Выбор оптимальных методов культивирования и трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека в условиях эксперимента тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.16, кандидат медицинских наук Пулин, Андрей Алексеевич

• Пулин, Андрей Алексеевич
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Пулин, Андрей Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Поверхностные маркеры, характеризующие ММСК костного мозга человека.

1.2. Влияние методов культивирования на фенотип ММСК in vitro и поведение in vivo.

1.3. Кинетика ММСК in vivo после трансплантации, распределение по органам и терапевтический эффект.

1.4. Трансплантация ММСК для лечения сахарного диабета 1 типа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Культивирование клеток и исследование культур in vitro.

2.2. Объекты исследования и распределение мышей по группам.

2.3. Экспериментальное исследование.

2.4. Исследование образцов тканей мышей.

2.5. Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. СОПОСТАВЛЕНИЕ КУЛЬТУР ММСК, ВЫРАЩЕННЫХ В ВЫСОКОЙ И НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ.

3.1. Исследование ютоногенности, жизнеспособности и дифференцировочного потенциала ММСК.

3.2. Зависимость агрегации ММСК в суспензии и выживаемости реципиента после внутривенного введения ММСК от времени культивирования.

3.3. Исследование экспрессии генов.

3.4. Исследование экспрессии поверхностных белков.

3.5. Проточная цитофлуориметрия культур ММСК.

3.6. Исследование динамики экспрессии поверхностных эпитопов культур ММСК.

3.7. Агрегация ММСК, вызванная РНК-интерференцией к PODXL.

ГЛАВА 4. СОПОСТАВЛЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК ПО ОРГАНАМ IN VIVO.

4.1. Подбор оптимальной дозы для введения животным

4.2. Циркуляция клеток в крови после системного введения.

4.3. Распределение клеток по органам через 15 мин после введения.

4.4. Кинетика нпММСК в легких после внутривенного введения.

4.5. Циркуляция и распределение по органам нпММСК, прошедших предварительную обработку, через 15 мин после внутривенного введения.

4.6. Распределение нпММСК по органам у животных с моделями острого и хронического заболеваний.

ГЛАВА 5. ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПРИ ВНУТРИАРТЕРИАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ НПММСК ЖИВОТНЫМ С МОДЕЛЬЮ СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА.

5.1. Модель эксперимента.

5.2. Влияние инфузии нпММСК на уровни глюкозы и инсулина сыворотки крови мышей.

5.3. Исследование образцов тканей поджелудочной железы методом реал-тайм ПЦР.

5.4. Гистоморфологическое исследование тканей поджелудочной железы.

5.5. Гистоморфологическое исследование тканей почек.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выбор оптимальных методов культивирования и трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека в условиях эксперимента»

Актуальность темы

Среди негемопоэтических клеток, используемых для клеточной терапии, наибольшее применение находят мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из костного мозга, или ММСК [45]. В связи с развитием клеточных технологий начато применение ММСК в клинических целях [60, 77, 78, 90, 129, 132]. Однако до настоящего времени многие вопросы, касающиеся получения, культивирования, фенотипирования, распределения и кинетики клеток in vivo, остаются нерешенными. Не разработан универсальный и воспроизводимый протокол культивирования и фенотипирования клеток, не определены единые критерии оценки качества культуры клеток для трансплантации. В научной литературе отсутствуют указания на различия в поведении ММСК in vivo после инфузии их интактным животным и животным с моделями острого и хронического патологического процесса. Одним из основных остается вопрос: при каких патологических процессах применение ММСК оправданно и эффективно?

На данный момент разработано несколько методов культивирования ММСК. По одному из них — культивирование ММСК в высокой плотности (впММСК) считают оптимальным и выгодным способом подготовки клеток к трансплантации. Согласно другому — конфлюэнтные культуры частично коммитированы к дифференцировке или даже старению, поэтому впММСК теряют некоторые свойства, присущие ММСК, выращенным в низкой плотности (нпММСК).

Общепринятым считается метод выделения ММСК из костного мозга путем их агдезии к поверхности лабораторного пластика [52, 122, 127]. Клетки были охарактеризованы главным образом по их способности образовывать колонии в культуре и дифференцироваться в адипоциты, остеобласты и хондроциты. В дальнейшем с целью получения более стандартизованных и точных процедур изоляции и идентификации ММСК стали применять антитела к поверхностным белкам клеток. Первыми были открыты моноклональные антитела (IgM) к белку STRO-1, который экспрессировался конфлюэнтными культурами человеческих ММСК [143]. Антитела к STRO-1 и комбинация их с другими антителами в дальнейшем использовались для определения и выделения ММСК [39, 44, 57, 67, 68, 85, 151, 165]. Затем была выявлена дополнительная серия антител к ММСК [11, 18, 71, 174], причем для фенотипирования ММСК стали использовать антитела, первоначально полученные для других типов клеток [6, 12, 20, 109]. Однако ни одно из этих антител не позволяет выделить культуру клеток, наиболее насыщенную ранними предшественниками и обладающую максимальным терапевтическим эффектом.

В последние годы появились сообщения о том, что нпММСК содержат субпопуляцию быстро само-реплицирующихся клеток [35, 42], проявляющих характерные паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов клеток конфлюэнтных культур [66], имеют гораздо больший потенциал к образованию моноклональных культур [35, 146] и характеризуются лучшей эффективностью при трансплантации [103].

Преимущество использования культур нпММСК для клеточной терапии требует дальнейшего изучения. Важное значение имеет и определение (выбор) наиболее эффективных путей доставки ММСК в органы/ткани-мишени. Имеются сообщения об успешном приживлении клеток при внутривенном или локальном введении в ишемизированные, облученные или другим образом поврежденные органы/ткани [13, 107, 118, 120, 166]. В то же время практически не изучена способность ММСК к миграции из системного кровотока через неповрежденный, неактивированный эндотелий, то есть в условиях, приближенных к тем, которые наблюдаются при большинстве заболеваний, потенциально пригодных для клеточной терапии.

Во всех публикациях, посвященных применению ММСК в клеточной терапии, количественную оценку приживления клеток в тканях и органах осуществляют преимущественно в отдаленные сроки, не раньше чем через несколько суток после трансплантации [50, 113]. Имеются лишь единичные сообщения о качественной оценке распределения меченых клеток в ранние сроки после введения [138]. Количественная оценка распределения клеток не проводится.

Все вышеизложенное указывает не только на актуальность теоретической разработки единых критериев и методов оценки пригодности культуры клеток для трансплантации и создания оптимального модифицированного и воспроизводимого протокола получения культуры ММСК для трансплантации, но и на необходимость изучения кинетики и распределения клеток такой культуры in vivo после введения в организме лабораторных животных, в том числе при наличии острого и хронического патологического процесса.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлась разработка оптимального и воспроизводимого протокола получения клеточного трансплантата на основе ММСК костного мозга человека, критериев экспресс-оценки качества трансплантата, определение возможности и эффективности его использования в эксперименте у животных в норме и при различных патологических состояниях.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуру ММСК с высоким содержанием стволовых/прогениторных клеток.

2. Разработать критерии экспресс-оценки культуры ММСК для трансплантации.

3. Подобрать условия культивирования ММСК, при которых минимизируется риск агрегации клеток в суспензии in vitro и образования тромбоэмболов при трансплантации in vivo.

4. Изучить распределение клеток полученных культур по органам и их кинетику после введения в организм мыши в норме и при патологии.

5. Изучить терапевтическую активность полученных ММСК у мышей на модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

Научная новизна

Работа является первым экспериментальным исследованием, в котором при сравнении существующих протоколов культивирования ММСК выбран оптимальный, направленный на получение максимально возможного количества клеток из одного биоптата костного мозга человека с сохранением качества культуры.

В ходе исследования впервые идентифицированы антитела к поверхностным клеточным маркерам, позволяющим охарактеризовать ранние клетки-предшественники в культурах ММСК человека. Показана возможность быстрой оценки культур на наличие ранних клеток-предшественников путем обнаружения маркерных поверхностных эпитопов РСЮХЬ, интегрина-аб, интегрина-а4, ЬЮРЯ методом проточной цитометрии ММСК после снятия их с пластика трипсином/ЭДТА. Определены качественные и количественные характеристики культуры ММСК на этапах подготовки клеток к трансплантации.

Впервые изучена кинетика и распределение нпММСК в ранние сроки после системного введения мышам — циркуляция в крови и распределение по органам и тканям. Впервые проводится количественная оценка распределениия нпММСК по органам в зависимости от метода введения.

В ходе работы предложены экспериментальные модели острого и хронического заболеваний для оценки распределения и кинетики после трансплантации отобранной культуры нпММСК. На модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета у мышей впервые изучен терапевтический эффект введения нпММСК: показано восстановление структуры островкового аппарата поджелудочной железы и активация ее эндокринной функции, а также репарация структуры гломерулярного аппарата почек.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан метод, позволяющий получить трансплантат на основе ММСК человека с максимальным числом клеток из единственного образца костного мозга. Этот метод позволяет сохранить максимальное количество клеток-предшественников в культуре и одновременно минимизировать риск агрегации ММСК и образования тромбоэмболов в сосудах микроциркуляторного русла после трансплантации. Предложен эффективный подход к оценке качества ММСК, подготовленных для трансплантации, методом проточной цитофлуориметрии. Выявлен кластер поверхностных маркеров ранних клеток-предшественников. При сопоставлении внутривенного и внутриартериального способов введения определен оптимальный метод доставки клеток в пораженный орган/ткань. Показана структурная и функциональная репарация пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы у мышей со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом после внутриартериальной трансплантации культуры нпММСК человека. Установлено, что секреторной активностью обладали и некоторые из мигрировавших в поджелудочную железу нпММСК человека, причем при двойном иммуноцитохимическом окрашивании показана экспрессия этими клетками мышиного инсулина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Культуры ММСК могут быть быстро оценены на наличие ранних клеток-предшественников, клоногенность и способность к дифференцировке, риск агрегации их в суспензии и образования летальных тромбоэмболов методом проточной цитометрии по уровню экспрессии спектра поверхностных маркеров. Наиболее информативными являются РСЮХЬ, интегрин-аб, интегрин-а4, НОРЯ.

2. Особенности кинетики и распределения нпММСК по органам и тканям в ранние сроки после трансплантации зависят как от способа системного введения, так и от наличия и характера патологического процесса.

3. Системное введение нпММСК человека мышам со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом стимулирует репарацию пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы преимущественно за счет паракринных эффектов, при этом частично восстанавливается нормальная структура островков Лангерганса, снижается уровень глюкозы, повышается уровень инсулина крови этих животных. После трансплантации нпММСК человека у животных с сахарным диабетом также наблюдается восстановление структуры и функции гломерул почек.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на:

• 7th Annual Rachmiel Levine Diabetes and Obesity Symposium, Advances in Diabetes Research: From Cell Biology to Cell Therapy (2006r, Long Beach, CA, USA);

• 18th Annual Research Days of Tulane University Health Sciences Center (2007r, New Orleans, LA, USA); th

• American Society of Gene Therapy's 10 Annual Meeting (2007r, Seattle, WA, USA);

• Adult Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine (2007r, Cleveland, OH, USA);

• V конференция молодых ученых России с международным участием (2008г, Москва).

Внедрение полученных результатов

Результаты диссертационного исследования используются для выделения, культивирования и подготовки клеток к трансплантации в лаборатории клеточной биологии и патологии развития ГУ НИИОПП РАМН.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Пулин, Андрей Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. В культурах нпММСК костного мозга человека на ранних пассажах преобладают клетки-предшественники, экспрессирующие поверхностные маркеры: РСЮХЬ, интегрин-аб, интегрин-а4, НЮРЯ, СХСЯ4 и СХЗСШ. Эти культуры по сравнению с культурами впММСК обладают большим клоногенным и дифференцировочным потенциалом, низкой способностью к агрегации в суспензии и к образованию летальных тромбоэмболов в микроциркуляторном русле легких после внутривенной трансплантации животным.

2. Экспресс-оценка качества снятой с пластика культуры ММСК, в том числе обогащенности ее клетками-предшественниками и степени риска тромбоэмболии после трансплантации, может быть проведена по уровню экспрессии поверхностных маркеров: РСЮХЬ, интегрина-аб, интегрина-а4 и НвРЯ - методом проточной цитофлуориметрии.

3. После системной инфузии (внутривенно или внутриартериально) нпММСК человека и использованных в качестве контроля опухолевых клеток, человеческих и крысиных периферических мононуклеаров крови мышам линии ЖЮ/яс/й? количество этих клеток в циркуляторном русле через 15 мин не превышает 9% от исходного. Распределение нпММСК по тканям и органам у здорового животного зависит от метода введения: при внутривенном способе в первые 15 мин 70-90% клеток задерживается в сосудах легких. К 4 сут после трансплантации их количество в легких составляет менее 1%. При внутриартериальном введении распределение нпММСК по органам и тканям происходит равномерно, наибольшее количество обнаруживается в почках, легких, головном мозге, сердце.

4. Предварительное введение системного вазодилататора - нитропруссида натрия, приводит к достоверному увеличению количества циркулирующих нпММСК и уменьшению фракции клеток, задержавшихся в легких мышей, через 15 мин после внутривенной инъекции. После предварительной обработки нпММСК антителами к СБ49Г и СБ49с1 или смешивании их с клетками мононуклеарной фракции крови не происходит достоверного увеличения циркулирующих клеток, и сохраняется тенденция к преимущественной миграции нпММСК в легкие.

5. В первые сутки после внутривенного введения нпММСК человека мышам с острым токсическим поражением селезенки вследствие лекарственной деплеции макрофагов количество нпММСК во всех органах, кроме легких, в десятки раз превышает их количество у здоровых животных, разница исчезает только к 4 сут. Количество нпММСК в легких мышей с вышеупомянутой моделью повреждения в течение всех 4 сут после инъекции не отличается от их количества у здоровых животных.

6. При внутривенном введении нпММСК человека мышам с моделью стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета (патологического процесса хронического течения) распределение этих клеток по органам и тканям в первые 15 мин, на 1, 2, 4 сут не отличается от распределения у здоровых животных, и не наблюдается достоверного изменения уровня глюкозы и инсулина крови.

7. При внутриартериальном введении нпММСК человека мышам с моделью стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета эти клетки определяются в поджелудочной железе и почках через 22 сут. Показано усиление репаративных процессов в островках поджелудочной железы и в гломерулах почек — увеличение количества островков, снижение количества макрофагов в почках по сравнению с контрольными животными с той же моделью сахарного диабета, но без введения нпММСК человека. В крови мышей с сахарным диабетом, получивших инъекции нпММСК, наблюдалось повышение уровня инсулина и снижение уровня глюкозы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Пулин, Андрей Алексеевич, 2008 год

1. Abdi R., Fiorina P., Adra C.N., Atkinson M., Sayegh M.H. 1.munomodulation by mesenchymal stem cells: a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes. //Diabetes.-2008.- V.57-№7.-P.l759-1767.

2. Abounader R., Laterra J. Scatter factor/hepatocyte growth factor in brain tumor growth and angiogenesis. // Neuro-oncol 2005.- V.7.- P.436-451.

3. Akiyama Y., Radtke C., Honmou O., Kocsis J.D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. // Glia 2002.-V.39.-P.229-236.

4. Alon R., Rossiter H., Wang X., Springer T.A., Kupper T.S. Distinct cell surface ligands mediate T lymphocyte attachment and rolling on P and E selectin under physiological flow.// J. Cell Biol.- 1994.-V.127.-№5.-P.1485-1495.

5. Anjos-Afonso F., Bonnet D. Nonhematopoietic/endothelial SSEA-1+ cells define the most primitive progenitors in the adult murine bone marrow mesenchymal compartment. // Blood.- 2007 V.109.- P. 1298-1306.

6. Banerjee M., Kumar A., Bhonde R.R. Reversal of experimental diabetes by multiple bone marrow transplantation. // Biochem. Biophys. Res. Commun — 2005.-V.328 №1— P.318-325.

7. Barry F.P., Boynton R.E., Haynesworth S., Murphy J.M., Zaia J. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD 105). // Biochemical and Biophysical

8. Research Communications.- 1999-V.265.-№1-P.134-139.

9. Barry F.P., Boynton R., Murphy M., Haynesworth S., Zaia J. The SH-3 and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells. //Biochem. Biophys. Res. Commun-2001.-V.289.-P.519-524.

10. Berditchevski F. Complexes of tetraspanins with integrins: more than meets the eye. //J. Cell Sci.- 2001,- V. 114.-P.4143-4151.

11. Beresford N.N., Bennett J.H., Devlin C., Leboy P.S., Owen M.E. Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures. // J. Cell Sci 1992.- V.102 - P.341-351.

12. Brenner W., Aicher A., Eckey T., Massoudi S., Zuhayra M., Koehl U., Heeschen C., Kampen W.U., Zeiher A.M., Dimmeler S., Henze E. 11 lln-labeled

13. CD34+ hematopoietic progenitor cells in a rat myocardial infarction model. // J. Nucl. Med.- 2004.- V.45 P.512-518.

14. Bruder S.P., Horowitz M.C., Mosca J.D., Haynesworth S.E. Monoclonal antibodies reactive with human osteogenic cell surface antigens. // Bone — 1997 — V.21- P.225-235.

15. Buhring H.J., Battula V.L., Treml S., Schewe B., Kanz L., Vogel W. Novel markers for the prospective isolation of human MSC. // Ann. N. Y. Acad. Sci— 2007.-V.l 106.-P.262-271.

16. Butcher E.C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. // Cell.- 1991.- V.67 №6. P.1033-1036.

17. Caplan A. I. Mesenchymal stem cells. // J. Ortho. Res 1991.- V.9.- №5.-P.641-650.

18. Caplan A.I. Osteogenesis imperfecta, rehabilitation medicine, fundamental research and mesenchymal stem cells. // Connect. Tissue Res 1995 - V.31Suppl — P.9-14.

19. Caplan A.I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. // J. Cell. Physiol.- 2007 V.213 - P.341-347.

20. Carter R.A., Wicks I.P. Vascular cell adhesion molecule 1 (CD106): a multifaceted regulator of joint inflammation. // Arthritis Rheum- 2001 V.44 — P.985-994.

21. Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnick G., Kapoor N., Meyers P., Chiarieri D., McKenzie S., Broxmeyer H.E., Moore M.A. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. // Blood-1980.- V.56.-P.289-301.

22. Chen J., Li Y., Wang L., Zhang Z., Lu D., Lu M., Chopp M. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebralischemia in rats. // Stroke.- 2001 V.32.-P.1005-1 Oil.

23. Chen L.B., Jiang X.B., Yang L. Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells. // World J. Gastroenterol — 2004.- V. 10.- №20.- P.3016-3020.

24. Chen X.D., Qian H.Y., Neff L., Satomura K., Horowitz M.C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. // J. Bone Miner. Res 1999 — V.14.-P.362-375.

25. Chopp M., Zhang X.H., Li Y., Wang L., Chen J., Lu D., Lu M., Rosenblum M. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation. // NeuroReport.- 2000.- V.l 1.- №13.- P.3 001-3005.

26. Chute J.P. Stem cell homing. // Curr. Opin. Hematol.- 2006- V.13.-P.399-406.

27. Clark B.R., Keating A. Biology of bone marrow stroma. // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1995 V.770.- P.70-78.

28. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2000,-V.97.-P.3213-3218.

29. Colter D.C., Sekiya I., Prockop D.J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001.- V.98.- P.7841-7845.

30. Corso S., Comoglio P.M., Giordano S. Cancer therapy: can the challenge be MET? // Trends Mol. Med.- 2005.- V. 11.- №6.- P.284-292.

31. Couri C.E.B., Foss M.C., Voltarelli J.C. Secondary prevention of type 1 diabetes mellitus: stopping immune destruction and promoting B-cell regeneration. // Brazilian Journal of Medical and Biological Research.- 2006.- V.39 P.1271-1280.

32. Coyne T.M., Marcus A.J., Woodbury D., Black I.B. Marrow stromal cellstransplanted to the adult brain are rejected by an inflammatory response and transfer donor labels to host neurons and glia. // Stem Cells 2006 - V.24- №11- P.2483-2492.

33. Dennis J.E., Carbillet J.P., Caplan A.I., Charbord P. The STRO-1+ marrow cell population is multipotential. // Cells Tissues Organs.- 2002 V.170 - P.73-82.

34. Deschaseaux F., Charbord P. Human marrow stromal precursors are alpha 1 integrin subunit-positive. // J. Cell Physiol.-2000- V. 184-№3-P.319-325.

35. Devine S.M., Cobbs C., Jennings M., Bartholomew A., Hoffman R. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into non-human primates. // Blood 2003- V. 101.- P.2999-3001.

36. Doerschuk C. M., Allard M.F., Martin B.A., MacKenzie A., Hogg J.C. Marginated pool of neutrophils in lungs of rabbits. // J. AppZ. Physiol- 1987-V.63P. 1806-1815.

37. Doherty M., Boot-Handford R.P., Grant M.E., Canfield A.E. Identification of genes expressed during the osteogenic differentiation of vascular pericytes in vitro. // Biochem. Soc. Trans.- 1998.- V.26.- №1- Suppl 4.

38. Dooner M., Cerny J., Colvin G., Demers D., Pimentel J., Greer D., Abedi M., McAuliffe C., Quesenberry P. Homing and conversion of murine hematopoietic stem cells to lung. // Blood Cells Mol. Dis 2004.- V.32 - P.47-51.

39. Doyle N.A., Hogg J.C., Doerschuk C.M. Contributions of capillary pathway size and neutrophil deformability to neutrophil transit through rabbit lungs. // J. Appl. Physiol.- 1994.- V.77 №1- P.463-470.

40. DuBois R.N., Radhika A., Reddy B.S., Entingh AJ. Increased cyclooxygenase-2 levels in carcinogen-induced rat colonic tumors. // Gastroenterology.- 1996.- V.l 10.- P. 1259-1262.

41. Fraser C.C., Chen B.P., Webb S., Van Rooijen N., Kraal G. Circulation of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient mice after C12MDP-liposome-mediated macrophage depletion. // Blood 1995 - V.86 - P.183-192.

42. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. // Cell Tissue Kinet- 1970.- V.3.- P.393-403.

43. Furness S.G., McNagny K. Beyond mere markers: functions for CD34 family of sialomucins in hematopoiesis. //Immunol. Res-2006 V.34.-P.13-32.

44. Furukawa T., Duguid W.P., Kobari M., Matsuno S., Tsao M.S. Hepatocyte growth factor and c-Met receptor expression in human pancreatic carcinogenesis. // Am. J. Pathol.- 1995.- V.147.-№4.-P.889-895.

45. Gang E.J., Bosnakovski D., Figueiredo C.A. Visser J.W., Perlingeiro R.C. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow. // Blood 2007— V. 109.- №4.- P. 1743-1751.

46. Gao J., Dennis J.E., Muzic R.F., Lundberg M., Caplan A.I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. // Cells Tissues. Organs.- 2001.-V.l69.-P. 12-20.

47. Garcia-Pacheco J.M., Oliver C., Kimatrai M., Blanco F.J., Olivares E.G. Human decidual stromal cells express CD34 and STRO-1 and are related to bone marrow stromal precursors. //Mol. Hum. Reprod-2001 -V.7.-P.l 151-1157.

48. Gebb. S.A., Graham J., Hanger C.C., Godbey P.S., Capen R.L., Doerschuk C.M., Wagner W.W. Sites of leukocyte sequestration in the pulmonary microcirculation. // J. Appl. Physiol.- 1995.- V.79- №2 P.493-497.

49. Giordano A., Galderisi U., Marino I.R. From the laboratory bench to the patient's bedside: an update on clinical trials with mesenchymal stem cells. // J. Cell Physiol.- 2007.- V.211.- P.27-35.

50. Gothot A., van der Loo J.C., Clapp D.W., Srour E.F. Cell cycle-related changes in repopulating capacity of human mobilized peripheral blood CD34(+) cells in non-obese diabetic/severe combined immune- deficient mice. // Blood— 1998 — V.92 — P.2641-2649.

51. Gregory C.A., Gunn W.G., Peister A., Prockop D.J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. // Anal. Biochem.- 2004.- V.329.- P.77-84.

52. Gregory C.A., Singh H., Perry A.S., Prockop D.J. The Wnt signalinginhibitor dickkopf-1 is required for reentry into the cell cycle of human adult stem cells from bone marrow. // J. Biol. Chem.- 2003.- V.278 P.28067-28078.

53. Gregory C.A., Ylostalo J., Prockop D.J. Adult bone marrow stem/progenitor cells (MSCs) are preconditioned by microenvironmental "niches" in culture: a two-stage hypothesis for regulation of MSC fate. // Sci. STKE 2005-V.2005 — №294.- P.pe37.

54. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., Robey P.G., Storms R.W., Gimble J.M. Characterization of surface protein expression on human adipose tissue-derived stromal cells. // Journal of Cellular Physiology.- 2001.- V.189.- P.54-63.

55. Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J., Shi S., Graves S.E., Kortesidis A., Simmons P.J. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. // J. Cell Sci 2003 - V.l 16 - P.1827-1835.

56. Grove J.E., Lutzko C., Priller J., Henegariu O., Theise N.D., Kohn D.B., Krause D.S. Marrow-derived cells as vehicles for delivery of gene therapy to pulmonary epithelium. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.- 2002.- V.27 P.645-651.

57. Hardikar A.A. Generating new pancreas from old. // Trends Endocrinol. Metab.- 2004.- V.l 5.- №5.- P. 198-203.

58. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. // Bone.- 1992.- V.13.-P.69-80.

59. Hess D., Li L., Martin M., Sakano S., Hill D., Strutt B., Thyssen S., Gray D.A., Bhatia M. Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration. // Nat. Biotechnol.- 2003.- V.21.- P.763-770.

60. Hidvegi M., Raso E., Farkas R.T., Lapis K., Szende B. Effect of MSC on the immune response of mice. //Immunopharmacology — 1999 — V.41 P. 183-186.

61. Hogg J.C., Coxson H.O., Brumwell M.L., Beyers N., Doerschuk C.M., MacNee W., Wiggs B.R. Erythrocyte and polymorphonuclear cell transit time and concentration in human pulmonary capillaries. // J. Appl. Physiol 1994 - V.77 — №4.-P. 1795-1800.

62. Hogg J.C., Doerschuk C.M., Wiggs B., Minshall D. Neutrophil retentionduring a single transit through the pulmonary circulation. // J. AppZ. Physiol 1992— V.73 — P.1683-1685.

63. Hogg J.C., McLean T., Martin B.A., Wiggs B. Erythrocyte transit and neutrophil concentration in the dog lung. // J. AppZ. Physiol 1988 - V.65- P.1217-1225.

64. Ianus A., Holz G.G., Theise N.D., Hussain M.A. In vivo derivation of glucosecompetent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion. //J. Clin. Invest.-2003.- V.lll.-№6.-P.843-850.

65. Iihoshi S., Honmou O., Houkin K., Hashi K., Kocsis J.D. A therapeutic window for intravenous administration of autologous bone marrow after cerebral ischemia in adult rats. // Brain Res.- 2004.- V.1007- P. 1-9.

66. Jorgensen C., Djouad F., Apparailly F., Noel D. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. // Gene Therapy.- 2003.- V. 10.- P.928-931.

67. Joyner C.J., Bennett A., Triffitt J.T. Identification and enrichment of human osteoprogenitor cells by using differentiation stage-specific monoclonal antibodies. //Bone.- 1997.-V.21.-№l.-P.l-6.

68. Juarez J., Bendall L., Bradstock K. Chemokines and their receptors as therapeutic targets: the role of the SDF-1/CXCR4 axis. // Curr. Pharm. Des.- 2004.-V.10-P.1245-1259.

69. Koc O.N., Day J., Nieder M., Gerson S.L., Lazarus H.M., Krivit W. Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IH). // Bone Marrow Transplant.- 2002.- V.30.- P.215-222.

70. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. // Arthritis Research & Therapy.- 2007.- V.9.- №1.- P.204.

71. Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 - V.96-№19.- P.10711-10716.

72. Kotton D.N., Ma B.Y., Cardoso W.V., Sanderson E.A., Summer R.S., Williams M.C., Fine A. Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium. // Development.- 2001.- V. 128.- P.5181 -5188.

73. Kucia M., Ratajczak J., Ratajczak M.Z. Bone marrow as a source of circulating CXCR4+ tissue-committed stem cells. // Biol. Cell- 2005 V.97.-P.133-146.

74. Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P.G. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. // J. Bone Miner. Res 1997-V.12.—№9 - P.1335-1347.

75. Larson B.L., Ylostalo J., Prockop D.J. Human multipotent stromal cells (MSCs) undergo sharp transition from division to development in culture. // Stem Cells.- 2007.- V.26 — P. 193-201.

76. Lazarus H.M., Koc O.N., Devine S.M., Curtin P., Maziarz R.T., Holland H.K., Shpall E.J., McCarthy P., Atkinson K., Cooper B.W., Gerson S.L., Laughlin

77. Le Blanc K., Ringden O. Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow transplantation. // Curr. Opin. Immunol.- 2006- V.l8 — P.586-591.

78. Lechner A., Yang Y.G., Blacken R.A., Wang L., Nolan A.L., Habener J.F. No evidence for significant transdifferentiation of bone marrow into pancreatic b-cells in vivo. // Diabetes.- 2004.- V.53 №3.- P.616-623.

79. Lee R.H., Hsu S.C., Munoz J., Jung J.S., Lee N.R., Pochampally R., Prockop D.J. A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially engraft in mice. //Blood-2006.- V.l07.-№5 -P.2153-2161.

80. Lipscomb E.A., Mercurio A.M. Mobilization and activation of a signaling competent alpha6beta4integrin underlies its contribution to carcinoma progression. // Cancer Metastasis Rev 2005 - V.24.- P.413-423.

81. MacDonald I.C., Groom A.C., Chambers A.F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. // Bioessays.- 2002.- V.24.- P.885-893.

82. Mangi A.A., Noiseux N., Kong D., He H., Rezvani M., Ingwall J.S., Dzau V.J. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. // Nat Med.- 2003.- V.9.- №9.- P. 1195-1201.

83. Martin B.A., Wiggs B.R., Lee S., Hogg J.C. Regional differences in neutrophil margination in dog lungs. // J. AppZ. Physiol 1987 - V.63- P. 12521261.

84. Martinez C., Hofmann T.J., Marino R., Dominici M., Horwitz E.M. Human bone marrow mesenchymal stromal cells express the neural ganglioside GD2: a novel surface marker for the identification of MSCs. // Blood 2007 - V.109 — P.4245-4248.

85. McBride C., Gaupp D., Phinney D.G. Quantifying levels of transplanted murine and human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. // Cytotherapy.- 2003.- V.5.- №1.- P.7-18.

86. McCullough B., Peppa D., Monk P.N. A role for CD63 in signal transduction. // Immunology 1996.- V.89.- Suppl. 1- P.OM114.

87. Mets T., Verdonk G. In vitro aging of human bone marrow derived stromal cells. // Mech. Ageing Dev.- 1981.- V.16.- P.81-89.

88. Miyake K., Medina K.L., Hayashi S., Ono S., Hamaoka T., Kincade P.W. Monoclonal antibodies to Pgp-1/CD44 block lympho-hemopoiesis in long-term bone marrow cultures. // J. Exp. Med.- 1990.- V.171.- №2.- P.477-488.

89. Nauta A.J., Fibbe W.E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. // Blood.- 2007.- V.l 10.- №10.- P.3499-3506.

90. Otonkoski T., Cirulli V., Beattie M., Mally M.I., Soto G., Rubin J.S., Hayek A. A role for hepatocyte growth factor/scatter factor in fetal mesenchyme-induced pancreatic beta-cell growth. // Endocrinology- 1996- V.137- №7-P.3131-3139.

91. Owen M., Friedenstein A.J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. // Ciba Found. Symp 1988 - V.136 - P.42-60.

92. Pelchen-Matthews A., Signoret N., Klasse P.J., Fraile-Ramos A., Marsh M. Chemokine receptor trafficking and viral replication. // Immunol. Rev— 1999-V.168 —P.33-49.

93. Piersma A.H., Brockbank K.G., Ploemacher R.E., van Vliet E., Brakel-van Peer K.M., Visser P.J. Characterization of fibroblastic stromal cells from murine bone marrow. // Exp. Hematol.- 1985 V.13.- P.237-243.

94. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science.- 1999 V.284- P. 143147.

95. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. // Science.- 1997.- V.276 P.711-774.

96. Prockop D.J., Olson S.D. Clinical trials with adult stem/progenitor cells for tissue repair: let's not overlook some essential precautions. // Blood- 2007.-V. 109.-P.3147-3151.

97. Qian H., Tryggvason K., Jacobsen S.E., Ekblom M. Contribution of alpha6 integrins to hematopoietic stem and progenitor cell homing to bone marrow and collaboration with alpha4 integrins. // Blood.- 2006.- V.107 P.3503-3510.

98. Rozemuller H., Knaan-Shanzer S., Hagenbeek A., van Bloois L., Storm G., Martens A.C. Enhanced engraftment of human cells in RAG2/gammac doubleknockout mice after treatment with CL2MDP liposomes. // Exp. Hematol 2004-V.32.-P.l 118-1125.

99. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C., de la Fuente R., Cigudosa J.C., Lloyd A.C., Bernad A. Spontaneous human adult stem cell transformation. // Cancer

100. Res.- 2005.- V.65 №8.- P.3035-3039.

101. Ruster B., Gottig S., Ludwig R.J., Bistrian R., Muller S., Seifried E., Gille J., Henschler R. Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells. // Blood 2006 - V. 108.- P.3938-3944.

102. Schadt E.E., Li C., Ellis B., Wong W.H. Feature extraction and normalization algorithms for high-density oligonucleotide gene expression array data. //J.Cell Biochem. Suppl.-2001.- V.37. Suppl.-P. 120-125.

103. Schmieder S., Nagai M., Orlando R.A., Takeda T., Farquhar M.G. Podocalyxin activates RhoA and induces actin reorganization through NHERF1 and Ezrin in MDCK cells. // J. Am. Soc. Nephrol.- 2004.- V.15 P.2289-2298.

104. Schrepfer S, Deuse T., Reichenspurner H., Fischbein M.P., Robbins R.C., Pelletier M.P. Stem cell transplantation: the lung barrier. // Transplant. Proc 2007-V.39 — P.573-576.

105. Shipp M.A., Look A.T. Hematopoietic differentiation antigens that are membrane-associated enzymes: cutting is the key! // Blood- 1993- V.82 №4-P. 1052-1070.

106. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. // Blood- 1991 —1. V.78 P.55-62.

107. Sizemore S., Cicek M., Sizemore N., Ng K.P., Casey G. Podocalyxin increases the aggressive phenotype of breast and prostate cancer cells in vitro through its interaction with ezrin. // Cancer Res.- 2007.- V.67 №13.- P.6183-6191.

108. Smith D.A., Monk P.A., Partridge L.J. Antibodies against human CD63 activate transfected rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells. // Mol. Immunol.-1995.- V.32 — P.1339-1344.

109. Smith J.R., Pochampally R., Perry A., Hsu S.C., Prockop D.J. Isolation of a highly clonogenic and multipotential subtraction of adult stem cells from bone marrow stroma. // Stem Cells 2004.- V.22.- P.823-831.

110. Studeny M., Marini F.C., Champlin R.E., Zompetta C., Fidler I.J., Andreeff M. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-beta delivery into tumors. // Cancer Res 2002 - V.62 — №13.- P.3603-3608.

111. Szilvassy S.J., Meyerrose T.E., Grimes B. Effects of cell cycle activation on the short-term engraftment properties of ex vivo expanded murine hematopoietic cells. // Blood.- 2000.- V.95.- P.2829-2837.

112. Takeda T., Go W.Y., Orlando R.A., Farquhar M.G. Expression of podocalyxin inhibits cell-cell adhesion and modifies junctional properties in Madin-Darby canine kidney cells. // Mol. Biol.Cell.- 2000.- V.l 1.- P.3219-3232.

113. Taneera J., Rosengren A., Renstrom E. Nygren J.M., Serup P., Rorsman P., Jacobsen S.E.W. Failure of transplanted bone marrow cells to adopt a pancreatic b-cell fate. // Diabetes.- 2006.- V.55.-№2.-P.290-296.

114. Tang D.Q., Cao L.Z., Burkhardt B.R., Xia C.Q., Litherland S.A., Atkinson M.A., Yang L.J. In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow. // Diabetes 2004 - V.53 - P. 1721-1732.

115. Tay Y.C., Wang Y., Kairaitis L., Rangan G.K., Zhang C., Harris D.C. Can murine diabetic nephropathy be separated from superimposed acute renal failure? // Kidney Int.- 2005.- V.68.- №1.- P.391-398.

116. Urbich C., Dimmeier S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. I I Circ. Res 2004.- V.95.- P.343-353.

117. Van Rooijen N., Sanders A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. // J. Immunol. Methods.- 1994.- V.174.- P.83-93.

118. Wakitani S., Saito T., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. // Muscle Nerve 1995-V.18 - №12—P. 1417-1426.

119. Wang J.S., Shum-Tim D., Chedrawy E., Chiu R.C. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg- 2001 V.122 - №4.-P.699-705.

120. Wang L, Scabilloni J.F., Antonini J.M., Rojanasakul Y., Castranova V., Mercer R.R. Induction of secondary apoptosis, inflammation, and lung fibrosis after intratracheal instillation of apoptotic cells in rats. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol.

121. Physiol.- 2006.- V.290 P.L695-L702.

122. Wiesmann A., Buhring H.J., Mentrup C., Wiesmann H.P. Decreased CD90 expression in human mesenchymal stem cells by applying mechanical stimulation. // Head & Face Medicine 2006 - V.2.- P.8.

123. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. // J. Neurosci. Res — 2000.- V.61.- №4.- P.364-370.

124. Wu X., Miyake K., Medina K.L., Kincade P.W., Gimble J.M. Recognition of murine integrin beta 1 by a rat anti-stromal cell monoclonal antibody. // Hybridoma.- 1994.- V. 13.- №5.- P.409-416.

125. Yan X., Liu Y., Han Q., Jia M., Liao L., Qi M., Zhao R.C. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1+ mesenchymal stem cell in lung. // Experimental Hematology — 2007.- V.35.— P. 14661475.

126. Yoder M.C., Checkley L.L., Giger U., Hanson W.L., Kirk K.R., Capen R.L., Wagner W.W. Pulmonary microcirculatory kinetics of neutrophils deficient in leukocyte adhesion-promoting glycoproteins. // J. Appl. Physiol — 1990 V.69 - №1. P.207-213.

127. Yoo H.J., Yoon S.S., Park S., Park W.S., Kim D.J., Lee E.B., Song Y.W. Production and characterization of monoclonal antibodies to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow. // Hybridoma (Larchmt.).- 2005.- V.24 — P.92-97.