Воздействие фемтосекундного лазерного излучения на развитие эмбрионов и ооцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Осыченко Алина Анатольевна

• Осыченко Алина Анатольевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Осыченко Алина Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список условных сокращений Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Лазерные технологии для клеточной нанохирургии.

1.1.1. Излучение различных диапазонов в применении для нанохирургии.

1.1.2. Лазеры ближнего инфракрасного диапазона: наносекундный, пикосекундный, фемтосекундный.

1.1.3. Физико-химические механизмы взаимодействия фемтосекундного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона с материалом клетки.

1.1.4. Фотохимические эффекты многофотонной ионизации

1.1.5. Эффекты, связанные с поглощением фемтосекундного лазерного излучения.

1.1.6. Действие одиночным фемтосекундным импульсом и цугом фемтосекундных импульсов.

1.1.7. Точечные абсорберы лазерного излучения

1.2. Возможности лазерной нанохируругии для работы с различными биологическими объектами.

1.2.1. Возможности лазерного «скальпеля» как инструмента для проведения внутриклеточных операций.

1.2.2. Оптопорация (оптоперфорация) для введения в клетку лекарственных препаратов и генетических конструктов.

1.2.3. Лазерная нанохирургия доимплантационных эмбрионов млекопитающих.

1.3. Искусственное слияние клеток: методики и значение.

1.3.1. Слияние клеток при помощи лазерных технологий.

1.3.2. Механизм слияния клеток.

1.3.3. Формирование тетраплоидности и объединение цитоплазмы.

Глава 2. Экспериментальные методы

2.1. Экспериментальные животные

2.2. Получение и культивирование преовуляторных ооцитов мыши на стадии зародышевого пузырька

2.3. Получение и культивирование двухклеточных эмбрионов.

2.4. Получение пар ооцитов

2.5. Проведение экспериментов

2.6. Экспериментальная установка

2.7. Окраска флуоресцентными красителями и регистрация флуоресценции.

2.8. Рамановская спектроскопия

2.9. Приготовление суховоздушных препаратов (по Тарковскому).

2.10. Статистический анализ данных.

Глава 3. Воздействие фемтосекундным лазером на ооциты и двухклеточные эмбрионы мыши: механизм поглощения и исследование жизнеспособности

3.1. Образование светопоглощающих центров в живой клетке после фемтосекундного лазерного воздействия.

3.2. Воздействие фемтосекундным лазерным излучением на преовуляторные ооциты и двухклеточные эмбрионы мыши.

3.2.1. Парогазовый пузырь в различных областях клетки.

3.2.2.Влияние дозы фемтосекундного лазерного излучения на жизнеспособность и развитие ооцитов и двухклеточных эмбрионов мыши.

Глава 4. Слияние эмбриональных клеток при помощи фемтосекундного лазера

4.1. Развитие слитых, не слитых и частично разрушенных эмбрионов.

4.2. Слияние двухклеточных эмбрионов в зависимости от линии и возраста самок-доноров.

4.3. Формирование тетраплоидности после фемтосекундного лазерного слияния.

4.4. Механика клеточного слияния. Обмен цитоплазматического материала при слиянии клеток.

Заключение

Выводы

Список литературы Приложения

Список сокращений.

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АФК - активные формы кислорода ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИК - инфракрасный

MII - стадия метафазы второго деления мейоза

МЕ - международная единица

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

миРНК -малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота

НАД - никотинамиддинуклеотид

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

УФ - ультрафиолет

DMEM - модифицированная среда Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) GFP - зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescence protein) GV - зародышевый пузырек (germinal vesicle)

GVBD - разрушение зародышевого пузырька (germinal vesicle breakdown)

HeLa - линия клеток из раковой опухоли пациентки по имени Генриетта Лакс (Henrietta Lacks)

NA - числовая апертура (numerical aperture)

SCNT - перенос ядра соматической клетки (somatic cell nuclear transfer)

Введение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Воздействие фемтосекундного лазерного излучения на развитие эмбрионов и ооцитов»

Актуальность темы исследования.

Изучение структуры и жизненных процессов клеток, взаимосвязи их частей, динамики внутриклеточных процессов является фундаментальной биологической задачей. Для исследований в этой области необходимы новые физико-химические методы, среди которых перспективным направлением является фемтосекундная лазерная нанохирургия. Этот высокоточный метод предоставляет возможность манипулировать отдельными клетками, проводить прицельные внутриклеточные операции без повреждения окружающего материала клетки. Исследования и разработки в области нанохирургии ооцитов и доимплантационных эмбрионов с использованием остросфокусированного фемтосекундного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона (ИК) позволяют получать новые фундаментальные знания о структуре и жизненных процессах клетки, а так же могут найти практическое применение в сферах терапевтического клонирования и репродуктивных технологиях, в том числе и человека.

В данной работе использовался фемтосекундный лазер с длиной волной генерации около 800 нм. Излучение ближнего инфракрасного диапазона (650-1350 нм) попадает в так называемое «окно прозрачности» биологических объектов. При фокусировке объективом микроскопа с числовой апертурой КЛ лазерное излучение длиной волны X образует перетяжку с полушириной w0 = 0,61ХМА и параметром Релея 20 = /2 (к = 2л/Хо — волновое число). В области перетяжки достигается высокая плотность мощности лазерного излучения, что обеспечивает высокую эффективность нелинейно-оптического взаимодействия излучения с веществом, формируя эффект лазерного «скальпеля». Таким образом, воздействие лазера локализуется вблизи перетяжки и может не повреждать клеточную целостность, сохраняя компоненты клетки и плазматическую мембрану интактными. Эта особенность формирует главное достоинство фемтосекундного лазерного «скальпеля»: возможность работать с отдельными клетками в культуре или многоклеточной структуре, а так же с отдельными фрагментами (органеллы, филаменты цитоскелета и др.) внутри клетки в строго заданной точке. Кроме того, лазерный «скальпель» позволяет проводить прицельное слияние клеток, действуя на область контакта двух прилежащих друг к другу плазматических мембран.

Актуальной задачей является количественная оценка жизнеспособности (в том числе и долгосрочной - в течение нескольких суток) оперированных объектов и исследования внутриклеточных процессов после фемтосекундного лазерного воздействия.

Цели и задачи исследования.

Диссертационная работа направлена на изучение механизмов взаимодействия фемтосекундного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона на состояние и жизнеспособность ооцитов и эмбрионов. Для достижения данной цели в работе были решены следующие задачи:

1. Установить границы неинвазивного воздействия фемтосекундного лазера на доимплантационные эмбрионы и ооциты млекопитающих на основе результатов исследования механизма взаимодействия фемтосекундного лазерного излучения с материалом клетки и наблюдения за их развитием.

2. Изучить динамику парогазовых пузырей при фемтосекундном лазерном воздействии на различные области живых клеток. Установить параметры порога образования пузырей в ядре, ядрышке, цитоплазме и области контакта цитоплазматических мембран клеток.

3. Установить механизм тетраплоидизации при лазерном слиянии. Изучить биофизические процессы обмена цитоплазматическим материалом клеток при фемтосекундном лазерном слиянии.

Научная новизна.

Предложен новый механизм образования парогазовых пузырей в клетке при воздействии цугом фемтосекундных лазерных импульсов ближнего ИК диапазона, следующих с частотой 80 МГц. Показано, что в начальной стадии цуга фемтосекундных импульсов образуются светопоглощающие центры, появление которых обуславливает переход из нелинейного в линейный режим поглощения лазерного излучения. В спектрах комбинационного рассеяния светопоглощающих центров выявлены D- и G- полосы, соответствующие 1355 и 1590 см-1 и характерные для графеноподобных структур, что дает основание предположительно рассматривать светопоглощающие центры как углеродные точки (C-Dots).

Обнаружена люминесценция светопоглощающих центров. Люминесценция этих центров активируется за счет однофотонного и двухфотонного возбуждения. Установлен спектр люминесценции светопоглощающих центров. Разработана методика применения светопоглощающих центров в качестве трекинг-частиц для изучения внутриклеточных процессов, происходящих при слиянии и делении клеток.

Показано, что светопоглощающие центры не оказывают существенного токсического воздействия на клетки.

Установлен порог образования парогазовых пузырей в различных областях клетки: цитоплазме, ядре, ядрышке и плазматической мембране. Обнаружено, что максимальный размер и время существования парогазового пузыря могут характеризовать вязкоупругие свойства среды, в которой они образуются. Наблюдения за деформацией объекта позволяет делать предположения о его структуре: так, например, анизотропная деформация ядрышка ооцитов указывает на негомогенную, с признаками гранулярности, организацию компонентов ядрышка.

Был определен диапазон неинвазивного воздействия фемтосекундного лазерного излучения на ооциты и эмбрионы мыши. В данной работе дана количественная оценка влияния дозы лазерного излучения на жизнеспособность объектов (способность к делению, достижению стадии бластоцисты, количество клеток в бластоцистах). Парогазовый пузырь может приводить к снижению вероятности развития до стадии бластоцисты и уменьшению количества клеток в бластоцистах.

В результате лазерного воздействия на двухклеточный эмбрион наблюдали следующие исходы: слияние двух клеток с образованием общей цитоплазмы и плазматической мембраны; отсутствие слияния и других морфологических изменений (эмбрион остается двухклеточным); разрушение одного бластомера; разрушение двух бластомеров. Показано, что необходимым условием для слияния клеток является парогазовый пузырь. Установлено, что на вероятность слияния так же влияют свойства объекта, обусловленные линией и возрастом самок-доноров. Все эмбрионы, за исключением целиком разрушенных, способны развиваться до стадии бластоцисты. Фемтосекундное лазерное воздействие на область контакта двухклеточных эмбрионов не влияет на эмбриональные «часы»: все группы оперированных эмбрионов (не слитые, слитые и эмбрионы, у которых был разрушен один бластомер) достигают стадии морулы, морулы с кавитацией, бластоцисты с одинаковой скоростью.

Слитые эмбрионы обладают тетраплоидным набором хромосом и способны развиваться до стадии бластоцисты. При помощи методики фемтосекундной лазерной нанохирургии было обнаружено, что тетраплоидность после слияния возникает по механизму «проскальзывания» митоза, а не путем слияния ядер или образования общей метафазной пластинки, как это утверждается в литературе.

При помощи методики фемтосекундного лазерного слияния было установлено, что при слиянии и последующем делении клеток не происходит равномерного перемешивания клеточного материала. На модели зеленого флуоресцентного белка (green fluorescence protein, GFP), было показано, что гиалоплазма (жидкая часть цитоплазмы, включающая в себя растворенные вещества и белки, но не включающая цитоскелет) перераспределяется

7

между сливающимися клетками по законам диффузии. С использованием методики получения светопоглощающих центров установлено, что при слиянии и последующем делении клеток не происходит равномерного перемешивания цитоплазмы.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Методика фемтосекундной лазерной нанохирургии ооцитов и доимплантационных эмбрионов востребована как для фундаментальных исследований структуры клеток, так и для вспомогательных репродуктивных технологий человека, а также для терапевтического и репродуктивного клонирования. Светопоглощающие центры, описанные в данной работе, представляют собой альтернативу существующим флуоресцентным красителям. Данные о механизме образования парогазовых пузырей вносят новые фундаментальные знания о взаимодействии лазерного излучения с веществом клетки. Лазерное слияние может применяться для получения тетраплоидных животных и гибридом, а так же для проведения процедуры переноса ядра соматической клетки (somatic cell nucleus transfer, SCNT), которая является ключевым этапом клонирования.

Методы исследования.

Для выделения и культивирования объектов использовали классические методы работы с лабораторными животными, ооцитами и эмбрионами. Для воздействия на ооциты и эмбрионы мыши в работе использовали лазерное излучение ближнего инфракрасного диапазона (800 нм) в фемтосекундном и в непрерывном режимах. Фемтосекундный режим применяли в виде одиночных импульсов и в виде цугов импульсов. Для наблюдения за объектами применяли микроскопию в проходящем свете, флуоресцентную, конфокальную микроскопию и рамановскую спектроскопию. Полученные результаты исследовали на предмет достоверного различия, используя статистические тесты: обобщенную линейную модель, точный критерий Фишера, критерий Манна-Уитни и дисперсионный анализ ANOVA.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявлен пороговый характер образования парогазовых пузырей при действии в различные области живой клетки цугом фемтосекундных импульсов с длительностью 100 фс, длиной волны 800 нм и частотой следования 80 МГц. Определены параметры порога образования парогазовых пузырей. Показано, что образование парогазового пузыря является необходимым, но недостаточным условием для слияния.

2. Установлены предельные параметры воздействия на доимплантационные эмбрионы и ооциты млекопитающих (энергия импульса и длительность цуга фемтосекундных импульсов), при которых ооциты и эмбрионы остаются жизнеспособными и способны развиваться.

3. Обнаружено, что при действии цугом фемтосекундных импульсов на материал клеток формируются светопоглощающие центры. Показано, что образование светопоглощающих центров сопутствует образованию парогазовых пузырей в клетке за счет перехода поглощения фемтосекундного лазерного излучения биоматериалом из нелинейного режима поглощения в линейный режим.

4. Показано, что светопоглощающие центры люминесцируют и могут быть использованы в качестве трекинг-частиц. Предложена методика использования этих центров для регистрации перемещения цитоплазмы двух бластомеров после их лазерного слияния.

5. Установлен механизм тетраплоидизации при фемтосекундом лазерном слиянии бластомеров эмбриона мыши. Показано, что тетраплоидность возникает по механизму «проскальзывания» митоза.

Степень достоверности полученных результатов. Достоверность результатов, представленных в данной работе, подтверждаются корректным статистическим анализом данных. Результаты экспериментов демонстрировали высокую повторяемость в опытах разных серий. Эксперименты по оценке жизнеспособности проявляли хорошую воспроизводимость, несмотря на заведомо гетерогенные свойства объектов.

Апробация результатов. Основные результаты, изложенные в данной работе,

докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях: VI

Троицкая конференция «Медицинская Физика и Инновации в Медицине» (ТКМФ-6),

(Троицк, 2014); VII Съезд Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, 2014);

57-я научная конференция МФТИ с международным участием, посвященной 120-летию

со дня рождения П. Л. Капицы (Москва-Долгопрудный, 2014); 58-я научная конференция

МФТИ с международным участием (Москва-Долгопрудный, 2015); V International

Symposium «TOPICAL PROBLEMS OF BIOPHOTONICS» (Нижний Новгород, 2015); 20-я

Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ -

НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 2016); XXIII Международная молодежная научная

конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2016);

PHOENIX 2017 - International medical students conference (Mangalore, India, 2017); 21-я

9

Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 2017), VIII Съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 15-20 сентября 2017 года.

Публикации. По результатам, содержащихся в диссертации, опубликовано 6 печатных работ, из них 6 - в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК. Также по результатам диссертации было получен 1 патент.

Личный вклад автора. Все эксперименты, представленные в данной диссертационной работе, выполнены лично автором либо при его непосредственном участии. Вся часть работы, связанная с выделением, культивированием образцов, обработка изображений и статистические исследования выполнялись лично автором. Эксперименты на лазерных установках выполнялись при непосредственном участии автора.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, формулировки основных результатов, заключения и выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 101 странице, содержит 8 таблиц, 35 рисунков, 6 приложений и библиографию из 100 наименований.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Лазерные технологии для клеточной нанохирургии.

Изучение процессов, происходящих в живой клетке - простейшей единицей живого мира - является фундаментальной биологической задачей. Повреждая отдельные клеточные структуры, можно судить об их функции или взаимосвязи с другими структурами. Химическое ингибирование компонентов клетки, создание нокаутных клеточных линий или животных, вмешательство в целостность клетки посредством микрохирургических инструментов - широко распространенные методы для изучения клетки и манипулирования материалом клетки. Однако применение лазеров открыло принципиально новые возможности для проведения внутриклеточных операций. Высокая точность позиционирования лазерного пятна в поле микроскопа позволяет проводить операции на отдельных клеточных органеллах, не повреждая клетку как целое.

Для проведения внутриклеточных операций in vivo основными ограничениями являются размер и точность повреждения. Нежелательным эффектом, часто сопутствующим лазерному воздействию, является нагрев образца за пределами области, которая подвергается облучению. За более чем полувековую историю лазерные системы прошли собственную эволюцию, и на сегодняшний день уже существуют инструменты, способные наносить разрезы с субдифракционным пространственным разрешением. Подобное манипулирование с клеткой называется лазерной нанохирургией, а остросфокусированное лазерное излучение, применяемое для разрезания или локального повреждения материала, обычно называют лазерным «скальпелем».

1.1.1. Излучение различных диапазонов в применении к биологическим объектам.

В общем случае для проведения нанохирургических операций могут использоваться лазеры с длиной волны генерации в широком диапазоне. Рассмотрим все доступные диапазоны лазерного излучения для работы с клетками и тканями животных.

Ультрафиолетовое излучение (УФ) лежит в диапазоне 180-440 нм. Основные хромофоры, способные поглощать УФ излучение - это нуклеиновые кислоты, белки и меланин. Пептидная связь способна эффективно поглощать фотоны, и пик поглощения приходится на длину волны 190 нм. Пик поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований находится на длине волны 260 нм. Ароматические аминокислоты (триптофан,

тирозин, фенилаланин) эффективно поглощают в диапазоне с максимумом 250-280 нм (Vogel A., Venugopalan V., 2003). Кроме того, в ближнем УФ и в видимом диапазоне поглощают важные для биоэнергетических процессов молекулы АТФ, НАД, НАДН, флавины (Lehmann J. et al., 1998).

При использовании лазеров с УФ излучением можно достигнуть высокого пространственного разрешения, но при этом происходит существенное повреждение клетки, т.к. в этом диапазоне происходит сильное поглощение света белками и нуклеиновыми кислотами (Stein B. et al., 1989). Кроме того, излучение УФ лазера поглощается и за пределами области фокусировки, что затрудняет манипуляции с объектами чрезвычайно малых размеров (Shen N. et al., 2005).

Излучение в видимом диапазоне (400-780 нм) считается более подходящим для работы с биологическими объектами. Хромофоры, поглощающие в видимом диапазоне -меланин и гемоглобин. Лазерное излучение ближнего инфракрасного (ИК) диапазона так же успешно применяется для лазерной нанохирургии. Излучение видимого и ближнего ИК диапазонов существенно меньше рассеивается и поглощается биологической тканью по сравнению с УФ диапазоном. Кроме того, сечение однофотонного поглощения биологической тканью в ближнем ИК диапазоне 650 - 1350 нм близко к нулю, поэтому данный диапазон принято считать окном прозрачности биологической ткани (Smith A.M. et al., 2009). Поглощение излучения ближнего ИК диапазона биологическим объектом может быть обусловлено нелинейно-оптическими эффектами и многофотонным поглощением. Нелинейно-оптические эффекты отчетливо проявляются при высоких интенсивностях светового поля, поэтому применение фетосекундных лазеров для нанохирургии становится особенно привлекательным - при низкой энергии импульса за счет короткой длительности достигается высокая пиковая интенсивность (Xu C. et al., 1996), (Konig K. et al., 1999, a).

За пределами излучения ближнего ИК диапазона находятся пики поглощения воды (0,96, 1,44, 1,95, 2,94, 4,68, 6,1 мкм), спектры поглощения жирных кислот и липидов (1,21,3 мкм), а также спектры поглощения белка (6,02-6,10 мкм) (Tsai C.-L. et al., 2001). Излучение этого диапазона при действии на живую ткань вызывает сильный нагрев и кипение, поэтому практически не используется для внутриклеточной хирургии.

1.1.2. Лазеры с ультракороткими импульсами: наносекундный, пикосекундный,

фемтосекундный.

Нано-, пико- и фемтосекундные лазеры успешно используются для проведения абляции в различных материалах и живых объектах. Лазеры, генерирующие ультракороткие импульсы, начинают свою историю приблизительно с шестидесятых годов. В качестве активной среды лазеров, как правило, используют растворы красителей (лазеры на красителях) либо кристаллы (твердотельные лазеры). Наиболее часто в настоящее время используется титан-сапфировый кристалл (Ti:sapphire) (Krüger J., Kautec W., 2004).

Сменяя друг друга, каждое новое поколение лазеров двигается в направлении уменьшения длительности импульса и размера производимой абляции. При уменьшении длительности импульса в направлении от наносекунд к пико- и фемтосекундам с каждым шагом на порядок уменьшается энергия импульса, при которой достигается порог пробоя или абляции, и так же на порядок уменьшается размер наносимого повреждения.

Если в микросекундном импульсе энергия составляла несколько десятков Дж (30 Дж), то в наносекундном импульсе (100 нс) энергия на порядок меньше: приблизительно 1 Дж. Сообщается о возможности более точной локализации воздействия в случае наносекундного режима по сравнению с микросекундным при действии на меланому, лежащую под поверхностью кожи. Если микросекундный импульс вызывал лишь частичное повреждение меланомы и заметное повреждение окружающей ткани (область диаметром порядка 1 мм), то наносекундный импульс не оставлял заметных следов в окружающей ткани, повреждая только нижележащий участок меланомы (Minton J.P., Ketcham A.S., 1964).

В другой работе - так же на живой ткани (роговице) - проводилось сравнение нано-, пико- и фемтосекундного воздействия. Для импульса длительностью 8 нс порог абляции достигался при 500 мкДж, и размер абляции достигал 1 мкм глубины. С использованием пикосекундного импульса (30 пс) порог абляции оказался на порядок меньше, чем в случаях наносекунд (50 мкДж), так же как и размер абляции (0,01-0,1 мкм). Импульсы длительностью 65 фс имеют порог абляции в 0,8 мкДж и размер повреждения менее 0,001 мкм, что означает переход в область наноразмерного воздействия. При уменьшении длительности импульса существенно уменьшаются коллатеральные повреждения материала, появляется возможность к более точной фокусировке и улучшается контроль над размером повреждения (Stern D. et al., 1989).

Лазеры с генерацией ультракоротких импульсов представляют особый интерес для достижения высокой интенсивности излучения. В этом случае даже при низкой энергии импульса за счет его малой длительности получается высокая пиковая интенсивность излучения. При фокусировке лазерного излучения объективом с высокой числовой апертурой пятно максимальной интенсивности будет сосредоточено в перетяжке лазерного луча. Вне области перетяжки интенсивность излучения существенно ниже, и многофотонное поглощение маловероятно (Konig K. et al., 1999, a; Xu C. et al., 1996). Поэтому с использованием остросфокусированного излучения лазера и ультракоротких импульсов ближнего ИК диапазона в качестве скальпеля для нанохирургии можно достичь высокой локализации воздействия на биообъект без повреждения окружающего материала мишени.

Поле Е фемтосекундного импульса, поляризованное по ординате х, описывается модой Гаусса (1):

E(r, z, t ) = .

fi 7 F ^ 1 ' Z0 ' E0

i' Z0 + z

• E0' exp

i '(®0' t - к' z)-

к' Z0 + i' к' z 2 '(z2 + Zo2) '

' exp [- (t - z / cf/r2 ], (1)

где т = 100 фс - длительность импульса, к = - волновое число, соответствующее

длине волны = 780 нм, ^ = к ■ ^ /2 - параметр Релея, 0 - перетяжка лазерного пучка в

фокальной области г = 0. Диаметр перетяжки 2^0 для объектива с числовой апертурой NA

= 0,7 оценивается как 2wo = 1,22X/NA = 1,36 мкм, параметр Релея - Z0 = 1,86 мкм.

Максимальная интенсивность поля в момент времени t = 0 достигается в точке фокуса

объектива х, у, г = 0. При энергии импульса 1 нДж плотность мощности для пятна с

11 2

радиусом w0 = 0,68 мкм равна 6,8-10 Вт/см . При такой плотности мощности прозрачный в исследуемом диапазоне спектра материал поглощает свет по законам нелинейной оптики - вероятность возбуждения молекулы равна Р = опГ, где п > 2, о^-сечение п-фотонного поглощения света. Вероятность возбуждения молекул среды пропорциональна Е2п(Г).

2

r

1.1.3. Физико-химические механизмы взаимодействия фемтосекундного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона с материалом клетки.

Излучение ближнего инфракрасного диапазона попадает в окно прозрачности биологической ткани. В клетке отсутствуют вещества, которые эффективно поглощают в спектральном диапазоне 650-1350 нм, линейное поглощение такого излучения

пренебрежимо мало и не вызывает ни нагрева, ни химических превращений в клетке (Smith A.M. et al., 2009).

В настоящее время механизм поглощения лазерного излучения материалом живой клетки в области фокуса представляется как последовательность процессов, в основе которых лежат нелинейные эффекты фотоионизации. Первичные стадии фотоионизации связаны с появлением свободных электронов путем многофотонной или туннельной ионизации.

Туннельная ионизация происходит при наложении на атом внешнего электрического поля. Происходит деформация потенциального поля, с одной стороны от потенциальной ямы возникает потенциальный барьер конечной величины. С определенной вероятностью электрон может оказаться по ту сторону этого барьера - т.е., туннелировать. В случае если энергетический уровень электрона до наложения внешнего поля был выше полученного барьера, электрон может свободно вылететь из атома, и тогда этот процесс называется надбарьерной ионизацией.

Процесс многофотонной ионизации возникает, когда электрон, находящийся в потенциальной яме, в поле электромагнитной волны поглощает два или более фотона и отрывается от ядра атома. Считается, что многофотонная ионизация вносит основной вклад в образование свободных электронов (Joglekar A.P. et al., 2004).

Многофотонная и туннельная ионизация могут предшествовать лавинной ионизации: электрон поглощает один фотон за другим, разгоняется и выбивает электроны из других молекул.

Механизмы туннельной и многофотонной ионизации подробно рассмотрены в

рамках теории Келдыша (Келдыш Л.В., 1965). В теории Келдыша анализируется величина

1/2

параметра у = ю(рЛР) /e-|E|, где ц - приведенная масса электрона и дырки, Ip - потенциал ионизации, E - амплитуда напряженности электрического поля световой волны. При большом потенциале ионизации (величине запрещенной зоны) и высокой частоте светового поля ю справедливо неравенство у >> 1. В этом случае реализуется преимущественно механизм многофотонной ионизации. При у << 1 доминирует туннельный механизм ионизации. Величина у ~ 1 предполагает сосуществование двух механизмов - многофотонной и туннельной ионизации. Физические идеи теории Келдыша используются и при интерпретации экспериментальных данных в области фемтосекундной нанохирургии.

Последние детальные исследования процессов лазерной ионизации показывают, что выводы о механизме ионизации, полученные на основе оценки параметра у, носят полуколичественный характер. Вероятность элементарного акта туннельной ионизации

15

23 3

атома низка. Однако, учитывая высокую концентрацию валентных электронов ~10 см- , вклад туннельной ионизации в общий выход электронов в условиях воздействия фемтосекундных импульсов может быть существенным (Joglekar A.P. et al., 2004).

В условиях интенсивного лазерного воздействия вода трактуется как аморфный полупроводник с шириной запрещенной зоны Ui = 6.5 эВ. Скорость генерации электронов в воде Ne(t) определяется кинетическим уравнением (2)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Осыченко Алина Анатольевна, 2018 год

Список литературы.

1. Барбашов Ю.В., Залесский А.Д., Айбушев А.В., Саркисов О.М., Радциг М.А., Хмель И.А., Кокшарова О.А., Надточенко В.А. Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 в присутствии наночастиц золота // Российские Нанотехнологии - 2011 - Т. 6 - № 9-10 - С. 32-27.

2. Келдыш Л.В., Ионизация в сильном поле электромагнитной волны // Журнал Экспериментальной и Теоретической Физики. 1965. Т. 20. №. 5. С. 1307-1314.

3. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Теоретическая физика (в 10 томах): Гидродинамика -Т. 6 - Издание: 5-е., Год издания: 1988 - С. 56.

4. Манк М. Биология развития млекопитающих. Москва: "Мир". 1990. С. 303.

5. Осыченко А.А., Точило У.А., Астафьев А.А., Залесский А.Д., Шахов А.М., Кривохарченко А.С., Надточенко В.А. Определение диапазона неинвазивного воздействия фемтосекундными лазерными импульсами ближнего инфракрасного спектра для нанохирургии ооцитов млекопитающих // Современные технологии в медицине - 2017 - Т. 9 - №. 1 - С. 21-27.

6. Севастьянов В.И. Биосовместимость. Москва: ГУЛ «Информационный центр ВНИИгеосистем» - 1999 - С. 15

7. (а) Шахбазян А.К, Карменян А.В., Свиридова-Чайлахян Т.А, Кривохарченко А.С., Чои А., Чайлахян Л М. Возможности оптико-лазерных технологий в клеточной инженерии // Доклады Академии Наук - 2009 - T. 429 - № 4 - С. 1-4.

8. (б) Шахбазян А.К, Карменян А.В., Свиридова-Чайлахян Т.А, Кривохарченко А.С., Чои А., Чайлахян Л М. Использование лазера для получения реципиентных цитопластов при пересадке ядер у млекопитающих // Доклады Академии Наук -2009 - Т. 428 - № 3 - С 1-4.

9. Шахбазян А.К., Тарантул В.З., Залесский А.Д., Рябова А.В., Лощенов В.Б., Антонов С.А., Гривенников И.А., Кривохарченко А.С., Карменян А.В., Надточенко В.А. Получение химерных бластоцист мыши методами лазерной нанохирурги // Онтогенез - 2013 - Т. 44 - №. 6 - С. 403-408.

10. Астафьев А.А., Гулин А.А., Осыченко А.А., Солодина А.Е., Сырчина М.С., Титов А.А, Шахов А.М., Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Панаит А.И., Надточенко В.А. Структурные особенности ядрышка в ооците мыши на стадии зародышевого пузырька, выявленные методами атомно-силовой микроскопии, электронной сканирующей микроскопии и времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов // Российские нанотехнологии - 2017 - Т. 12 - № 7-8 - С. 13-16.

11. Alvarez-Dolado M. Cell fusion: biological perspectives and potential for regenerative medicine // Frontiers in Bioscience. - 2007 - V. 1 - I. 12 - P. 1-12.

12. Baumgart J., Kuetemeyer K., Bintig W., Ngezahayo A., Ertmer W., Lubatschowski H., Heisterkamp A. Repetition rate dependency of reactive oxygen species formation during femtosecond laser-based cell surgery // Journal of Biomedical Optics - 2009 - V. 14 - I. 5

- 059802.

13. Chen E.H., Grote E., Mohler W., Vignery A. Cell-cell fusion // FEBS Letters - 2007 - V. 581 - I. 11 - P. 2181-2193.

14. Chernomordik L.V., Sowers A.E. Evidence that the spectrin network and a nonosmotic force control the fusion product morphology in electrofused erythrocyte ghosts // Biophysical Journal - 1991 - V. 60 - I. 5 - P. 1026-1037.

15. Choi M., Yoon J., Ku T., Choi K., Choi C. Label-free optical activation of astrocyte in vivo // Journal of Biomedical Optics - 2011 - V. 16 - I. 7 - 075003.

16. Claude B., Justin T. Homokaryon production by electrofusion: A convenient way to produce a large number of viable mammalian fused cells // Biochemical and Biophysical Research Communications - 1983 - V. 114 - I. 2 - P. 663-669.

17. Colombelli J., Reynaud E.G., Stelzer E.H. Investigating relaxation processes in cells and developing organisms: from cell ablation to cytoskeleton nanosurger // Methods in Cell Biology - 2007 - V. 82 - P. 267-291.

18. Darke S.A., Tyson J.F. Interaction of laser radiation with solid materials and its significance to analytical spectrometry // Journal of analytical atomic spectrometry - 1993

- V. 8 - I. 2 - P. 145-209.

19. Dowgiallo A.M., Knappenberger K.L. Ultrafast electron-phonon coupling in hollow gold nanospheres // Physical Chemistry Chemical Physics - 2011 - V. 13 - P. 21585-21592.

20. Dubietis A., Couairon A., Kucinskas E., Tamosauskas G., Gaizauskas E., Faccio D., Di Trapani P. Measurement and calculation of nonlinear absorption associated with femtosecond filaments in water // Applied Physics B - 2006 - V. 84 - I. 3 - P. 439-446.

21. Gabel C.V. Femtosecond lasers in biology: nanoscale surgery with ultrafast optics // Contemporary Physics - 2008 - V. 49 - I. 6 - P. 391-411.

22. Gomez-Godinez V., Wu T., Sherman A.J., Lee C.S., Liaw L.H., Zhongsheng Y., Yokomori K., Berns M.W. Analysis of DNA double-strand break response and chromatin structure in mitosis using laser microirradiatio // Nucleic Acids Research - 2010 - V. 38 -I. 22 - e202.

23. Gong, J., Zhao X., Xing Q., Li F., Li H., Li Y., Chai L., Wang Q., Zheltikov A. Femtosecond laser-induced cell fusion // Applied Physics Letters - 2008 - V. 92 - I. 9 -093901.

24. Goppert-Mayer M. Elementary process with two quantum jumps // Annals of Physics -1931 - V. 9 - P 273-294.

25. Gottesman A., Milazzo J., Lazebnik Y. V-fusion: a convenient, nontoxic method for cell fusion // Biotechniques - 2010 - V. 49 - I. 4 - P. 747-750.

26. Graham C.F. Virus assisted fusion of embryonic cells // Acta Endocrinologica. Supplementum (Copenh). 1971 - V. 153 - P. 154-167.

27. He H., Kong S.K., Chan K.T. Transfection and cell fusion by femtosecond lasers // Journal of Innovative Optical Health Sciences - 2011 - V. 4 - I. 2 - P. 113-125.

28. Heinemann D., Schomaker M., Kalies S., Schieck M., Carlson R., Escobar H.M., Ripken T., Meyer H., Heisterkamp A. Gold Nanoparticle Mediated Laser Transfection for Efficient siRNA Mediated Gene Knock Down // Plos One - 2013 - V. 8 - I. 3 - e58604.

29. Heisterkamp A., Maxwell I.Z., Kumar S., Underwood J.M., Nickerson J.A., Ingber D.E., Mazur E. Nanosurgery in live cells using ultrashort laser pulses // Optical Interactions with Tissue and Cells XVI, SPIE Proceedings - 2005 - V. 5695 - P. 230-235.

30. Heisterkamp A., Maxwell I.Z., Mazur E., Underwood J.M., Nickerson J.A., Kumar S., Ingber D.E. Pulse energy dependence of subcellular dissection by femtosecond laser pulses // Optics Express - 2005 - V. 13 - I. 10 - P. 3690-3696.

31. Hosokawa Y., Ochi H., Iino T., Hiraoka A., Tanaka M. Photoporation of Biomolecules into Single Cells in Living Vertebrate Embryos Induced by a Femtosecond Laser Amplifier // Plos One - 2011 - V. 6 - I. 11 - e27677.

32. Iino T., Li P.-L., Wang W.-Z., Deng J.-H., Lu Y.-C., Kao F.-J., Hosokawa Y. Contribution of stress wave and cavitation bubble in evaluation of cell-cell adhesion by femtosecond laser-induced impulse // Applied Physics A - Materials Science & Processing - 2014 - V. 117 - I. 1 - P. 389-393.

33. Joglekar A.P., Liu H.H., Meyhofer E., Mourou G., Hunt A.J. Optics at critical intensity: Applications to nanomorphing // PNAS - 2004 - V. 101 - I. 16 - P. 5856-5861.

34. Kalies S., Birr T., Heinemann D., Schomaker M., Ripken T., Heisterkamp A., Meyer H. Enhancement of extracellular molecule uptake in plasmonic laser perforation // Journal of Biophotonics - 2014 - V. 7 - I. 7 - P. 474-482.

35. Karmenyan A.V., Shakbazyan A.K., Sviridova-Chailakhyan T.A., Krivokharchenko A.S., Chiou A.E., Chailakhyan L.M. Use of Picosecond Infrared Laser for

Micromanipulation of Early Mammalian Embryos // Molecular Reproduction and Development - 2009 - V. 75 - P. 975-983.

36. Kerkis A.Yu., Zhdanova N.S. Formation and ultrastructure of somatic cell hybrids // Electron Microscopy Reviews - 1992 - V. 5 - I. 1 - P. 1-24.

37. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature - 1975 - V. 256 - I. 5517 - P. 495-497.

38. (a) Konig K., Riemann I., Fischer P., Halbhuber K.-J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses // Cellular and Molecular Biology - 1999 - V. 45 - I. 2

- P. 195-201.

39. (6) Konig, K., Riemann I., Fischer P., Halbhuber K.-J. Intracellular nanosurgery with compact femtosecond laser // 18th Congress of the International Commission for Optics: Optics for the Next Millennium, Technical Digest. Proceedings - Volume 3749 - 1999 -P. 390-390.

40. Kotaidis V., Plech A. Cavitation dynamics on the nanoscale // Applied Physics Letters -2005 - V. 87 - 213102.

41. Krivokharchenko A., Galat V., Ganten D., Bader M. In vitro formation of tetraploid rat blastocysts after fusion of two-cell embryos // Molecular Reproduction and Development

- 2002 - V. 61 - I. 4 - P. 460-465.

42. Krivokharchenko A., Karmenyan A., Sarkisov O., Bader M., Chiou A., Shakhbazyan A. Laser Fusion of Mouse Embryonic Cells and Intra-Embryonic Fusion of Blastomeres without Affecting the Embryo Integrit // PLOS One - 2012 - V. 7 - I. 12 - e50029.

43. Krüger J., Kautek W. Ultrashort Pulse Laser Interaction with Dielectrics and Polymers // Advances in Polymer Science - 2004 - V. 168 - P. 247-290.

44. (a) Kuetemeyer K., Lucas-Hahn A., Petersen B., Niemann H., Heisterkamp A. Femtosecond laser-induced fusion of nonadherent cells and two-cell porcine embryos // Journal of Biomedical Optics - 2011 - V. 16 - I. 8 - 088001.

45. (6) Kuetemeyer K., Rezgui R., Lubatschowski H., Heisterkamp A. Mechanisms of femtosecond laser cell surgery in the low-density plasma regime // Optical Interactions with Tissue and Cells XXII. Proc. SPIE - 2011 - V. 7897 - 789704.

46. Kuo Y.-E., Wu C.-C., Hosokawa Y., Maezawa Y., Okano K., Masuhara H., Kao F.-J. Local stimulation of cultured myocyte cells by femtosecond laser-induced stress wave // Applied Physics A - Materials Science & Processing - 2010 - V. 101 - I. 4 - P. 597-600.

47. Lauterborn W., Vogel A. Shock Wave Emission by Laser Generated Bubbles // C.F. Delale (Ed.): Bubble Dynamics & Shock Waves - 2013 - P. 67-103.

48. Lehmann J., Pollet D., Peker S., Steinkraus V., Hoppe U. Kinetics of DNA strand breaks and protection by antioxidants in UVA- or UVB-irradiated HaCaT keratinocytes using the single cell gel electrophoresis assay // Mutation Research - 1998 - V. 407. - P. 97108.

49. Mie G. Contributions to the optics of turbid media, particularly of colloidal metal solutions // Annals of Physics. - 1978 - V. 4 - P. 1-69.

50. Minai L., Yeheskely-Hayon D., Golan L., Bisker G., Dann E.J., Yelin D. Optical Nanomanipulations of Malignant Cells: Controlled Cell Damage and Fusion // Small -2012 - V. 8 - I. 11 - P. 1732-1739.

51. Minton J.P., Ketcham A.S. A comparison of the effect of microsecond and nanosecond ruby laser radiation on rat tissues and mouse melanoma: A preliminary report // Journal of Surgical Research - 1964 - V. 4 - P. 281-285.

52. Moeendarbary E., Valon L., Fritzsche M., Harris A.R., Moulding D.A., Thrasher A.J., Stride E., Mahadevan L., Charras G.T. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material // Nature Materials - 2013 - V. 12 - I. 3 - P. 253-261.

53. Molk J.N., Salmon E.D., Bloom K. Nuclear congression is driven by cytoplasmic microtubule plus end interactions in S. cerevisiae // The Journal of Cell Biology - 2006 -V. 172 - I. 1 - P. 27-39.

54. Moroz P.E. The Cell in the Field of Gravity and the Centrifugal Field // Journal of Theoretical Biology - 1984 - V. 107 - I. 2 - P. 303-320.

55. Mthunzi P., He K., Ngcobo S., Khanyile T., Warner J.H. Graphene for improved femtosecond laser based pluripotent stem cell transfection // Journal of Biophotonics -2014 - V. 7 - I. 5 - P. 351-362.

56. Neumann J., Brinkmann R. Boiling nucleation on melanosomes and microbeads transiently heated by nanosecond and microsecond laser pulses // Journal of Biomedical Optics - 2005 - V. 10 - 24001.

57. Neumann J., Brinkmann R. Self-limited growth of laser-induced vapor bubbles around single microabsorbers // Applies Physics Letters - 2008 - V. 93 - 033901.

58. Ogle B.M., Cascalho M., Platt J.L. Biological implications of cell fusion // Molecular Cell Biology - 2005 - V. 6 - P. 567-575.

59. Ormö M., Cubbit A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J., Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science - 1996 - V. 273 - I. 5280 - P. 1392-1395.

60. Paltauf G., Dyer P.E. Photomechanical Processes and Effects in Ablation // Chemical Reviews - 2003 - V. 103 - I. 2 - P. 487-518.

61. Pannuzzo M., De Jong D.H., Raudino A., Marrink S.J. Simulation of polyethylene glycol and calcium-mediated membrane fusion // The Journal Of Chemical Physics - 2014 - V. 140 - I. 12 - 124905.

62. Plesset M.S., Prosperetti A. Bubble Dynamics and Cavitation // Annual Review of Fluid Mechanics - 1977 - V. 9 - P. 145-185.

63. Podbilewicz B. P. (CA): WormBook, Cell fusion - 2006 - P. 1-32.

64. Pontecorvo G., Riddle P.N., Hales A. Time and mode of fusion of human fibroblasts treated with polyethylene glycol (PEG) // Nature - 1997 - V. 265 - I. 5591 - P. 257-258.

65. Popova E., Bader M., Krivokharchenko A. Effects of electric field on early preimplantation development in vitro in mice and rats // Human Reproduction - 2011 - V. 26 - I. 3 - P. 662-670.

66. Poxleitner M.K., Carpenter M.L., Mancuso J.J., Wang C.J., Dawson S.C., Cande W.Z. Evidence for Karyogamy and Exchange of Genetic Material in the Binucleate Intestinal Parasite Giardia intestinalis // Science - 2008 - V. 319 - I. 5869 - P. 1530-1533.

67. Prather R.S., Hoffman K.E., Schoenbeck R.A., Stumpf T.T., Li J. Characterization of DNA synthesis during the 2-cell stage and the production of tetraploid chimeric pig embryos // Molecular Reproduction and Development - 1996 - V. 45 - I. 1 - P. 38-42.

68. Praveen B.B., Stevenson D.J., Antkowiak M., Dholakia K., Gunn-Moore F.J. Enhancement and optimization of plasmid expression in femtosecond optical transfection // Journal of Biophotonics - 2011 - V. 4 - I. 4 - P. 229-235.

69. Prendergast F.G., Mann K.G. Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea // Biochemistry - 1978 -V. 17 - I. 17 - P.3448-3453.

70. Raabe I., Vogel S.K., Peychl J., Tolic-Norrelykke I.M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser // Journal of Microscopy - 2009 - V. 243 - I. 1 - P. 1-8.

71. Rechsteiner M., Parsons B. Studies on the intranuclear distribution of human and mouse genomes and formation of human-mouse hybrid cells // Journal of Cellular Physiology -1976 - V. 88 - I. 2 - P. 167-179.

72. Sarpe C., Köhler J., Winkler T., Wollenhaupt M., Baumert T. Real-time observation of transient electron density in water irradiated with tailored femtosecond laser pulses // New Journal of Physics - 2012 - V. 14 - I. 7. 075021.

73. Schierenberg E. Altered cell-division rates after laser-induced cell fusion in nematode embryos // Developmental Biology - 1984 - V. 101 - I. 1 - P. 240-245.

74. Schneeberger E. E., Harris H. An ultrastructural study of inter-specific cell fusion induced by inactivated Sendai virus // Journal of Cell Science - 1966 - V. 1 - I. 4 - P. 401-406.

75. Sekirina G.G., Bogolubova N.A., Antonova N.V., Dyban A.P. The behavior of mitochondria and cell integration during somatic hybridisation of sister blastomeres of the 2-cell mouse embryo // Zygote - 1997 - V. 5 - I. 2 - P. 97-103.

76. Shen N., Datta D., Schaffer C.B., LeDuc P., Ingber D.E., Mazur E. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in cells using a femtosecond laser nanoscissor // Mechanics & Chemistry of Biosystems - 2005 - V. 2 - I. 1 - P. 17-25.

77. Siems A., Weber S.A.L., Boneberg J., Plech A. Thermodynamics of nanosecond nanobubble formation at laser-excited metal nanoparticles // New Journal of Physics -2011 - V. 13 - 043018.

78. Sims M., First N.L. Production of calves by transfer of nuclei from cultured inner cell mass cells // PNAS - 1994 - V. 91 - I. 13 - P. 6143-6147.

79. Smith A.M., Mancini M.C., Nie S., Second window for in vivo imaging // Nature Nanotechnology - 2009 - V. 4 - P. 710-711.

80. Spindle A. Polyethylene glycol-induced fusion of two-cell mouse embryo blastomeres // Experimental Cell Research - 1981 - V. 131 - I. 2 - P. 465-470.

81. Stein B., Rahmsdorf H.J., Steffen A., Litfin M., Herrlich P., UV-induced DNA damage is an intermediate step in UV-induced expression of human immunodeficiency virus type 1, collagenase, c-fos, and metallothionein // Molecular and Cellular Biology - 1989 - V. 9 -I. 11 - P. 5169-5181.

82. Stern D., Schoenlein R.W., Puliafito C.A., Dobi E.T., Birngruber R., Fujimoto J.G. Corneal Ablation by Nanosecond, Picosecond, and Femtosecond Lasers at 532 and 625 nm // Archives of Ophthalmology - 1989 - V. 107 - I. 4 - P. 587-592.

83. de StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics // Journal of Immunological Methods - 1980 - V. 35 - I. 1-2 - P. 1-21.

84. Stevenson D.J., Gunn-Moore F.J., Campbell P., Dholakia K. Single cell optical transfection // Journal of the Royal Society Interface - 2010 - V. 7 - I. 47 - P. 863-871.

85. Suzuki H., Ogasawara I., Takahashi H., Imada Y., Toyokawa K. Electrofusion of blastomeres of hamster 2-cell embryos and dynamic changes of the cytoskeletal distribution // Journal of Reproduction and Development - 2001 - V. 47 - I. 4 - P. 227235.

86. Tanabayashi K., Compans R.W. Functional interaction of paramyxovirus glycoproteins: identification of a domain in Sendai virus HN which promotes cell fusion // Journal of Virology - 1996 - V. 70 - I. 9 - P. 6112-6118.

87. Tängemo C., Ronchi P., Colombelli J., Haselmann U., Simpson J.C., Antony C., Stelzer E.H., Pepperkok R., Reynaud E.G. A novel laser nanosurgery approach supports de novo Golgi biogenesis in mammalian cells // Journal of Cell Science - 2011 - V. 15 - I. 124 - P. 978-987.

88. Tarkowski A.K. An air-drying method for chromosome preparation from mouse eggs // Cytogenesis - 1966 - V. 5 - P. 394-400.

89. Tsai C.-L., Chen J-C., Wang W.-J. Near-infrared Absorption Property of Biological Soft Tissue Constituents // Journal of Medical and Biological Engineering - 2001 - V. 21 - I. 1

- P. 7-14.

90. Uchugonova A., Isemann A., Gorjup E., Tempea G., Bückle R., Watanabe W., König K. Optical knock out of stem cells with extremely ultrashort femtosecond laser pulses // Journal of Biophotonics - 2008 - V. 1 - I. 6 - P. 463-469.

91. Uchugonova A., Lessel M., Nietzsche S., Zeitz C., Jacobs K., Lemke C., König K. Nanosurgery of cells and chromosomes using near-infrared twelve-femtosecond laser pulses // Journal of Biomedical Optics - 2012 - V. 17 - I. 10 - 101502.

92. Vitale I., Galuzzi L., Castedo M., Kroemer G. Mitotic catastrophe: a mechanism for avoiding genomic instability // Nature Reviews Molecular Cell Biology - 2011 - V. 12 - I. 6 - P. 385-392.

93. Vogel A. Shaker: Optical Breakdown in Water and Ocular Media, and its Use for Intraocular Photodisruption - 2001 - P. 47.

94. Vogel A., Noack J., Hüttman G., Paltauf G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues // Applied Physics B - Lasers and Optics - 2005 - V. 81 -I. 8 - P. 1015-1047.

95. Vogel A., Venugopalan V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues // Chemical Reviews - 2003 - V. 103 - P. 577-644.

96. Watanabe W., Arakawa N., Matsunaga S., Higashi T., Fukui K., Isobe K., Itoh K. Femtosecond laser disruption of subcellular organelles in a living cell // Optics Express -2004 - V. 12 - I. 18 - P. 4203-4213.

97. Wiegand R., Weber G., Zimmermann K., Monajembashi S., Wolfrum J., Greulich K. Laser-induced fusion of mammalian cells and plant protoplasts // Journal of Cell Science

- 1987 - V. 88 - P. 145-149.

98. Willkomm L., Bloch W. State of the art in cell-cell fusion // Methods in Molecular Biology - 2015 - V. 1313 - P. 1-19.

99. Wilson T. Electrofusion - a faster, more efficient technique for hybridoma production // BioTechnology - 1983 - V. 1 - I. 5 - P. 390-391.

100. Xu C., Zipfel W., Shear J.B., Williams R.M., Webb W W. Multiphoton fluorescence excitation: New spectral windows for biological imaging // PNAS - 2009 -V. 93 - I. 20 - P. 10763-10768.

Приложения.

Приложение 1. Размер и время жизни парогазовых пузырей, возникающих в разных областях клетки (ядре, цитоплазме, ядрышке и в области клеточного контакта) при различных параметрах фемтосекундного лазерного воздействия. 1 - время жизни парогазового пузыря, мс. Б - максимальный диаметр парогазового пузыря, мкм. В таблице значения времени жизни представлены по возрастанию, и каждому времени жизни соответствует свой диаметр.

Параметры воздействия № образца Ядро Цитоплазма Ядрышко Контакт

1 мс Б, мкм 1 мс Б, мкм 1 мс Б, мкм 1 мс Б, мкм

0,5 нДж 15 мс - - - - - - -

0,5 нДж 30 мс - - - - - - -

0,5 нДж 60 мс 1 - - - - 200 1,2

Средние значения 200 1,2

1 нДж 15 мс 1 160 4,5 120 1,2 400 2,8 80 2,3

2 120 1,5 120 1,5 400 2,0 120 2,1

3 160 2,1 120 2,3 400 1,2 160 2,4

4 120 1,5 160 3,7 560 1,3 160 2,7

5 120 1,5 160 1,5 200 2,0

6 120 1,5 200 2,8 200 2,6

7 440 3,6 200 3,1 240 2,6

8 800 7,5 200 3,4 240 2,7

9 280 3,3 280 3,0

10 440 2,2 320 3,2

Средние значения 225 2,9 200 2,5 440 1,7 200 2,6

1 нДж 30 мс 1 120 3,4 40 2,4 120 0,7 160 2,4

2 360 4,3 280 1,5 200 2,2

3 560 6,6 280 2,1 240 3,7

4 760 6,9 400 1,5 240 3,5

5 1160 11,6 480 1,2 280 3,9

6 1240 10,8 800 1,6 320 2,6

7 1280 11,3 320 7,0

8 320 2,3

9 320 3,7

10 400 4,2

Средние значения 120 3,4 860 7,3 393 1,4 280 3,6

1 нДж 60 мс 1 120 3,6 160 4,6 80 0,7 200 2,7

2 280 4,5 200 1,7 280 3,7

3 320 4,6 400 2,2 320 3,7

4 440 6,8 480 2,0 400 4,5

5 640 6,9 760 1,3 400 4,2

6 680 7,7 960 1,5 440 4,4

7 840 9,1 480 4,7

8 1280 12,3 1400 13,2

9 1560 11,7 1480 14,1

10 1880 10,7 1600 14,8

Средние значения 120 3,6 808 7,9 480 1,6 700 7,0

2 нДж 15 мс 1 200 3,4 240 4,0 120 2,2 160 1,8

2 520 5,4 840 7,6 160 0,9 200 3,6

3 560 8,2 2160 12,7 200 1,7 240 3,2

4 1960 13,0 2160 12,7 240 1,8 280 3,0

5 2160 12,7 360 1,5 320 3,7

6 3720 16,2 480 0,6 360 2,7

7 4160 16,7 400 3,9

8 4320 16,3 680 3,6

9 1720 15,0

10 4800 18,9

Средние значения 2200 11,5 1350 9,2 314 1,5 916 5,9

2 нДж 30 мс 1 1080 8,5 120 3,5 160 1,8 440 4,3

2 2600 14,6 240 3,8 160 2,1 760 8,7

3 2720 13,3 840 9,3 200 2,0 800 4,9

4 2920 14,5 1240 10,4 240 2,0 1320 14,5

5 3400 15,2 1520 11,9 240 1,8 2120 13,1

6 3680 16,1 1640 11,2 360 1,3 3040 14,7

7 4560 24,0 1880 12,7 800 4,3 4600 21,4

8 6000 19,5 1920 13,6 4800 16,7

9 9120 23,5 2720 12,3 6200 22,1

10 4800 16,9 7200 19,7

Средние значения 4008 16,6 1692 10,6 308 2,2 3128 14,0

2 нДж 60 мс 1 680 7,9 240 3,4 160 1,3 760 5,6

2 1920 13,4 240 4,3 200 2,3 800 4,1

3 2960 13,3 400 3,3 200 1,3 1560 9,8

4 3040 14,5 1920 9,5 240 1,6 1680 14,9

5 4120 14,5 2800 13,4 280 1,6 3080 10,9

6 5000 16,0 4440 17,3 280 2,8 3360 10,8

7 9480 20,5 4840 18,0 280 2,9 4440 17,9

8 5280 18,3 4560 17,9

9 7120 24,7

10 8960 21,8

Средние значения 3885 14,3 2520 10,9 234 2,0 3632 13,8

Приложение 2. Количество клеток в бластоцистах при разных параметрах воздействия.

0,3 нДж 15 мс 0,3 нДж 30 мс 0,3 нДж 60 мс 1 нДж 15 мс 1 нДж 30 мс 1 нДж 60 мс 2 нДж 15 мс 2 нДж 30 мс 2 нДж 60 мс контрол ь

40 39 33 18 38 25 20 45 26 25

42 47 36 19 38 30 37 48 27

47 50 43 20 65 33 38 32

50 57 45 24 71 34 41 37

50 60 47 26 78 34 47 52

52 61 53 28 84 38 50 56

56 62 53 31 92 39 60 59

59 62 59 39 39 60 60

62 62 60 45 40 63 63

80 67 65 49 41 66

89 68 66 53 42 77

72 66 55 43 77

74 67 43 83

74 77 46 102

77 48

90 51

53

62

Среднее количество клеток, количество образцов

57 ± 15, п = 11 64 ± 16, п = 16 55 ± 14, п = 14 34 ± 14, п = 12 52 ± 21, п = 12 41 ± 9, п = 18 46 ± 14, п = 9 47 ± 2, п = 2 26, п = 1 58 ± 23, п = 14

Приложение 3. Количество клеток в бластоцистах контрольных и опытных эмбрионов на пятый и шестой день.

Контроль Не слитые Слитые Из 1 бластомера

5 день 6 день 5 день 6 день 5 день 6 день 5 день 6 день

27 34 22 21 12 15 13 17

29 40 23 21 13 16 14 33

37 47 25 24 13 17 14

41 48 27 35 14 21 15

44 52 28 37 14 22 17

45 58 29 46 16 42

45 61 30 51 17

47 62 31 61 18

54 66 33 18

57 71 35 20

64 74 37 22

65 78 43 22

67 80 45 23

75 80 47 24

78 84 49 25

85 54 26

101 28

Среднее количество клеток ± стандартное отклонение (количество образцов)

52 ± 16 (п = 15) 66 ± 17 (п = 17) 35 ± 10 (п = 16) 37 ± 15 (п = 8) 19 ± 5 (п = 17) 22 ± 10 (п = 6) 15 ± 3 (п = 7) 25 ± 11 (п = 2)

Приложение 4. Эффективность слияния при помощи фемтосекундного лазера и развитие слитых эмбрионов у чистой и гибридной линии мышей.

Время Количест Количест- Количест- Эмбрионы, у Полностью % слитых эмбрионов, % тетраплоид-ных

№ опыта от укола ХГЧ во эмбрионов во слитых эмбрионов во не слитых эмбрионов которых разрушен 1 бласто- разрушенные эмбрионы достигших стадии бластоцис- бластоцист от общего числа

мер ты опытных эмбрионов

1 43,5 30 3 18 7 2 100% 10%

(10%) (60%) (23%) (7%) (3/3) (3/30)

2 44,5 20 3 10 6 1 100% 15%

(15%) (50%) (30%) (5%) (3/3) (3/20)

3 44-45 32 8 13 8 3 87% 22%

(25%) (41%) (25%) (9%) (7/8) (7/32)

4 44-45 30 8 14 2 6 37% 10%

- П 1п (27%) (47%) (7%) (20%) (3/8) (3/30)

5 45 35 5 15 0 15 40% 6%

и (14%) (43%) (0%) (43%) (2/5) (2/35)

6 45- 50 10 17 14 9 70% 14%

46.5 (20%) (34%) (28%) (18%) (7/10) (7/50)

7 47 12 1 (8%) 6 (50%) 2 (17%) 3 (25%) 100% (1/1) 8% (1/12)

8 47 24 6 11 2 5 66% 16%

(25%) (46%) (8%) (21%) (4/6) (4/24)

Суммарные данные: 233 44 (19%) 104 (45%) 41 (17%) 44 (19%) 75% (30/44) 13% (30/233)

9 44-45 40 13 17 5 5 46% 15%

(33%) (43%) (12%) (12%) (6/13) (6/40)

10 45 20 4 10 1 5 75% 15%

(20%) (50%) (5%) (25%) (3/4) (3/20)

11 S 45 20 12 4 0 4 41% 25%

1п (60%) (20%) (0%) (20%) (5/12) (5/20)

12 и 45 50 20 17 3 10 45% 18%

П (40%) (34%) (6%) (20%) (9/20) (9/50)

13 U 47 20 10 3 0 7 0% 0%

(50%) (15%) (0%) (35%) (0/20) (0/20)

14 47 20 5 8 0 7 0% 0%

(25%) (40%) (0%) (35%) (0/20) (0/20)

Суммарные данные: 170 64 (38%) 59 (35%) 9 (5%) 38 (22%) 35% (23/64) 12% (23/170)

Приложение 5. Площадь ядер диплоидных и тетраплоидных эмбрионов во время второго и третьего клеточного цикла.

№ образца Площадь ядер во время второго клеточного цикла, мкм2

Слитые эмбрионы Контрольные эмбрионы

1 119 109

2 121 112

3 133 116

4 133 121

5 151 121

6 156 122

7 122

8 125

9 135

10 136

Среднее значение 136 122

№ образца Площадь ядер во время третьего клеточного цикла, мкм2

Слитые эмбрионы Контрольные эмбрионы

1 142 109

2 158 111

3 159 113

4 170 114

5 179 122

6 180 122

7 190 124

8 199 131

9 207 139

10 139

Среднее значение 176 122

2

Приложение 6. Площадь ядер диплоидных и тетраплоидных бластоцист (мкм ).

№ образца Диплоидные, контроль Диплоидные, не слитые Тетраплоидные (слитые)

1 77 69 123

2 81 88 130

3 88 89 138

4 88 90 146

5 95 92 154

6 98 101 173

7 98 102 173

8 99 104 174

9 99 105 178

10 99 106 179

11 100 107 180

12 101 108 183

13 104 109 183

14 104 112 183

15 105 116 191

16 105 118 194

17 109 119 206

18 112 120 207

19 113 121 209

20 117 123 212

21 118 125 219

22 119 126 220

23 119 129 224

24 119 129 224

25 119 130 226

26 120 130 235

27 124 131 236

28 125 132 259

29 130 138 272

30 133 139 2S3

31 144 140 292

32 14б 141 29б

33 154 142 307

34 155 144 314

35 159 171 333

3б 1б0 175 3б7

37 1б4 179 373

3S 1б9 191 392