активность — 526, на продукцию щелочной фосфатазы — 429. 720 изолятов анализированы па наличие плазмидпых ДНК. Число микроорганизмов, содержащих ЭР П типа составил 4,5 % от числа исследованных. Обнаруженные ЭР являлись изошизомерами SalGI (изоляты Dg-757, Dg-724, Dg-757 и др.), PspEI (изолят Gi-402), PstI (изоляты Gi-988t, К-4371 и др.), MspR9I (изоляты Gi-344, Gi-1080 и др.), Bgll (штамм Paenibacillus sp. Dg-1009), Bsa29I (изоляты Dg-607l и Dg-608t), Ilpall (изоляты Gi-320t, Gi-321t и др.), НаеШ (изоляты К-43It, K-437t и др.). Последние два фермента (Ilpall и НаеШ) широко распространены в микроорганизмах Камчатки.

Выяснено, что около 48,0% от исследованных изолятов Долины гейзеров являются продуцентами щелочной фосфатазы, из которых 2,4 % - высокоактивны, перспективны для биотехнологичсских разработок.

Выделены и идентифицированы 83 микробных психрофильпых и мезофильпых изолята из снега и льда Антарктиды. Доминирующими видами среди культивируемых штаммов оказались грамотрицательные Pseudomonas spp. (35 штаммов) и грамположительные Arthrobacter spp. (14 штаммов). Кроме того, обнаружены эубактерии родов Flavobacterium, Psychrobacter, Aquaspirillum, Polaromonas, семейства Comamonadcicea, Actinobacteridae и др. Проведен скрининг штаммов на ферментативную активность при температуре 4-б°С и наличие плазмидных ДНК. Показано, что все штаммы не имели амилазы, небольшой процент из них обладал протеолитической активностью, у большинства из них обнаружена оксидазная, пероксидазная и каталазиая активности. 8,2% от общего количества штаммов содержали эндонуклеазы рестрикции II-типа. Неспецифичсские экзонуклеазы обнаружены у 16,4% штаммов.

Липазиая активность, детектируемая с применением эфиров жирных кислот при температуре 4-6°С, обнаружена у 31,6 % штаммов, выделенных из образцов льда Антарктиды. Липолитические ферменты штаммов А-45р, А-50р А-52р, А-53р, A-55p, Lv-6, Lv-14, гидролизовали эфиры всех трех жирных кислот (лауриповой, пальмитиновой и олеиновой, соответственно - твип-20, твин-40 или твин-80). По два субстрата утилизировали штаммы А-7р, А-23р, А-32р, А-ЗЗр, А-41 Lv-17 (твин-20 и твип-40); штаммы Lv-9 и Lv-13 (твин-20 и твин-80) и штамм А-5р (твин-40 и твии-80). Только один субстрат гидролизовали липазы штаммов А-1р, А-4р, А-46р, А-56р, А-57р и Lv-5p (твин-80), а также А-12р и А-34р (твин-20). Наиболее выраженной липазной активностью при температуре 4-6°С обладали штаммы Aqiiaspirillum arcticum А-12р, Pseudomonas aurantiaca А-23р, Arthrobacter sp. Lv-21, Flavobacterium frigidarium A-32p, Janthinobacteriwn lividum Lv-6 и Polaromonas vacuolatci Lv-9.

Высокий уровень продукции щелочной фосфатазы при температуре 4-6°С отмечен более, чем для 40% изолятов из Антарктиды. Наибольшую активность фермента проявили мезофнльпые штаммы А-1, А-2 и А-3, отнесенные к Pseudomonas sp., пенхрофпльиые штаммы А-14р и А-26р, определенные как Duganella sp., штамм А-32р (.Flavobacterium frigidarium), штамм А-41р (Janthinobacteriwn sp.), психрофильные псевдомонады А-55р, А-56р, А-57р и ряд других.

Полученные психрофильные штаммы, продуцирующие ЭР, фосфатазы и липолитические ферменты при 4-6°С, а также имеющие плазмидиые ДНК, обеспечивающие устойчивость штаммов к пониженным температурам, могут представлять интерес для биотехнологичеекого применения.

В исследованных образцах аэрозолей воздуха, взятых на разных высотах (от 500 до 7000 м) обнаружены микроорганизмы, относящиеся к широкому спектру родов и видов, таких как Brevibacillus, Kocuria, Brevimdimonas, Deinococcus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Bacillus, Paenibacillus, Acinetobacter, Staphylococcus,

Streptococcus, Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Alternaria, Fusarhun, Cryptococcus, Rhodotorulla и др.

Показано, что в разных пробах от б до 10% бактериальных изолятов, из числа выделенных из аэрозолей, обладают ферментами рестрикции. Среди идентифицированных ЭР в наибольшем количестве выделены продуценты изошизомеров Clal (изоляты Ах-78, Az-252, Az-592, Az-806, Az-956 и др) и Ilaelll (изоляты Ах-158, Ах-161, Az-582 и др.). Выделены также продуценты изошизомеров ЭР PstI (изолят Az-20), Asull (изолят Az-504), Bgll (изолят Az-575), Bst2UI (изолят Ax-252), Kzo91 (изолят Ax-279) и ряд других. Около 50% изолятов от исследованных продуцировали щелочную фосфатазу, 38% из них были высокоактивны. Из числа микробных аэроизолягов, образующих эндоспоры, выявлены спорообразующие бактерии Bacillus thuringiensis, формирующих при споруляции параспоральпые включения.

Микроорганизмы, выделяющиеся из аэрозолей воздуха, заслуживают самого пристального внимания не только для бнотехнологических разработок, но и в плане изучения влияния биогенной компоненты аэрозолей атмосферы на здоровье людей изучаемого региона, гак как от 8 и до 40% микроорганизмов, выделенных из разных проб аэрозолей, обладали признаками патогениостн.

В составе полученной коллекции микробных изолятов обнаружен ряд уникальных микроорганизмов, для которых не найдены аналоги в доступных базах данных. Полученные фепотипические и геномные характеристики ряда ппаммов позволили идентифицировать их как новые виды, ранее пе известные: Paenibacillus inaequabilis sp. nov. (штамм Dg-1009, номер доступа нуклеотидной последовательности 16S рРНК в базе данных GenBank EU497637), Paenibacillus formosus sp. nov. (штаммы К-58 и К-59, помер доступа EU497638), Roseomonas baikalica sp. now. (штамм Che-82, номер доступа DQ508813), Brevibacillus barguzinii sp. now. (штамм LB-56, номер доступа EF467658).

Из числа микроорганизмов созданной коллекции выделены новые штаммы-продуценты ЭР, в том числе, имеющие ряд преимуществ, в сравнении с ранее известными штаммами-прототипами, мезофильные и термофильные продуценты изошизомеров таких ЭР как Bell, SacII, Clal, SalGl, BspRI, Ball, BstEII, Bgll, Bbvll, ScrFI, BsiYI, Пае III. Так, штамм R. leguminozarum 69 продуцирует ЭР, имеющую сайт узнавания идентичный сайту узнавания ЭР ЕсоЗП (Bso31I, Ppal). Для ЭР Ppal и Bso311 данные по продуктивности пе указаны. Согласно полученным результатам штамм R. leguminozarum 69 имеет выход фермента в 3,3 раза больше, чем прототип, штамм Escherichia coli RFL31- продуцент изошизомера ЕсоЗП, что является его преимуществом перед ранее известными продуцентами ЭР данной специфичности.

Штамм R. trifolii R-63 (прототип SalGI) продуцировал ЭР Rtrl, узнающую иуклсотидную последовательность 5Л-СТССАС-3\ Высокая продуктивность нового штамма-продуцента и наличие в нем единственной сайт-специфической эпдонуклеазы обеспечивают преимущества последнего по сравнению с рапсе известными штаммом-прототипом и другими штаммами, продуцирующими изошизомеры ЭР SalGI.

Штамм В. megaterium В-361, продуцирующий ЭР Вте 3611, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5Л-СССС-3\ имеет продуктивность в 510 раз более высокую по сравнению с продуцентами, описанными в литературе. Штамм не патогенен, не требователен к условиям роста.

В результате селекционной работы выделена не вирулентная, не токсичная высокопродуктивная субкультура штамма Klebsiella pneumoniae В-378,, содержащая ЭР Крп 378 I, узнающую и гидролизующую последовательность нуклеотидов S'-CCGCGG^', являющуюся изошизомером ЭР SacII. Технологически важным является то, что в отличие от известных продуцентов SacII, штамм К. pneumoniae 378 содержит только одну ЭР.

Штаммы В. stearothermophilus Т-10, В. stearothermophilus Т-9, выделенные из горячих источников Камчатки, продуцируют ЭР BslTlOl и BstT91, узнающие и расщепляющие нуклеотидную последовательность 5'-GGTNACC-3\ В отличие от известных прототипов штаммы В. stearothermophilus Т-10, В. stearothermophilus Т-9 растут на простых средах, имеют по одной ЭР и в 3-4 раза выше показатели по выходу фермента.

Выделен штамм-продуцеит В. stearothermophilus 22, обладающий термостабильпой ЭР Bst22I, сохраняющей активность при температуре среды до 80°С, с редко встречающейся специфичностью (сайт узнавания 5'-CCNNNNNANNGG-3\ идентичный сайту узнавания ЭР Bsc41, являющейся изошизомером ЭР BsiYI), значительно превышающей продуктивность прототипа.

Из грамотрицательиого, спорообразующего штамма Dg-1009 рода Paenibacillus (в последующих исследованиях определен как новый вид P. inaequabilis sp. nov.) впервые выделена высокоактивная ЭР, узнающая и расщепляющая последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-3\ являющаяся изошизомером фермента Bgll, выделеного из штамма Bacillus globigii. В отличие от ранее известных продуцентов изошизомсров ЭР Bgll {Bacillus species 6-3-1 и Thermus species 8E), содержащих по две эпдонуклеазы разной специфичности, штамм Paenibacillus sp. Dg-1009 содержит только один фермент, хорошо растет на простых питательных средах и не относится к патогенам, является технологически более удобным.

Из образца льда, взятого из зоны мерзлоты выделен психрофильпый штамм Acinetobacter ОК-ЮЗр, продуцент изошизомера ЭР ВашШ, с максимум активности при температуре 6-10°С. В литературных источниках не приводятся данные по продукции ЭР Baml-II при температуре ниже 20°С.

Составлена коллекция из 36 вновь выделенных кристаллосодержащих, спорообразующих штаммов вида Bacillus thuringiensis, обнаруженных в нескольких природных источниках: в аэрозолях воздуха, осадках Байкала, почве и источниках Долины гейзеров (Камчатка). Штаммы отличаются друг от друга по антимикробной и энтомопатогеииой активностям. Инсектицидными подвидами представлены 15 штаммов В. thuringiensis ssp. kurstaki, выделенные из аэрозолей воздуха, и 3 штамма В. thuringiensis ssp. galleria, выдслсные из осадков Байкала. Показано, что штаммы Аг 100-04, Аг 78-04, Аг 78-04, Аг 63-04, Che-159 и ряд других обладают высокой инсектицидной активностью против комаров Aedes aegypti и могут быть рекомендованы для разработки соответствующих эптомопатогепных биопрепаратов. Выраженная антимикробная активность штаммов проявляется, прежде всего, относительно против S. thyphimurium (Аг 2-18, Аг 63-04, Аг 118-17, Аг 5-18) и С. albicans (Аг 63-04, Аг 63-04, Аг 18-15, Аг 0901-40, Ar 100-04 и ряд др.).

Из образцов Долины гейзеров также выделена группа штаммов В. thuringiensis (Dg-1011, Dg-1015, Dg-1018, Dg-1024, Dg-992, Dg-994, Gi-47, Gi-117, Gi-416, Gi-424, Gi-429, Gi-443, Gi-466, Gi-528, Gi-530, Gi-535, Gi-542, Gi-719), образующих крупные параспоральные включения. Штаммы Долины гейзеров систематизировны по белковому составу включений, изучены морфо-физиологические и биохимические свойства штаммов, проведена оценка инсектицидной и антибактериальной активностей.

Выяснено, что штаммы Bt Долины гейзеров, имеют существенные отлнчпя по ряду признаков от ранее известных типовых подвидов Bt. Для штаммов Bt Долины гейзеров характерна низкая или отсутствующая инсектицидная активность относительно тест-насекомых Hyponomeuta evonymellus (Lepidoptera), Aedes aegypti (Diptera), Leptinotarsa decemlineata (Colepotera), капсулироваппые клетки, ослизненные колонии, споры и кристаллы, соединенные в пары после разрушения спорангия. Шесть штаммов, из 18 исследованных, показали отрицательный результат элекгрофоретического анализа па наличие белков в имеющихся крупных параспоральиых включениях. Все это признаки, не свойственные подавляющему большинству ранее известных типичных штаммов Bt.

Водорастворимые метаболиты культуральиой жидкости и растворы белков параспоральиых включений штаммов Bt Долины гейзеров обладали антибиотическим действием относительно патогенных микроорганизмов S. aureus, S. thyphimurium, S. sonnei, С. albicans и ряда других. Тест-штаммы проявили разную восприимчивость к действию метаболитов штаммов Bt. Наибольшую чувствительность к действию водорастворимых метаболитов КЖ штаммов Bt проявил тест-штамм С. albicans. Полученные растворы 5-эндотоксинов штаммов Bt Долины гейзеров не угнетали рост Е. coli, S. aureus, S. thyphimurium, S. sonnei и С. albicans, в то же время в разной степени и в разных сочетаниях проявили антагонистические свойства относительно грамположительных штаммов рода Micrococcus и грамотрицательных фитопатогепов Р. jluorescens, Entcrobacter sp. и X. malvacearum. Штаммы Bt Долины гейзеров перспективны для исследования и применения в качестве антимикробных агентов разной направленности, прежде всего - с целыо подавления возбудителей капдидозов и сальмонеллезов. Два штамма Bt Gi-528 и Gi-530 эффективно подавляли патогенную тест-культуру S. sonnei.

При тестировании на противовирусную активность препаратов на основе водорастворимых метаболитов культуралыюй жидкости и клеточных лизатов штаммов Bt Долины гейзеров выяснено, что все исследуемые препараты были нетоксичны для клеток MDCK н в разной степени подавляли размножение вируса гриппа птиц A/chickeri/Kurgari/05/2005 (A/H5N1) на клетках MDCK. При высокой инфекционпости вируса на клетках (титр в ^ТЦД50/мл составил 8,5) его нейтрализация под влиянием исследованных препаратов составляла от 2 lg до 7 lg, а в ряде вариантов - до 8 lg, что является показателем высокой противовирусной активности исследованных препаратов.

При филогенетическом анализе штаммов с использованием RAPD-днагпостики показано, что на филогенетическом дереве штаммы Долины гейзеров формируют отдельную ветвь, далеко отстоящую от типовых штаммов. Полученные факты показывают существование в экологических нишах Долины гейзеров подвидов 5/, ранее пе охарактеризованных.

Следует отметить, что большая часть коллекции, созданной в процессе выполнения настоящей работы, представлена разнообразием микроорганизмов, выделенных из уникальных мест обитания и обладающих уникальными генетическими ресурсами. Полученная базовая коллекция природных микробных изолятов является цепным генофондом для выполнения фундаментальных и прикладных исследований, потенциальные возможности которой лишь в малой мере представлены в настоящей работе.

Перечень выделенных продуцентов БАВ представлен в Приложении 1. По материалам исследований новых штаммов-продуцентов оформлены статьи, авторские заявки и патенты (Приложение 2).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андреева, Ирина Сергеевна, 2009 год

1. Абызов С.С. Микрофлора ледникового щита Центральной Антарктиды// Автореф. дис. докт. биол. наук.-М., 2001.

2. Абызов С.С. Микробиологические исследования в Антарктиде// Антарктика,- 1989. № 28. -С. 214-216.

3. Абызов С.С., Белякова JI.A. Мицелиальные грибы из толщи ледника центральной Антарктиды// Изв. АН СССР. Сер. биол. 1982. - № 3. - С. 432-435.

4. Абызов С.С., Кузнецов В.Д., Филиппова С.Н. Nocardiopsis antarcdcus новый вид актиномицета из толщи ледника центральной Антарктики// Изв. АН СССР. Сер. биол. -1983,-№4,-С. 559-569.

5. Абызов С.С., Мицкевич И. 11., Поглазова М.Н., Иванов М.В. Микробиологические исследования ледниковой толщи Антарктиды// Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградекого РАН. Юбилейный сборник к 70-летию Института М.: Наука, 2004-Вып. XII,- С. 5-28.

6. Азизбекян P.P., Белых Р.А., Нетыкса Е.М., Погосбекова М.Р. Сравнительная характеристика спорообразующих и аспорогенных штаммов Bacillus thuringiensis II Генетика.- 1978,-Т. 14, № 3.-С. 510-518.

7. Арчегова И. Б. Восстановление земель на Крайнем Севере.-Сыктывкар, 2000,- 152 е.

8. Белавин П.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий // Прикл. биохим. микробиол,-1988.-Т. 23, № 1.- С. 121-124.

9. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах// Прикл. биохим. микробиол.- 2004.- Т.40,- С. 312-3 16

10. Белявская В.А., Ромашева II.Г., Сорокулова И.Б., Ильичева А.А., Нестеров A.M., Колосов А.В., Подкуйко В.В., Михайлов В.В. Разработка технологии получения таблеточной формы препарата субалин // Биотехнология.- 2001.- №2,- С. 64-69.

11. Бопч-Осмоловская Е.А. Изучение термофильных микроорганизмов в Институте микробиологии РАН // Микробиология. 2004. -Т.73, №5. - С. 644-658.

12. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Соколова Т.Г., Слободкип А.И. Термофильные микробные сообщества: новые физиологические группы, новые местообитания //Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградекого PAIL- М.: Наука, 2004. -Вып. XII.-423 с.

13. Боропип A.M., Сахаровский В.Г., Ермакова И.Т., Гречкина Г.М., Старовойтов И.И. Утилизация продуктов детоксикации ипритно-люизитной смеси// Прикл. биохим. микробиол. 1999. - Т. 35, №. 6. - С. 671-678.18.21,22,23,24,25,2627,2829,3031,32,33,34,35.36,37.

14. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сиб. отд. Российской Академии наук, 1999.-252 с.

15. Вятчина О.Ф. Штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola) в Камчатской области // Сиб. экол. журн,- 2004. № 4. — С. 501 -506.

16. Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В. Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе// Мат. рос. науч.-практ. конф., поевящ. 100-летию со дня рождения проф. Е.В. Талалаева, г.Иркугск, I 1-13 марта 2002 г. С. 13-18.

17. Гальчснко В.Ф. Антарктида: микробиология озер / В.Ф. Гальченко; отв. ред. М.В. Иванов. -М.: Наука, 2005.-25 л.

18. Гальченко В.Ф. Сульфатредукция, метанобразоваиие и метанокислспие в различных водоемах Оазиса Бангер Хиллс, Антарктида // Микробиология.-1994.-Т.63 С. 683-698.

19. Гальченко В.Ф., Болыниянов Д.Ю., Черных 11.А. Андерсен В. Бактериальные процессы фотосинтеза и темповой ассимиляции углекислоты в озерах Оазиса Бангер Хиллс, Восточная Антарктида // Микробиология. 1995 - Т.64. - С. 833-844.

20. Гейл Э., Кандлифф Э., Реннодолдс П., Ричмонд М., Уоринг М. Молекулярные основы действия антибиотиков.- М.: Мир, 1975. 485 С.

21. Герхард Ф. и др. /Под ред./ Методы общей бактериологии.- М.: Мир, 1984.-Т.З.- 264 С.

22. Гсрхард Ф. и др. /Под ред./ Методы общей бактериологии М.: Мир3-1983.-Т.1.- 536 С.

23. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение /Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

24. Глупов В.В. /Под ред./ Патогены насекомых: структурные и функциональные аспскты.-М.: Круглый год, 2001.-716 с.

25. Голубева И.В., Килессо В.А., Кисилева Б.С. // «Энтеробактерпи» /Под ред. В. И. Покровского.-М.: Медицина, 1985.- С. 321.

26. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзипа Д.Г., Жилина Т.Н. Активность еульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология. 1999. - Т. 68. - С. 664-670.

27. Градова Н.Б., Горнова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.11. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации иефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. микробиол. 2003.-Т. 39, № 39. С. 318-321.

28. Давранов К.Д. Микробные липазы в биотехнологии // Прикл. биохим. микробиол. — 1994. -Т. 30.-С. 527-534.

29. Дедков В.С, Килева Е.В, Попичспко Д.В., Дегтярев С X. Эндонуклеаза рестрикции Fat I Flavobacterium aqiiatilr NL3 расщепляет ДНК по сайту 5'-j.CATG-37/ Биотехнология.-2002,-№ 5.-С. 3-7.

30. Дужак А.Б., Панфилова З.И., Васюнина Е.А. Выделение и свойства препаратов внеклеточных липаз природного и мутаптного штаммов Serratia inarcescens II Прикл. биохим. микробиол. 2000. - Т. 36. - С. 402-411.

31. Дятлова К.Д. Микробные препараты в растениеводстве// Соросовский образоват. Ж.-2001,-№5,- С. 17-22.39.