Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Пермякова, Наталья Владиславовна

• Пермякова, Наталья Владиславовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пермякова, Наталья Владиславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Agrobacterium tumefaciens как вектор для переноса экзогенной ДНК в растительный геном.

1.2 Интеграция векторных последовательностей в геном трансгенных растений.

1.3 Механизмы образования векторных последовательностей: процессинг и перенос Т-ДНК в геном растений.

1.4 Предпочтительные места встраивания Т-ДНК.

1.5 Частота встраивания плазмидных последовательностей в геном трансгенных растений: факторы, влияющие на частоту образования векторных фрагментов.

1.6 Создание специальных конструкций, позволяющих избежать встраивания векторных последовательностей.

1.7 Нежелательные последствия встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1 Исходный материал.

2.2 Выделение геномной ДНК из листьев табака и моркови. табака.

2.4 Полимеразная цепная реакция, проводимая для трансгенного статуса растений и наличия у них векторной ДНК подтверждения

2.5 Схема секвенирования участков растительной ДНК, принадлежащих к краевым повторам Т-ДНК.

2.6 Электрофоретический анализ ДНК.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Анализ частоты встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.

3.2 Особенности встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.

3.3 Анализ наследования векторных фрагментов.

3.4 Влияние различных факторов на частоту встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.)»

В течение последних двух десятилетий в ведущих биотехнологических центрах мира интенсивно развиваются работы по модификации ядерного генома высших растений с применением методов генной инженерии. Спектр практического применения генетически модифицированных (трансгенных) растений достаточно широк: трансгенные растения могут быть использованы в качестве биореакторов для накопления различных метаболитов для практических целей, для улучшения отдельных хозяйственно-ценных признаков, а также, например, для ремидиации почв. Генетически модифицированные растения представляют удобные модели для изучения функционирования перенесенных генов в новом окружении генов растения-реципиента (Castle, Meinke, 1994, Winkler, Feldmann, 1998, Howden et al, 1998, Zhu et al., 2003).

Необходимо подчеркнуть, что чужеродные гены, переносимые в геном растения в виде фрагмента экзогенной ДНК (генетической конструкции), могут быть интегрированы в районы расположения собственных генов растения. Такие инсерции трансгенов не только изменяют функционирование генов в районе встройки, но и одновременно являются маркерами тех генов, функционирование которых было нарушено встройкой. К настоящему времени описано большое число мутаций, индуцированных инсерциями трансгенов (Winkler, Feldmann, 1998, Chiang et al, 1995, Christensen et al, 1997, Gilliland et al, 1998).

Для «доставки» чужеродных генов в ядерный геном растений в настоящее время используются два подхода: векторный перенос с помощью большой мегаплазмиды (Ti-плазмиды) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (преимущественно для двудольных растений) и прямой перенос с помощью генной пушки - для однодольных. При использовании метода агробактериальной трансформации гены, представляющие интерес для исследователя, клонируются между двумя непрямыми краевыми повторами (левым и правым) Т-области большой мегаплазмиды A. tumefaciens. Последовательности вектора, окаймляющие Т-ДНК, представляют собой несовершенные повторы размером 25 п.н. и являются необходимыми элементами в цис положении, играющими важную роль в процессе переноса трансгенов. Именно по районам повторов происходит вырезание генов, заключенных в Т-области мегаплазмиды, которые в дальнейшем и переносятся в ядро растительной клетки.

Долгое время общепринятым оставалось представление, что в ядро растительной клетки переносится только фрагмент ДНК (Т-ДНК), заключенный между правым и левым краевыми повторами (Tinland 1996, Zambryski et al., 1982). Однако, на основании полученных за последние годы данных, стало очевидно, что фрагменты «внешней» (векторной ДНК) также могут быть перенесены и стабильно интегрированы в растительный геном (Ramanathan, Veluthambi 1995, van der Graaff et al., 1996, Wenck et al., 1997, De Buck et al., 2000). Очевидно, что причины такого переноса могут быть связаны с ошибками процессинга Т-ДНК в агробактериальной клетке (Tinland 1996, Castle et al., 1993, Martineae 1994).

Установлено, что на всех стадиях процессинга Т-ДНК могут происходить ошибки, приводящие к вырезанию вместе с Т-ДНК и участков (фрагментов) векторной ДНК (Ramanathan, Veluthambi 1995, van der Graaff et al., 1996, Wenck et al., 1997, De Buck et al., 2000). Описаны случаи неправильного вырезания Т-ДНК фрагмента из плазмиды при недостатке белка VirD2 (Wenck et al., 1997), a также при неправильном определении данным белком границ Т-ДНК области (Yin, Wang, 2000). Установлено, что последовательности внутренних участков Т-ДНК, прилежащие к концевым повторам, также играют важную роль в процессинге. Так, например, удаление районов Т-ДНК, прилежащих к левой или правой границам Т-области и замена их на фрагменты ДНК со случайными последовательностями нуклеотидов приводит к существенному возрастанию числа ошибок узнавания границ Т-ДНК (De Buck et al., 2000).

Фрагменты, образующиеся в результате ошибок процессинга Т-ДНК, различаются по протяженности и включают как всю векторную последовательность, так и отдельные ее участки (van der Graaff et al., 1996, Yin, Wang, 2000, Miranda et al, 1992). В растительный геном такие фрагменты встраиваются совместно с Т-ДНК или независимо от нее (Ramanathan, Veluthambi 1995, De Buck et al., 2000, Kononov et al 1997).

Итак, при агробактериальной трансформации в ядерный геном растений одновременно с трансгенами могут быть перенесены и фрагменты векторной ДНК. Перенос векторных последовательностей, по-видимому, является частью механизма переноса Т-ДНК, что необходимо принимать во внимание при получении трансгенных растений.

Актуальность проблемы.

Технология создания трансгенных растений основана на переносе генов из различных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, животных, человека), поэтому трансгенные растения можно рассматривать как яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, изолирующих геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004). Недостатком метода агробактериальной трансформации, широко применяемой для получения трансгенных растений, являются случайные ошибки при процессинге Т-ДНК, в результате которых в растительный геном могут быть интегрированы фрагменты векторных ДНК (Ramanathan, Veluthambi, 1995, van der Graaff et al, 1996, Wenck et al, 1997, De Buck et al, 2000).

К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о встраивании векторной ДНК, не только в геном двудольных трансгенных растений. При агробактериальной трансформации фрагменты «внешней» (векторной) ДНК обнаруживались и в геноме однодольных растений, а также в геномах грибов и дрожжей (Olhoft et al., 2004, Lange et al., 2006, Kim et al., 2003, Michielse et al., 2004, Bundock et al., 2002).

С коммерческой точки зрения перенос векторных последовательностей в геномную ДНК трансгенных растений представляется крайне нежелательным. Нежелательность встраивания векторных фрагментов, с одной стороны, связана с тем, что они могут изменять стабильность экспрессии целевых генов. Нарушение стабильности экспрессии перенесенных генов в составе таких встроек описана в ряде работ (Iglesias et al., 1997, Jakowitsch et al., 1999). Известно, что прокариотические последовательности, интегрированные в растительный геном, могут быть опознаны как чужеродные и метилированы (Meza et al., 2002). С другой стороны, встраивание в геном растения векторных фрагментов может повышать нестабильность самого района встройки. Установлено, что повторяющиеся участки, или ori репликации, входящие в состав плазмидной ДНК, могут стимулировать перестройки внутри инсерции Т-ДНК (Muller et al., 1999, Linden et al., 1996), что также может приводить к изменению экспрессии перенесенных целевых генов.

Важным моментом в ошибках процессинга Т-области при агробактериальном заражении растений является то, что в растительный геном в составе векторных фрагментов могут быть перенесены гены устойчивости к антибиотикам. В случае использования не бинарных векторов в геноме трансгенных растений могут быть найдены и агробактериальные гены вирулентности. Обнаружение таких фрагментов в геноме трансгенных растений также представляется нежелательным по многим причинам. Присутствие векторных последовательностей затрудняет исследование а прилежащих к Т-ДНК участков растительной ДНК и выявление растительных генов, функция которых была нарушена в результате встройки чужеродной инсерции. С точки зрения биобезопасности трансгенные растения не должны содержать генов устойчивости к антибиотикам и других «посторонних» фрагментов ДНК. В то же время, перенос векторных последовательностей, по-видимому, является частью механизма переноса Т-ДНК, что необходимо принимать во внимание при получении трансгенных растений.

На основе изучения феномена встраивания векторных последовательностей разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, позволяющих избежать встраивания как фрагментов вектора, так и маркерных генов (Sugita et al., 2000, Hanson et al., 1999, Podevin et al., 2006, Vain et al., 2003, Coutu et al., 2007, Kondrak et al., 2006, Conner et al., 2007).

Таким образом, в связи с интенсивным развитием генетической инженерии и биотехнологии растений проблема встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений представляется весьма актуальной. Понимание феномена встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений может внести существенный вклад и в решение фундаментальных задач. В ряде работ авторами выявлены новые детали механизма процессинга Т-ДНК и взаимодействия белков, участвующих в процессинге (Ramanathan Veluthambi, 1995, Wenck et al., 1997, Yin, Wang 2000, De Buck et al., 2000, McCormac et al., 2001, Michielse et al., 2004, Podevin et al., 2006). Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов. Поэтому изучение феномена встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений, исследование механизмов встраивания таких фрагментов, а также изучение спектра факторов, влияющих на частоту встраивания векторных фрагментов у различных видов трансгенных растений, представляется чрезвычайно актуальным.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования являлось изучение частоты и особенностей встраивания векторных последовательностей у трансгенных растений табака {Nicotiana tabacum L.) и моркови {Daucus carota L.). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Провести ПЦР-анализ на присутствие различных участков векторной последовательности мегаплазмиды A.tumefaciens у трансгенных растений табака и моркови.

2. Подтвердить наличие векторных последовательностей в геномных ДНК анализируемых трансгенных растений посредством секвенирования районов ДНК, прилежащих к Т-ДНК-инсерциям.

3. Установить количество копий Т-ДНК в исследуемых трансгенных растениях методом Саузерн блот гибридизации.

4. Установить характер взаиморасположения фрагментов векторной, растительной и Т-ДНК для отдельных растений, несущих несколько-фрагментов векторной ДНК.

5. Проанализировать наследование векторных фрагментов в поколениях трансгенных растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение особенностей встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений табака и моркови, а также на выявление частотных характеристик исследуемого явления у двух видов растений и анализ сохранения фрагментов векторных ДНК среди потомков на примере трансгенных растений табака. Охарактеризована популяция независимо полученных трансформантов табака и моркови по наличию в геноме фрагментов векторных ДНК, установлено долевое соотношение групп растений с различными видами фрагментов. Установлено, что для трансгенных растений табака доля растений, в геноме которых были выявлены фрагменты векторных ДНК, составила 35.2%, а для трансгенных растений моркови - 34.9%. В сумме для трансгенных растений табака и моркови доля растений, в геноме которых выявлялись фрагменты векторных ДНК различной конфигурации, составила 35.1%.

Следует отметить, что отсутствие различий по частоте встраивания векторных фрагментов между различными видами трансгенных растений отмечено в литературе (Wenck et al., 1997). Однако в работе Венк выявлялась значительно более высокая частота встраивания векторной ДНК в геном трансгенных растений табака и арабидопсиса (60% и 62% соответственно).

Более того, даже если рассматривать работы различных групп исследователей на одном виде трансгенных растений (N. ТаЪасит), вариабельность частот встраивания достаточно высокая, от 1,3% (Ramanathan, Veluthambi, 1995) до 75,0% (Kononov et al., 1997). Эти данные свидетельствуют о существовании неизвестных пока факторов влияющих на частоту встраивания векторных фрагментов и безусловно требуют дальнейшего изучения.

Выявлен необычайно широкий спектр вариантов взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений, представленный 20 вариантами. Установлено, что у 6 трансгенных растений (5,2% от общего числа проанализированных растений) в геноме выявлялась вся последовательность вектора. У 13 (11.4%) проанализированных растений обнаруживались векторные фрагменты различной длины, прилежащие к левому краевому повтору Т-ДНК и у 5 (4.4%) - к правому краевому повтору Т-ДНК. Среди общего числа проанализированных растений выявлено 10 (8,8%), в геноме которых обнаруживались два фрагмента векторных ДНК. Выявлено 8 (7%) растений, содержащих в геномной ДНК векторные фрагменты различной длины, интегрированные независимо от Т-ДНК. Среди них присутствуют два растения (одно растения табака и одно растение моркови) несущих не только фрагмент вектора, интегрировавшийся в растительный геном независимо от Т-ДНК, но также и фрагмент вектора прилежащий к левому концевому повтору Т-ДНК. Такие растения были выявлены впервые. Между тем чрезвычайный интерес представляет механизм образования такого сочетания Т-ДНК и векторных фрагментов. В данном случае могло иметь место одновременно неправильное определение концевых повторов, а также и реорганизация (делеция) векторной ДНК в процессе ее транспорта и интеграции в растительный геном. Дальнейшее изучение данных растений представляет несомненный интерес для более детального понимания молекулярно-генетических механизмов встраивания векторной ДНК. Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований по изучению механизмов агробактериального инфицирования растений.

Установлено, что векторные последовательности не только могут быть перенесены в геном потомков первого поколения от самоопыления, но могут рекомбинировать и сегрегировать как обычные гены растений. Хотя ранее предполагалось, что мультимерные комплексы (состоящие из нескольких копий Т-ДНК, перемежающихся векторной и растительной ДНК) мейотически нестабильны, соответственно, в последующих поколениях растений может произойти их эксцизия и потеря трансгена (Srivastava et al., 1996).

Полученные результаты представляют большое значение при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования генетически модифицированных организмов.

Данные, полученные в ходе исследования, используются при чтении, лекций в курсе «Генетическая инженерия растений» в Томском государственном университете.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: в виде устного доклада на международной научной конференций «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004, где доклад был удостоен диплома «За высокопрофессиональный доклад»; на Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 16-23 сентября 2005 г., МЭС ТИБОХ; на школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.; в виде устного доклада на международной конференции «Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии», посвященной 40-летию основания Украинского общества генетиков и селекционеров и 120-летию со дня рождения Н. И. Вавилова, Алушта, 24-27 сентября 2007 года. Материалы диссертационной работы представлялись в устных докладах на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2004, 2007 г.г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи.

Пухначева Н.В., Новоселя Т.В., Зоткевич Е.А., Дейнеко Е.В. Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений // Генетика. 2005. Т. 41. № 9. С. 1203-1209.

Пермякова (Пухначева) Н.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Особенности встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений// Генетика. 2007. Т. 43. № 11. С. 1501-1510.

1 статья находится в печати.

Пермякова Н.В., Шумный В.К., Дейнеко Е.В. Агробактериальная трансформация растений: перенос фрагментов векторной ДНК в растительный геном (принята в печать).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (117 наименований). Работа изложена на 98 страницах, включает 14 рисунков и 8 таблиц в тексте диссертационной работы.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Пермякова, Наталья Владиславовна

ВЫВОДЫ

1. В геномной ДНК 114 независимо полученных методом агробактериального переноса трансгенных растений табака и моркови выявлены фрагменты, соответствующие векторным последовательностям плазмид pBil21 и pBilOl. Частота данного события для двух видов растений составила 35.1%

2. Доля растений, несущих в геноме фрагменты векторных ДНК, существенно не различалась между двумя анализируемыми видами и составила 35.2% для растений табака и 34.9% - для растений моркови (у которой эта частота оценена впервые).

3. Выявлен широкий спектр, взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений табака и моркови представленный 20 вариантами. Впервые установлено, что векторные фрагменты могут быть интегрированы в геном одного и того же трансгенного растения как сцеплено с Т-ДНК, так и независимо от нее.

4. На основании данных о составе нуклеотидов районов растительной ДНК, фланкирующих Т-ДНК-встройки, подтверждено их соответствие векторным последовательностям.

5. Доказано, что чужеродные векторные последовательности стабильно наследуются в первом поколении от самоопыления исходных трансгенных растений и способны сегрегировать и рекомбинировать, как обычные генетические маркеры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие новых технологий, позволяющих модифицировать геномы растений посредством переноса новых генов различного гетерологического происхождения с одной стороны существенно расширило возможности формообразовательного процесса и создания нового исходного материала для практических целей. Однако, с другой стороны, исследователи поставили перед собой ряд вопросов, связанных с оценкой «биобезопасности» разработанных технологий.

Создание трансгенных растений основано на технологиях переноса и интеграции в геном растения фрагментов экзогенной ДНК. Попадание инсерций Т-ДНК в функционально-значимые районы растительного генома может приводить к нарушению проявления генов, локализованных в данной области. Фенотипически это выражается в нарушении каких-либо признаков у растений. В терминах классической генетики подобные нарушения относятся к инсерционным мутациям. Потенциальным источником мутационных изменений собственных генов растения могут выступать как гетерологичные гены, так и фрагменты векторной ДНК. На основании представленных в диссертационной работе результатов показано, что в случайной выборке независимо полученных трансгенных растений табака и моркови обнаруживаются фрагменты векторных ДНК. Согласно нашим данным частота этого феномена была довольно высока и составила 35,1%. Полученные данные свидетельствуют о том, что при создании трансгеннных растений методом агробактериального переноса в каждом третьем случае в геном трансформанта переносится и встраивается не только Т-ДНК, но и фрагменты плазмидной ДНК. Такие фрагменты могут представлять собой дополнительный источник инсерций и потенциально приводить к мутационным изменениям.

Встраивание векторных фрагментов было подтверждено при помощи секвенирования. Гомология последовательностей ДНК, прилежащих к левому концевому повтору Т-ДНК, встроившейся в трансгенные растения табака и моркови, с последовательностью вектора, используемого для трансформации, составила 99%.

Переносимые фрагменты имеют высокую вариабельность, они могут быть различной длины и представляют собой различные участки плазмидной ДНК. Все выявленные нами фрагменты можно разделить на 2 типа - фрагменты, прилежащие к той или иной границе Т-ДНК и фрагменты, встроившиеся независимо от Т-ДНК. Также нами впервые выявлены два растения несущих фрагменты векторной ДНК промежуточного типа - один фрагмент, прилежащий к левой границе Т-ДНК и еще один фрагмент, встроившийся независимо от Т-ДНК.

Частота, с которой фрагменты векторной ДНК выявляются в геноме трансгенных растений, непосредственно связана с частотой ошибок процессинга Т-ДНК, происходящего в клетке агробактерии. В основе механизма образования большей части векторных фрагментов, по-видимому, лежат ошибки определения левого концевого повтора Т-ДНК, происходящие при репликации Т-ДНК в клетке агробактерии. В результате таких ошибок образуются протяженные фрагменты ДНК, содержащие кроме Т-ДНК еще и участок векторной последовательности прилежащий к левому концевому повтору Т-ДНК. В пользу этого предположения свидетельствует то, что из всех 40 (35.1%) обнаруженных нами растений, несущих векторные фрагменты, 23 (20.2%) несли векторные фрагменты, прилежащие к левому концевому повтору и только 13 (11.4%) несли векторные фрагменты, прилежащие к правому концевому повтору. Наши данные вполне согласуются с данными литературы, о том, что правая граница Т-ДНК чаще определяется правильно, чем левая, и что осуществление точного надреза в области правого концевого повтора является важным этапом процессинга Т-ДНК (Tinland 1996, Meza et al., 2002, Podevin et al., 2006). Фрагменты вектора прилежащие к правому концевому повтору образуются, скорее всего, по другому механизму, в основе которого лежит неправильное определение правого концевого повтора. Левый концевой повтор неправильно опознается как правый, и синтез новой цепи «Т-ДНК» начинается именно с него. Этот же механизм, скорее всего, ответственен за выявляемые нами случаи встраивания векторных фрагментов независимых от Т-ДНК. Большой интерес представляет механизм образования фрагментов векторной ДНК встроившихся в геном одного и того же трансгенного растения как вместе с Т-ДНК, так и независимо от нее. В данном случае, возможно справедливы обе гипотезы касающиеся механизма образования векторных фрагментов - имело место как неправильное определение левого концевого повтора (как правого), так и проскакивание левого концевого повтора. Также вполне вероятно, что в данном случае, в процессе транспортировки и интеграции Т-ДНК и сопутствующих векторных фрагментов в растительный геном, произошла реорганизация (делеция) векторной ДНК.

Показано, что фрагменты векторной ДНК, перенесенные в геном трансгенных растений вместе или независимо от Т-ДНК, стабильно наследуются в первом поколении от самоопыления исходных трансгенных растений. Встроившись в растительный геном, они ведут себя к традиционные генетические маркеры - свободно сегрегируют и рекомбинируют.

Феномен встраивания плазмидной ДНК в геном трансгенных растений привлекает внимание исследователей в связи с тем, что встраивание векторных фрагментов влечет за собой массу негативных последствий. Содержащиеся в плазмидной ДНК повторы, палиндромы, А-Т-богатые участки, ori репликации, содержащиеся в векторной ДНК, способны провоцировать перестройки трансгена (Muller et al., 1999, Linden et al., 1996). Множественные повторы, C-G богатые прокариотические участки могут метилироваться и вызывать метилирование трансгена, нарушая тем самым его экспрессию (Meza et al, 2002, Matzke et al, 1996, Iglesias et al, 1997, Jakowitsch et al, 1999). Мультимеризованные комплексы, то есть комплексы, состоящие из нескольких копий Т-ДНК разделенных фрагментами векторной и растительной ДНК, мейотически нестабильны, что может привести к эксцизии трансгена (Srivastava et al, 1996). Прилежащие к Т-ДНК векторные фрагменты затрудняют исследование участков растительной ДНК, окружающих трансген. Крайне нежелательным представляется встраивание в геном трансгенных растений плазмидных генов, находящихся за границами Т-ДНК, даже несмотря на то, что эти гены не содержат растительных регуляторных элементов (промоторов, терминаторов, энхансеров). Согласно данным литературы вполне вероятно встраивание векторной ДНК под растительный промотор с последующей экспрессией плазмидного гена (Takano et al., 1997, Iglesias et al., 1999, Speulman et al, 1999, Sha et al., 2004).

Необходимо отметить, на сегодняшний день разработан широкий спектр методов, применяя которые можно либо вовсе избежать встраивания векторных фрагментов, либо элиминировать их в процессе получения трансгенных растений. Для того чтобы облегчить идентификацию растений несущих векторную ДНК, можно встроить позитивный маркер за пределами Т-ДНК. чтобы растения элиминировались на этапе селективного отбора в плазмидную ДНК можно встроить негативный маркер (Kononov et al, 1997, Hanson et al., 1999, Kuraya et al, 2004). Найдены способы, позволяющие существенно повысить частоту правильного узнавания концевых повторов Т-ДНК (Kuraya et al, 2004, Podevin et al., 2006). Также на сегодняшний день разработан ряд векторов у которых минимизирована плазмидная ДНК, практически до полного ее отсутствия. Для удаления векторной ДНК и маркерных генов широко используются в векторах природные системы сайт-специфической рекомбинации (Cornielle et al., 2001, Hare, Chua, 2002, Kondrak et al., 2006). Активно разрабатывается класс принципиально новых векторов для трансформации растений - интрагенных, которые содержат только ДНК растительного происхождения (Rommens et al, 2004, Conner et al, 2007). Несомненно одно, все имеющиеся методы безусловно требуют дополнительной работы еще на стадии создания трансгенной конструкции, они удорожают и удлиняют процесс получения трансгенных растений и в большинстве случаев требуют дополнительной проверки на наличие векторной ДНК у трансгенного растения. В то же время наша работа показывает, что даже простой ПЦР анализ, направленный на выявление только фрагментов векторной ДНК прилежащих к левому краевому повтору Т-ДНК, уже позволит выявить более 50% трансгенных растений несущих векторные последовательности.

Молекулярно-генетические механизмы, приводящие к переносу векторных фрагментов в геном трансгенных растений, все еще до конца не выяснены. Данный феномен привлекает внимание исследователей в связи с возможными негативными последствиями, которые приносят с собой плазмидные последовательности. Выявленные в ходе выполнения данной работы особенности встраивания векторных фрагментов у трансгенных растений табака и моркови представляют интерес для дальнейшего изучения причин и механизмов данного явления у трансгенных растений.

84

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пермякова, Наталья Владиславовна, 2008 год

1. Дрейпер Дж., Скотт Р. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. С. 277-303.

2. Пермякова Н.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Особенности встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений. Генетика 2007, том 43, №11, с. 1501-1510.

3. Пухначева Н.В., Новоселя Т.В., Зоткевич Е.А., Дейнеко Е.В. Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений. Генетика 2005, том 41, №9, с. 985-990.

4. Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко M.JI. и др. Получение трансгенных растений табака продуцентов интерлейкина-18 человека // ДАН. 2004. Т. 395. № 5. С. 1-4.

5. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов.: Слово, 2001. 256 с.

6. Abdal-Aziz S.A., Pliego-Alfaro F., Quesada M.A., Mercado J.A. Evidence of frequent integration of non-T-DNA vector backbone sequences in transgenic strawberry plant//J. Bioscience Bioengineering. 2006. V. 101. № 6. P. 508-510.

7. Abuodeh R.O., Orbach M.J., Mandel M.A., Das A., Galgiani J.N. Genetic transformation of Coccidioides immitis facilitated by Agrobacterium tumefaciens. // J. Infect. Dis. 2000. V. 181. P. 2106-2110.

8. Barakat A., Gallois P., Raynal M., Mestre-Ortega D., Sallaud C., Guiderdoni E., Delseny M., Bernardi G. The distribution of T-DNA in the genomes of transgenic Arabidopsis and rice // FEBS Letters. 2000. V. 41. P. 161-164.

9. Barton K.A., Binns A.N., Matzke A.J., Chilton M.D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length engineered T-DNA and transmission of T-DNA toRl progeny//Cell. 1983. V. 32. P. 1033-1043.

10. Bermetzen J.L. The contribution of retroelements to plant genome organization, function and evolution // Trends Microbiol. 1996. V. 4. P. 347 353.

11. Bundock P., van Attikum H., den Dulk-Ras A., Hooykaas P.J.J. Insertional mutagenesis in yeasts using T-DNA from Agrobacterium tumefaciens II Yeast. 2002. V. 19 №6. P. 529-536.

12. Castle L.A., Errampalli D., Atherton T.L., Franzmann L.H., Yoon E.S., Meinke D.W. Genetic and molecular characterization of embryonic mutant identified following seed transformation in Arabidopsis // Mol Gen Genet. 1993. V. 241. P. 504-514.

13. Castle L.A. Meinke D.W. A FUSCA gene of Arabidopsis encodes a novel protein essential for plant development // The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 25-41.

14. Chiang H.H., Hwang I., Goodman H.M. Isolation of the Arabidopsis GA4 locus // The Plant Cell. 1995. V. 7. № 2. P. 195-201.

15. Chilton M.D., Drummond M.H., Merio D.J. Sciaky D., Montoya A.L., Gordon M.P., Nester E.W. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorgenesis // Cell. 1977. V. 11. P. 263-271.

16. Christensen C.A., King E.J., Jordan J.R., Drews G.N. Megagametogenesis in Arabidopsis wild type and the Gf mutant // Sex. Plant Reprod. 1997. V. 10. P. 4964.

17. Cluster P.D., O'Dell M., Metzlaff M., Flavell R.B. Details of T-DNA structural organization from a transgenic petunia population exhibiting co-supression //Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 1197-1203.

18. Conner A.J., Barrell P.J., Baldwin S.J., Lokerse A.S., Cooper P.A., Erasmuson A.K., Nap J.-P., Jacobs J.M.E. Intragenic vectors for gene transfer without foreign DNA // Euphytica. 2007. V. 154. P. 341-353.

19. Corneille S., Lutz K., Svab Z., Maliga P. Efficient elimination of selectable marker genes from the plastid genome by the CRE-lox-site-specific recombination system // Plant J. 2001. V. 27. P. 171-178.

20. Coutu C., Brandle J., Brown D., Brown K., Miki В., Simmonds J., Hegedus D.D. pORE: a modular binary vector series suited for both monocot and dicot plant transformation // Transgenic Res. 2007. V. 16. № 6. P. 771-781.

21. De Buck S., De Wilde C., Van Montagu M., Depicker A. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium — mediated transformation // Molecular Breeding. 2000. V. 6. P. 459-468.

22. Endo S., Kasahara Т., Sugita K. The isopentenyl transferase gene is effective as a selectable marker gene for plant transformation in tobacco (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SRI) // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 60-66.

23. Fang J., Zhai W.X., Wang W.M., Li S.W., Zhu L.H. Amplification andanalysis of T-DNA flanking sequences in transgenic rice // Yi Chuan Xue Bao. 2001. V. 28. No 4. P. 345-351.

24. Fladung M. Gene stability in transgenic aspen (Populus). I. Flanking DNA sequences and T-DNA structure // Mol Gen Genet. 1999. V. 260. P. 574-581.

25. Forsbach A., Schubert D., Lechtenberg В., Gils M., Schmidt R. A comprehensive characterization of single-copy T-DNA insertions in the Arabidopsis thaliana genome // Plant Molecular Biology 2003. V. 52. P. 161-176.

26. Frary A., Hamilton C.M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato // Transgenic Res. 2001. V. 10. № 2. P. 121-132.

27. Gelvin B. Agrobacterium mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-Jockeying" tool // Microbiology and Molecular biology reviews. 2003. V. 67. № l.P. 16-37.

28. Gheysen G., Villarroel R., Van Montagu M. Illegitimate recombination in plants: a model for T-DNA integration // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 287-297.

29. Gilliland L.U., Pawloski L.C., Kandasamy M.K., Meaghe R.B. Arabidopsis actin gene ACT7 plays an essential role in germination and root growth // The Plant Journal. 2003. V. 33. P. 319-328.

30. Hamilton С. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular weight DNA // Gene. 1997. V. 200. P. 107-116.

31. Hanson В., Engler D., Moy Y., Newman В., Ralston E., Gutterson N. A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences // Plant J. 1999. V. 9. P. 727-734.

32. Hare P.D., Chua N.-H. Excision of selectable marker genes from transgenic plants // Nat Biotechnol. 2002. V. 20. P. 113- 122.

33. Hellens R., Mullineaux P., Klee H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends in Plant Science. 2000. V. 5. №. 10. P. 446-451.

34. Hellens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R., Bean S., Mullineaux P.M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediatQd plant transformation // Plant Mol. Bio. 2000b. V. 42. P. 819-832.

35. Hoekma A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. A binary vector strategy based on separation of the vir and T-region of the Agrobacterium tnmefaciens Ti plasmid // Nature. 1983. V. 303. P. 179-180.

36. Hood E.E., Helmer G.L., Fraley R.T., Chilton M.-D. The hypervirulence of Agrobacterium tnmefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA//J Bacterid. 1986. V. 168.P. 1291-1301.

37. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 208-218.

38. Horsch R.B., Klee H.J., Rapid assay of foreign gene expression in leaf discs transformed by Agrobacterium tumefaciens: role of T-DNA borders in the transfer process // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83. P. 4428-4432.

39. Howden R., Park S.K., Moore J.M., Orme J., Grossniklaus U., Twell D. Selection of T-DNA-Tagged Male and Female Gametophytic Mutants by Segregation Distortion in Arabidopsis // Genetics. 1998. V. 149. P. 621-631.

40. Iglesias V.A., Moscone E.A., Papp I., Neuhuber F., Michalowsky S., Phelan Т., Spiker S., Matzke M., Matzke A.J.M. Molecular and Cytogenetic Analyses of Stably and Unstably Expressed Transgene Loci in Tobacco // The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1251-1264.

41. Kim S.-R., Lee J., Jun S.-H., Park S., Kang H.-Gyu Kwon S., An G. Transgene structures in T-DNA-inserted rice plants // Plant Molecular Biology. 2003. V. 52. P. 761-773.

42. Kononov E., Bassuner В., Gelvin S.B. Integration of T-DNA binary vector 'backbone' sequences into the tobacco genome: evidence for multiple complex patterns of integration // The plant Journal. 1997. V. 11. № 5. P. 945-957.

43. Koncz C., Schell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector//Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

44. Krizkova L., Hrouda M. Direct repeats of T-DNA integrated in tobacco chromosome: characterization of junction regions // Plant J. 1998. V. 16. P. 673680.

45. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. T-DNA as an Insertional Mutagen in Arabidopsis // The Plant Cell. 1999. V. 11. № 12. P. 2283-2290.

46. Kunik Т., Tzfira Т., Kapulnik Y., Пфатш Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 1871-1876.

47. Lange M., Vincze E., M0ller M.G., Holm P.B., Molecular analysis of transgene and vector backbone integration into the barley genome following Agrobacterium-mediated transformation //Plant Cell Rep. 2006. V. 25. P. 815-820.

48. Laufs P., Autran D., Traas J. A chromosomal paracentric inversion associated with T-DNA integration in Arabidopsis II The Plant Journal. 1999. V. 18. №2. P. 131-139.

49. Lazo, G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. A DNA transformation competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium I I Biotechnology. 1991. V. 9. P. 963 -967.

50. Levee V., Garin E., Klimaszewska K., Seguin A. Stable genetic transformation of white pine {Pinus strobus L.) after cocultivation of embryogenic tisues with Agrobacterium tumefaciens II Mol. Breeding. 1999. V. 5. P. 429-440.

51. Linden R.M., Winocour E., Berns K.I. The recombination signals for adeno-associated virus site-specific integration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 7966-7972.

52. Martineau В., Voelker T.A., Sanders R.A. On defining T-DNA // The Plant Cell. 1994. №8. P. 1032-1033.

53. Matzke A.J.M., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes // Curr. Opp. In Plant Biology. 1998. V. 1. P. 142-148.

54. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Eggleston W.B. Paramutation and transgene silencing: A common response to invasive DNA? // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 382-388.

55. McBride K.E., Summerfelt K.R. Improved binary vectors for Agrobacterium -mediated plant transformation // Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 269-276.

56. McCormac A.C., Fowel M.R., Chen D.- F., Elliot M.C. Efficient со -transformation of Nicotiana tabacum by two independent T DNAs, the effect of T -DNA size and implications for genetic separation // Transgenic Research. 2001. № 10. P. 143-155.

57. Miki В., McHugh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety // Journal of Biotechnology. 2004. V. 107. P. 193-232.

58. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G., Ream, W.J. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism // Bactreiol. 1992. V. 174. P. 2288 2297.

59. Muller A.E., Kamisugi Y., Gruneberg R., Neidenhof I., Horold R.J., Meyer P. Palindromic sequences and A+T-reach DNA elements promote illegitimate recombination in Nicotiama tabacum II J. Mol. Biol. 1999. V. 291. P. 29-46.

60. Ochman H., Ajioka J.W., Garza D., HartI D.L. PCR technology: principles and applications for DNA amplification // Biotechnology. 1990. V. 8. P. 759-760.

61. Olhoft P.M., Flagel L.E., Somers D.A. T-DNA locus structure in a large population of soybean plants transformed using the Agrobacterium -mediated cotyledonary-node method // Plant Biotechnology Journal. 2004. V. 2. P. 289-300.

62. Ooms G., Bakker A., Molendijk L., Wullems G.J., Gordon M.P., Nester E.W., Schllperoort R.A. T-DNA organization in homogeneous and heterogeneous octopine-type crown gall tissues of Nicotiana tabacum // Cell. 1982. V. 30. P. 589597.

63. Pan X., Li Y., Stein L. Site Preferences of insertional mutagenesis agents in Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 137. P. 168 175.

64. Perez-Hernandez J.B., Swennen R., Sagi L. Number and accuracy of T-DNA insertions in transgenic banana (Musa spp.) plants characterized by an improved anchored PCR technique // Transgenic Research. 2006. V. 15. P. 139— 150.

65. Piers K.L., Heath J.D., Liang X., Stephens K.M., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 1613-1618.

66. Podevin N., De Buck S., De Wilde C., Depicker A. Insights into recognition of the T-DNA border repeats as termination sites for T-strand synthesis by Agrobacterium tumefaciens //Transgenic Res. 2006. № 15. P. 557-571.

67. Porsch P., Jahnke A., During K. A plant transformation vector with a minimal T DNA II. Irregular integration patterns of the T - DNA in the plant genome // Plant Molecular Biology. 1998. V. 37 P. 581 - 585.

68. Ramanathan V., Veluthambi K. Transfer of non T - DNA portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the left terminus of Tl - DNA // Plant Molecular Biology. 1995. V. 28. P. 1149 - 1154.

69. Ream W. Modern microbial genetics. 2nd ed. Edited by Streips U.N., Yasbin R.E. Wiley Liss Inc. 2002. P. 672.

70. Rogers S.O. Bendish A.J. In Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic publishers. 1988. P. 1-10.

71. Rommens C.M., Humara J.M., Ye J.S., Yan H., Richael C., Zhang L., Perry R., Swords K. Crop improvement through modification of the plant's own DNA // Plant Physiol. 2004. V. 35. P. 421-431.

72. Sha Y., Li S., Pei Z., Luo L., Tian Y., He C. Generation and flanking sequence analysis of a rice T-DNA tagged population // Theor Appl Genet. 2004. V. 108. P. 306-314.

73. Speulman E., Metz P.L.J., van Arkel G., Hekkert B.L., Stiekema W.J., Pereira A. A Two Component Enhancer - Inhibitor Transposon Mutagenesis System for Functional Analysis of the Arabidopsis Genome // The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1853-1866.

74. Srivastava V., Vasil V., Vasil I.K. Molecular characterization of the fate of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.) // Theor Appl Genet. 1996. V. 92. P. 1031-1037.

75. Stougaard J. Substrate-dependent negative selection in plants using a bacterial cytosine deaminase gene // Plant. J. 1993. V. 3. P. 755-761.

76. Sugita K., Kasahara Т., Matsunaga E., Ebinuma H. A transformation vector for the production of markerfree transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency // Plant J. 2000. V. 22. P. 461-469.

77. Sviatashev S.K., Pawlowski W.P., Makarevitch I., Plank D.W., Somers D. Complex transgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. The Plant Journal (2002), 32, pp. 433-445.

78. Takano M., Egawa H., Ikeda Joh-E, Wakasa K. The structures of integration sites in transgenic rice // The Plant Journal. 1997. V.l 1. № 3. P. 381-361.

79. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends in Plant Science. 1996. V. 1. № 6. P. 178-183.

80. Того N., Datta A., Carmi O.A., Young C., Prusti R.K., Nester E.W. The Agrobacterium tumefaciens virCl gene product binds to overdrive, a T-DNA transfer enhancer//J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 6845-6849.

81. Того N., Datta A., Yanofsky M., Nester E. Role of the overdrive sequence in T-DNA border cleavage in Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 8558-8562.

82. Tzfira Т., Li J., Lacroix В., Citovsky V. Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models // Trends in Genetics. 2004. V. 20. № 8. P. 375-383.

83. Waters V.L., Guiney D.G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication // Mol Microbiol. 1993. V. 9. P. 11231130.

84. Wenck A.R., Czako M., Kanevski I., Marton L. Frequent collinear long transfer of DNA inclusive of the whole binary vector during Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol Biol. 1997. V. 34. №> 6. P. 913-22.

85. Wenck A.R., Quinn M., Whetten R.W. Pullman G., Sederoff R. High-efficiency Agrobacterium-mQ<\\a.iQ& transformation of Norway spruce (Picea abies) and loblolly pine {Pinus taeda) I/ Plant Mol. Biol. 1999. V. 39. P. 407-416.

86. Winkler R, Feldmann K.A. Identifying T-DNA insertion mutants in Arabidopsis using PCR // Methods in molecular biology, Arabidopsis protocols. Martinez-Zapater, J.M and Salinas J. (eds.). 1998. V. 82. P. 129-136.

87. Wu H., Sparks C.A., Jones H.D. Characterisation of t-DNA loci and vector backbone sequences in transgenic wheat produced by Agrobacterium-mediated transformation // Mol. Breeding. 2006. V. 18. P. 195 208.

88. Yin Z, Wang G-L. Evidence of multiple complex patterns of T-DNA integration into the rice genome // Theor Appl Genet 2000. V. 100. P. 461-470.

89. Zambryski P., Depicker A., Kruger K., Goodman H.M. Tumour induction by Agrobacterium tumefaciens: analysis of the boundaries of T-DNA // J. Mol. Appl. Genet. 1982. V. 1. № 4. P. 361-370.

90. Zhang J., Guo D., Chang Y., You C., Li X., Dai X., Weng Q., Zhang J., Chen G., Li X., Liu H., Han., Zhang Q., Wu C. Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13 804

91. T-DNA flanking sequences from an enhancer trag^rlutant library // The Plant Journal. 2007. V. 49. P. 947 - 959.

92. Zhong G.-Y. Genetic issues and pitfalls in transgenic plant breeding // Euphytica. 2001. V. 118. P. 137-144.

93. Zhu Y., Nam J., Humara J.M., Mysore K.S. et al. 2003. Identification of Arabidopsis rat mutants. Plant Physiology, v. 132, 494-505.

94. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer В., Hooykaas P.J., Farrand S.K., Winans. The Bases of Crown Gall Tumorigenesis // J. Bacterid. 2000. V. 182. № 14. P. 3885-3895.

95. Ziemienowicz A. Odyssey of Agrobacterium T-DNA // Acta Biochimica Polonica. 2001. V. 48. № 3. P. 623-635.

96. Zupan J., Muth T.R., Draper O., Zambryski P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights // The Plant Journal. 2000. V. 23. № 1. P. 11-28.