Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.09, кандидат биологических наук Дронина, Мария Алексеевна

• Дронина, Мария Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дронина, Мария Алексеевна

Введение.

Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная структура и механизм действия (обзор литературы).

1.1. Молекулярная организация Cry-белков.

1.1.1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура.

1.1.2. Пространствнная организация молекулы

Cry-белков.

1.1.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков.

1.2. Механизм действия Cry-белков.

1.2.1. Специфичность инсектицидной активности.

1.2.2. Общая схема патогенеза.

1.2.3. Ещё раз об активации протоксинов.

1.2.4. Связывание Cry-белков с мембранами кишечного эпителия чувствительных насекомых.

1.2.5. Токсины В. thuringiensis способны образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах.

1.2.6. Факторы, вызывающие гибель насекомых.

1.3. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Cry-белков.

1.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых.

1.4.1. Кадгериноподобный рецептор Cryl-белков.

1.4.2. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков.

1.4.3. Элементы структуры Cry-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором.

1.4.4. Доказательства участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo.

1.4.5. Токсин-связывающие свойства аминопептидазы N.

1.4.6. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N.

1.4.7. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Cry-белков.

1.4.8. Другие кандидаты на роль рецептора

Cry-белков.

1.5. Москитоцидные токсины В. thuringiensis.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Выделение дельта-эндотоксинов.

2.2. Определение концентрации белка.

2.3. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков.

2.4. Выращивание личинок комаров.

2.5. Определение биологической активности.

2.6. Методика электронно-микроскопического исследования.

2.7. Приготовление гистологических препаратов для иммуноцитохимических и цитохимических исследований.

2.8. Биотинилирование энтомоцидных белков.

2.9. Проведение гистохимической реакции.

2.10. Проведение иммуногистохимической реакции.

2.11. Получение препаратов апикальных мембран

ВВМ) кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi.

2.12. Синтез аффинных сорбентов.

2.13. Изучение белкового состава экстрактов мембранных белков, полученных с помощью различных детергентов.

2.14. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков Ли. stephensi.

2.15. Электрофорез.

2.16. Лиганд-блоттинг.

2.17. Изучение связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков

An. stephensi с токсинами В. thuringiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москитоцидных белков CryllA и Сгу4В.

2.18. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции.

2.19. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков.

2.20. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

2.21. Определение активности щелочной фосфатазы.

Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti.

3.1. Цели и объекты исследования.

3.2. Определение диапазона эффективных концентраций кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А.

3.3. Влияние кристаллов эндотоксина на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti.

3.4. Влияние индивидуальных токсинов на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti.Ill

Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара A. aegypti.

4.1. Схема эксперимента.

4.2. Визуализация связывания москитоцидных белков с кишечным эпителием личинок A. aegypti.

Глава 5. Выделение токсин-связывающих белков из мембран кишечного эпителия личинок An. stephensi.

5.1. Белковый состав ВВМ кишечного эпителия личинок An. stephensi.

5.2. Использование лиганд-блоттинга для обнаружения токсин-связывающего белка в экстракте ВВМ An. stephensi.

5.3. Аффинная хроматография белков ВВМ кишечного эпителия личинок An. stephensi.

5.4. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ

An. stephensi с токсинами Bacillus thuringiensis, обладающими различной специфичностью энтомоцидного эффекта.

5.5. Обратимость связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ An. stephensi с Cry4B-tox.

5.6. Гомологическая и гетерологическая конкуренция при взаимодействии эндотоксина Cryl 1А и Cry4B-tox с 65 кДа- и 57 кДа-белками.

5.7. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков с продуктами ограниченного протеолиза эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А.

5.8. Определение N-концевой последовательности 57 кДа-белка из ВВМ An. stephensi.

5.9. Определение фосфатазной активности в элюате, содержащем 65 кДа- и 57 кДа-белки из ВВМЛи. stephensi.

5.10. Растворимая форма 65 кДа- и 57 кДа-белков из

ВВМ An. stephensi.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti»

Актуальность проблемы.

Одними из самых перспективных биоинсектицидов являются препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (8-эндотоксинов), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. В частности, токсины, продуцируемые ssp. israelensis, убивают личинок многих видов комаров и мошек, но безвредны для всей остальной фауны водоёмов.

В основе биологического эффекта 8-эндотоксинов В. thuringiensis лежит их цитопатологическое действие на эпителиальные клетки кишечника насекомых. В свою очередь, специфичность этих белков определяется их взаимодействием с рецепторами, экспонированными в апикальной мембране эпителиальных клеток. Изучение воздействия 8-эндотоксинов на кишечный эпителий, поиск и характеристика соответствующих рецепторов необыкновенно важны для понимания механизма действия и специфичности энтомо-цидных белков, основ патогенного эффекта В. thuringiensis.

Идентификация рецепторов эндотоксинов важна также для понимания путей возникновения резистентности у насекомых - мишеней, поскольку часто этот эффект связан именно с ухудшением связывания энтомоцидных белков со стенкой кишечника. Вследствие этого работы по изучению взаимодействия эндотоксинов В. thuringiensis с кишечным эпителием чувствительных насекомых по- прежнему необыкновенно актуальны. Цели и задачи исследования.

Целью работы было изучение энтомоцидного действия эндотоксинов

Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti.

Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучение цитопатологических изменений, происходящих в эпителиальных клетках личинок комаров (на примере личинок Aedes aegypti) под действием москитоцидных токсинов Сгу4В и Cryl 1 А, продуцируемых Bacillus thuringiensis ssp. israelensis;

- идентификация сайтов связывания токсинов со стенкой кишечника личинок комаров;

- выделение специфического рецептора (ов), ответственного за связывание токсинов кишечным эпителием личинок Anopheles stephensi.

Научная новизна.

В работе впервые: всесторонне изучено воздействие эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на эпителиальные клетки личинок Ае. aegypti, с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов визуализировано место связывания этих белков с кишечным эпителием насекомого; выделены 65 и 57 кДа токсинсвязывающие белки из апикальных мембран эпителиальных клеток личинок An. stephensi', высказано предположение, что наряду с выделенными ранее токсинсвязывающими белками из Ае. aegypti, эти два белка образуют не описанный ранее класс рецепторов эндотоксинов В. thuringiensis.

Практическая ценность работы.

Полученные данные о воздействии москитоцидных токсинов на кишечный эпителий личинок комаров и о природе рецепторов этих токсинов указывают точки приложения для дальнейших исследований механизма мос-китоцидного эффекта и возможных путей возникновения резистентных линий комаров. В свою очередь, эти исследования позволят в дальнейшем создать биоинсектициды нового поколения с существенно повышенной эффективностью биологического эффекта и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых. Апробация работы, публикации.

Основные положения диссертации представлены на конференции «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России» (Великий Новгород, 2000), II Республиканской научной конференции (Великий Новгород: НовГУ, 2002), на XXVII Межвузовской н.-практ. конфер. по проблемам биологии и мед. паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н.Павловского (С.-Пб, 2000).

Материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах: 4 статьях и 2 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 136 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, 5 - ти глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Последний содержит 179 названий, из которых 7 - на русском языке.

Заключение диссертации по теме «Энтомология», Дронина, Мария Алексеевна

выводы

1. С помощью электронной микроскопии показано, что под действием москитоцидных белков Bacillus thuringiensis ssp. israelensis в средней кишке личинок комара Aedes aegypti происходят ультраструктурные изменения клеток столбчатого эпителия, включающие дезинтеграцию цитоплазмы, образование удлинённых лакун, деградацию клеточных органелл и разрушение микроворсинок. Перитрофическая оболочка смещается в полость средней кишки. В ультраструктуре клеток эпителия передней и задней кишки каких-либо изменений не отмечено.

2. Сравнение влияния энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных токсинов Сгу4В и Cryl 1А показывает, что эффект всех трёх препаратов однотипен, хотя наиболее сильные разрушения происходят под действием кристаллов.

3. С помощью цитохимических методов установлено, что специфическое связывание эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В (Cry4B-tox) с тканями личинок комара Aedes aegypti происходит только в области микроворсинок эпителия средней кишки и перитрофической оболочки.

4. Из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Anopheles stephensi методом аффинной хроматографии выделены белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные специфически связываться с эндотоксином Cryl 1А и Cry4B-tox в условиях лиганд-блоттинга, причём оба Cry-белка конкурируют друг с другом за это связывание.

5. Способность продуктов ограниченного протеолиза эндотоксинов Cryl 1А и Сгу4В к связыванию с 65 и 57 кДа белками коррелирует с их активностью для личинок комаров. N-концевая аминокислотная последовательность 57 кДа белка уникальна и отсутствует в NCBI GenBank.

6. По большинству изученных свойств 65 и 57 к Да белки сходны с токсинсвязывающими белками Aedes aegypti и, возможно, образуют вместе с ними новый класс (классы) рецепторов дельта-эндотоксинов.

Заключение

Суммируя полученные данные можно сказать, что как место приложения действия эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на ткани кишечника личинок комаров, так и основные нарушения ультраструктуры эпителиальных клеток, происходящие в результате этого воздействия, похожи и мало отличаются от тех, которые наблюдаются при действии токсинов В. thuringiensis на представителей других отрядов насекомых. В то же время, белки, связывающие токсины Сгу4В и Cryl 1А на апикальной мембране эпителиальных клеток, существенно отличаются от описанных рецепторов Cry-белков из кишечника гусениц.

В данной работе мы провели комплексное исследование воздействия москитоцидных токсинов Сгу4В и Cryl 1 А, продуцируемых подвидом israel-ensis ВТ, на кишечный эпителий личинок комаров. Были изучены гистопа-тологические изменения эпителия личинок A. aegypti, наступающие после проглатывания насекомым токсинов. Связывание этих белков с клетками эпителия было прослежено с помощью гистохимических и иммуногистохи-мических методов. Наконец, из апикальных мембран эпителиальных клеток An. stephensi был выделен токсинсвязывающий белок, по нашему предположению являющийся рецептором токсинов Сгу4В и Cryl 1 А.

Проведённые исследования продемонстрировали серьёзные изменения, происходящие под действием москитоцидных белков в эпителиальных клетках и перитрофической мембране личинок комаров в средней кишке. Эти изменения, в общем, близки тем, что показаны для гусениц, обработанных ле-пидоцидными токсинами В. thuringiensis, и включают деградацию микроворсинок, вакуолизацию цитоплазмы и разрушение клеточных органелл. В то же время в клетках передней и задней кишки никаких изменений не зафиксировано.

Было показано, что эндотоксин Cryl 1А и активированный токсин Сгу4В связываются с микроворсинками кишечного эпителия средней кишки.

Используя метод аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах CiyllA- и Сгу4В-сефароза, мы выделили белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные обратимо и специфично связывать указанные токсины. По всем изученным характеристикам эти белки близки 65- и 62 кДа токсинсвязывающим белкам, выделенным ранее в нашей лаборатории из апикальных мембран кишечного эпителия личинок A. aegypti. В то же время, по молекулярной массе и энзиматической активности, указанные токсинсвя-зывающие белки существенно отличаются от белков, выполняющих аналогичную функцию у гусениц. По всей видимости, мы обнаружили новый класс мембранных белков насекомых, способных связывать токсины В. thuringiensis.

Тот факт, что связывание москитоцидных и лепидоцидных токсинов В. thuringiensis с разными рецепторными белками приводит к однотипным гис-топатологическим изменениям эпителия у личинок комаров и у гусениц, обусловлено описанными нами (см. «Обзор литературы») особенностями Ciy-белков: общая принципиальная схема организации вторичной и третичной структуры сочетается у них с существенными различиями первичной структуры в тех районах молекулы, которые ответственны за связывание с рецептором, или внутримолекулярные перестройки. Именно такая стратегия позволяет токсинам В. thuringiensis приспособиться к физиологическим и биохимическим особенностям, характерным для различных видов насекомых.

Интересно, что москитоцидный белок CytlA, также продуцируемый В. thuringiensis ssp. israelensis, не связывается с выделенными нами 65 и 57 кДа белками. По всей видимости, наличие разных молекулярных сайтов связывания Ciy4B и Ciyl 1А с одной стороны, и CytlA - с другой у одного и того же насекомого важно, как для объяснения синергизма, продемонстрированного для действия москитоцидный белков подвида israelensis на личинок комаров, так и для предотвращения возникновения устойчивости к В. thuringiensis у этих насекомых.

Полученные данные о взаимодействии токсинов В. thuringiensis ssp. israelensis с кишечным эпителием личинок комаров имеют громадное значение как для понимания механизма действия этих белков, так и для создания новых биоинсектицидов, обладающих высокой эффективностью и более широкой видовой специфичностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дронина, Мария Алексеевна, 2007 год

1. Жужиков, Д.П. Изучение перитрофической оболочки некоторых двукрылых в поляризованном свете // Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол., почв. 1966. №1. С. 37-41.

2. Жужиков Д. П. Строение перитрофической оболочки двукрылых // Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол., почв. 1963. №1. С. 24-35.

3. Кригер И.В., Ревина Л.П., Костина Л.И., Буздин А.А., Залунин И.А., Честу-хина Г.Г., Степанов В.М. // Биохимия, 1999. Т. 64. С.1377-1384.

4. Кузнецова Л.А. Кутикулярная выстилка кардиального отдела кишечника личинок Chironomus plumosus L. и Aedes aegypti L. (Diptera: Chi-ronomidae, Culicidae) и ее связь с перитрофической оболочкой // Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол. 1979. №. С. 9-13.

5. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М., 1957.

6. Честухина Г.Г., Костина Л.И-, Залунин И.А., Котова Т.С., Катруха С.П., Кузнецов Ю.С., Степанов В.М. // Биохимия, 1977. Т. 42. С. 1660-1667.

7. Agrawal, N., Malhotra, P., and Bhatnagar, R.K. Interaction of gene-cloned and insect cell-expressed aminopeptidase N of Spodoptera litura with insecticidal crystal protein Cry 1С // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 45834592.

8. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo II FEMS Microb. Lett. 1992. Vol. 94. P. 63-68.

9. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. Effects on toxicity of eliminating a cleavage site in a predicted interhelical loop in Bacillus thuringiensis CrylVB 8-endotoxin//FEMS Microb. Lett. 1993. Vol. 111. P. 255-262.

10. Angus, Т.A. A bacterial toxin paralysing silkworm larvae // Nature, 1954. Vol. 173. P. 545-546.

11. Angus, T.A. Extraction, purification and properties of Bacillus sotto toxin // Can. J. Microbiol. 1956a. Vol. 2. P. 416-426.

12. Angus, T.A. Association of toxicity with protein-crystalline inclusions of Bacillus sotto Ishiwata I I Can. J. Microbiol. 1956b. Vol. 2. P. 122-131.

13. Aronson, A.I., and Shai, Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action // FEMS Microbiol.1.tters, 2001. Vol. 195. P. 1-8.

14. Banks, D.J., Hua, G., and Adang, J. Cloning of a Heliothis virescens 110 kDa aminopeptidase N and expression in Drosophila S2 cells // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 499-508.

15. Barbehenn, R.V. Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species // J. Chem. Ecol. 2003. Vol. 29. P. 683-702.

16. Barton, K.A., Whiteley, H.R., and Yang, N.-S. Bacillus thuringiensis 8-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteraninsects // Plant Physiol. 1987. Vol. 85. P. 1103-1109.

17. Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 348. P. 3.

18. Borovsky, D., and Meola, S.M. Biochemical and cytoimmunological evidence for the control of Aedes aegypti larval trypsin with Aea-TMOF // Arch. Insect Biochem. Physiol. 2004. Vol. 55. P. 124-139.

19. Bravo, A. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin family proteins and their functional domains // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179 P. 27932801.

20. Bradford, M.M.//Analyt. Biochem. 1976. Vol.72. P. 248-254.

21. Bottjer, K.P., Bone, L.W., and Gill, S.S. Nematoda: susceptibility of the egg to Bacillus thuringiensis toxins // Exp. Parasitol. 1985. Vol. 60. P. 239-244.

22. Bravo A., Jansens S., Peferoen M. Immunocytochemical localization of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins in intoxicated insects // J. Invertebr. Pathol. Vol. 60. P. 237-246.

23. BtToxin Specificity Database: http://www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca

24. Candas, M., Francis,. B.R., Griko, N.B., Midboe, E.G., and Bulla, L.A. Proteolytic cleavage of the developmentally important cadherin BT-Ri in the midgut epithelium of Manduca sexta II Biochermistiy, 2002. Vol. 41. P. 13717-13724.

25. Carroll, J., Li, J., and Ellar, D.J. Proteolytic processing of a coleopteran-specific 5-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis var tenebrionis // Biochem. J. 1989. Vol. 261. P. 99-105.

26. Charles, J.F., and de Barjac, H. pH variations in the midgut of Aedes aegypti in relation to Bacillus thuringiensis var. israelensis (serotype HI4) crystal intoxication// Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales, 1981. Vol. 74. P. 91-95.

27. Choma C.T., Surewicz W.K., Carey P.R., Pozsgay M., Raynor Т., Kaplan H. Unusual proteolysis of the protoxin and toxin from Bacillus thuringiensis structural implications // Eur. J, Biochem. 1990. Vol. 189. P. 523-527.

28. Chungjatupornchai, W.P., Hoefte, H., Seurinck, J., Angsuthanasombat, C., and Vaeck, M. Common features of Bacillus thuringiensis toxins specific for Dip-tera and Lepidoptera//Eur. J. Biochem. 1988. Vol. 173. P. 9-16.

29. Clark T.M., Koch A., Moffett D.F. The anterior and posterior 'stomach' regions of larval Aedes aegypti midgat // J. Exp. Biol. 1999. Vol. 202. N 3. P. 247-252.

30. Clements A.N. The physiology of mosquitoes // Oxford a.o., Pergamon Press, 1963.

31. Cooper, M.A., Carroll, J., Travis, E.R., Williams, D.H., and Ellar, D.J. Bacillus thuringiensis Cryl Ac toxin interaction with Manduca sexta aminopeptidase N in a model membrane environment // Biochem. J. 1998. Vol. 333. P. 677-683.index.html

32. Crickmore, Full list of delta-endotoxins //http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/

33. Crickmore, N., Zeigler, D.R., Feitelson, J., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Dean, D.H. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. Vol. 62. P. 807-813.

34. Dadd R.H. Alkalinity within the midgut of mosquito larvae with alkaline-aktive digestive enzymes // J. Insect Physiol. 1975. Vol. 21. N 11. P. 1847-1853.

35. Derbyshire, D.J., Ellar, D.J., and Li, J. Crystalization of the Bacillus thuringiensis toxin Cryl Ac and its complex with the receptor ligand N-acetyl-D-galactosamine // Acta Crystallog. 2001 sect. D. Vol. 57. P. 1938-1944.

36. Detra R.L., Romoser W.S. Permeability of Aedes aegypti larval peritrophic membrane to proteolytic enzyme // Mosquito News. 1979. Vol. 39. N 3. P. 582585.

37. English, L.H., Readdy, T.R., and Bastian, A.E. Delta-endotoxin phospholipid vesicles is catalysed by reconstituted midgut membrane // Insect Biochem. 1991. Vol. 21. P. 177-184.

38. Endo Y., Nishiitsutsuji-Uwo J. Mode of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin: histopathological changes in the silkworm midgut // J. Invertebr. Pathol. 1980. Vol. 36. N1. P. 90-103.

39. Fernandez L.E., Aimanova K.G., Gill S.S., Bravo A., Soberon M. A GPI- anchored alkaline phosphatase is a functional midgut receptor of Cry llAa toxin in Aedes aegypti larvae // Biochem J. 2006. Vol. 394. P. 77-84.

40. Fitz-James, P.C., Toumanoff, C., and Yong, I.E. Localization of a toxicity for silkworm larvae in the parasporal inclusion of Bacillus cereus var. alesti II Can. J. Microbiol. 1958. Vol. 4. P. 385- 192.

41. Gazit, E., and Shai, Y. Structural and functional characterization of the a5 segment of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin // Biochemistry, 1993. Vol. 32. P. 3429-3436.

42. Gill, S.S., Cowles, E.A., and Francis, V. Identification, isolation, and cloning of a Bacillus thuringiensis CrylAc toxin-binding protein from the midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens II J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 27277-27282.

43. Gomez, I., Oltean, D.I., Gill, S.S., Bravo, A., and Soberon, M.

44. Mapping the epitope in cadherin-like receptors involved in Bacillus thuringiensis

45. Cryl A toxin interaction using phage display // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 31. P. 28906-28912.

46. Gonzalez, J.M., Jr., Dulmage, H.T., and Carlton, B.C. Carlton, B.C. Correlation between specific plasmids and 5-endotoxin production in Bacillus thuringiensis // Plasmid, 1981. Vol. 5. P. 351-365.

47. Griffitts, J.S., Haslam, S.M., Yang, Т., Garczynski, S.F., Mulloy, ., Morris, H., Cremer, P.S., Dell, A., Adang, M.J., and Aroian, R.V. Glycolipids as receptors for Bacillus thuringiensis crystal toxin // Science, 2005. Vol. 307. P. 922925.

48. Grochulski, P., Masson, L., Borisova, S., Pusztai-Carey, M., Schwartz, J.-L., Brousseau, R., Cygler, M. Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin -crystal structure and channel formation // J. Mol. Biol. 1995. Vol. 254. P. 447-464.

49. Haider, M.Z., and Ellar, D.J. Functional mapping of an entomocidal delta-endotoxin. Single amino acid changes produced by site-directed mutagenesis influence toxicity and specificity of the protein // J. Mol. Biol. 1989. Vol. 208. P. 183-194.

50. Hannay, C.L. Crystalline inclusions in aerobic spore forming // Nature, 1953. Vol. 172. P. 1004.

51. Hannay, C.L., and Fitz-James, P.I. The protein crystals of Bacillus thuringiensis Berliner // Can. J. Microbiol. 1955. Vol. 1. P. 694-710.

52. Ho Beng G., Khoo H.G.N., Chew L.-M., Wong K.P., Ewert A. Food ingestion and digestive enzymes in larval Aedes aegypti and Ae. albopictus (Diptera: Culicidae) // J. Med. Entomol. 1992. Vol. 29. N 6. P. 960-964.

53. Hodgman, T.C. & Ellar, DJ. Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis 8-endotoxins determined by compilation analysis //

54. DNA Seq. 1990. Vol. 1. P. 97-106.

55. Hoefte, H., Whiteley, H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus

56. Thuringiensis II Microbiol. Rev. 1989. Vol. 53. P. 242-255.

57. Hofmann, C., Liithy, P. Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to vertebrate cells // Arch. Microbiol. 1986. Vol. 146. P. 7-11.

58. Hua, G., Tsukamoto, K., Rasilo, M.L., and Ikezawa, H. Molecular cloning of a GPI-anchored aminopeptidase N from Bombyx mori midgut: a putative receptor for Bacillus thuringiensis CrylA toxin // Gene, 1998. Vol. 214. P. 177185.

59. Hua, G., Jurat-Fuentes, J.L., and Adang, M.J. Bt-Rla extracellular cadherinrepeat 12 mediates Bacillus thuringiensis CrylAb binding and cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 28051-28056.

60. Jenkins, J.L., Lee, M.K., Sangadala, S., Adang, M.J., and Dean, D.H. Binding of Bacillus thuringiensis CryiAc toxin to Manduca sexta aminopeptidase-N receptor is not directly related to toxicity // FEBS Lett. 1999. Vol. 462. P. 373376.

61. Jenkins, J.L., Lee, M.K., Valaitis, A.P., Curtiss, A., and Dean, D.H. Bivalent sequential binding model of a Bacillus thuringiensis toxin to gypsi moth amin-opeptidase N receptor // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 14423-14431.

62. Jenkins, J.L., and Dean, D.H. Binding specificity of Bacillus thuringiensis CrylAa for purified, native Bombyx mori aminopeptidase N and cadherin-like receptors // BMC Biochem. 2001. Vol. 2. P. 12.

63. Johnson, D.E. Cellular toxicities and membrane binding characteristics of insecti-cidal crystal proteins from Bacillus thuringiensis toward cultured insect cells //J. Invertebrate Pathol. 1994. Vol. 63. P. 123-129.

64. Jurat-Fuentes, J.L. and Adang, M.J. Characterization of a Cryl Ac-receptor alkaline phosphatase in susceptible and resistant Heliothis virescens larvae // Eur. J. Biochem. 2004. Vol. 271. P. 3127-3125.

65. Knight, P.J., Crickmore, N., and Ellar, D.J. The receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the lepidopteran Manduca sexta is aminopeptidase N // Mol. Microbiol. 1994. Vol. 11. P. 429436.

66. Knight, P.J.K., Knowles, B.H., and Ellar, D. J. Molecular cloning of an insect aminopeptidase N that serves as a receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 17765-17770.

67. Knowles, B.H., and Ellar, D.J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins with different insect specificity // Biochim. Biophys. Acta, 1987. Vol. 924. P. 509-518.

68. Krieg, A., Schnetter, W., Huger, A.M., and Langenbruch, G.A. Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis strain В1 256-82: a third pathotype within the H-serotype 8a8b // System. Appl. Microbiol. 1987. Vol. 9. P. 138-141.

69. Krywienczyk, J., and Angus, T.A. A serological comparison of the parasporal bodies of three insect pathogenes // J. Insect Pathol. 1960. Vol. 2. P. 411-417.

70. Kumar, A.S.M., and Aronson, A.I. Analysis of mutations in the pore-forming region essential for insecticidal activity of a Bacillusthuringiensis 5-endotoxin // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 6103-6107.

71. Kunz P.A. Resolution and properties of the proreinases in the larva of the mosquito Aedes aegypti II Insect Biochem. 1978. Vol. 8. N 1. P. 43-51.

72. Masson, L., Mazza, A., Sandagala, S., Adang, M.J., and Brousseau, R. Polydisper-sity of Bacillus thuringiensis Cryl toxins in solution and its effect on receptor binding kinetics // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1594. P. 266-275.

73. Masson, L., Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Brousseau, R., and Schwartz, J.L. Helix 4 of the Bacillus thuringiensis CrylAa toxin lines the lumen of the ion channel //J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 31996-32000.

74. Masson, L., Lu, Y.J., Mazza, A., Brousseau, R, and Adang, M.J. The CrylA(c) receptor purified from Manduca sexta displays multiple specificities // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 20309-20315.

75. McNall, R.J., and Adang, M.J. Identification of novel Bacillus thuringiensis Cryl Ac binding proteins in Manduca sexta midgut through proteomic analysis // Insect Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 999-1010.

76. Morse, R.J., Yamamoto, Т., and Stroud, R.M. Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope // Structure, 2001. Vol. 9. P. 409-417.

77. Nagamatsu, Y., Toda, S., Yamaguchi, F., Ogo, M., Kogure, M., Nakamura, M.,

78. Shibata, Y., and Katsumoto, T. Identification of Bombyx mori midgut receptor for Bacillus thuringiensis insecticidal CrylA(a) toxin // Bio-sci.Biotechnol.Biochem. 1998. Vol. 62. P. 718-726.

79. Nagamatsu, Y., Itai, Y., Hatanaka, G., Funatsu,G., Hayashi K. A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensis II Agric. Biol. Chem. 1984. Vol. 48. P. 611-619.

80. Nicholls, C.N., Ahmad, W., and Ellar, D.J. Evidence for two different types of insecticidal P2 toxins with dual specificity in Bacillus thuringiensis subspecies //J. Bacterriol. 1989. Vol.-171. P. 5141-5147.

81. Nicolas L., Lecroisey A., Charles J.-F. Role of the gut proteinases from mosquito larvae in the mechanism of action the specificity of the Bacillus sphaeri-cus toxin 11 Can. J. Microbiol. 1990. Vol. 36. N 11. P. 804-807.

82. Percy J., Fast P.G. Bacillus thuringiensis crystal toxin: ultrastructural studies of its effect on silkworm midgut cells // J. Invertebr. Pathol. 1982. Vol. 40. P/ 90103.

83. Peters W. The fine structure of peritrophic membranes of mosquito and blackfly larvae of the genera Aedes, Anopheles, Culex, and Odagmia (Diptera: Culicidae/Simuliidae) //Entomol. Gen. 1979. Vol. 5. N 4. P. 289-299.

84. Peyronnet, O., Vachon, V., Brousseau, R., Baines, D., Schwartz, J.L. and Laprade, R. Effect of Bacillus thuringiensis toxins on the membrane potential of lepi-dopteran insect midgut cells // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 1679-1684.

85. Rajamohan, F., Hussain, S.R., Cotrill, J.A., Gould, F., and Dean, D.H.

86. Report of the WHO Informal Consultation on the evaluation and testing of insecticides // WHO, Geneva, 1996. P. 38-40.

87. Richards A.G., Richards P.A. Origin and composition of the peritrophic membrane of the mosquito, Aedes aegypti II J. Insect Physiol. 1971. Vol. 17. N 11. P. 2253-2275.

88. Schnepf, H.E., and Whiteley, H.R. Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981. Vol. 78. P. 2893-2897.

89. Schnepf, H.E., Wong, H.C., and Whiteley, H.R. The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 6264-6272.

90. Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R., Dean, D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. Vol. 62. P. 775-806.

91. Singh G.J.P., Gill S.S. An electron microscope study of the toxic action of Bacillus sphaericus in Culex quiquefasciatus larvae // J. Invertebr. Pathol. 1988. Vol. 52. N. 2. P. 237-247.

92. Singh, G.J.P., and Gill, S.S. Myotoxic and neurotoxic activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal toxin // Pest. Biochem. Physiol. 1985. Vol. 26. P. 406-414.

93. Singh,G.J.,Schouest, L.P.Jr, Giil, S.S. Action of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis delta-endotoxin on the ultrastructure of the house fly larva neuromuscular system in vitro // J Invertebr Pathol. 1986. Vol. 47. N. 2. P. 155-66.

94. Smith, G.P., and Ellar, D.J. Mutagenesis of two surface exposed loops of the Bacillus thuringiensis Cry 1С 5-endotoxin affects insecticidal specificity // Biochem J. 1994. Vol.302. P. 611-616.

95. Spiro-Kern A., Chen P.S. Uber die Proteasen der Steckmucke Culexpipiens //Rev. SuisseZool. 1972. Vol. 79. P. 1151-1159.

96. Sur В., Bihari V. Microbial control of mosguitoes // Everyman's Sci., 1997. Vol. 32. N3. P. 105-108.

97. Thomas, W.E., and Ellar, D.J. Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal a- endotoxin: effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo II J. Cell Sci. 1983. Vol. 60. P. 181-197.

98. Valdamudi, R.K., Ji, Т.Н., and Bulla, L.A.,Jr. A specific binding protein from Manduca sexta for the insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis subspecies berlinerll J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 12334-12340.

99. Valdamudi, R.K., Weber, E., Ji, I., Ji, Т.Н., and Bulla, L.A.,Jr. Cloning and expression of a receptor for an insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 5490-5499.

100. Volkmann A., Peters W. Investigation on the midgut caeca of mosquito larvae. I.

101. Wolfersberger, M.G. V-ATPase-energized epithelia and biological insect control //

102. Wolfersberger, M.G. Enzymology of plasma membranes of insect intestinal cells // Am. Zool. 1984. Vol. 24. P. 187-197.

103. Wu, D., and Aronson, A.I. (1992) Localized mutagenesis defines regions of the Bacillus thuringiensis 8-endotoxin involved in toxicity and specificity. J. Biol. Chem. 267: 2311-2317.

104. Wu,, S.-J., and Dean, D.H. (1996). Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CrylllA 8-endotoxin. J. Mol. Biol. 255: 628-640.

105. Wu, S.-J., Koller, C.N., Miller, D.L., Bauer, L.S. and Dean, D.H. (2000) Enhanced toxicity of Bacillus thuringiensis СгуЗА 8-endotoxin in coleopterans by mutagenesis in a receptor binding loop. FEBS Letters 473: 227-232.

106. Xie, R., Zhuang, M., Ross, L.S., Gomez, I., Oltean, D.I., Bravo, A., Soberon, M., and, Gill, S.S. (2005). Single amino acid mutations in the cadgerin receptor from Heliothis virescens affect its toxin binding ability to CrylA toxins. JBC, 280:8416-8425.

107. Yang Y.J., Davies D.M. Digestive enzymes in the excreta of Aedes aegypti larvae //J. Insect Physiol. 1971. Vol. 17. N 11, P. 2129-2123.

108. Yang Y.J., Davies D.M. The effect of cations on chymotrypsin from Aedes aegypti larvae // J. Insect Physiol. 1972. Vol. 18. N 4. P. 747-755.

109. Yaoi, K., Kadotani, Т., Kuwana, H., Shinkawa, A., Takahashi, Т., Iwahana, H., and Sato, R. Aminopeptidase N from Bombyx mori as a candidate for the receptor of Bacillus thuringiensis CrylAa toxin // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 246. P. 652-657. :

110. Yaoi, K., Nakanishi, K., Kadotani, Т., Imamura, M., Koizumi, N., Iwahana, H., and Sato, R. Bacillus thuringiensis CrylAa toxin-binding region of Bombyx mori aminopeptidase N // FEBS Lett. 1999. Vol. 463. P. 221-224.

111. Yong, I.E., and Fitz-James, P.C. Chemical and morphological studies of bacterial spore formation. II. Spore and parasporal protein formulation in Bacillus cer-eus var. alestill J. Biophys. Biochim. Cytol. 1959. Vol. 6. P. 483-486.

112. Zalunin, I.A., Revina, L.P., Kostina, L.I., and Chestukhina, G.G. Peculiarities of Cry proteins to be taken into account during their in vivo and in vitro study // IOBC Wrps Bulletin, 2004. Vol. 27. P. 177-185.

113. Zhu, Y.C., Kramer, K.J., Oppert, В., and Dowdy, A.K. cDNAs of aminopeptidase-like protein genes from Plodia interpunctella strains with different susceptibilities to Bacillus thuringiensis toxins // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2000. Vol. 30. P. 215-224.