Возможность использования структурно модифицированных вирусов растений в качестве основы для создания вакцинных препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Рябчевская Екатерина Михайловна

• Рябчевская Екатерина Михайловна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Рябчевская Екатерина Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структурно модифицированный вирус табачной мозаики - сферические частицы

1.1. Получение и физико-химические свойства СЧ

1.1.1. Получение СЧ разных размеров

1.1.2. Физико-химические свойства СЧ

1.1.3. Аминокислотный состав поверхности и вторичная структура белка СЧ

1.2. Свойства СЧ, обуславливающие возможность их применения

1.2.1. Адсорбционные свойства СЧ

1.2.2. Адъювантные свойства СЧ

1.2.3. Биоконъюгация СЧ с различными биологически активными веществами как подход к получению биоконтрастных веществ

1.2.4. Безопасность использования СЧ

1.2.5. СЧ в противоопухолевой терапии

1.2.6. Металлизация СЧ

2. Краснуха - инфекционное заболевание вирусной природы

2.1. Характеристика, строение и жизненный цикл вируса краснухи

2.1.1. Строение вириона вируса краснухи

2.1.2. Жизненный цикл вируса краснухи

2.1.3. Генотипы вируса краснухи и их распространение

2.2. Структурные белки и антигенные детерминанты вируса краснухи

2.2.1. Гликопротеин Е1

2.2.2. Гликопротеин Е2

2.2.3. Белок оболочки вируса краснухи

2.3. Клиническая картина краснухи, специфический иммунный ответ и вакцинация

2.3.1. Клиническая картина, распространение и осложнения краснухи

2.3.2. Иммунный ответ при естественной инфекции краснухи

2.3.3. Вакцинация против краснухи

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Трансформация бактериальных клеток

2. Выделение и очистка плазмидной ДНК

3. Экспрессия рекомбинантных белков

4. Хроматографическая очистка (Н1в)6-рекомбинантных белков на М2+-ОТЛ агарозе

5. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле

6. Выделение препарата вируса табачной мозаики

7. Получение сферических частиц (СЧ)

8. Просвечивающая электронная микроскопия

9. Иммуноэлектронная микроскопия

10. Анализ траекторий наночастиц

11. Иммунофлуоресцентная микроскопия

12. Иммуноблот-анализ рекомбинантных белков

13. Иммунизация

14. Получение антисывороток

15. Непрямой иммуноферментный анализ

16. Изучение безопасности СЧ при однократном введении

17. Оценка безопасности СЧ при последовательных введениях

18. Изучение возможного иммунотоксического действия СЧ

19. Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика СЧ и рекомбинантного антигена вируса краснухи

2. Получение и характеристика композиций СЧ с тетраэпитопом А

3. Иммуностимулирующие свойства вакцинного кандидата (композиции

СЧ + тетраэпитоп А)

4. Анализ состава изотипов антител, вырабатывающихся при иммунизации вакцинным кандидатом

5. Сравнение иммунного ответа на антиген (тетраэпитоп А) и на платформу-адъювант (СЧ) в составе вакцинного кандидата

6. Оценка эффективности иммунного ответа на антиген и платформу (СЧ) для композиций СЧ с овальбумином

7. Безопасность применения СЧ в качестве адъюванта

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотные остатки АГ - аппарат Гольджи АОК - антителообразующие клетки АТ - антитела

АТН - анализ траекторий наночастиц

БО - белок оболочки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВГ - вирус гриппа

ВК - вирус краснухи

ВМКГ - вирус мозаики коровьего горошка

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВОС - вирус оспы сливы

ВПЧ - вирусоподобные частицы

ВТМ - вирус табачной мозаики

ДСН - додецилсульфат натрия

ИПТГ - изопропил-Р-0-1-тиогалактопиранозид ИФА - иммуноферментный анализ

КПЭ - клетки перитонеального экссудата

МАТ - моноклональные антитела

МОГ - миелиновые олигодендроциты

нт - нуклеотид

ОРС - открытая рамка считывания ПААГ - полиакриламидный гель ПВДФ - поливинилиденфторид

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

ПЭП - поли-№этил-4-винилпиридиний бромид

СВК - синдром врожденной краснухи

сгРНК - субгеномная РНК

СЧ - сферическая частица

ТЕМЕД - ^^№,№-тетраметилэтилендиамин

ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

ЭМ - электронная микроскопия

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ХВК - Х-вирус картофеля

BHK - Baby Hamster Kidney (культура клеток почки эмбриона хомячка)

CHO - Chinese Hamster Ovary (культура клеток яичника китайского хомячка)

Gd(DOTA) - gadolinium 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',NM,Nm-tetraacetate (1,4,7Д0-тетраазоциклододекан-Ы,№,№',№"-терраацетат гадолиния)

Ig - Immunoglobulin (Иммуноглобулин)

MeR - Measles-Rubella (вакцина Корь-Краснуха)

MHC I - Major Histocompatibility Complex I (главный комплекс гистосовместимости I-го типа)

MHC II - Major Histocompatibility Complex II (главный комплекс гистосовместимости II-го типа)

MMR - Measles-Mumps-Rubella (вакцина Корь-Паротит-Краснуха)

MMRV - Measles-Mumps-Rubella-Varicella (вакцина Корь-Паротит-Краснуха-Ветряная оспа)

MuR - Mumps-Rubella (вакцина Паротит-Краснуха)

6

Ni-NТА - nickel-nitrilotriacetic acid (Ni -нитрилотриуксусная кислота) PBS - Phosphate-Buffered Saline (фосфатно-солевой буфер) R - Rubella (вакцина Краснуха)

RdRp - RNA-dependent-RNA-polymerase (РНК-зависимая-РНК-полимераза) rE1 - recombinant E1 (рекомбинантный белок Е1) RG - Rubella Genotype (генотип вируса краснухи)

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Возможность использования структурно модифицированных вирусов растений в качестве основы для создания вакцинных препаратов»

Актуальность проблемы

Использование вирусов растений и их вирусоподобных частиц

(ВПЧ) - перспективное направление биотехнологий, включающее

разработку новых адъювантов и платформ для презентации

функционально активных молекул (антигенов патогенов). В последние

десятилетия развитие вирусологии растений и методов генной инженерии

привели к созданию кандидатных вакцин на основе вирусов растений

против различных инфекционных агентов человека и животных (Zhao &

Hammond, 2005; Phelps et al., 2007; Balke & Zeltins, 2019). В ряде

исследований была продемонстрирована иммуностимулирующая

способность фитовирусов и их ВПЧ с различной структурой (Brennan et

al., 2001; McCormick, Palmer, 2008; Denis et al., 2008; Lico et al., 2009;

Kalnciema et al., 2012). Основные преимущества использования вирусов

растений - это их безопасность для млекопитающих и простота получения

вирусных препаратов (Balke & Zeltins, 2019). В рамках данного подхода

весьма перспективным представляется применение не только вирионов и

ВПЧ, но и структурно модифицированных частиц вирусов растений

(Никитин и др., 2016). В настоящее время лучше всего изучены и

охарактеризованы структурно модифицированные частицы,

формирующиеся в процессе термической перестройки вируса табачной

мозаики (ВТМ), имеющие сферическую форму (сферические частицы -

СЧ). Ввиду того, что для СЧ было продемонстрировано наличие высокого

иммуностимулирующего потенциала (Karpova et al., 2012; Trifonova et al.,

2014), их дальнейшее исследование как платформы-носителя и адъюванта

для рекомбинантных вакцин представляется весьма привлекательным.

Разработка современных вакцинных препаратов для профилактики

инфекционных заболеваний - одна из наиболее актуальных проблем

медицины и биологии. Несмотря на широкое применение

аттенуированных и инактивированных вакцин, современные тенденции

8

создания безопасных вакцинных препаратов нового поколения предполагают отсутствие в них патогена в том или ином виде и использование рекомбинантных антигенов. Однако очищенные индивидуальные белки зачастую низкоиммуногенны, и их использование требует добавления адъюванта (Del Giudice et al., 2018; O'Hagan & De Gregorio, 2009). Ввиду этого, поиск эффективных и безопасных платформ-адъювантов, которыми могут стать СЧ, - одна из важнейших задач, которую необходимо решить для успешного предупреждения распространения инфекционных заболеваний. Детальное изучение и характеристика взаимодействия СЧ с организмом млекопитающих и иммунной системой позволит получить новые фундаментальные сведения об иммуностимулирующем потенциале СЧ и возможности их применения как основы для создания кандидатных вакцин.

Степень разработанности темы

Впервые возможность получения структурно модифицированных

частиц сферической формы при термической денатурации вириона ВТМ

была описана в 1956 году (Hart, 1956). Детально этот феномен был изучен

на кафедре вирусологии МГУ (Atabekov et al., 2011). Была исследована

возможность образования из ВТМ структурно модифицированных частиц

сферической формы (СЧ) различного размера. Продемонстрировано, что

СЧ могут быть получены не только из вирионов ВТМ, но и из мономеров и

олигомеров белка оболочки (БО) ВТМ, а также из ВПЧ ВТМ, не

содержащих РНК. Описана стабильность СЧ при различных физических

воздействиях, таких как повторное нагревание, многократное

замораживание и оттаивание, центрифугирование и ресуспендирование

(Atabekov et al., 2011). Физико-химические свойства СЧ также были

подробно изучены, в частности, определены такие параметры, как

плотность и изоэлектрическая точка СЧ, описаны вторичная структура

белка, входящего в состав СЧ, и аминокислотный состав поверхности СЧ

9

(Dobrov et al., 2014, Ksenofontov et al., 2019). Продемонстрировано, что СЧ восприимчивы к воздействию протеолитических ферментов и, следовательно, биодеградируемы (Никитин и др., 2011). Показаны антигенные различия СЧ и вирионов ВТМ (Atabekov et al., 2011). Продемонстрирована возможность адсорбции на поверхности СЧ белков различного размера и аминокислотного состава, в том числе рекомбинантных антигенов, с образованием композиций СЧ-антиген (Atabekov et al., 2011; Karpova et al., 2012). Показано, что СЧ обладают иммуностимулирующими свойствами (Karpova et al., 2012; Trifonova et al., 2014). После публикации результатов, полученных на кафедре вирусологии МГУ, интерес к изучению СЧ был проявлен со стороны других исследовательских групп. Была продемонстрирована возможность образования комплексов СЧ с хелатами гадолиния и применения этих комплексов как парамагнитного контрастного вещества (Bruckman et al., 2013а). Также были получены комплексы СЧ с наночастицами золота (Shah et al., 2012) и наночастицами серебра (Rodriguez-Galvan et al., 2017), которые потенциально могут быть применимы для создания наноматериалов для наноэлектроники, катализа и медицины. Помимо этого, была показана возможность применения СЧ в химиотерапии рака в качестве системы доставки доксорубицина (Bruckman et al., 2016). А также недавно было продемонстрировано, что СЧ могут способствовать активации противоопухолевого иммунитета (Murray et al., 2018). Однако стоит отметить, что в предыдущих исследованиях не была проведена детальная оценка иммуногенности и токсичности СЧ, что, безусловно, важно для дальнейшей разработки медико-биологических препаратов на их основе.

Цель работы

Целью исследования было изучение возможности использования

сферических частиц, формирующихся при термической перестройке

10

вируса табачной мозаики, в качестве платформы-адъюванта для создания вакцинных кандидатов.

Задачи работы

1) Получить СЧ и рекомбинантный антиген патогена (тетраэпитоп А, содержащий антигенные детерминанты гликопротеина Е1 вируса краснухи), изучить возможность неспецифической адсорбции тетраэпитопа А на поверхности СЧ, охарактеризовать композиции СЧ + тетраэпитоп А физико-химическими и иммунохимическими методами и изучить их стабильность в физиологических условиях.

2) Провести сравнительный анализ иммуногенности полученных композиций СЧ + тетраэпитоп А с индивидуальным тетраэпитопом А и смесью тетраэпитопа А с адъювантом на основе гидроксида алюминия.

3) Охарактеризовать состав изотипов антител, вырабатывающихся в ответ на иммунизацию композициями СЧ + тетраэпитоп А.

4) Сравнить эффективность стимуляции иммунного ответа на антиген, находящийся в составе композиции с СЧ, и на сами сферические частицы на примере двух различных антигенов - тетраэпитопа А и овальбумина.

5) Изучить безопасность СЧ как компонента вакцинных препаратов (адъюванта): оценить влияние различных доз СЧ при однократном внутримышечном, внутривенном или внутрибрюшинном введении, а также влияние трёх последовательных внутримышечных введений СЧ, исследовать возможное иммунотоксическое действие СЧ.

Научная новизна

В работе впервые путём неспецифической адсорбции получены стабильные в физиологических условиях композиции СЧ с рекомбинантным антигеном вируса краснухи (тетраэпитопом А). Впервые

11

детально охарактеризован иммунный ответ у лабораторных животных, индуцированный на антиген в составе композиции со структурно модифицированными вирусами растений. Впервые проведён сравнительный анализ адъювантных свойств СЧ и адъюванта на основе гидроксида алюминия. Определены титры общих IgG, вырабатывающихся при иммунизации композициями СЧ + тетраэпитоп А, индивидуальным тетраэпитопом А и тетраэпитопом А в смеси с адъювантом на основе гидроксида алюминия. Проведён анализ состава изотипов IgG, вырабатывающихся при иммунизации композициями СЧ + тетраэпитоп А. Впервые показано, что большинство специфичных к тетраэпитопу А антител относятся к классу IgG1, что свидетельствует о стимуляции преимущественно гуморального иммунного ответа. На примере двух различных белков (рекомбинантного тетраэпитопа А и овальбумина) впервые продемонстрировано, что титр IgG, вырабатываемых на белок, находящийся в композиции с СЧ, значительно преобладает над титром IgG, вырабатываемых на платформу-адъювант (СЧ). В работе впервые проведены исследования на трёх видах лабораторных животных, позволяющие оценить безопасность СЧ как платформы для разработки вакцин и адъювантов. Показано, что СЧ не вызывают патологических изменений физиологических, гистологических и гематологических параметров у лабораторных животных. В отдельных экспериментах на животной модели (мыши) было продемонстрировано, что СЧ не оказывают токсического действия на иммунную систему. Таким образом, впервые показана безопасность использования СЧ в качестве компонента кандидатных вакцин.

Научная и практическая значимость

Полученные результаты представляют научный интерес и могут

быть применены в исследовательской практике в области молекулярной

биологии и вирусологии. Подробная характеристика

12

иммуностимулирующего потенциала СЧ наряду с изучением их воздействия на организм млекопитающих открывает новые возможности для использования СЧ в качестве универсальной платформы-носителя и адъюванта для различных биомедицинских препаратов, в том числе вакцин нового поколения на основе рекомбинантных белков.

Личный вклад автора

Личный вклад автора заключается в работе с литературными источниками, планировании и проведении экспериментов, анализе полученных результатов, подготовке к печати публикаций и написании диссертации. Основные результаты диссертационной работы получены лично автором или при его непосредственном участии. Имена всех соавторов указаны в опубликованных работах. Участие соавторов отражено в тексте диссертации и автореферата.

Методология и методы исследования

Исследования выполнены с использованием современных методов молекулярной биологии, вирусологии и иммунохимии. Анализ препарата СЧ проводился методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и методом анализа траекторий наночастиц (АТН). Для получения и характеристики рекомбинантного белка были использованы методы трансформации бактериальных клеток и экспрессии белков в культуре E. coli, метод аффинной хроматографии, спектрофотометрический и электрофоретический методы анализа белков. Для характеристики рекомбинантного антигена в составе композиций с СЧ были использованы иммунофлуоресцентная и иммуноэлектронная микроскопия. Оценка титров антител после иммунизации лабораторных животных проводилась методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа, детекция сигнала осуществлялась с помощью метода спектрофотометрии.

Положения, выносимые на защиту

1) Взаимодействие СЧ с антигеном вируса краснухи (тетраэпитопом А) приводит к образованию композиций, стабильных в физиологических условиях.

2) СЧ эффективно стимулируют иммунный ответ на антиген, находящийся в составе композиции.

3) СЧ, применяемые в качестве платформы и адъюванта, стимулируют преимущественно Т^2 иммунный ответ на антиген вируса краснухи - тетраэпитоп А.

4) При иммунизации композициями СЧ с антигеном иммунный ответ на антиген в несколько раз превышает иммунный ответ на СЧ.

5) Как однократное, так и повторные введения СЧ не приводят к возникновению патологических изменений в организме млекопитающих; СЧ безопасны для лабораторных животных.

6) СЧ могут быть использованы в качестве платформы-адъюванта при разработке кандидатных вакцин.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты были получены с использованием современных методик и качественных расходных материалов на исправно работающем оборудовании. По теме диссертационной работы опубликовано 6 статей в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.02.02 - вирусология, и 1 патент РФ.

Результаты диссертационной работы были представлены на ХХ11-ой, ХХ1У-ой и ХХУ-ой Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 12-15 апреля 2015 г.; 11- 14 апреля 2017 г.; 9-13 апреля 2018 г.); Всероссийской конференции молодых

14

ученых и специалистов «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии и иммунофармакологии» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2017 г.); 42-ом, 43-ем и 44-ом Конгрессах Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) (Иерусалим, Израиль, 10-14 сентября 2017 г; Прага, Чехия, 4-12 июля 2018 г.; Краков, Польша, 6-11 июля 2019 г.); IX-ом и XI-ом Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 20-22 февраля 2017 г.; Москва, 25-27 февраля 2019 г.); 4-ой летней школе «4th Innovative Approaches for Identification of Antiviral Agents Summer School» (IAAASS) (Кальяри, Италия, 24-28 сентября 2018 г.); Международной конференции In Vitro Biology Meeting (Миннеаполис, Миннесота, 2-6 июня 2019 г.) и II-ом Объединённом научном форуме, включающем VI Съезд физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России и IX Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, 1-6 октября 2019 г.).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структурная модификация при воздействии внешних факторов продемонстрирована для некоторых вирусов и вирусоподобных частиц (ВПЧ) со спиральной симметрией. Было показано, что нитевидные бактериофаги M13, f1 и fd (семейство Inoviridae, род Inovirus) способны образовывать полые частицы сферической формы под действием хлороформа (Griffith et al., 1981). В свою очередь, для различных вирусов растений с палочковидными и нитевидными вирионами была продемонстрирована возможность структурного перехода при воздействии высоких температур (80-98°C) (Hart, 1956; Atabekov et al., 2011; Nikitin et al., 2016; Трифонова и др., 2017). Структурно модифицированные частицы вирусов растений были получены при термической обработке палочковидных вирионов вируса табачной мозаики (ВТМ) (сем. Virgaviridae, род Tobamovirus) (Hart, 1956; Atabekov et al., 2011), вируса штриховатой мозаики ячменя (сем. Virgaviridae, род Hordeivirus) (Трифонова и др., 2017) и нитевидных вирионов Х-вируса картофеля (ХВК) (семейство Alphaflexiviridae, род Potexvirus) (Nikitin et al., 2016). Во всех описанных случаях под действием температуры происходила структурная перестройка вириона фитовируса в частицы сферической формы (Atabekov et al., 2011; Nikitin et al., 2016; Трифонова и др., 2017). Частицы сферической формы также были получены из несодержащих РНК нитевидных ВПЧ вируса мозаики альтернантеры (семейство Alphaflexiviridae, род Potexvirus) при нагревании до 90°С (Трифонова и др., 2017), и из любых форм белка оболочки (БО) ВТМ при нагревании до 65°С (Atabekov et al., 2011). Интересно отметить, что образование структурно модифицированных частиц при нагревании вирусов растений с икосаэдрическим типом симметрии (вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), семейство Caulimaviridae, род Caulimovirus; вирус мягкой мозаики фасоли, семейство Tombusviridae) не детектировалось (Трифонова

и др., 2017). Для структурно модифицированных частиц ВТМ и ХВК было показано, что они не содержат РНК, а структурный переход сопровождается увеличением плотности частиц и появлением большего количества ß-структур в составе белка по сравнению с вирионами, помимо этого, структурно модифицированные частицы ВТМ и ХВК обладают адсорбционными свойствами (Atabekov et al., 2011; Dobrov et al., 2014; Nikitin et al., 2016). На данный момент наиболее подробно изучены и наибольший интерес с точки зрения разработки различных биотехнологий, в том числе кандидатных вакцинных препаратов, представляют структурно модифицированные частицы ВТМ, которые авторы назвали сферическими частицами (СЧ) (Karpova et al., 2012).

В настоящей работе СЧ, полученные из ВТМ, были использованы в качестве платформы-адъюванта для создания вакцинного кандидата против вируса краснухи (ВК). В связи с этим в первой части литературного обзора будут подробно рассмотрены публикации, посвящённые физико-химическим свойствам и возможностям применения СЧ, а во второй будет дана характеристика ВК, рассмотрены его основные антигены и специфика иммунного ответа на данный патоген.

1. Структурно модифицированный вирус табачной мозаики -

сферические частицы 1.1. Получение и физико-химические свойства СЧ

1.1.1. Получение СЧразных размеров

Впервые структурная перестройка ВТМ была продемонстрирована в 1956 году (Hart, 1956). Харт показал, что под воздействием температур в диапазоне от 80°С до 98°С ВТМ претерпевает следующие структурные изменения: сначала происходит набухание одного или двух концов вириона, а затем постепенное увеличение возникшего терминального утолщения, сопровождающееся укорачиванием вирусной частицы, и полная трансформация в частицу шаровидной формы («ball-like particles»). Для этих экспериментов использовался водный раствор препарата ВТМ с концентрацией примерно 0,5 мг/мл. Объем одной частицы в этом случае оказался сопоставим с объёмом вириона ВТМ. Частицы шаровидной формы были получены при нагревании ВТМ в диапазоне от 80°С до 98°С, при этом отмечалось, что чем ниже температура, тем больше времени требовалось для того, чтобы все вирионы претерпели структурную перестройку. Так, при термической обработке в течение 15 секунд при 85°С и 10 секунд при 90°С были зафиксированы переходные формы, представляющие собой вирионы с одним или двумя терминальными утолщениями. После термической обработки в течение 10 секунд при 98°С в препарате наблюдались только шарообразные частицы.

Тем не менее, работа Харта оставила открытыми множество

вопросов, связанных со структурно модифицированными СЧ из ВТМ,

оставалось неясным. Например, какими физико-химическими свойствами

обладают полученные СЧ, могут ли СЧ образоваться из препарата ВТМ с

концентрацией отличной от 0,5 мг/мл или препаратов БО ВТМ, и если да,

то будут ли они отличаться от СЧ, полученных Хартом. После 1956 г. в

течение длительного времени не появлялось работ, связанных со

18

структурной перестройкой ВТМ. Только в 2010 г. на кафедре вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова начались исследования, посвящённые СЧ, и были подробно изучены их физико-химические свойства.

В 2011 г. была опубликована работа, в которой впервые было показано, что уже при 94°С при инкубации в течение 10 секунд происходит полная термическая перестройка вирионов в СЧ. При нагревании до 90°С в течение 10 секунд, так же как и в экспериментах Харта, была зафиксирована переходная форма, таким образом, было подтверждено, что образование СЧ из вирионов ВТМ происходит как минимум в две стадии. Впервые были получены СЧ из различных по концентрации препаратов ВТМ: от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл (Л1аЬекоу & а!., 2011). Было продемонстрировано, что существует зависимость между концентрацией вирусного препарата и размером СЧ. При нагревании до 94-98°С препарата ВТМ с концентрацией 0,1 мг/мл были получены СЧ, диаметр которых составил около 65 нм, что примерно сопоставимо с объёмом отдельного вириона ВТМ. Иногда в препаратах наблюдались СЧ диаметром менее 50 нм, что, скорее всего, связано с наличием обломков вирионов. Для препаратов ВТМ с большей концентрацией (1-10 мг/мл) была показана возможность получения СЧ большего размера (от 100 нм до 1200 нм). Так, из препарата с концентрацией 1 мг/мл были получены СЧ размером около 460 нм, из ВТМ с концентрацией 10 мг/мл - около 1100 нм. Вероятно, в образовании СЧ больших размеров участвуют несколько вирионов (Л1аЬекоу & а1., 2011; Трифонова и др., 2015). В различных исследованиях размеры СЧ определяли с помощью методов ПЭМ, динамического рассеяния света и АТН (Л1аЬекоу & а1., 2011; БоЬгоу & а1., 2014; Трифонова и др., 2015). Размеры СЧ в составе одного и того же препарата, определённые разными методами, были сопоставимы друг с другом. Было показано, что СЧ, полученные из вирионов ВТМ, как правило, имеют достаточно узкое распределение по размерам. Варьируя

исходную концентрацию вируса можно получить частицы заданного размера. Однако следует отметить, что из препаратов ВТМ, имеющих одинаковую концентрацию, могут быть получены СЧ разного размера. Помимо исходной концентрации ВТМ на размер формирующихся СЧ в том числе могут влиять агрегационное состояние вирусного препарата и состав буферных растворов, используемых для выделения и хранения вируса. Длительное хранение препарата ВТМ (2-3 года) способствует агрегации вируса, что приводит к увеличению среднего размера образующихся СЧ по сравнению с СЧ, формировавшимися из свежевыделенного препарата ВТМ с той же концентрацией (Трифонова и др., 2015).

Возможность структурной перестройки в СЧ была показана не только для вирионов ВТМ, но и для БО ВТМ. Из препаратов различных форм БО ВТМ (мономеры, димеры, 4Б тримеры, 20Б диски и реполимеры) СЧ образуются уже при 65°С, и такой переход происходит, по-видимому, в одну стадию, так как промежуточные формы не были обнаружены. Интересно отметить, что для СЧ, формирующихся из любых форм БО ВТМ, характерна гетерогенность по размерам. В одном препарате одновременно могут присутствовать СЧ диаметром от 35 до 800 нм. В отличие от СЧ из вирионов ВТМ, в данном случае зависимость размеров СЧ от концентрации исходного препарата БО отсутствует (Л1аЬекоу et al., 2011).

1.1.2. Физико-химические свойства СЧ

При дальнейшем изучении СЧ было продемонстрировано, что эти частицы настолько электронноплотные, что могут быть визуализированы с помощью ПЭМ без дополнительного контрастирования (Трифонова и др., 2015). Анализ ультратонких срезов СЧ позволил установить, что СЧ однородны и не имеют полостей внутри (Трифонова и др., 2015).

-5

Плотность СЧ составляет 1,43 г/см , что значительно отличается от

20

плотности вирионов ВТМ (1,31 г/см ) и от плотности реполимеров БО

-5

ВТМ (1,19 г/см ). То есть, во время термической перестройки БО ВТМ претерпевает серьёзные конформационные изменения, что приводит к образованию более плотных, чем вирионы ВТМ, СЧ (Dobrov et al., 2014). Изоэлектрическая точка СЧ лежит в диапазоне 3,7-3,9 (Никитин и др., 2011). СЧ нерастворимы в воде (Atabekov et al, 2011). В тоже время СЧ не агрегируют в водном растворе, что было показано с помощью метода АТН (Dobrov et al., 2014).

СЧ проявляют высокую стабильность к различным физическим воздействиям, таким как повторное нагревание до 98°С, многократное замораживание и оттаивание, центрифугирование и ресуспендирование (Atabekov et al., 2011), а также сохраняют форму и размеры в процессе лиофилизации (Ksenofontov et al., 2019). Была продемонстрирована стабильность СЧ при хранении в воде и в следующих условиях: 10мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4), PBS, 100мМ боратный буфер (pH 8,5) как минимум 26 дней и в условиях 100мМ ацетатного буфера (pH 5,5) как минимум в течение 18 дней (Bruckman et al, 2014b). В то же время СЧ биодеградируемы. СЧ эффективно гидролизуются протеиназой К (Никитин и др., 2011) и трипсином (Ksenofontov et al., 2019). Так, 8 мкг протеиназы К в течение 14 часов полностью гидролизуют 100 мкг СЧ, в то время как нативные вирионы ВТМ в тех же условиях не подвергаются протеолизу вовсе (Никитин и др., 2011). Трипсинолиз СЧ был подробно изучен. Данные, полученные в экспериментах по частичному протеолизу, свидетельствуют о том, что расщепление СЧ трипсином происходит в несколько стадий: на первом этапе происходит гидролиз как минимум по трём сайтам, а на втором этапе ещё не менее чем по шести сайтам. При протеолизе препарата СЧ с концентрацией 1 мг/мл и соотношении фермент:субстрат, равном 1:500, полное исчезновение полноразмерного белка СЧ (Молекулярная масса 17,5 кДа) наблюдается через 20 минут

инкубации при комнатной температуре, в то же время интересно отметить, что вирионы ВТМ в таких же условиях были устойчивы к действию трипсина в течение часа (КБепоЮПюу & а1., 2019).

Методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) было установлено, что СЧ и вирионы ВТМ отличаются по своим антигенным свойствам. Сыворотка, полученная к СЧ, может взаимодействовать с вирионами ВТМ, однако с меньшей эффективностью, чем непосредственно с СЧ. Это позволяет сделать вывод, что СЧ и ВТМ антигенно близки, но не идентичны (Л1аЬекоу & а!., 2011). БО ВТМ при структурной модификации вириона не деградирует, однако белок, выделенный из СЧ, теряет способность образовывать реполимеры со спиральной структурой (Л1аЬекоу & а!., 2011).

Такая разница в плотности, чувствительности к действию протеаз, антигенной специфичности и способности образовывать реполимеры между белком СЧ и ВТМ свидетельствует о том, что в процессе перестройки, по-видимому, происходит изменение вторичной структуры БО ВТМ, а аминокислотный состав поверхности белка СЧ и вирионов различен.

1.1.3. Аминокислотный состав поверхности и вторичная структура белка СЧ

Изучение СЧ с помощью методов Рамановской спектроскопии, кругового дихроизма, флуоресцентной спектроскопии и тритиевой планиграфии позволило получить информацию о вторичной структуре белка в составе СЧ и определить основные а. о., находящиеся на поверхности СЧ (БоЬгоу & а!., 2014; КБепоЮПюу & а!., 2019).

Спектры комбинационного рассеяния оказались схожи для СЧ различных размеров и при этом существенно отличались от спектра ВТМ.

Пик, соответствующий а-спиральной структуре (935 см-1), отчётливо различимый в спектре ВТМ, исчезает в спектре СЧ, в то же время появляется пик, характерный для Р-структуры (1235 см-1), который отсутствует в спектре ВТМ. Ярко выраженный в спектре ВТМ пик (1656 см-1) сдвигается (1668 см-1), что также свидетельствует о появлении Р-структуры (ЭоЬгоу et al., 2014). Анализ спектров кругового дихроизма в дальнем ультрафиолетовом диапазоне также подтвердил, что при термической перестройке БО вирионов в СЧ происходит исчезновение подавляющего количества а-спиралей и появление Р-структуры, а также увеличение доли неупорядоченной структуры (ЭоЬгоу et al., 2014). БО ВТМ, согласно данным кристаллографии, содержит около 50% спиральной структуры (а-спирали или 310-спирали) и 10% Р-структуры (КашЬа et al., 1989). Однако после термической перестройки, по данным кругового дихроизма, в составе вторичной структуры белка СЧ остаётся всего 14% а-спиралей, в то время как процент Р-слоёв возрастает до 32%, а оставшиеся 54% приходятся на неупорядоченную структуру (ЭоЬгоу et al., 2014). Тиофлавиновый тест показал наличие в составе белка СЧ амилоидоподобной кросс-Р-структуры, что может объяснять их повышенную стабильность (ЭоЬгоу et al., 2014).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рябчевская Екатерина Михайловна, 2020 год

ВТМ СЧ Источник

Способность изолированного белка образовывать реполимеры в отсутствии РНК + - Л1аЬекоу ег а!., 2011

Плотность 1,31 г/см3 1,43 г/см3 БоЬгоу ег а!., 2014

Гидролиз протеиназой К - + Никитин и др., 2011

Гидролиз трипсином - + КБепоГоп1оу ег а!., 2019

Вторичная структура белка Спиральная структура ~ 50%, Р-структура ~ 10%, неупорядоченная структура ~ 40% Спиральная структура - 14%, Р-структура - 32%, неупорядоченная структура -54% ВТМ - КатЬа ег а!., 1989 СЧ - БоЬгоу ег а!., 2014

Взаимодействие с тиофлавином Т - + БоЬгоу ег а!., 2014

Возможность ковалентного присоединения ФИТЦ - + КБепоГоп1оу ег а!., 2019

Пептиды, экспонированные на поверхности Бег1-Лг§41 ТЬг59-8ег65 8ег142-ТЬг158 Лг§41-Лг§71 Пе93-Лг§122 КБепоГоп1оу ег а!., 2019

Таблица 1. Сравнение физико-химических свойств белка в составе вирионов ВТМ и

СЧ.

1.2. Свойства СЧ, обуславливающие возможность их

применения

1.2.1. Адсорбционные свойства СЧ

В ряде работ была показана возможность презентации на поверхности СЧ целевых белков различного размера и аминокислотного состава, и даже небольших по размеру простых икосаэдрических вирионов вирусов животных и растений. Таким образом, были продемонстрированы уникальные адсорбционные свойства СЧ. Так, на поверхности СЧ были адсорбированы БО ХВК, бычий сывороточный альбумин (БСА), химерный рекомбинантный БО ХВК, слитый с эпитопом вируса оспы сливы (ВОС) SMLNPIFTPA, а также рекомбинантные антигены вируса гриппа (ВГ) и ВК (Кагроуа et al., 2012). Авторы предполагают, что при адсорбции целевых белков играют роль как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия. Стабильность композиций СЧ с адсорбированными на их поверхности белками была изучена с использованием флуоресцентно меченных БО ХВК и БСА (БО ХВКФИТЦ и БСАФИТЦ). Было показано, что в водном растворе БО ХВКФИТЦ и БСАФИТЦ связаны с поверхностью СЧ, а при концентрации №С1 в пределах 0,05-0,10М происходит постепенная диссоциация флуоресцентно меченых белков. В связи с этим был предложен вариант стабилизации белков на поверхности СЧ с помощью 0,05% формальдегида, который приводит к образованию ковалентных связей между а. о. адсорбируемого белка и белка СЧ.

При изучении антигенных свойств адсорбированных белков было показано, что БО ХВК, полиэпитоп гемагглютинина ВГ, эпитоп белка М2 ВГ, слитый с дегидрофолатредуктазой, тетраэпитоп А гликопротеина Е1 ВК, а также эпитоп ВОС, слитый с БО ХВК, сохраняют свою антигенную специфичность в составе стабилизированных формальдегидом комплексов СЧ-белок. Это было продемонстрировано с помощью метода непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии с сыворотками к ХВК, ВГ, ВК и

ВОС соответственно, используемыми в качестве первичных антител (АТ) (Karpova et al., 2012). Помимо индивидуальных белков на поверхности СЧ были адсорбированы целые вирионы простых икосаэдрических вирусов. Получены комплексы с вирионами следующих вирусов: ВМЦК (сем. Caulimoviridae, род Caulimovirus), вирус мозаики костра (сем. Bromoviridae, род Bromovirus), вирус энцефаломиокардита (сем. Picornaviridae, род Cardiovirus), энтеровирус С человека (сем. Picornaviridae, род Enterovirus). ВМЦК и энтеровирус С человека в составе комплексов с СЧ, стабилизированных формальдегидом, сохраняли свою антигенную специфичность (Trifonova et al., 2014). Возможность адсорбции целевых белков/вирионов на поверхности СЧ и сохранение их антигенной специфичности в составе стабилизированных формальдегидом комплексов позволили предположить возможность использования СЧ в качестве платформы-адъюванта.

Ещё одним вариантом иммобилизации на поверхности СЧ биологически активных молекул является присоединение через поликатионный спейсер. Описаны варианты, когда в роли такого спейсера были использованы: поли-К-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭП) (Никитин и др., 2011), а также его производные, обладающие большей гидрофобностью (Nikitin et al., 2014). Так, в щелочной среде (рН 9,0) на поверхности отрицательно заряженных СЧ был адсорбирован положительно заряженный ПЭП, что сопровождалось перезарядкой поверхности СЧ и позволило нековалентно присоединить модельный антиген БСА, который при рН 9,0 имеет ярко выраженный отрицательный заряд. Была продемонстрирована высокая агрегационная устойчивость как бинарного комплекса СЧ-ПЭП, так и тройного комплекса СЧ-ПЭП-БСА. Связь между компонентами комплекса ослабевала при повышении ионной силы. Так, бинарный комплекс полностью распадался в условиях 0,3M NaCl, в составе же тройного комплекса около 30% молекул ПЭП

оставались связанными с СЧ вне зависимости от концентрации соли. Это позволило авторам предположить, что в образовании тройного комплекса играют роль не только электростатические, но и гидрофобные взаимодействия (Никитин и др., 2011). Это предположение было подтверждено тем фактом, что производные ПЭП, содержащие гидрофобные функциональные группы, образовывали более устойчивые тройные комплексы, около 80% которых оставались стабильными в 0,15М NaCl и более концентрированных растворах NaCl (Nikitin et al., 2014). Для тройных комплексов, состоящих из СЧ, производных ПЭП, содержащих гидрофобные функциональные группы, и БО ХВК, было продемонстрировано, что БО ХВК сохраняет свою антигенную специфичность в составе тройных комплексов (Nikitin et al., 2014). В описанных работах изучение возможности образования и стабильности бинарных и тройных комплексов с участием поликатионов проводилось в щелочной среде (боратный буфер, рН 9,0). На данный момент в литературе отсутствуют данные о том, могут ли такие комплексы образоваться и остаются ли они стабильными при физиологических значениях рН.

Таким образом, можно выделить три принципиально разных подхода к получению комплексов и композиций СЧ с адсорбированными на их поверхности функционально-активными биологическими молекулами (белками):

1) создание комплексов СЧ-белок, в составе которых белок ковалентно связан с поверхностью СЧ;

2) создание композиций СЧ + белок, в составе которых белок нековалентно связан с поверхностью СЧ за счёт электростатических и/или гидрофобных взаимодействий и может диссоциировать;

3) присоединение белков через поликатионный спейсер.

При ковалентной фиксации белковых молекул на поверхности СЧ

29

получившиеся комплексы СЧ-белок стабильны в физиологических условиях, а белок сохраняет свои антигенные свойства в составе таких комплексов. Это открывает возможности для использования СЧ в качестве платформы-носителя антигенов. При использовании поликатионного спейсера также было показано сохранение антигенной специфичности адсорбированных белков, однако вопрос стабильности при физиологических значениях рН остаётся открытым. Ввиду того, что адсорбция на поверхности СЧ возможна и без спейсеров, подобное усложнение системы не оправдывает себя. В случае прямой нековалентной адсорбции, вероятно, часть белка связана с поверхностью частицы, а часть находится в свободной форме в растворе. Скорее всего, между связанным и растворимым белком существует равновесие, которое может смещаться в ту или иную сторону при изменении рН и ионной силы раствора. Можно предположить, что, как и в случае с ковалентно связанными и адсорбированными с помощью поликатионного спейсера белками, в составе композиций СЧ + белок антигенная специфичность белка также будет сохраняться. В этом случае при использовании СЧ в качестве платформы-носителя они могли бы выступать в роли депо для целевых антигенов. Таким образом, наиболее перспективными видятся первый и второй варианты получения комплексов и композиций с адсорбированными на их поверхности целевыми белками.

1.2.2. Адъювантные свойства СЧ

СЧ обладают сильными иммуностимулирующими свойствами. Иммунный ответ на антигены, вводимые совместно с СЧ, выше по сравнению с иммунным ответом, вырабатываемым на соответствующие индивидуальные антигены (Кагроуа ег а!., 2012; ТпЮпоуа ег а!., 2014). Впервые адъювантные свойства СЧ были описаны в работе Карповой с соавторами (2012) на примере двух антигенов различной природы:

нативного БО ХВК и рекомбинантного БО ХВК, слитого с эпитопом ВОС.

30

Также в данной работе было проведено сравнение эффективности стимуляции иммунного ответа на целевые белки (БО ХВК и БО ХВК с эпитопом ВОС) в составе композиций с СЧ, образованных за счёт гидрофобных и/или электростатических взаимодействий, и в составе комплексов, дополнительно стабилизированных формальдегидом. Во всех случаях иммунный ответ на любой из проанализированных антигенов, вводимых вместе СЧ как в виде стабилизированного комплекса, так и в виде композиции, был выше по сравнению с иммунным ответом на соответствующие индивидуальные антигены. В этой же работе было проведено сравнение адъювантных свойств СЧ с самым сильным из известных адъювантов - полным адъювантом Фрейнда - и показано, что иммуностимулирующий эффект сопоставим с этим адъювантом. (Кагроуа et al., 2012).

В работе Трифоновой с коллегами (2014) было продемонстрировано, что СЧ проявляют адъювантные свойства не только в отношении отдельных белков, но и простых икосаэдрических вирионов вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК). Несмотря на то, что ВМЦК сам по себе достаточно иммуногенен, СЧ усиливали выработку АТ на ВМЦК в 4 раза. В контрольных экспериментах полный адъювант Фрейнда усилил иммуностимуляцию у лабораторных животных на ВМЦК в 7 раз. Интересно, что СЧ работали как иммуностимулятор и в составе стабилизированных формальдегидом комплексов СЧ-ВМЦК, так и в составе образованных за счёт гидрофобных/электростатических взаимодействий композиций СЧ + ВМЦК (ТпЮпоуа et al., 2014).

Таким образом, был продемонстрирован высокий иммуностимулирующий потенциал СЧ, который они проявляют, находясь как в комплексе, так и в композиции с антигеном. Авторы предполагают, что после попадания композиций СЧ + антиген в брюшную полость лабораторных животных, вероятно, происходила постепенная диссоциация антигена с поверхности СЧ, предположительно, выполняющих роль депо

31

антигена, что могло сыграть положительную роль в стимуляции иммунного ответа (Trifonova et al., 2014). В связи с этим, возможно, композиции, полученные путём простого смешивания СЧ и антигена, являются более перспективной основой для разработки вакцинных препаратов, поскольку получение таких комплексов исключает дополнительную стадию, связанную с обработкой формальдегидом.

Недавно в работе Никитина с соавторами (2018) было продемонстрировано, что СЧ способны увеличивать не только иммуногенность, но и протективность. СЧ усиливали протективный эффект широко используемой ветеринарной вакцины против бешенства «Рабикан». Адъювантный эффект СЧ оказался сопоставим с таковым для неполного адъюванта Фрейнда, который использовался в качестве положительного контроля (Nikitin et al., 2018).

Таким образом, СЧ обладают высоким адъювантным потенциалом и способны усиливать выработку АТ на широкий круг антигенов вне зависимости от их природы и физико-химических характеристик. Более того, СЧ способны повышать протективность вакцинных препаратов. Это свидетельствует в пользу того, что СЧ могут служить в качестве платформы-адъюванта для разработки рекомбинантных вакцин.

1.2.3. Биоконъюгация СЧ с различными биологически активными веществами как подход к получению биоконтрастных веществ

Ряд научных публикаций исследователей из западного резервного университета Кейза США посвящён получению путём биоконъюгации биоконтрастирующих веществ на основе СЧ. Для использования в качестве контрастного вещества для магнитной резонансной томографии СЧ модифицировали хелатом гадолиния Gd(DOTA). Модифицированные СЧ были получены путём биоконъюгации ВТМ перед термической перестройкой. Изначально исследователям удалось получить СЧ только из

32

ВТМ, связанного с хелатом гадолиния через а. о. глутаминовой кислоты, экспонированные во внутренний канал вириона. Предпринятые попытки получить СЧ из вирионов ВТМ с модифицированными а. о. тирозина, экспонированными на внешней поверхности вириона, в тех же условиях (нагревание в термоциклере в течение 15 секунд при 96°С) поначалу не приводили к успеху (Вгиекшап et al., 2013а). Однако в дальнейших экспериментах, используя альтернативный способ получения СЧ в проточной системе, предполагающий нагревание до 100°С в течение минимум 125 секунд, учёным удалось получить СЧ из ВТМ с модифицированной внешней поверхностью (Вгиекшап et al., 2014Ь). А впоследствии также была показана возможность биоконъюгации функционально активных молекул с поверхностью уже сформировавшихся СЧ (Вгиекшап et al., 2016).

Конъюгация хелата гадолиния с СЧ позволила значительно увеличить магнитную релаксивность Оё(ЭОТЛ), которая оказалась наибольшей по сравнению с другими вирусными платформами (ВТМ, вирус хлоротической пятнистости коровьего горошка, вирус мозаики коровьего горошка (ВМКГ), бактериофаги МБ2, QP и Р22), конъюгированными с различными производными гадолиния (Вгиекшап et 2013а; 2013Ь).

Для СЧ, полученных из конъюгированного с хелатом гадолиния ВТМ, так же как и для СЧ, формирующихся из нативных вирионов ВТМ (Л1аЬекоу et al., 2011), была показана зависимость размеров СЧ от исходной концентрации вируса. Из ВТМ с концентрацией 0,1 мг/мл, 1 мг/мл, 2,5 мг/мл, 5 мг/мл в проточной системе были получены СЧ размерами 58 нм, 88 нм, 188 нм и 218 нм соответственно (Вгисктап et al., 2014Ь). Эти размеры СЧ-Оё(БОТЛ) сопоставимы с размерами немодифицированных СЧ, полученных из препаратов ВТМ ранее (Л1аЬекоу et al., 2011). СЧ большего размера содержали большее количество хелата гадолиния и обладали большей магнитной

33

релаксивностью. При этом каждый отдельно взятый атом гадолиния в составе СЧ также обладал в 4-5 раз большей магнитной релаксивностью (21,0-25,4мМ-1сек-1), чем свободный Gd(DOTA) (5мМ-1сек-1). Минерализация кремнием СЧ, конъюгированных с хелатом гадолиния, позволила дополнительно увеличить разрешение контраста, снизить время выведения контрастного агента из организма и предотвратить возможное нежелательное связывание с АТ, которое может повлиять на путь контрастного вещества в организме (Bruckman et al., 2015).

Помимо СЧ, конъюгированных с хелатом гадолиния, были получены СЧ, конъюгированные с флуоресцентным красителем Cy5, полиэтиленгликолем (ПЭГ) (молекулярная масса 2 кДа) и биотином. По данным иммуноэлектронной микроскопии, биотин в составе модифицированных СЧ сохранял антигенную специфичность (Bruckman et al., 2016), так же как и адсорбированные и впоследствии стабилизированные формальдегидом или адсорбированные с помощью поликатионного спейсера антигены (Karpova et al., 2012; Trifonova et al., 2014; Nikitin et al., 2014).

Продемонстрированы варианты получения СЧ из вирионов ВТМ, конъюгированных через а. о. лизина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или цистеина. А. о., с помощью которых происходит модификация, могут быть расположены как на внешней, так и на внутренней поверхности вириона. Более того, показано, что возможна биоконъюгация с поверхностью уже сформировавшихся СЧ (Bruckman et al., 2016).

Морфология СЧ, полученных из нативного препарата ВТМ, из ВТМ с модифицированными а. о. на внутренней или внешней поверхности вириона, или после биоконъюгации различных веществ с сформированными заранее СЧ, не отличались друг от друга (Bruckman et al., 2014b).

СЧ, связанные с различными биологическими веществами

34

посредством биоконъюгации, так же как и немодифицированные СЧ, обладают высокой стабильностью. Для СЧ, конъюгировнных с Су5, биотином и хелатом гадолиния, было показано отсутствие каких-либо морфологических изменений при хранении в воде в течение трёх недель (Вгиекшап et al., 2014Ь).

1.2.4. Безопасность использования СЧ

В отдельной работе была изучена безопасность применения СЧ в качестве основы для контрастных веществ. Продемонстрировано, что СЧ в концентрации 2,5 мг/мл не вызывают гемолиза и не оказывают влияния на показатели свёртываемости крови. Также в экспериментах на мышах было изучено распределение и скорость выведения из организма СЧ, конъюгированных с Су5, при внутривенном введении в дозе 10мг/кг, что соответствует примерно 200-250 мкг СЧ на животное. Показано, что через 4 часа после инъекции СЧ накапливаются преимущественно в печени (клетки Купфера) и селезёнке, а также их присутствие детектируется в тканях лёгких, желудка и почек. Через 24 часа СЧ полностью выводятся из организма мышей (Вгиекшап et al., 2014а). Эти данные свидетельствуют о хорошей биодеградируемости СЧ, что согласуется с результатами их успешного гидролиза протеазами (Никитин и др., 2011, КвепоАэйоу et al., 2019). Гистологические исследования тканей печени и селезёнки, проведённые через 4, 24, 96 часов и 14 дней после инъекции, не выявили каких-либо патологических изменений. Таким образом, на мышиной модели была показана безопасность СЧ, конъюгированных с Су5, при однократном внутривенном введении в дозе 10 мг/кг (Вгисктап et al., 2014а).

Данные результаты свидетельствуют о безопасности использования

СЧ в качестве контрастирующего агента и позволяют надеяться, что

применение СЧ и в иных целях, например, в качестве основы для

рекомбинантных вакцин с внутримышечным способом введения, также

35

будет безопасно, хотя этот вопрос, безусловно, требует дальнейших исследований.

1.2.5. СЧ в противоопухолевой терапии

Для изучения возможности применения СЧ в качестве системы доставки в противоопухолевой терапии были получены СЧ, конъюгированные с противоопухолевым препаратом доксорубицином. Такие СЧ были получены путём биоконъюгации по аналогии с СЧ, конъюгированными с хелатом гадолиния и другими веществами. Однако в данном случае биоконъюгация была не единственным вариантом, который предложили Bruckman с соавторами (2016) для получения СЧ, несущих доксорубицин. Во втором варианте вирионы ВТМ смешивали с доксорубицином и затем подвергали термической обработке в течение 30 секунд при 96°С. В результате формировались СЧ, которые были нековалентно связаны с доксорубицином, который авторы назвали инкапсулированным. Как при конъюгации, так и при инкапсуляции СЧ содержали от 800 до 1800 молекул доксорубицина на частицу. Доксорубицин сохранял способность убивать клетки после конъюгации или инкапсуляции, что было продемонстрировано с использованием двух клеточных линий рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF-7. Интересно отметить, что СЧ поглощались клетками эффективнее, чем вирионы ВТМ, конъюгированные с доксорубицином, что, вероятно, связано с их сферической формой. Несмотря на то, что в экспериментах in vitro не было зарегистрировано статистически значимых различий между эффективностью свободного и инкапсулированного/конъюгированного с СЧ доксорубицина, по мнению авторов исследования, можно ожидать, что белковая платформа-носитель (СЧ) сможет обеспечить преимущество при доставке доксорубицина in vivo, например, за счёт того, что позволит присоединить лиганды, обеспечивающие тканеспецифическую доставку,

или соединения, способные оптимизировать фармакокинетические

36

параметры (например ПЭГ), что позволит снизить дозу доксорубицина (Bruckman et al., 2016).

Также в литературе существуют данные об изучении возможности применения СЧ без какой-либо модификации в целях индукции противоопухолевого иммунитета на примере кожной меланомы. Murray с соавторами (2018) исследовали способность СЧ индуцировать противоопухолевый иммунитет при непосредственном введении в опухоль (in situ вакцинация). Аналогичный эксперимент был проведён с нативными вирионами ВТМ, укороченными вирионами ВТМ, мономером БО ВТМ и ВМКГ. Наиболее эффективным противоопухолевым агентом оказался ВМКГ. Однако, для СЧ, ВТМ и укороченного ВТМ также было показано замедление роста опухоли и увеличение времени выживания у проиммунизированных мышей. Иммунизация субъединичным БО ВТМ никак не повлияла на развитие опухоли. Авторы предполагают, что именно мультивалентная структура вирионов и ВПЧ вирусов растений вне зависимости от их формы и размера играет ключевую роль в активации врождённого иммунитета к опухоли путём стимуляции паттерн-распознающих рецепторов (Murray et al., 2018).

1.2.6. Металлизация СЧ

Ещё одно интересное направление работы с СЧ, которое хотелось бы

рассмотреть, это их металлизация наночастицами золота или ионами

серебра. Вирионы и ВПЧ являются привлекательными каркасами для

создания металлизированных наноконструкций, которые могут быть

потенциально применимы для создания различных комплексных

наноматериалов. В 2012 году японские исследователи показали

возможность модификации СЧ наночастицами коллоидного золота

размером 15 нм (Shah et al., 2012). А в работе учёных из Мексики,

опубликованной в 2017 году, СЧ были использованы в качестве каркаса

для построения наночастиц из серебра (Rodriguez-Galvan et al., 2017). В

37

данной работе проводили восстановление нитрата серебра боргидридом натрия в присутствии СЧ. При однократном добавлении ионов серебра были получены частицы, более 40% которых имели размер менее 5 нм, при этом частицы не агрегировали и не выпадали в осадок. Авторы предполагают, что в данном случае, находящиеся на поверхности СЧ свободные -СООН группы а. о. глутаминовой и аспарагиновой кислот могут служить центрами нуклеации для наночастиц серебра. Использование СЧ в качестве каркаса позволяет проводить на их поверхности контролируемое получение наночастиц серебра, которые имеют узкое распределение по размерам и не агрегируют, что является безусловным плюсом для перспективы их дальнейшего использования (Яоёп§ие7-Оа1уап et al., 2017).

Таким образом, СЧ, полученные при термической перестройке ВТМ, могут быть использованы для создания самых разных биотехнологий, потенциально применимых в различных областях медицины и диагностики. Простота процесса получения, контролируемые размеры, биодеградируемость, безопасность для человека и млекопитающих, уникальные адсорбционные свойства, а также высокий иммуностимулирующий потенциал делают их привлекательной основой для создания вакцин, в составе которых СЧ могли бы играть роль платформы-адъюванта.

2. Краснуха - инфекционное заболевание вирусной природы 2.1. Характеристика, строение и жизненный цикл вируса краснухи

ВК был впервые выделен в 1962 г. Это было сделано независимо двумя группами учёных: в Гарвардском университете и в институте военных исследований Вальтера Рида (Weller & Neva, 1962; Parkman et al., 1962). До 2019 г. он относился к роду Rubivirus, семейству Togaviridae. В настоящее время по новой классификации вирусов ВК по-прежнему остался единственным видом рода Rubivirus, который, однако, стал единственным родом семейства Matonaviridae, относящегося к порядку Hepelivirales, классу Alsuviricetes, типу Kitrinoviricota, царству Orthornavirae, домену Riboviria (ICTV, 2020).

2.1.1. Строение вириона вируса краснухи

ВК — это сложный, то есть покрытый липидной мембраной клеточного происхождения вирус. Мембрана декорирована гетеродимерами вирусных гликопротеинов Е1 и Е2, которые образуют шипы (Рис. 1 I). Вирионы ВК плеоморфны. Большая часть вирионов имеют округлую форму с диаметром примерно 70 нм (диапазон от 50нм до 90 нм), другие представлены вытянутыми или цилиндрическими частицами, достигающими 150 нм в длину, встречаются также вирусные частицы каплевидной формы (Рис. 1 IIa) (Battisti et al., 2012).

Томографические срезы и усреднённые распределения плотности

показывают, что сферические вирионы ВК состоят из двух

концентрических плотных оболочек. Между внутренней и наружной

оболочками располагается область низкой плотности. Внешняя плотная

оболочка образована мембраной и гликопротеинами Е1 и Е2, а внутренняя

представляет собой нуклеокапсид (Рис. 1 Пб), матриксный белок

отсутствует (Battisti et al., 2012; Prasad et al., 2017). Гликопротеиновые

шипы возвышаются над поверхностью вирусной мембраны

39

приблизительно на 8 нм и образуют параллельные ряды (Рис. 1 iib). Согласно модели, построенной на основании томографического анализа, расстояние между параллельными рядами составляет примерно 9 нм. Ряды спарены, причем взаимодействие между двумя частями пары сильнее, чем между соседними неспареными рядами (Рис. 1 IIr). Е2 может образовывать связи между парами рядов и частично покрыт гликопротеином Е1 (Рис. 1 IIr). Ряды гликопротеинов обычно расположены перпендикулярно длинной оси вытянутых вирионов (Рис. 1 Пв) (Battisti et al., 2012; Prasad et al., 2017).

Рис. 1. Строение вирионов ВК.

I. Схематичное изображение вириона ВК (по Hulo et al., 2011).

II. Крио-электронная томография срезов вирионов (а-в) (по Prasad et al., 2017) и модель расположения поверхностных гликопротеинов (г) (по Battisti et al., 2012).

Более тёмный цвет соответствуют областям с более высокой плотностью. Красные пунктирные прямоугольники обозначают отдельные шипы, сформированные гетеродимером белков Е1 и Е2. Красные пунктирные овалы указывают на места соединения внутренней оболочки (нуклеокапсида) и внешней оболочки (мембрана и гликопротеины). Черные стрелки указывают на параллельные ряды гликопротеинов. Размер масштабной метки: а - 200А, б и в - 100А. На схеме г красные эллипсоиды отражают положение гликопротеина Е1, синие сферы - гликопротеина Е2.

III. Модель спирального расположения рядов гликопротеинов на поверхности вытянутого (а), цилиндрицеского (б) и округлого (в) вирионов ВК (по Prasad et al., 2017). Размер масштабной метки - 100А.

Организация рядов гликопротеинов на поверхности вирионов ВК с рзличной структурой носит нерегулярный спиральный характер (Рис. 1 III). Нуклеокапсид ВК состоит из БО и геномной РНК. Поверхность нуклеокапсида повторяет контур вирусной мембраны. Димеры белка оболочки образуют псевдотетрамерные структуры, которые организованы в параллельные ряды, располагающиеся примерно перпендикулярно рядам гликопротеинов Е1 и Е2. То есть, спиральное расположение

гликопротеинов Е1 и Е2 на поверхности вириона ВК коррелирует с псевдотетрамерной организацией белка оболочки (Prasad et al., 2013, 2017). Это единственный сложный вирус со спиральной структурой внешней поверхности, так как все другие известные сложные вирусы со спиральной симметрией проявляют её лишь в структуре внутреннего нуклеокапсида и/или слое матриксного белка (Prasad et al., 2017).

2.1.2. Жизненный цикл вируса краснухи

Проникновение в клетку происходит посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Вирусные гликопротеины взаимодействуют с рецепторами клетки хозяина, инициируя клатрин-зависимый эндоцитоз. Далее происходит слияние вирусной мембраны с мембраной эндосомы клетки хозяина, и вирусная РНК освобождается в цитоплазму (Hulo et al., 2011).

Геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной 9756 нуклеотидов (нт.) (без учета длины поли(А)) (Frey, 1994). Содержание G/C нт. составляет 69,91%, что больше? чем у любого другого РНК-содержащего вируса (Phakaratsakul et al., 2018). На 5'-конце вирусной РНК находится кэп-структура [m G(5')ppp(5')Np] (Oker-Blom et al., 1984a). На 3'-конце - поли(А) последовательность, длина которой может варьировать и в среднем составляет 53 нт. (Wang et al., 1994).

Геномная РНК ВК содержит две длинные открытые рамки считывания (ОРС). 5'-проксимальная ОРС состоит из 6345 нт. (с 41 по 6385) и кодирует неструктурные белки, 3' -проксимальная ОРС состоит из 3189 нт. (с 6506 по 9694) и кодирует структурные белки (Dominguez et al., 1990). 5'-нетранслируемая область состоит из 40 нт., 3'-нетранслируемая область имеет длину около 60 нт. ОРС не перекрываются и разделены нетранслируемым участком длиной 120 нт. (Frey, 1994) (Рис. 2).

5'-проксимальная ОРС кодирует полипротеин p200, который состоит

из 2116 а. о., его молекулярная масса, рассчитанная исходя из первичной

41

последовательности белка, составляет 231 кДа, однако он обладает аномальной электрофоретической подвижностью и мигрирует в геле на уровне белков с массой 200 кДа (Forng & Frey, 1995).

г Разрезание V катализируется Р150

кэп

Разрезание катализируется сигнальными пептидазами

Рис. 2. Структура генома ВК (по Hulo et al., 2011).

БО - Белок оболочки

RdRp - РНК-зависимая-РНК-полимераза

p200 содержит сайт протеолиза между 1301 и 1302 а. о. В результате разрезания, которое происходит автокаталитически, образуются неструктурные белки p150 (N-терминальный продукт, 1-1301 а. о.) и p90 (RdRp) (С-терминальный продукт, 1302-2116 а. о.) (Chen et al., 1996). В составе р150 содержатся метилтрансферазный домен и домен папаинподобной тиоловой протеазы (Marr et al., 1994). Протеазный домен р150, находящегося в составе полипротеина р200, осуществляет автокатализ (Рис. 2). Белок р90 обладает ферментотивными активностями хеликазы и РНК-зависимой-РНК-полимеразы (RdRp) (Frey, 1994). р90 содержит в своем составе характерный для RdRp трипептид Gly-Asp-Asp (1966-1968 а. о.), замены в котором критически сказываются на репликации вируса (Wang & Gillam, 2001).

3'-проксимальная ОРС кодирует структурные белки в следующем порядке: NH2-B0-E2-E1-C00H. Они транслируются с 24S субгеномной РНК в виде полипротеина р110, который затем гидролизуется с образованием БО и гликопротеинов Е1 и Е2 (Oker-Blom, 1984b). Разрезание катализируется сигнальными пептидазами клетки хозяина (Рис. 2).

Полипротеин-предшественник p200 катализирует синтез цепи РНК отрицательной полярности на матрице геномной РНК, а процессированные белки р150 и р90 осуществляют синтез (+) РНК на матрице (-) РНК (Liang & Gillam, 2001). Реализация генетической информации ВК происходит следующим образом (Liang & Gillam, 2001) (Рис. 3):

1) После проникновения вируса в клетку 40 S геномная РНК транслируется на рибосомах с образованием полипротеина р200.

2) Полипротеин р200 взаимодействует с 3'-концом мРНК, направляющей его синтез, и начинает катализировать процесс образования (-) РНК на матрице геномной РНК. В этом процессе также участвуют белки клетки-хозяина.

3) Далее р200 гидролизуется белком р150, находящимся в составе полипротеина (автокатализ) с образованием белков р150 и р90.

4) Комплексы белков р150 и р90 (RdRp) катализируют синтез 40S геномной РНК и субгеномной 24 S РНК, которая направляет синтез БО, Е1 и Е2.

Содержание (+) РНК молекул в инфицированных клетках больше, чем (-) РНК (Banatvala & Peckham, 2007), а субгеномных РНК синтезируется в 1,3 - 1,8 раза больше, чем (+) РНК (Hemphill et al., 1988).

Chen и Icenogle (2004) показали, что БО ВК принимает активное участие в регуляции репликации генома. Он может как стимулировать, так и ингибировать репликацию. При низком уровне содержания вирусной РНК в клетке и небольшом количестве свободного БО происходит стимуляция репликации. При большом содержании геномной РНК вируса в клетке БО ингибирует её репликацию, возможно путем вовлечения в сборку вирионов посредством БО-РНК взаимодействий (Chen & Icenogle, 2004).

Рис. 3. Схема реализации генетической информации ВК в клетке хозяина (по Liang & Gillam, 2001).

40S РНК - 40S геномная РНК 24S сгРНК - 24S субгеномная РНК

Структурные белки вируса локализуются в области аппарата

Гольджи (АГ) и на поверхности цитоплазматических везикул.

Полипротеин-предшественник структурных белков ВК ассоциирован с

эндоплазматическим ретикуломом (ЭПР) клетки хозяина (Oker-Blom et al.,

1984a). В составе полипротеина транслируются Е1 и Е2 сигнальные

пептиды, необходимые для правильного заякоривания структурных белков

в мембранах ЭПР и АГ и последующей сборки вируса (Hobman et al.,

1997). После котрансляционного разрезания БО остается прикрепленным к

цитоплазматической стороне мембраны в силу гидрофобности Е2

сигнального пептида (Рис. 4) (Suomalainen et al., 1990). БО связывается с

геномной РНК и формирует нуклеокапсид (Hobman & Chantler, 2007). С-

концевой участок белка Е2 состоит из трансмембранного якоря и

гидрофобного мембран-ассоциированного сигнального пептида Е1 (Рис.

44

4), которые соединены коротким гидрофильным цитоплазматическим доменом из семи а. о., пять из которых - остатки аргинина (Frey et al., 1986).

Рис. 4. Структурные белки ВК (по Prasad et al. ,2013).

А. Структурные белки в составе полипротеина предшественника.

Б. Положение структурных белков в мембране ЭПР после пострансляционного разрезания. Е1-зелёный, Е2 - красный; Е1 сигнальный пептид - желтый, Е2 сигнальный пептид - синий.

Цитоплазматический домен Е2 играет ключевую роль в сборке ВПЧ. Предполагается, что положительно заряженные остатки аргинина вовлечены в электростатические взаимодействия с положительно заряженными а. о. БО. В составе БО обнаружено два близко расположенных кластера остатков аспарагиновой и глутаминовой кислоты (143-151 и 183-189 а. о.), которые могут потенциально связываться с остатками аргинина. Гидрофобные взаимодействия между Е2 сигнальным пептидом, присоединенным к С-концу белка оболочки, и трансмембранным доменом Е2 в мембране аппарата Гольджи также могут увеличивать электростатические взаимодействия между Е2 и белком оболочки во время сборки частиц (Garbutt et al., 1999).

Сборка вирионов происходит в АГ. После отпочковывания в цистерну аппарата Гольджи вирусные частицы транспортируются к клеточной поверхности в везикулах, которые являются производными АГ, и сливаются с плазматической мембраной (Hobman et al., 1994).

2.1.3. Генотипы вируса краснухи и их распространение

ВК представлен одним единственным серотипом, тем не менее,

штаммы ВК обладают генетической вариабельностью. Существует 13

генотипов ВК, которые объединяют в две монофилетические

таксономические группы, называемые кладами (англ. - clades) (Katow et

al, 1997; Rivailler et al, 2017; WHO, 2013, 2020). Изначально было

выявлено два генотипа ВК RGI (Rubella Genotype I) и RGII (Rubella

Genotype II), разделение которых было основано на сравнении

последовательностей гена белка Е1 (Frey et al., 1998). Позднее было

показано, что филогенетическое древо, построенное на основе анализа

участка гена белка Е1 с 8687 по 9088 п.н., практически идентично

филогенетическому древу, построенному на основе анализа полной

нуклеотидной последовательности гена белка Е1. Этот промежуток был

назван «молекулярным эпидемиологическим окном». Основываясь на

сравнении нуклеотидной последовательности данного участка у разных

штаммов, было выявлено, что различие между генотипами RGI и RGII

составляет около 8%. Вариативность в пределах RGI не превышает 5,8%. В

то же время внутри генотипа RGII были выявлены три группы: RGIIA,

RGIIB и RGIIC; вариативность внутри каждой из групп была около 5,5%, а

вот различия между группами составили около 7%, поэтому они были

выделены как отдельные генотипы. В 2003 году впервые была показана

возможность существования рекомбинации между различными штаммами

(Zheng et al., 2003). Zhou с коллегами (2007) в своих исследованиях взяли

за основу стандартный участок гена гликопротеина Е1 с 8291 по 9469 нт.,

рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для

генотипирования ВК. Основываясь на рекомендациях ВОЗ (WHO, 2005),

они выделили 10 генотипов ВК, семь из которых принадлежат к кладе 1

(1a, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F и 1g), а три из которых - к кладе 2 (2A, 2B и 2c),

причём генотипы, обозначенные маленькими буквами, были

промежуточными. Клады 1 и 2 соответствуют ранее описанным генотипам

46

RGI и RGII. Вирусы, относящиеся к кладе 1, распространены по всему миру, в то время как вирусы, относящиеся к кладе 2, преобладают в Евразии. Также в 2007 г. было показано, что 78% нуклеотидной последовательности генома является консервативной для всех ВК (Zhou et al., 2007). В 2013 г. Abernathy с коллегами также на основании рекомендаций ВОЗ выделили уже 10 генотипов, относящихся к кладе 1(1a, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1h, 1i и 1j), при этом 1a, 1h, 1i и 1j считались промежуточными. Помимо этого, исследуя нуклеотидные последовательности 30 штаммов вирусов краснухи, 16 из которых были отсеквенированы ими впервые, они продемонстрировали консервативность 74% нуклеотидной последовательности ВК. Процент идентичности аминокислотной последовательности составил 89% (Abernathy et al., 2013). С 2013 года ВОЗ выделяет 13 генотипов, относящихся к двум кладам, из которых 12 - это признанные генотипы (1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1I, 1J, 2A, 2B, 2C) и один промежуточный (1а) (WHO, 2013). C 2016 г. в документах ВОЗ появляется информация о 13 признанных генотипах (WHO, 2016, 2020). Генотипы ВК, определённые по данным из различных источников, представлены в таблице 2.

Генотипы 1B, 1C, 1D и 1F связаны с определёнными географическими зонами. Так, например, 1B чаще всего встречался в Европе и вдоль восточного побережья Южной Америки, а в 2007-2008 г.г. был зарегистрирован в Южной Африке; 1С — в Центральной Америке и вдоль западного побережья Южной Америки; 1D — в странах Азии и в Эфиопии; 1F — в Китае. Генотип 1E, впервые идентифицированный в 1997 году, сейчас распространён по всему миру. Генотип 1H содержит штаммы из Европы и Азии. Генотипы, относящиеся к кладе 2, были обнаружены только в Африке, Азии и Европе. Генотип 2B - наиболее распространённый генотип клады 2. Генотип 2А был обнаружен только в Китае, а генотип 2С - только в РФ (WHO, 2005; Reef & Plotkin, 2018).

Источник, год Описанные генотипы

Frey et al., 1998 RGI RGII

Zheng et al., 2003 RGI RGIIA RGIIB RGIIC

Zhou et al., 2007 1a, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1g 2A 2B 2C

Abernathy et al., 2013 1a, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1i, 1h, 1j 2A 2B 2C

ВОЗ, 2013 г. (WHO, 2013) 1a, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1I, 1H, 1J 2A 2B 2C

ВОЗ с 2016 г. по настоящее время (WHO, 2016, 2020) 1А, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1I, 1H, 1J 2A 2B 2C

Таблица 2. Генотипы ВК по данным различных источников.

RG - Rubella Genotype (генотип вируса краснухи).

Генотипы, обозначенные маленькими буквами, являются промежуточными.

В настоящее время краснуха считается искоренённой в Американском регионе и пока остаётся эндемичной на территории остальных регионов (Европейском, Африканском, Восточно-Средиземноморском, Юго-Восточной Азии и Западно-Тихоокеанском) (Brown et al., 2019). Последние сведения о циркуляции 1D были в 1996 году, 1F - в 2002 г., 1I - в 1994 г., а дикий тип 2A последний раз был замечен в 1980 г. (WHO, 2013, 2016, 2020), хотя вакцинные дериваты 2A были зарегистрированы в 2001 г. (Zhu et al., 2010). Генотип 1А был широко распространён в мире до 1984 г. В 1985 г. был зарегистрирован в Канаде и после этого вплоть до 2005 встречается только в Монголии и Республике Союза Мьянма (WHO, 2005). В 2006 г. генотип 1а был зарегистрирован в Казахстане, в 2008 г. в Японии, в 2009 г. в Камбодже (Reef & Plotkin, 2018). С 2010 по 2015 гг. в мире встречались только генотипы 1А, 1Е, 1G, 1J и 2B. В 2016 году были зафиксированы случаи краснухи, вызванной пятью генотипами (1E, 1G, 1H, 1J и 2B), причём большинство определённых последовательностей относились к генотипам

1E и 2B. В 2018 году были получены данные о распространении только двух генотипов - 1Е и 2B. Однако отмечается, что эти данные могут быть не полными, так как 96,6% изученных последовательностей относятся к Западно-Тихоокеанскому региону, а два региона с наибольшим количеством подтверждённых случаев краснухи (Африканский и Восточно-Средиземноморский) не предоставляли данные о генотипах (Brown et al2019; WHO, 2020).

2.2. Структурные белки и антигенные детерминанты вируса

краснухи

Основным антигеном ВК является гликопротеин Е1, так как большинство нейтрализующих вирус АТ направлено против него (Waxham & Wolinsky, 1985). Однако было показано, что специфические к Е2 АТ тоже способны нейтрализовать вирусную инфекцию in vitro (Green & Dorsett, 1986). И более того, Т- и В-клеточные эпитопы присутствуют в составе БО и гликопротеина Е2 (Ou et al., 1992a,b,c). Таким образом, все структурные белки вируса являются антигенами, каждый из которых несет определенные эпитопы.

Белок Е1 и белок Е2 принадлежат к мембранным белкам и, как уже ранее было описано в разделе 2.1 обзора литературы, формируют гетеродимеры (Baron & Forsell, 1991). Е1 и Е2 содержат соответственно 481 и 282 а. о., С-концевые трансмембранные сегменты (Рис. 4) заякоривают белки в мембране вириона (DuBois et al., 2013).

2.2.1. Гликопротеин Е1

Гликопротеин Е1 несет основные антигенные детерминанты ВК и является основным антигеном, на который вырабатываются АТ во всех случаях заболевания, кроме случаев синдрома врожденной краснухи (СВК) (Katow, Sugiura, 1985). Молекулярная масса гликопротеина Е1 составляет 58 кДа (Oker-Blom et al, 1983). Е1 гликозилирован по трем а. о.: Asn76, Asn177 и Asn209, расположенным на N-конце, размер каждого олигосахарида около 2 кДа (Hobman et al., 1991), молекулярная масса негликозилированного Е1 - 53 кДа (Oker-Blom et al, 1983). Углеводы не принимают непосредственного участия в образовании антигенных структур гликопротеина Е1 и не влияют на его связывание с АТ. Однако они необходимы для правильного фолдинга и поддержания стабильной

конформации, при удалении любой олигосахаридной боковой цепи Е1 происходит снижение иммуногенности (Qiu et al., 1992).

Е1 отвечает за взаимодействие с клеточными рецепторами. Было показано, что гликопротеин миелиновых олигодендроцитов (МОГ) специфически связывается с Е1 и обеспечивает проникновение вируса в клекту. АТ к МОГ блокируют вирусную инфекцию, а экспрессия МОГ в клетках, непермиссивных к вирусу краснухи, делает их пермиссивными (Cong et al., 2011).

Эктодомен Е1 состоит из трех богатых Р-слоями доменов, называемых 1, 2 и 3. Также Е1 имеет трансмембранный якорь и небольшой цитоплазматический домен; короткий S участок соединяет домен 3 и трансмембранный якорь (Рис. 5А). Получение кристаллической структуры Е1 (Рис. 5Б) позволило выявить структурную гомологию с вирусными белками слияния второго класса (DuBois et al., 2013), однако Е1 отличается от них наличием двух петель слияния (Dube et al., 2014). Сегмент полипептида, формирующий большую часть поверхности слияния, расположен на амино- и карбокси-концах петель слияния (петли слияния 1 и 2 образованы а. о. 88-93 и 131-137, соответственно), которые выдаются в направлении мембраны. Эти петли могут принимать различные конформации и взаимодействовать с мембраной (Рис. 5А,Б) (DuBois et al., 2013). Функциональная значимость этого участка также была продемонстрирована в экспериментах Qiu с коллегами (2000). Мутации в гидрофобном домене Е1 не оказывали влияния на сборку вириона, однако значительно подавляли вирусную инфекцию, это позволило авторам предположить, что гидрофобный домен Е1 принимает непосредственное участие в процессах слияния (Qiu et al., 2000).

Уникальной особенностью гликопротеина Е1 ВК является наличие сайта связывания металла. Ион металла находится между атомами основной и боковой цепи, в петле слияния 1 он связан с Asn88, а в петле слияния 2 - с Asp136 (Рис. 5Б) (DuBois et al., 2013). В 2014 году было

51

установлено, что Ca2+ критически необходим для индуцируемого понижением pH встраивания E1 в мембрану эндосомы и последующего выхода вируса в цитоплазму. В отсутствия Ca2+ вирус терял инфекционность, хотя мог связываться с рецепторами на поверхности клеток и подвергаться эндоцитозу ^иЬе & а!., 2014).

DI DI DI DIII S TM+C

HJi Ji ш

414-DPAAQSFTGVWGTHTTAVSETRQTWAEM'AAAH

N-ter

Рис. 5. Структура гликопротеина Е1 ВК (А, Б) (по DuBois et al., 2013) и соотнесение атомарной структуры эктодомена Е1 со структурой шипа на поверхности вирусной частицы (В) (по Prasad et al., 2017).

A. Линейная диаграмма. Эктодомен окрашен, трансмембранный и цитоплазматический домен представлены белым. FL1 - петля слияния 1; FL2 - петля слияния 2; DI, DII, DIII - домены 1, 2 и 3 соответственно; S - S-участок; TM+C - трансмембранный и цитоплазматический домены. Б. Трехмерная диаграмма эктодомена Е1 в составе тримера. Дисульфидные связи представлены зеленым. Домены окрашены в соответствии с диаграммой А. Стрелки указывают на сайт связывания металла.

B. Усреднённая структура шипа ВК (голубой цвет) на поверхности вирусной мембраны (жёлтый цвет), полученная с помощью криоэлектронной томографии. Желтая звёздочка указывает на положение гликопротеина Е2. Чёрными скобками отмечены иммуногенные регионы поверхности Е1. Масштабная метка 25А.

Существует предположение, что вариабельность шипов ВК, наблюдаемая при изучении структуры вириона методом криоэлектронной томогафии, связана с тем, что E1 имеет гибкие концы. Такое строение

могло бы помочь избежать непродуктивных взаимодействий Е1 с мембранами при нейтральном pH, и объяснить потребность в ионах кальция для стабилизации конформации петли слияния при низких рН в эндосоме. Соотнесение структуры шипа ВК, полученной с помощью томографического анализа, с атомарной структурой эктодомена Е1 позволило визуализировать положениее Е1 в соотаве вириона (Рис. 5В) и продемонстрировать, что основные иммуногенные участки Е1, определённые в более ранних исследованиях, располагаются в дистальной части шипа (на рисунке 5В отмечены черным пунктиром) (Prasad et al., 2017).

На рисунке 6 схематично представлены эпитопы поверхностного гликопротеина Е1, которые были идентифицированы и опубликованы различными исследовательскими группами по мере изучения этого вопроса. Некоторые из них обладают только нейтрализующей или только гемагглютенирующей активностью, другие же могут проявлять обе активности одновременно. Также на рисунке 6 отмечены участки, активирующие клеточный иммунный ответ.

Прежде всего при помощи моноклональных антител (МАТ) было идентифицированно три эпитопа гликопротеина Е1 (Е1ЕР1, Е1ЕР2 и Е1ЕР3). Е1 ер1 и е1ер2 обладают гемагглютинирующий и нейтрализующей активностями, а Е1ЕР3 только нейтрализующей активностью (Ho-Terry et al., 1986). Немного позднее было установлено, что эти три эпитопа локализуются между 245-285 а. о. Е1 (Terry et al., 1988). Далее последовательность между 243 и 286 а. о. была детально проанализирована посредством синтеза полного набора перекрывающих октопептидов, полностью охватывающих этот участок. В результате было показано, что

250 252

важнейшая часть ЕР2 эпитопа - это трипептид PER , основной частью

260 263

эпитопа ЕР3 является тетрапептид ADDP , а эпитоп ЕР1 состоит из

273 275

двух эпитопов: первый соответствует трипептиду EVW , а второй октапептиду 278PVIGSQAR285 (Lozzi et al., 1990). Они были названы E1a и

53

E1b. Кроме того, группой этих исследователей было показано, что нет никакой разницы в силе связывания МАТ для разных штаммов ВК, то есть определенные ранее эпитопы являются консервативными (Londesboroug et al, 1995).

| | - Нейтрализующая I I - Гемагглгатиниругащая | | - Нейтрализующая и | | - Активация

активность активность гемагглгатиниругащая клеточного

активности одновременно иммунитета

213-233 Mitchell et al., 1993

_I 273-284 Qu et al, 1994 |

| 258-277 Mitchell et gl., 1993 |

| 219-233 Chaeeíoí, 1992

214-233 Chaeefí¿s1992

214-240 Ctaeetal, 1992 1

Глнкопротенн Е1 (208-285)

208-239 WoKnski etal., 1993: Mertsch et al 1997; 245-285Тепуе/о/. 198S

Corboba etal., 2000; Karpovaef o¿s2012 E2 1 ЕЗ 1 El

| 221-239 DuBois etal, 2013 | 250-252 | 1 260-263 | 273-275 278-285

| 223-239 DuBois et id., 2013 Ela Elb

<-Ho-Theny et al., 1986 ^-Lozzi etal, 1990 ^-Londesboroug etal., 1995

Рис. 6. Антигенные детерминанты гликопротеина Е1 ВК по данным различных источников.

Chaye с коллегами (1992) исследовали участок с 193 по 269 а. о. также посредством МАТ и выяснили, что этот регион тоже содержит гемагглютинирующие и нейтрализующие эпитопы. Согласно их данным, гемагглютинирующий эпитоп располагается в области Е1214-Е1240, а два нейтрализующих эпитопа - в области Е1214-Е1233 и Е1219-Е1233 (Chaye et al., 1992). В 1993 г. при изучении клеточного иммунного ответа на структурные белки ВК была показана способность индуцировать пролиферацию лимфоцитов для участков гликопротеина Е1213-Е1239, Е1258-Е1277 (Mitchell et al., 1993) и Е1273-Е1284 (Ou et al., 1994). Более того, было установлено, что данные участки содержат перекрывающиеся В- и Т-клеточные антигенные детерминанты и обладают нейтрализующей активностью (Mitchell et al., 1993; Ou et al., 1994).

При изучении нейтрализующих эпитопов гликопротеина Е1 ВК с помощью перекрывающихся синтетических пептидов и МАТ было продемонстрировано, что пептид Е1208-Е1239, названный SP15, эффективно

связывается с двуми типами МАТ (Wolinsky et al., 1993). Этот же участок (Е1208-Е1239) в более поздних публикациях других авторов фигурирует под названием эпитоп А (Karpova et al., 2012). Ключевыми последовательностями для связывания АТ являются 221-239 а. о. и 223-239 а. о. (Wolinsky et al., 1993). Было установлено, что 223-239 а. о. (сегмент, включающий в себя восьмую дисульфидную связь) содержат важный нейтрализующий эпитоп. Данный эпитоп расположен в центре тримера из эктодоменов Е1. Такая структура позволяет предположить, что механизм нейтрализации основан на том, что связывание АТ с эпитопом блокирует тримеризацию и дальнейшее проникновение вируса в клетку (DuBois et al., 2013). Позднее была продемострирована ключевая роль Arg237 и His238 гистидина в формировании нейтрализующего эпитопа (Li et al., 2014). Иммунизация мышей и кроликов пептидом SP^/эпитоп А индуцирует выработку поливалентных АТ, которые способны нейтрализовать инфекционность ВК in vitro (Wolinsky et al., 1993). Консервативность этого участка была продемонстрирована для ряда штаммов: Therien (Frey et al., 1986; Domínguez et al., 1990), M33 (Clarke et al., 1987), Judith (Terry et al., 1988) HPV77 (Zheng et al., 1989). В настоящее время считается, что SP^/эпитоп А консервативен для всех штаммов ВК (Petrova et al., 2016). Вакцинный штамм RA27/3 отличается только одной аминокислотной заменой в этом участке: His-210 на Tyr-210 (Nakhasi et al., 1989), однако эта замена находится вне минимальной критической эпитоп-содержащей области (Wolinsky et al., 1993). Анализ уровня АТ к SP^^m^ А можно использовать для диагностики СВК в пренатальный период. У новорожденных с СВК наблюдается сильно сниженный уровень АТ к этому фрагменту, в то время как у новорожденных с бессимптомной внутриутробной вирусной инфекцией вируса краснухи наблюдался нормальный уровень АТ к SP^/эпитоп А.

Cordoba с коллегами (2000) использовали МАТ, связывающиеся с последовательностью с 208 по 239 а. о. гликопротеина Е1 (SP^/эпитоп А),

55

для того чтобы временно блокировать выход вирионов из клеток VERO, инфицированных вирусом краснухи. Взаимодействие с МАТ задерживало выход вирионов из инфицированных культур в течение 24 часов. Таким образом, нейтрализующий домен SPlS/эпитоп А индуцирует выработку АТ, которые обладают нейтрализующей и гемагглютенирующей активностями, а также могут препятствовать входу вируса в клетку и задерживать выход вируса из клетки. Эти результаты свидетельствуют о том, что SPlS/эпитоп А играет ключевую роль в защитных механизмах гуморального иммунного ответа и может быть использован для создания рекомбинантных вакцин (Cordoba et al., 2000).

Результаты биоинформатического анализа эпитопов хорошо соотносятся с экспериментальными данными. Наиболее вероятным

233 240

В-клеточным эпитопом Е1 является последовательность PVCQRHSP , которая входит в состав SP^^m^ra А. Помимо этого, для консервативной последовательности 101YFNPGGSSY109 была предсказана высокая вероятность связывания с главным комплексом гистосовместимости I-го типа (Major Histocompatibility Complex I - MHC I), а для коровой последовательности FTGVVYGTH, располагающейся в диапазоне 417-434 а. о., - с главным комплексом гистосовместимости II-го типа (Major Histocompatibility Complex II - MHC II) (Elgenaid et al, 2018).

2.2.2. Гликопротеин Е2

При электрофоретическом анализе белка Е2 фиксируются две полосы: Е2а с молекулярной массой 47 кДа и Е2Ь с молекулярной массой 42 кДа. Различия в молекулярной массе связаны с различной степенью гликозилирования продукта одного гена. Молекулярная масса негликозилированного Е2 составляет 30 кДа (Oker-Blom et al., 1983).

При изучении имунного ответа к различным белкам ВК было

показано, что титры АТ к белкам Е1 и БО остаются относительно

постоянными вне зависимости от штамма ВК, выбранного в качестве

56

антигена. В то же время АТ к Е2 специфично реагировали только с гомологичными антигенами, а с антигенами других штаммов взаимодействовали слабо. Исходя из этих наблюдений, было сделано предположение, что белок Е2 несет штамм-специфичные эпитопы (Dorsett et al., 1985).

Как правило, Е1 является доминантным антигеном, и сыворотки к ВК содержат больше АТ к Е1, чем к Е2. В случае СВК ситуация иная, наблюдается увеличение соотношения АТ Е2/Е1. Katow и Sugiura (1985), обнаружившие это явление, предположили, что это может быть связано с тем, что Е2 менее иммунодоминантен, чем Е1, и для поддержания гуморального иммунитета к Е2 после определенного времени требуется повторная стимуляциия антигеном вируса, персистирующего в организме. Также авторы предположили, что увеличение соотношения АТ Е2/Е1 может быть связано со снижением количества АТ к Е1 при СВК, например, за счет частичной толерантности в период внутриутробного развития (Katow, Sugiura, 1985).

В 1986 году Green и Dorsett получили несколько вариантов МАТ к ВК и показали, что гликопротеин Е2 узнается одним из вариантов МАТ, которые обладают нейтрализующей активностью, то есть содержит нейтрализующий эпитоп (Green, Dorsett, 1986). Позднее при исследовании Т-клеточных эпитопов Е2 с помощью 15 перекрывающихся синтетических пептидов, покрывающих последовательность белка, было показано, что наиболее часто распознаваемый эпитоп Е2 - это Е2-4, представленный 5474 а. о. Для более точного определения Т-клеточной детерминанты были использованы укороченные пептиды, перекрывающие последовательность Е2-4. Результаты показали, что 54-65 а. о. Е2 непосредственно вовлечены в Е2-4 Т-клеточную детерминанту (Ou et al., 1992a).

По данным биоинформатического анализа, пептид 163AQYPP167, скорее всего, является В-клеточным эпитопом Е2. Для консервативной

ОАО

последовательности FVLLVPWVL предсказана наибольшая

57

вероятность высокоаффинного связывания одновременно с MHC I и MHC II (Elgenaid et al., 2018).

2.2.3. Белок оболочки вируса краснухи

Белок оболочки (33 кДа) (Oker-Blom et al., 1983), исключая Е2 сигнальный пептид, состоит из 277 а. о. (Frey, 1994). Мономер БО состоит из пяти антипараллельных Р-слоёв - А, B, C, D и Е и из одной, состоящей из двух витков, а-спирали Н между слоями В и С. Слои и спираль образуют петли AB, BH, HC, CD и DE. ВН-петля самая длинная и содержит а. о. с 176 по 197 (Рис. 7А). (Prasad et al., 2013). Белок оболочки формирует гомодимеры, связанные дисульфидными мостиками (Baron & Forsell, 1991). Дисульфидные связи образуются между Cys-153 и Cys-197 (Рис. 7Б) (Prasad et al., 2013).

А

Б

Рис. 7. Структура БО ВК (по Prasad et al., 2013).

А. Мономер БО.

Б. Димер БО. Две трёхмерные модели димера БО повернуты на 180° осносительно друг друга. Дисульфидные связи показаны синим. Цепи мономеров показаны бирюзовым и пурпурным.

БО ВК не только упаковывает вирусную РНК в капсид, но также участвует в вирусной транскрипции и репликации. Он регулирует репликацию вирусной РНК путем взаимодействия с неструктурными белками вируса (Cheng et al., 1995). Другие функции этого белка связаны с взаимодействием с белками клетки хозяина. Он ингибирует апоптоз путем формирования комплекса с Bax (Ilkow et al., 2011). БО взаимодействует и с

другими хозяйскими белками, такими как р32 (Веа1:сИ, НоЬшап, 2000). Кроме того, он может блокировать импорт хозяйских белков в митохондрии (Ilkow ег а!., 2010). БО ВК взаимодействует с клеточным фактором инициации транскрипции - поли(А) связывающим белком, что может блокировать белковый синтез в конкретном внутриклеточном локусе или предотвратить дальнейшую трансляцию вирусных РНК (Ilkow ег а!., 2008).

Было показано, что четыре Т-клеточных эпитопа БО ВК располагаются в районе следующих а. о.: 96-123, 119-152, 205-233 и 255280. Пептиды, содержащие вышеперечисленные а. о., способны стимулировать чувствительные к вирусу краснухи Т-клеточные линии, полученные от серопозитивных пациентов. Пептид 255-280 а. о. узнавался одновременно четырьмя клеточными линиями, полученными от разных доноров, пептиды 96-123 а. о. и 199-152 а. о. - двумя разными клеточными линиями, а пептид 205-233 а. о. - только одной. Также были обнаружены два участка белка оболочки -1-30 а. о. и 96-123 а. о., содержащие иммунодоминантные В-клеточные эпитопы (Ои ег а!., 1992с).

258 261

По данным биоинформатического анализа, пепетид РРНТ , скорее всего, является В-клеточным эпитопом БО ВК. Наибольшая вероятность связывания с МНС I предсказана для последовательности

174 1Я9

БТКСОТРРЬ ; с МНС II - для коровой последовательности ЕУКУБЬНРТ, располагающейся в диапазоне 161-181 а. о. (Б1§епа1ё ег а!., 2018).

2.3. Клиническая картина краснухи, специфический иммунный ответ и вакцинация

2.3.1. Клиническая картина, распространение и осложнения краснухи

Краснуха - это антропонозная инфекция, единственным известным носителем ВК является человек. Инфицирование происходит при контакте с выделениями из носоглотки заражённого человека. Инкубационный период составляет 14-18 дней, но может варьироваться до 12-23 дней после заражения. Вирус, попавший на слизистую носоглотки восприимчивого к болезни человека, начинает размножаться в клетках респираторного эпителия, распространяется по близлежащим лимфатическим узлам и активно реплицируется в них в течение всего времени болезни. На 3-8 день после первых симптомов вирус попадает в кровоток, а затем в кожу и другие органы. В крови вирус циркулирует примерно с 6 по 20 день, но период наиболее активной виремии и вирусурии приходится на 10-17 сутки. Начиная с 17 дня происходит снижение виремии и переход к выздоравливанию. Вирус может быть выделен из носоглотки за неделю до и через две недели после появления сыпи. Но наиболее опасным для дальнейшего распространения вируса является период в течение 3 дней до появления сыпи и 7 дней после появления сыпи (WHO, 2007a).

Наиболее частыми осложнениями краснухи являются боли в суставах. Вероятность возникновения артрита или артралгии после краснухи у женщин, перенёсших заболевание в постпубертатном периоде, составляет около 50% (Tingle et al., 1986). Реже встречаются такие осложнения как пурпурная сыпь (1/1500 случаев перенесённой краснухи), переходящая тромбоцитопения (1/3500 случаев перенесённой краснухи) и постинфекционная энцефалопатия (1/5000 - 1/10000 случаев перенесённой краснухи). Редким осложнением является гемолитическая анемия и синдром Гийена-Барре (Banatvala & Brown, 2004).

СВК - наиболее опасное последствие краснухи. Причиной СВК

является фетальная инфекция краснухи во время внутриутробного развития, которая может привести к выкидышу, мертворождению или тяжёлым врождённым порокам развития. Потеря слуха - наиболее частое проявление СВК. Риск врождённых дефектов плода после перенесённой во время беременности краснухи варьирует от 10 до 90% и зависит от внутриутробного возраста плода на момент инфекции. Наиболее опасно заражение в первом триместре беременности (WHO, 2007a).

2.3.2. Иммунный ответ при естественной инфекции краснухи

В процессе вирусной инфекции в организме развивается гуморальный и клеточный иммунный ответ. Гуморальный иммунный ответ появляется через 14-18 дней после инфицирования, что примерно совпадает со временем появления сыпи. Специфический клеточный иммунный также развивается в ответ на инфекцию и сохраняется в течение всей жизни (WHO, 2007a).

В гуморальном иммунном ответе участвуют все типы иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD (Salonen et al., 1985).

Пик концентрации IgM приходится на вторую неделю после появления сыпи, после чего они практически полностью исчезают (WHO, 2007a).

IgG появляются немного позднее, чем IgM, примерно на 5-7 день после появления сыпи, и сохраняют максимальные значения в течение длительного времени. Незначительный спад концентрации IgG происходит только через семь недель (WHO, 2007a). Авидность специфических IgG является низкой в течение первого месяца после первичного инфицирования вирусом краснухи и высокой в случае повторного заражения (Thomas & Morgan-Capner, 1991). После первого месяца индекс авидности постепенно увеличивается. До 6 недель после появления сыпи наблюдается низкий индекс авидности (<40%). К 13 неделе после

61

заражения высокий индекс авидности (> 60%) наблюдается у большинства пациентов (Böttiger, Jensen, 1997). Основными изотипами IgG при краснухе являются IgG1 и IgG3. Наличие IgG3 и низкоавидных IgG1 может служить индикатором первичной инфекции (Thomas et al., 1992). В экспериментах Hedman и Seppälä (1988) по изотипированию IgG к вирусу краснухи также было показано преобладание IgG1 и стабильное наличие IgG3, в то время как IgG2 и IgG4 не были детектированы (Hedman & Seppälä, 1988).

IgA, так же как и IgM, появляются в течение двух дней после возникновения сыпи, ещё до появления иммуноглобулинов класса G, однако, в отличие от IgM, иммуноглобулины класса A не исчезают после выздоровления. IgA были обнаружены в сыворотке крови взрослых женщин, переболевших краснухой в детстве (Baublis & Brown, 1968). Были показаны наличие IgA к ВК в грудном молоке и их роль в защите младенцев от краснухи. Титр IgA в молоке коррелирует с титром IgG в крови. Также было установлено, что IgA, полученные из грудного молока, реагируют в основном с гликопротеином Е1 и в меньшей степени с БО ВК, но не с гликопротеином Е2 (Hayakawa et al., 2010).

Содержание IgD и IgE в сыворотке крови очень низко. Тем не менее, Salonen с коллегами (1985) удалось показать, что IgD и IgE стабильно детектируются при краснушной инфекции (Salonen et al., 1985).

Эксперименты, проведенные Wilson с коллегами в 2006 году, в целом подтвердили полученные ранее данные. Они изучали динамику титров и авидность IgM, IgG1, IgG3 и IgA после острой краснушной инфекции и показали, что основными АТ являются IgG1. Это единственные АТ, которые имеют высокую авидность и присутствуют в крови в высоких концентрациях спустя несколько месяцев после выздоровления. Их титр и авидность возрастают постепенно. Остальные АТ являются низкоавидными и присутствуют в крови в достаточно высоких концентрациях непосредственно во время заболевания или сразу после,

когда IgG1 ещё не сформировались, но потом их титры значительно падают. IgM, которые появляются самыми первыми, со временем полностью исчезают. Интересно отметить, что в данном исследовании была показана высокая авидность IgG1 не только к целому вириону краснухи, но и к отдельному участку гликопротеина Е1 -иммунодоминантному пептиду Е12о8-239 (ЗР15/эпитоп А) (Wilson et al., 2006).

Клеточный иммунный ответ возникает примерно за неделю до виремии, появления сыпи и последующего появления АТ. Развитие клеточного иммунного ответа совпадает с продромальными симптомами, наиболее частым из которых является лимфаденопатия (Forbes et al., 1969). При естественной инфекции в это время происходит стимуляция T-клеток в дренирующих лимфатических узлах (Honeyman et al., 1974). Клеточный иммунный ответ принимает участие в элиминации клеток, зараженных вирусом. В данном случае он представлен цитотоксическими Т-клетками, натуральными киллерами, моноцитами и секретируемыми лимфокинами (Banatvala & Peckham, 2007).

2.3.3. Вакцинация против краснухи Вакцины против краснухи

Все используемые в настоящее время вакцины против краснухи являются аттенуированными. Вакцина RA27/3 была разработана в 1969 году и сейчас в большинстве стран мира является единственной лицензированной вакциной против краснухи. Для производства вакцины на основе штамма RA27/3 используют культуру диплоидных клеток человека WI-38 (Banatvala & Peckham, 2007). Ещё несколько вакцин были лицензированы в отдельных странах. Вакцина BRD-2, для получения которой также используется культура диплоидных клеток человека, была создана и лицензирована в Китае (Yaru et al., 1985). Пять различных

вакцинных штаммов были разработаны в Японии (Terada, 2003), вакцины на основе трёх из них зарегистрированы до сих пор - это Matsuura, Takahashi и TO-366 (WHO, 2020). Вакцины Takahashi и TO-366 получают в культуре клеток почек кролика, а вакцину Matsuura в культуре клеток фибробластов эмбрионов японских перепелок (Shishido & Ohtawara, 1976; Perkins, 1985).

Вакцина против краснухи может быть представлена в моновалентной форме (Rubella - R) или в различных комбинациях с вакцинами против кори, паротита и ветрянки: двухвалентные вакцины Корь-Краснуха (Measles-Rubella - MeR) и Паротит-Краснуха (Mumps-Rubella - MuR), а также трёхвалентная и четырёхвалентная вакцины Корь-Паротит-Краснуха (Measles-Mumps-Rubella - MMR) и Корь-Паротит-Краснуха-Ветряная оспа (Measles-Mumps-Rubella-Varicella - MMRV). Для всех этих комбинаций была показана высокая эффективность и безопасность (Banatvala, Peckham, 2007; Weibel et al., 1980; Kuter et al., 2006). Используемые в настоящее время в мире вакцины против краснухи представлены в таблице 3.

При вакцинации виремия развивается в течение 7-11 дней, но на более низком уровне, чем при естественной инфекции. Известны случаи возникновения поствакцинальной краснухи. Совсем недавно была опубликована статья, посвящённая описанию двух случаев краснухи, возникших после введения вакцины Priorix (MMR, «GlaxoSmithKline»), и сопровождавшихся появлением сыпи и лёгким недомоганием, при этом у обоих пациентов не было диагностировано патологий иммунной системы. В смывах из горла пациентов был обнаружен ВК, идентичный вакцинному штамму RA27/3 (Ong et al., 2020).

Пока не существует ни одного свидетельства передачи вакцинного вируса от человека к человеку (WHO, 2007a; Scott & Byrne, 1971). В исследованиях Scott и Byrne (1971) был проведён скрининг почти 100 000 вакцинированных детей и их семей, который показал отсутствие случаев передачи вакцинного вируса серонегативным родственникам, находящимся

64

с ними в близком контакте (Scott & Byrne, 1971). Тем не менее, теоретически возможность передачи вакцинного вируса не исключается, и этот вопрос требует дальнейших исследований (Ong et al., 2020).

Производитель Торговая марка Штамм вируса / Культура

(Страна) (валентность) клеток

Merck (США) MMR II (MMR), ProQuad RA27/3

(MMRV) Диплоидные линии WI-38 клетки человека

GlaxoSmithKline Priorix (MMR), Priorix- RA27/3

(Великобритания) Tetra (MMRV) Диплоидные линии WI-38 клетки человека

Sanofi Pasteur (Франция) MMRVAXPRO (MMR) RA27/3

Диплоидные клетки человека

линии WI-38

BioManguinhos Vacina Triple Viral RA27/3

(Бразилия) (MMR), Vacina Tetra Viral (MMRV) Диплоидные линии WI-38 клетки человека

Institute of Immunology (R) RA27/3

(Хорватия) Диплоидные линии '1-38 клетки человека

Serum Institute of India R-Vac (R), MR-Vac (MeR), RA27/3

(Индия) Tresivac (MMR) Диплоидные линии WI-38 клетки человека

Microgen (Россия) (R), ВАКТИВИР (MMR) RA27/3

Диплоидные клетки человека

линии WI-38

Daiichi Sankyo Company POLYVAC (MeR) ТакаЬавЫ

(Япония) Культура клеток почек кролика

Kitasato Institute (R) Takahashi

(Япония) Культура клеток почек кролика

Biken (Япония) (R) Matsuura

Культура клеток фибробластов

эмбрионов Японских перепелок

Takeda Chemical (R) TO-336

Industries Культура клеток почек кролика

(Япония)

Chinese manufacture (R) BRD-II

(Китай) Диплоидные клетки человека

Таблица 3. Основные используемые в настоящее время аттенуированные вакцины против краснухи.

Специфический иммунный ответ при вакцинации

При вакцинации препаратами живых аттенуированных вакцин против краснухи развивается иммунный ответ, который схож по динамике и спектру формирования иммуноглобулинов с ответом на естественную вирусную инфекцию (Banatvala & Brown, 2004). Более чем у 95% привитых старше 11 месяцев наличие специфического иммунного ответа детектируется даже спустя 21 год (O'Shea et al., 1988). Специфические IgM появляются через 14 дней после вакцинации, наибольшее их количество наблюдается примерно через месяц (Enders, 1985). IgM сохраняются обычно в течение трех месяцев, однако в некоторых исследованиях удалось в небольшом проценте случаев обнаружить IgM в сыворотке привитых спустя год или даже три года после вакцинации (Best, 1991). Специфические к вирусу краснухи IgM присутствуют в крови в больших титрах и сохраняются дольше после вакцинации, чем после естественной инфекции. Напротив, титр IgG выше при естественной инфекции, чем при вакцинации. Авидность специфических IgG при естественной инфекции выше, а максимальное значение индекса авидности достигается быстрее, чем при вакцинации (Рис. 8) (Vauloup-Fellous & Grangeot-Keros, 2007). Секреторные IgA могут быть детектированы в носоглотке через месяц после вакцинации, но в меньших титрах, чем при естественной инфекции. При подкожном введении максимальные титры секреторных IgA наблюдаются примерно через 6 недель. При интраназальном введении вакцинного штамма R27/3 титр секреторных IgA нарастает постепенно и не снижается, по крайней мере, в течение 5 месяцев (Ogra et al., 1971).

Выявлена чёткая корреляция между титрами IgG к структурным белкам E1, E2, БО и неструктурному белку Р150 ВК в крови пациентов, привитых вакциной, содержащей штамм R27/3, и титром вируснейтрализующих АТ (Haralambieva et al., 2017).

Индекс Индекс

Дни Дни

Рис. 8. Изменение титров IgM, IgG и авидности IgG к вирусу краснухи (по Vauloup-Fellous & Grangeot-Keros, 2007).

А. После вакцинации.

Б. После естественной первичной инфекции.

Клеточный иммунный ответ при вакцинации ослабленным вирусом оказывается слабее, чем при естественной инфекции, однако быстрое развитие клеточного иммунного ответа после ревакцинации указывает на то, что T-клетки памяти были сформированы во время предыдущей вакцинации. Антигенная стимуляция инфицированных ранее людей или ревакцинация вызывают быстрый прирост клеточного иммунного ответа (Honeyman et al., 1974; Buimovici-Klein, Cooper, 1985). В 1999 году Mitchell c коллегами показали долговременное наличие клеточного иммунного ответа к вирусу краснухи. В их исследованиях 74,4% подростков, вакцинированных в детстве трёхвалентной вакциной MMR, имели лимфоциты, способные к пролиферации при стимуляции цельным вирионом ВК, а также отдельными пептидами структурных белков ВК (Mitchell et al., 1999).

Недостатки существующих вакцин и перспективы разработки новых препаратов

Несмотря на свою эффективность, существующие аттенуированные вакцины имеют ряд недостатков, к которым относят побочные реакции, отсутствие возможности вакцинации беременных женщин и людей с

иммунодефицитами, а также необходимость соблюдения жёстких температурных условий холодовой цепи при хранении и транспортировке.

Наиболее распространёнными побочными реакциями являются боли в суставах. Штамм RA27/3 может индуцировать артрит и артралгию у восприимчивых взрослых женщин после вакцинации с вероятностью до 40-42% (Best, 1991; Banatvala & Brown, 2004). Вероятность возникновения тромбоцитопенической пурпуры после вакцинации трёхвалентной вакциной MMR по данным различных исследований колеблется от 0,087 до 4 (в среднем 2,6) случаев на 100 000 доз вакцины (Mantadakis et al., 2010). Также зарегистрированы случаи возникновения поствакцинальной энцефалопатии, вероятность которой оценивается как 1/29 000 (Banatvala & Brown, 2004). Кроме того, присутствие в составе вакцин желатина и неомицина исключает возможность вакцинации людей с аллергическими реакциями на эти вещества, так как это может привести к анафилактическому шоку (Kelso et al., 1993; Rietschel & Bernier, 1981).

Применение аттенуированных вакцин для вакцинации людей с иммунодефицитами не рекомендуется (WHO, 2020), так как может вызвать субклиническую инфекцию, результатом которой может быть длительная персистенция вакцинного вируса в организме привитого, вследствие чего возрастает вероятность реверсии к патогенной форме. В недавнем исследовании, опубликованном в конце 2019 г., был установлен факт существования инфекционного вакцинного деривата ВК (infectious Vaccine Derived Rubella Viruses - iVDRV) в гранулёмах у людей с первичными иммунодефицитами, которые в детстве были привиты вакциной MMR. Важно отметить, что iVDRV был найден во всех исследуемых гранулёмах. Более того, у одного из пациентов геном ВК был обнаружен также в полости носоглотки. iVDRV близок к вакцинному штамму R27/3, однако все же отличается от него. Скорость мутации iVDRV несколько выше, чем в среднем для ВК дикого типа, что, вероятно, связано с непрерывной репликацией при хронической инфекции в организме одного человека по

68

сравнению с прерывистой репликацией при передаче вируса от человека к человеку. Пока что факты передачи iVDRV восприимчивым реципиентам зафиксированы не были, однако авторы исследования не исключают возможности такой передачи или же её появления в будущем в связи с возникновением дополнительных мутаций iVDRV (Perelygina et al., 2019).

Несмотря на то, что ни одного случая тератогенного воздействия на плод при случайной вакцинации беременных женщин не зафиксировано (Banatvala & Peckham, 2007; CDC, 2001; WHO, 2020), вакцинация при беременности не рекомендуется, более того, рекомендуется избегать зачатия в течение месяца после вакцинации (WHO, 2020). Это является серьёзным недостатком существующих вакцин ввиду того, что беременные женщины и женщины репродуктивного возраста составляют основную группу риска.

Таким образом, задача создания рекомбинантной вакцины против краснухи, не имеющей побочных негативных эффектов, обусловленных использованием живого вируса, является актуальной. Существует ряд работ, посвящённых разработкам вакцинных препаратов против краснухи нового поколения на основе рекомбинантных структурных белков вируса. В качестве подходов для создания вакцины были предложены: использование неинфекционных вирусоподобных частиц ВК, в образовании которых участвуют три структурных белка - E1, Е2 и БО (Hobman et al., 1994); использование ВПЧ на основе корового антигена вируса гепатита В, несущего эпитоп-содержащие фрагменты гликопротеина Е1 154-239 а.о. (Котляров, 2010), или 214-285 а. о., 214-240 а. о. и 245-285 а. о. (Skrastina et al., 2013); а также использование рекомбинантного секреторного rE1, обладающего свойствами нативного вирусного Е1 (Bernasconi et al., 1996); и даже использование ДНК-векторов, кодирующих последовательность всех трёх или только двух (Е1 и Е2) структурных белков ВК (Pougatcheva et al., 1999). Для каждого из

этих подходов была продемонстрирована стимуляция иммунного ответа против краснухи у иммунизированных мышей (Рш ег а!., 1994; Котляров, 2010; Бкгавйпа ег а1., 2013; Реггепоиё ег а1., 2004; Ро^сИеуа ег а1., 1999). Однако в дальнейшем эти работы не были продолжены.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали следующие химические реактивы и коммерческие препараты: бромфеноловый синий, кумасси бриллиантовый синий (G-250), полиэтиленгликоль (ПЭГ, молекулярная масса 6000 кДа), ^№-метиленбисакриламид, Р-меркаптоэтанол - производства фирмы «Serva» (Германия). ^^№,№-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) -фирмы «Acros organics» (США). Хлороформ, уксусная кислота - фирмы «Химмед» (Россия). Глицерин - фирмы «Лаверна» (Россия). Персульфат аммония - фирмы «ICN» (США). РНКаза А, белковые маркеры молекулярной массы, адъювант Imject Alum - фирмы «Thermo Scientific» (США). Целит, бычий сывороточный альбумин (БСА), ампициллин -фирмы «MP Biomedicals» (США). 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - фирмы «Иммунотех» (Россия). Дрожжевой экстракт - фирмы «BD» (США). Бактотриптон, глицин, трис, ЭДТА (натриевая соль), сахароза - фирмы «Gerbu» (Германия). Бактоагар - фирмы «Difco» (США). Акриламид, гидрохлорид гуанидина, дезоксихолат натрия, мочевина - фирмы «PanReac AppliChem ITW Reagents» (Испания). Формвар - фирмы «SPI-Chem» (США). Хемилюминесцентный субстрат для пероксидазы, мембрана Hypond-P из поливинилиденфторида (ПВДФ) - фирмы «GE Healthcare -Life Sciences» (США). Канамицин - фирмы «Phytotechnology laboratories» (США). Изопропил-Р^-1-тиогалактопиранозоид (ИПТГ) - фирмы «Anatrace» (США). Солевой раствор Хэнкса (14175137) - фирмы «Gibco» (США). Додецилсульфат натрия (ДСН), фотозащитная добавка 1,4 диазобицикло-[2,2,2]октан, Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl и NaOH, агароза, тринитробензолсульфоновая кислота (ТНБС) (P2297), сухое молоко, овальбумин, комплемент морской свинки (S1639) и флуоресцентные латексные сферические частицы (L3030) - фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Кровь баранья дефибринированная для питательных сред стерильная -фирмы «ЭКОлаб» (Россия). Прочие реактивы использовались только

квалификации «осч». В работе использовали деионизованную воду, очищенную с помощью системы Milli-Q Simplicity UV («Millipore», США), фосфатно-солевой буфер - PBS (состав: 7мМ Na2HPO4, 1,5 мМ KH2PO4, pH 7,4, 137мМ NaCl, 2,7 мМ KCl).

В работе использовали антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с флуорофором Alexa 546, - фирмы «Invitrogen» (США); антитела против общих IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, - фирмы «Promega» (США), а также антитела против общих IgG (ab6728) и антитела против изотипов IgG1(ab97240), IgG2a (ab97245) и IgG2b (ab97250) иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, - фирмы «Abcam» (США); антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с коллоидным золотом 12 нм, - фирмы «Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.» (США).

1. Трансформация бактериальных клеток

К 200 мкл суспензии компетентных клеток Escherichia coli штамма XL1-Blue (для дальнейшего выделения плазмидной ДНК) или SG (для дальнейшей экспрессии рекомбинантного белка) добавляли 1 мкл плазмидной ДНК, кодирующей тетраэпитоп А, с концентрацией 20 нг/мкл и инкубировали во льду 20 минут, после чего выдерживали 90 секунд при 42°С, и снова инкубировали во льду 2 минуты. Затем добавляли 800 мкл среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl) и инкубировали при 37°С в течение 45 минут. Суспензию клеток высевали на чашку со средой YT с агаром (0,8% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl, 1,5% агар), содержащей селективные антибиотики (для клеток штамма XL1-Blue - ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, для клеток штамма SG - ампициллин и канамицин в концентрации 100 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно) и инкубировали в течение 14 часов в шейкере-термостате (37оС, 180 об/мин).

2. Выделение и очистка плазмидной ДНК

Трансформированный бактериальный клон штамма ХЬ1-Б1ие высевали в 2-3 мл среды 2хYT, содержавшей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Инкубировали в течение 18 часов в шейкере-термостате (37оС, 180 об/мин). Клетки осаждали центрифугированием (центрифуга (ЦФ) «Eppendorf Мт1$рт», 5 минут, 5000 об/мин). Осадок ресуспендировали в 250 мкл раствора I (50мМ глюкоза, 10мМ ЭДТА, 25мМ трис-НС1, рН 8,0), инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут и добавляли 250 мкл раствора II (0,2М №ОН, 1% ДСН), осторожно перемешивали и выдерживали 5 минут во льду. К лизату клеток добавляли 250 мкл раствора III (3М ацетат калия, рН 5,2), инкубировали во льду 5 минут и центрифугировали (ЦФ «Eppendorf MiniSpin», 9 минут, Утах). Супернатант повторно центрифугировали (ЦФ «Eppendorf MiniSpin», 6 минут, Утах). К супернатанту добавляли 750 мкл 96% этанола, тщательно перемешивали и инкубировали при -20°С 5-10 минут. Центрифугировали при 4°С (ЦФ «Ерре^о^ 5415 D», 10 минут, Утах). К осадкам добавляли по 500 мкл 70% этанола, тщательно перемешивали и центрифугировали (ЦФ «Eppendorf 5415 D», 8 минут, Утах) также при 4°С. Осадок высушивали при 55°С до полного испарения этанола и растворяли в 150 мкл МйН-р. Для очистки от белковых примесей к 150 мкл выделенной плазмиды добавляли 150 мкл 7,5М ацетата аммония, инкубировали во льду 30 минут и центрифугировали при + 4°С (ЦФ «Eppendorf 5415 Б», 8 минут, Утах). К супернатанту добавляли 940 мкл 96% этанола с 0,08М ацетатом аммония и инкубировали 40 минут при -70°С. Центрифугировали при 4°С (ЦФ «Ерре^о^ 5415 Б», 9 минут, Утах). Затем осадок промывали 500 мкл 70% этанола и снова центрифугировали при 4°С (ЦФ «Eppendorf 5415 Б», 8 минут, Утах). Отбирали спирт, ДНК высушивали при 55°С до полного испарения этанола и растворяли в 50 мкл МИНр, затем добавляли 0,5мкл РНКазы А.

3. Экспрессия рекомбинантных белков

Полученные клоны клеток E. coli штамма SG13009 («Qiagen N.V.», Германия), содержащие плазмиду pREP4, несущую ген с геном устойчивости к канамицину и плазмиду pQE-30, несущую нуклеотидную последовательность тетраэпитопа А и ген устойчивости к ампициллину, растили в течение ночи в небольшом объеме (3 мл) культуральной среды 2хYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, в шейкере-термостате (37оС, 180 об/мин). Ночную культуру переносили в 200 мл свежей 2хYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина и инкубировали в шейкере-термостате (37°С, 180 об/мин) до OD^=600 равной 0,7-0,9. Индукцию экспрессии целевых генов проводили с помощью ИПТГ (конечная концентрация 2мМ). Культуру растили дополнительно 3,5 часа (37оС, 180 об/мин). Клетки отделяли от культуральной среды центрифугированием при 4оС 10 минут (ротор JA-14, 5000 об/мин, ЦФ «Beckman», США). Отделённые центрифугированием от культуральной среды клетки лизировали в 5 мл буфера А (6M гуанидин-HCl, 0,1M NaH2PO4, 1M трис-HCl; рН 8,0) с добавлением дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0,2% в течение одного - двух часов на качалке Biosan PSU-10i (Латвия) (160-170 об/мин/). Лизат клеток центрифугировали при 4оС 15 минут (ротор JA-14, 9000 об/мин, ЦФ J2-21 «Beckman», США).

4. Хроматографическая очистка (НЪ)6-рекомбинантных белков на Ni2+-NTA агарозе

Хроматографию (Н^)6-белков проводили согласно протоколу «The QIAexpressionist» фирмы «QIAGEN» с некоторыми изменениями. Супернатант, полученный после центрифугирования клеточного лизата, наносили на предварительно уравновешенную буфером А колонку с Ni -ЭТА агарозой ^сорбента=1,6 мл). Проводили сорбцию белка в течение часа.

Далее колонку промывали последовательно буфером А с добавлением дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0,2% (10 мл), затем буфером А (10 мл), буфером В (8М мочевина; 0,1М NaH2PO4; 0,01М трис-HCl; pH 8,0) (8мл), буфером С (аналогичного состава, pH 6,3) (10 мл), буфером D (аналогичного состава, pH 5,9) (2 мл) и буфером Е (аналогичного состава, pH 4,5) (5 мл), собирая фракции по 1 мл. Наиболее прочно связанные с сорбентом белки элюировали буфером F (8М мочевина, 0,2М уксусная кислота) (6 мл). Состав полученных фракций анализировали в 8-20% полиакриламидном геле (ПААГ) с добавлением ДСН. От гуанидин-HCl и мочевины избавлялись при помощи диализа. Диализ проводили в диализном мешке (ширина - 6 мм, диаметр пор - 1214 кДа, «Serva», Германия) против воды Milli-Q в соотношении раствор белка : вода - 1:1000 в течение четырёх часов, осуществляя смену воды каждый час.

5. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле

К препарату, содержащему анализируемый белок, добавляли 3-4 объёма буфера для нанесения (60% глицерин, 20% Р-меркаптоэтанол, 10% ДСН, 1% бромфеноловый синий, 0,5 М трис-HCl, рН 6,8), после чего пробу инкубировали 5 минут при 96°С. Электрофорез проводили в пластинах ПААГ в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970). Верхний (концентрирующий) гель содержал 4,5% акриламида, 0,075% N,N'-метиленбисакриламида, 0,125М трис-HCl, рН 6,8, и 0,1% ДСН. Нижний (разделяющий) гель содержал линейный градиент акриламида от 8% до 20% и NN'-метиленбисакриламида от 0,08% до 0,2%, 0,4М трис-HCl, рН 8,8 и 0,1% ДСН. Пробы вносили в лунки верхнего геля. В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы маркерных белков фирмы «Thermo scientific» (14,4-116,0 кДа). Электрофорез проводили в

приборе Mini-PROTEAN Tetra Cell фирмы «Bio-Rad» (размер геля 83х73х1 мм) в трис-глициновом буфере, рН 8,4 (25мМ трис, 0,192М глицин, 0,1% ДСН) при постоянном напряжении 200В в течение часа. Гель окрашивали кумасси (G-250) в течение 20 минут. Отмывку проводили в водном растворе 7% уксусной кислоты и 5% этанола. Фотографию геля получали с помощью системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ («Bio-Rad», США).

6. Выделение препарата вируса табачной мозаики

Вирус табачной мозаики (ВТМ), штамм U1 (коллекция кафедры вирусологии МГУ) выделяли, как описано ранее, c некоторыми модификациями (Трифонова и др., 2015). Замороженные листья зараженных ВТМ растений (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun) гомогенизировали с помощью ножевого гомогенизатора («Waring», США) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,8), содержащем 20 мМ ЭДТА и 0,1% ß-меркаптоэтанол (в соотношении 2 мл буфера на 1 г зеленого материала). После гомогенизации сок отжимали через марлю и осветляли при 10 000 об/мин в течение 20 минут (ротор JA-14, ЦФ J2-21 «Beckman», США), при 4°С. К супернатанту добавляли хлороформ в соотношении 6:1. Полученную смесь эмульгировали в течение 10 минут. Фазы в полученной эмульсии разделяли методом низкоскоростного центрифугирования при 10 000 об/мин (ротор JA-14, ЦФ J2-21 «Beckman», США). Верхнюю водную фазу отбирали и к ней добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) (молекулярная масса 6000 кДа) до конечной концентрации 2% и NaCl до конечной концентрации 1%. Раствор выдерживали в течение ночи при 4°С. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10 000 об/мин 20 минут (ротор JA-14, ЦФ J2-21 «Beckman», США) при 4°С. После этого экстрагировали вирус из полученного осадка в 0,01 М трис-НС1 буфере (рН 7,8) в течение 2-3 часов при постоянном перемешивании при

4°С. Полученный экстракт осветляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 20 минут (ротор JA-14, ЦФ J2-21 «Beckman», США) при 4°С. Дальнейшую очистку вируса проводили с помощью двух циклов дифференциального ультрацентрифугирования. При первом цикле осветлённый экстракт ультрацентрифугировали при 38 000 об/мин в течение 120 минут с использованием 20% сахарозной подушки, приготовленной на 0,01 М трис-НС1 буфере (рН 7,8) (ротор P70AT2, ЦФ CP100WX, «Hitachi», Япония). Полученные осадки растворяли в 0,01 М трис-НС1 рН 7,8 (ночь, 4°С). При втором цикле раствор осветленного вируса ультрацентрифугировали без сахарозной подушки при 38 000 об/мин 90 минут (ротор P70AT2, ЦФ CP100WX, «Hitachi», Япония). Вирусный осадок растворяли в воде. Концентрацию вируса определяли методом спектрофотометрии, используя коэффициент экстинкции: Е260нм 0,1% = 3,0 при соотношении OD260/OD280 = 1,2.

7. Получение сферических частиц (СЧ)

СЧ получали, как описано ранее (Трифонова и др., 2015), с некоторыми модификациями. Полипропиленовые пробирки на 1,5 мл (Eppendorf, Германия), содержащие 1 мл исходного раствора ВТМ с концентрацией 2 мг/мл, помещали в ячейки термостата «Термит» («ДНК-Технология», Россия) и инкубировали в течение 5 минут при 94°С. Затем пробирки вынимали из термостата, перемешивали и охлаждали при температуре -20°С в течение 10 минут, после чего снова перемешивали и помещали обратно в термостат. Время повторной инкубации при 94°С составляло 2 минуты. После завершения термической обработки пробирки, содержащие СЧ, снова перемешивали и охлаждали при температуре -20°С в течение 10 минут.

8. Просвечивающая электронная микроскопия

Анализируемый препарат сорбировали в течение 15-20 секунд на медных сетках для ЭМ, покрытых коллодиевой плёнкой (при нанесении плёнки использовали 4% раствор коллодия в амилоацетате) с углеродным напылением. После сорбции препарата лишнюю жидкость отбирали с помощью фильтровальной бумаги. Наблюдения проводили с помощью электронного микроскопа JEM-1011 («JEOL, Ltd», Japan) с цифровой фотокамерой GATAN ES500W («Gatan, Inc.», США). Расчёт среднего размера СЧ осуществляли с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, США), представлен средний размер ± стандартное отклонение.

9. Иммуноэлектронная микроскопия

Суспензию композиций СЧ с тетраэпитопом А наносили на медные сетки для ЭМ, покрытые формваровой плёнкой (при нанесении плёнки использовали 0,5% раствор формвара в дихлорэтане) и инкубировали в течение 15-20 секунд. До обработки первичными антителами неспецифические места связывания блокировались в течение 20 минут раствором, состоящим из 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), PBS и 0,05% твин-20. Затем препараты обрабатывали первичными антителами - мышиной поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи - в разведении 1:100 в блокирующем растворе и инкубировали в течение 30 минут. Контрольные образцы инкубировали в блокирующем растворе без добавления первичных антител. Не связавшиеся антитела отмывали раствором для отмывки (PBS с 0,25% БСА и 0,05% твин-20) 3 раза по 5 минут. После этого все образцы обрабатывали вторичными антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с коллоидным золотом 12 нм («Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.» США), в разведении 1:50 и инкубировали в течение 30 минут. От

несвязавшихся антител отмывали 3 раза по 5 минут в растворе для отмывки. Последнюю отмывку проводили в Milli-Q в течение 5 минут при покачивании. Препараты высушивали на воздухе и анализировали с помощью электронного микроскопа JEOL JEM2100 («JEOL, Ltd», США), снабжённого интегрированной камерой Gatan Ultrascan 1000 CCD («Gatan, Inc.», США).

10. Анализ траекторий наночастиц

Анализ образцов проводили согласно принятому стандарту (ASTM E2834 -12) с использованием прибора NanoSight NS500 и программного обеспечения NanoSight NTA 2.3 (Nanosight, Великобритания). Результаты полученных измерений обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel 2003 (Microsoft, США). Размеры представлялись в виде 95% доверительного интервала для среднего.

11. Иммунофлуоресцентная микроскопия

Суспензию композиций СЧ с тетраэпитопом А наносили на покровные стекла, предварительно покрытые формваром. Инкубировали с блокирующим раствором (PBS с 1% БСА, содержащий 0,05% твин-20) в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем стёкла обрабатывали первичными антителами - мышиной поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи - в разведении 1:100, приготовленном на блокирующем растворе. Инкубировали в течение часа. Несвязавшиеся антитела удаляли инкубируя с раствором для отмывки (PBS с 0,25% БСА, содержащий 0,05% твин-20) на качалке Biosan PSU-10i (Латвия) 3 раза по 5 минут (80 об/мин). Наносили блокирующий раствор с антивидовыми антителами, конъюгированными с флуорофором Alexa 546 («Invitrogen», США), в разведении 1:100. Инкубировали 30 минут, после чего несвязавшиеся антитела удаляли, инкубируя с раствором для отмывки 3 раза по 5 минут

на качалке. Затем раствор для отмывки заменяли на PBS и инкубировали при покачивании ещё 5 минут, после чего споласкивали стекла Milli-Q. Покровные стекла с препаратами монтировали поверх предметных стёкол. Между предметным стеклом и препаратом наносили фотозащитную добавку 1,4 диазобицикло-[2,2,2]октан и затем анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа «Axiovert 200M» (Carl Zeiss, Германия), снабжённого интегрированной камерой «ORCAII-ERG2» (Hamamatsu Photonics, Япония).

12. Иммуноблот-анализ рекомбинантных белков

Проводили электрофорез в градиентном ДСН-ПААГ 8-20%. В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы окрашенных маркерных белков фирмы «Thermo scientific» (10-250 кДа). Белки из геля переносили на предварительно обработанную этанолом мембрану Hybond-P из ПВДФ («Amersham», Великобритания) методом электропереноса (прибор Pierce Power Blotter фирмы «Thermo scientific», буфер для переноса - фирмы «Thermo scientific», США), время переноса -10 минут. После переноса мембрану инкубировали в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS (1М трис-HCl pH 7,4; 3М NaCl; 0,05% твин-20) в течение часа. Далее проводили инкубацию с мышиными поликлональными антителами к ВК в разведении 1:5000 на 5% растворе сухого молока в буфере tTBS в течение 1 часа. Отмывали 3 раза по 15 минут в буфере tTBS и затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена («Promega»), в разведении 1:10000 на 5% растворе сухого молока в буфере tTBS 1 час при комнатной температуре. Отмывали 2 раза по 15 минут в буфере tTBS, каждый раз меняя буфер. Последнюю отмывку проводили в течение 15 минут в TBS (1М трис-HCl pH 7,4; 3М NaCl). Проявляли с помощью ECL системы («Amersham», Великобритания), и детектировали хемилюминисцентный сигнал с

помощью системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ («Bio-Rad», США).

13. Иммунизация

При исследовании иммуногенности композиций СЧ с тетраэпитопом А использовали мышей инбредной линии BALB/c в возрасте 6-8 недель. В эксперименте участвовало три группы по 10 мышей. Первую группу иммунизировали смесью СЧ с тетраэпитопом А (100 мкг СЧ и 10 мкг тетраэпитопа А), вторую - свободным тетраэпитопом А в количестве 10 мкг, а третью - смесью тетраэпитопа А (10 мкг) с адъювантом Imject Alum (Thermo Scientific, США), соотношение объёмов антигена и адъюванта было равным 1:1. Все пробы были приготовлены на основе раствора PBS, объём одной дозы в каждом случае составил 100 мкл. Ещё одну группу, состоящую также из 10 мышей, иммунизировали 100 мкл раствора PBS в качестве контроля. Иммунизация проводилась внутримышечно, три раза: на нулевой, 14 и 28 дни эксперимента.

При исследовании иммуногенности композиций СЧ с овальбумином использовали мышей линии CD1. В эксперименте участвовало две группы по шесть мышей. Первую группу иммунизировали смесью СЧ и овальбумина (100 мкг СЧ и 5 мкг овальбумина), вторую свободным овальбумином в количестве 5 мкг. Все пробы были приготовлены на основе раствора PBS, объём одной дозы в каждом случае составил 200 мкл. Ещё одну группу, состоящую из пяти мышей, иммунизировали 200 мкл раствора PBS в качестве контроля. Иммунизация проводилась подкожно, четыре раза: на нулевой, 15, 29 и 43 дни эксперимента.

14. Получение антисывороток

В эксперименте по изучению иммуногенности композиций СЧ с тетраэпитопом А кровь забирали из хвостовой вены через 14 дней после

81

последней иммунизации. В эксперименте по изучению иммуногенности композиций СЧ с овальбумином кровь забирали из сердца через 13 дней после последней иммунизации. Полученную сыворотку инкубировали 2 часа при комнатной температуре, а затем выдерживали ночь при 4°С. На следующий день сыворотку центрифугировали (ЦФ «Eppendorf MiniSpin», 5 минут, Vmax). Супернатант отбирали и использовали для определения титров антител методом непрямого иммуноферментного анализа.

15. Непрямой иммуноферментный анализ

На 96-луночные планшеты для ИФА («Greiner Bio-One», Германия) шрбировали тетраэпитоп А вируса краснухи, овальбумин или СЧ в концентрации 10 мкг/мл. От несвязавшегося антигена планшеты промывали 5 раз раствором tPBS (PBS, содержащий 0,1% твин-20). Затем проводили забивку блокирующим раствором (PBS c 1-2% сухим молоком), после чего снова промывали 5 раз tPBS и вносили тестируемые антисыворотки (первичные антитела) в последовательных трёхкратных разведениях. После инкубации с первичными антителами планшеты промывали 5 раз tPBS и добавляли вторичные антитела против соответствующих иммуноглобулинов мыши (IgG общие, IgG1, IgG2a, IgG2b), конъюгированные с пероксидазой хрена («Abcam», США), в разведении 1:10 000. Инкубировали 1 час при 37°С, затем промывали 5 раз tPBS и добавляли субстрат - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Реакцию останавливали путём добавления H2SO4. Оптическую плотность в лунках оценивали при длине волны 450 нм с помощью планшетного спектрофотометра.

При исследовании иммуногенности композиций СЧ с тетраэпитопом А значения оптической плотности неиммунной сыворотки (сыворотка крови мышей, иммунизированных раствором PBS) были вычтены для каждого разведения соответственно. Титры антител рассчитывали методом

регрессионного анализа, путём построения зависимости оптической плотности от разведений сыворотки в логарифмической шкале. Использовали онлайн-программное обеспечение

(http://myassays.cloudapp.net/antibody-titres.assay), с уравнением регрессии Y=A+BlgX. Титр антител определяли как значение, в котором оптическая плотность становится равной нулю.

При исследовании иммуногенности композиций СЧ с овальбумином титры сывороток были определены как разведение, при котором поглощение при Х=450 нм было равно среднему значению фонового сигнала + 3 стандартных отклонения.

16. Изучение безопасности СЧ при однократном введении

Влияние СЧ при однократном введении исследовали на мышах линии BALB/c, аутбредных крысах Wistar и кроликах породы «Шиншилла». В эксперименте участвовало по три группы (две экспериментальных и одна контрольная) мышей и крыс (по 6 самцов и 6 самок в каждой группе) и две группы (экспериментальная и контрольная) кроликов (по 3 самца и 3 самки в каждой группе). Использовали препарат СЧ с концентрацией 1 мг/мл. Внутримышечный путь введения был изучен на мышах и крысах. Объём инъекции для мышей составил 100 мкл, для крыс - 400 мкл. Мышам и крысам из контрольной группы внутримышечно вводили стерильный раствор PBS в объёме, соответствующем объёму препарата СЧ (100 мкл для мышей и 400 мкл для крыс). Во всех случаях внутримышечного введения использовали две точки (мышцу правой и левой задней лапы). Внутривенный путь введения изучали на мышах и кроликах. Мышам исследуемый препарат СЧ вводили в объёме 500 мкл, кроликам - в объёме 30 мл. Кроликам из контрольной группы вводили 30 мл раствора PBS внутривенно. Внутрибрюшинный путь введения был исследован на крысах, объём вводимого препарата СЧ составил 3 мл.