Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Карпенко, Марина Николаевна

• Карпенко, Марина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Карпенко, Марина Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Аутоиммунный нейродегенеративпый процесс и его моделирование на животных

1.1.1. Патогенетические механизмы аутоиммунного нейродегенеративного процесса на примере PC и ЭАЭ.

1.1.2. Разработка новых подходов к лечению аутоиммунной нейродегенеративной патологии.

1.2. Кальпаиновая система внутриклеточных протеаз.

1.2.1. Структура кальпаинов.

1.2.2. Тканевая локализация кальпаинов.

1.2.3.Регуляция активности кальпаинов.

1.2.4. Физиологические функции кальпаиновой системы.

1.2.5. Участие кальпаиновой системы в патологических процессах.

1.3. БЕЛОК GAP-43 (Growth Associated Protein-43).

1.3.1 .Структурные и биохимические свойства белка GAP-43.

1.3.2.Физиологическая роль белка GAP-43.

1.3.3.Участие белка GAP-43 в патологических процессах.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2. Индукция ЭАЭ.

2.3. Оценка клинического течения заболевания.

2.4. Препарат.

2.5. Забор материала.

2.6. Выделение тотальной мРПК.

2.7. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

2.8. Электрофорез РНК и ДНК в агарозном геле.

2.9. Экстракция белка GAP-43.

2.10. Измерение концентрации белка.

2.11. Одномерный электрофорез белков в полиакриламидном геле в системе уксусная кислота/мочевина.

2.12. Окраска белков в ПААГ.

2.13. Препаративный электрофорез белков.

2.14. Иммуноблоттинг белков.

2.15. Иммуноферментный анализ.

2.16. Определение активности кальпаинов.

2.17. Методы математической статистики.

2.18. Используемые реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика развития ЭАЭ.

3.2. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ.

3.3. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ.

3.4. Влияние интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина 1 на выраженность ЭАЭ.

3.5. Экспрессия мРНК ОАР-43, распределение белка ОАР-43 и его фрагмента ОАР-43в клетках ЦНС в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни

3.6. Белок ОАР-43 в СМЖ крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс)»

Актуальность проблемы.

Ограниченный протеолиз белков и пептидов в живых тканях и клетках является особой формой физиологической регуляции и считается универсальным механизмом, ответственным за образование и модификацию ферментов. Реакции ограниченного протеолиза лежат в основе функционирования важнейших физиологических систем, в частности, ренин-ангиотензиновой, калликреин-кининовой, иммунитета, гемостаза, комплемента, апоптоза, регуляции экспрессии генов (Соловьева и др., 1995). Поэтому для понимания принципов регуляции физиологических систем необходимо детальное изучение внутриклеточных регуляторных протеаз и тех реакций, которые они катализируют.

Среди внутриклеточных протеолитических систем особого внимания заслуживают те из них, которые активируются в ответ на увеличение в клетке концентрации ионов кальция - ключевого посредника множества клеточных реакций. Однако при развитии ряда патологических процессов существует опасность чрезмерной активации кальций-зависимых протеолитических систем вследствие нарушения гомеостаза ионов кальция, вызванного, в частности, экзайтотоксическим действием глутамата, аномально высокой проводимостью кальциевых каналов (Lajtha, Banik,

2002). С этой точки зрения особый интерес вызывает Ca -зависимая кальпаиновая система внутриклеточных протеаз, гиперактивация которой приводит к нарушению регуляции многих физиологических функций организма (Göll et al., 2003). Так, гиперактивация кальпаинов, наблюдаемая в клетках ЦНС при развитии ряда нейродегенеративных заболеваний, способствует накоплению в клетке неупорядоченных нейрофибрилл и ß-амилоидных бляшек, а также вызывает запуск процесса апоптоза (Göll et al.,

2003).

В единичных научных работах показано изменение уровня экспрессии компонентов кальпаиновой системы в post mortem образцах тканей пациентов с рассеянным склерозом (наиболее распространенное и социально значимое нейродегенеративное заболевание аутоиммунного генеза) (Banik N. et al., 1999а). Однако роль кальпаиновой системы в условиях развития данного патологического процесса до сих пор не установлена. Гиперактивация кальпаинов при развитии рассеянного склероза может иметь значение на всех этапах патогенеза: от регуляции миграции активированных Т-лимфоцитов и расщепления белков миелина до активации проапоптотических ферментов. Действительно, расщепление кальпаином основного белка миелина, белка нейрофиламентов может стимулировать образование энцефалитогенных пептидов; расщепление прокаспаз до каспаз способствует запуску апоптотических каскадов; расщепление белков клеточной адгезии увеличивает миграционную способность клетки (Göll et al., 2003). Кроме этого, выявление новых субстратов кальпаина расширяет представление о функциональной роли кальпаиновой системы. Так, недавно было показано, что нейроспецифический белок GAP-43 (growth associated protein) является субстратом кальпаина (Захаров с соавт., 2005). Поскольку белок GAP-43 известен как маркер конусов роста, пластических и регенеративных процессов, протекающих в нервной ткани (Oestreicher et al., 1997), весьма вероятно, что протеолитическое расщепление белка GAP-43 кальпаином может, существенно изменяя его свойства, подавить регенеративную способность клеток ЦНС.

Поскольку спектр возможных исследований на пациентах с рассеянным склерозом достаточно узок, очевидна перспектива исследования вовлечения кальпаиновой системы в нейродегенеративные процессы аутоиммунного генеза на модели данной патологии у лабораторных животных. Действительно, модель на лабораторных животных обладает тем преимуществом, что за относительно короткое время воспроизводит различные стадии развития болезни и позволяет уточнить механизмы формирования патологии данного типа, а также выявить новые мишени для фармакологического воздействия с целью эффективного лечения нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза.

Наиболее адекватной моделью рассеянного склероза считается экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) (для обзора Gold et al., 2006). Многочисленные исследования показали, что основные механизмы поражения ЦНС в экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита, сходны с таковыми у пациентов с рассеянным склерозом (Smith et al., 1999 и мн. др.). У животных с индуцированным ЭАЭ, как и у людей при рассеянном склерозе, наблюдается аутоиммунный ответ на компоненты миелина, приводящий к демиелинизации, а затем и к дегенерации аксонов и, в итоге, к гибели нервных клеток; проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и другими симптомами болезни. Интересно, что у некоторых видов лабораторных грызунов наступает супрессия патологических процессов и регенерация поврежденных тканей даже при повреждении обширных областей ЦНС. У таких животных неврологические и двигательные нарушения сглаживаются, и наступает частичное или полное выздоровление, после которого животные резистентны к повторной индукции ЭАЭ (Gold et al., 2006). К сожалению, молекулярные механизмы, лежащие в основе спонтанного выздоровления животных, остаются практически неизученными. В этом отношении экспериментальное исследование протеолитического расщепления белка GAP-43 кальпаином позволит выявить новые аспекты регуляции регенераторной способности клеток ЦНС в условиях развития патологии данного типа.

Цели и задачи исследования.

Цель работы: показать включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие аутоиммунных нейродегенеративных процессов на модели ЭАЭ у крыс.

Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Определить уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ.

2. Определить уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках различных отделов ЦНС на пике развития ЭАЭ. Сопоставить полученные данные с тяжестью клинического течения ЭАЭ.

3. Исследовать действие ингибитора кальпаина I на выраженность клинических проявлений ЭАЭ.

4. Определить уровень экспрессии мРНК ОАР-43, а также изучить распределение белка ОАР-43 и его протеолитического фрагмента в клетках спинного мозга на пике развития ЭАЭ. Сопоставить полученные данные с тяжестью клинического течения ЭАЭ.

5. Определить уровень белка ОАР-43 в ликворе крыс в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Кальпаиновая система клеток ЦНС и иммунной системы вовлечена в процесс формирования и развития нейродегенеративной патологии аутоиммунного генеза.

2. Увеличение уровня белка ОАР-43 в ликворе крыс с ЭАЭ и увеличение степени его протеолиза кальпаином в клетках ЦНС отражает тяжесть течения заболевания, что может служить диагностическим и/или прогностическим критерием развития и интенсивности аутоиммунного нейродегенеративного процесса.

3. Подавление активности кальпаинов с помощью специфических ингибиторов является перспективным направлением для разработки новых подходов в лечении аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний.

Научная новизна работы.

В проведенном исследовании впервые получены данные о включении кальиаиновой системы клеток лимфатических узлов брыжейки и верхних отделов спинного мозга в процесс формирования и развития неиродегенеративной патологии аутоиммунного генеза. Выявлено, что распространенность гиперактивации и сверхэкспрессии ш-кальпаина по различным отделам спинного мозга крыс связана с тяжестью течения ЭАЭ. Впервые показано увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина и нейроспецифического белка ОАР-43 в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ, а также обнаружено увеличение степени протеолитического расщепления белка рАР-43 кальпаином в клетках различных отделов спинного мозга крыс с тяжелой формой ЭАЭ. Установлено увеличение содержания белка ОАР-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе крыс с симптомами ЭАЭ на пике заболевания. Впервые продемонстрировано, что подавление активности кальпаинов с помощью интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ.

Нау^но-практнческое значение полученных результатов.

• 1 - . . > . .1 . , . . >; . .1 .,„.-.

Выявленное в данном исследовании включение кальиаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие ЭАЭ у крыс углубляет представление о физиологических функциях кальпаинов и раскрывает ряд неизвестных ранее звеньев механизма формирования аутоиммунных нейродегенеративных процессов.

Предотвращение развития или снижение выраженности ЭАЭ| у крыс в результате подавления активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаина для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний и других форм патологии ЦНС, связанных с деструкцией нервных клеток.

Данные о протеолизе белка ОАР-43 под действием кальпаина существенно расширяют и дополняют сложившиеся к настоящему времени представления о механизмах функционирования белка ОАР-43 в условиях развития нейродегенеративного процесса. На основе полученных данных об изменении уровня белка ОАР-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе могут быть разработаны новые подходы для диагностики и прогнозирования течения аутоиммунного нейродегенеративного процесса в клинике.

Личный вклад соискателя.

Соискатель проанализировал литературу по теме исследования, осуществил планирование экспериментов и получил основную часть результатов, которые представил в докладах на конференциях и в статьях. Экспериментальная часть исследования полностью выполнена на базе Физиологического Отдела им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН. Индукция ЭАЭ и оценка клинического течения заболевания проводилась совместно с к.б.н. И.Н. Абдурасуловой (Физиологический Отдел им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН) и к.м.н. Ю.Л. Житнухиным (Отдел Иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН).

STI-'Si1- U '»

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. АУТОИММУННЫЙ НЕЙРрДЕГЕНЕРАТИгаЫЙ ПРОЦЕСС И ЕГО МОДЕЛИРОВАНИЕ НА ЖИВОТНЫХ

Как известно, головной мозг обладает частичной иммунной автономией, основы которой закладываются еще в эмбриональный период. В связи с этим попадающие в кровоток из-за нарушения целостности гематрэнцефалическрго барьера (ГЭБ) специфические белки мозга воспринимаются иммунной системой организма как чужеродные, что приводит к образованию аутоантител, способных вызывать повреждение и разрушение клеток центральной нервной системы (ЦНС). Если в результате аутоиммунной атаки происходит поражение нервной ткани, сопровождающееся нарушениями функций различных структур нервной системы, вследствие массовой гибели нервных и глиальных клеток, то говорят о развитии нейродегенеративного процесса аутоиммунного генеза. Необходимость детального изучения этиологии и патогенеза этих форм патологии, разработки эффективных диагностических методов и лекарственных средств стимулировала разработку экспериментальных моделей аутоиммунного нейродегенеративного процесса на лабораторных животных. Наиболее адекватной моделью данного процесса является экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) (Gold et al., 2006).

ЭАЭ может быть индуцирован у различных видов животных (обезьян, морских свинок, кроликов, собак, мышей, крыс, сирийских хомячков, овец, кур) с помощью подкожного введения энцефалитегенных компонентов с полным адъювантом Фрейнда или адоптивным переносом активированных к мозговым антигенам Т-клеток (АП-ЭАЭ) (для обзора Gold et al., 2006). Недавно появились данные о возможности индуцировать так называемое «прицельное» ЭАЭ (П-ЭАЭ) у крыс, в результате которого развивается локальное повреждение спинного мозга. Это достигается путем подкожной инъекции рекомбинантного миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) в полном адъюванте фрейнда с последующим введением провоспалительного цитокина фактора некроза опухолей -а (ФНО-а) в определенный отдел спинного мозга (Kerschensteiner et al., 2004). Разработка такой модели позволяет изучать динамику распространения повреждения, что дает новые возможности для выявления механизмов формирования патологии данного типа.

Аутоаллергические нейродегенеративные заболевания могут индуцироваться нейротропными вирусами - вирусом Theiler's, вирусом мышиного гепатита, вирусом Semliki Forest (Mokhtarian et al., 1994), что свидетельствует о возможной вирусной этиологии подобных форм патологии. В литературе также описаны токсические модели ЭАЭ, в которых наиболее часто используется введение этидиума бромида (Yajima, Suzuki, 1979) и купризона (Blakemore, 1973).

Таким образом, существует несколько видов ЭАЭ, отличающихся способом индукции заболевания, который выбирается исследователями в зависимости от цели эксперимента.

Многочисленные исследования показали, что основные механизмы поражения ЦНС в экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита, сходны с таковыми у пациентов с рассеянным склерозом (PC) (Smith et al., 1999 и мн. др.). У животных с идуцированным ЭАЭ, как и у людей при PC, наблюдается аутоиммунный ответ на компоненты миелина, приводящий к демиелинизации, а затем и к дегенерации аксонов и, в итоге, к гибели нервных клеток; проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и другими симптомами болезни.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Карпенко, Марина Николаевна

4. ВЫВОДЫ

1. В индуктивную фазу ЭАЭ в иммуноцитах и клетках поясничного отдела спинного мозга крыс наблюдается дисбаланс экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы; в клетках поясничного отдела спинного мозга выявлена гиперактивация кальпаинов.

2. Степень и распространенность сверхэкспрессии, а также гиперактивации кальпаинов клеток ЦНС является одним из факторов, определяющих тяжесть течения ЭАЭ у крыс; способность клеток ЦНС сверхэкспрессировать кальпастатин обеспечивает развитие легкой формы ЭАЭ.

3. Подавление активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ у крыс, что указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаина для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний.

4. Бессимптомное развитие ЭАЭ сопровождается повышением уровня экспрессии мРНК ОАР-43 в клетках спинного мозга; степень протеолиза белка ОАР-43 сохраняется на уровне контрольного значения. У животных с тяжелым течением заболевания в клетках всех отделов спинного мозга уровень ОАР-43 уменьшается за счет снижения экспрессии мРНК ОАР-43 и увеличения степени протеолитического расщепления ОАР-43 кальпаином.

5. Повышение уровня белка ОАР-43 в СМЖ крыс с ЭАЭ отражает тяжесть и фазу течения болезни, что может служить диагностическим и/или прогностическим критерием развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачей современной физиологии является выявление молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе физиологических реакций организма на воздействие экзогенных и/или эндогенных патогенных факторов, и причин, обусловливающих переход нормальной реакции в патологическую. Одно из необходимых условий для понимания этих механизмов — поиск новых участников и расширение имеющихся знаний о ферментативных системах и регуляторных белках, вовлекаемых в эти процессы. Выявленное в данном экспериментальном исследовании включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие аутоиммунных нейродегенеративных процессов на модели ЭАЭ у крыс дополняет представление о физиологических функциях кальпаинов и уточняет механизмы формирования патологии данного типа, а также открывает новые мишени для фармакологического воздействия с целью лечения нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза.

Проведенные исследования показывают включение кальпаиновой системы клеток иммуннокомпетентных органов (в данном случае клеток селезенки и лимфатических узлов брыжейки) уже на начальном этапе развития ЭАЭ. Об этом свидетельствует выявленное нами повышение уровня экспрессии мРНК |1- и т-кальпаина, а также кальпастатина и, кроме этого, изменение уровня протеолитической активности кальпаинов в первые дни после индукции заболевания. Поскольку кальпаиновая система относится к классу внутриклеточных регуляторных протеаз (протеолитическое расщепление кальпаинами своих субстратов приводит к образованию функционально активных молекул), мы полагаем, что активация кальпаинов в условиях развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса имеет важное физиологическое значение. В частности, есть все основания полагать, что кальпаины клеток иммуннокомпетентных органов способствуют миграции активированных энцефалитогенных Т-лимфоцитов из вторичных иммунных органов в ЦНС (см. п. З.2.). По-видимому, повышение уровня

145 экспрессии мРНК кальпастатииа в этих клетках является защитно-приспособительным механизмом, направленным на предотвращение развития воспалительной реакции в ЦНС. Действительно, повышение экспрессии кальпастатина способствует восстановлению базовой активности кальпаинов и, как следствие, вызывает снижение скорости миграции энцефалитогенных Т-лимфоцитов. Однако уже через несколько дней после индукции ЭАЭ мы обнаружили повышение уровня экспрессии мРНК ш-кальпаина и гиперактивацию кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга. При этом на протяжении индуктивной фазы заболевания в других отделах ЦНС дисбаланса экспрессии анализируемых компонентов кальпаиновой системы и повышения уровня активности кальпаинов выявлено не было. Это согласуется с данными литературы и нашими наблюдениями, указывающими на преимущественное повреждение именно поясничного отдела спинного мозга, где уже в индуктивную фазу ЭАЭ выявляются воспалительные инфильтраты и сопряженные с ними области демиелинизации и нейродегенерации (Абдурасулова и др., 2004). Обнаруженное повышение уровня экспрессии кальпаинов и гиперактивация кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс в индуктивную фазу ЭАЭ, вероятнее всего, характерны для резидентных и мигрировавших в ЦНС клеток иммунной системы. В пользу этого предположения свидетельствует показанное нами отсутствие увеличения степени протеолиза кальпаином нейроспецифического белка GAP-43, а также обнаружение в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс многократного увеличения уровня экспрессии ц-кальпаина (на 7-й д.п.и.), который в норме в нейронах и клетках глии практически не экспрессируется, но экспрессируется активированными Т-лимфоцитами (Shields et al., 1999а; Schaecher et al., 2002). Одним из субстратов ц-кальпаина является ингибитор транскрипционного фактора NF-kB — белок 1кВ, расщепление которого вызывает перемещение транскрипционного фактора NF-kB из цитозоля в ядро, где он активирует транскрипцию многих генов, в том числе гена индуцибельной NOS, циклооксигеназы-2а, ФНО-а, ИЛ-ip (Ruetten, Thiemermann, 1997). Активация транскрипции этих генов приводит к повышению уровня продукции соответствующих белков, которые вызывают развитие в ЦНС воспалительной реакции (Baumann, Pham-Dinh, 2001). Таким образом, сверхэкспрессия и гиперактивация (х-кальпаина в клетках поясничного отдела спинного мозга может способствовать созданию пермиссивной среды для развития воспалительной реакции в ЦНС.

В поясничном отделе спинного мозга крыс с ЭАЭ уже в индуктивную фазу заболевания детектируется межнуклеосомная деградация ДНК - признак необратимой фазы апоптоза (Das et al., 2008). Следовательно, уже на ранней стадии развития патологии данного типа часть клеток поясничного отдела спинного мозга погибает путем апоптоза (по нашим данным это процесс сопровождается гиперактивацией кальпаинов). Выявленное в данном исследовании повышение уровня экспрессии мРНК GAP-43 свидетельствует о наличии в этом отделе ЦНС регенеративных процессов. Действительно, усиление экспрессии белка GAP-43 во взрослом организме, наблюдаемое после повреждения нейронов и клеток глии, является маркером регенеративных процессов (Coggins, Zwiers, 1991; Oestreicher et al., 1997).

Данные литературы и наши собственные наблюдения показывают, что на пике заболевания клинические проявления ЭАЭ (парезы и параличи конечностей) преимущественно вызваны нейродеструктивными изменениями в ЦНС, поэтому величина клинического индекса на пике ЭАЭ использовалась в качестве показателя степени нейродегенерации. Анализ экспрессии и активности кальпаинов в клетках ЦНС и иммуннокомпетентных органов у животных с различной тяжестью заболевания (степенью нейродеструктивного процесса) в эту фазу ЭАЭ выявил вовлечение в данный процесс только кальпаиновой системы клеток ЦНС. Действительно, в клетках иммуннокомпетентных органов уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы не зависел от тяжести ЭАЭ и не отличался от базового. Повышенная протеолитическая активность кальпаинов отмечалась исключительно в клетках лимфатических узлов брыжейки, причем как у крыс с ЭАЭ, так и у животных, получивших инъекцию ПАФ. Данный факт свидетельствует о вовлечении кальпаиновой системы клеток лимфатических узлов брыжейки на этом этапе развития патологии в неспецифические для ЭАЭ процессы.

Анализ экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы в клетках ЦНС показал преимущественное вовлечение в процесс развития ЭАЭ т-кальпаина и кальпастатина. Действительно, в клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ обнаружен практически одинаковый уровень экспрессии мРНК |И-кальпаина. Уровень экспрессии мРНК ш-кальпаина и кальпастатина, а также степень активации кальпаинов были связаны с тяжестью течения заболевания: при бессимптомном и легком течении ЭАЭ ни в одном из анализируемых отделов спинного мозга, а также в мозжечке гиперактивации и сверхэкспрессии т-кальпаина не выявлено (в грудном отделе, напротив, обнаружено даже подавление активности кальпаинов); у животных с ЭАЭ средней тяжести в поясничном отделе спинного мозга выявляется сверхэкспрессия т-кальпаина и повышение протеолитической активности кальпаинов; при тяжелой и крайне тяжелой форме заболевания сверхэкспрессия и гиперактивация т-кальпаина наблюдается не только в клетках поясничного отдела, но также в грудном и шейном отделах спинного мозга. В клетках мозжечка ни у одного животного с ЭАЭ гиперактивации кальпаинов выявлено не было. Таким образом, в клетках спинного мозга животных с ЭАЭ наблюдается сверхэкспрессия т-кальпаина и гиперактивация кальпаинов, причем с усилением тяжести течения заболевания повышение протеолитической активности кальпаинов выявляется не только в нижних, но и в верхних отделах спинного мозга. Поскольку в клетках ЦНС животных с ЭАЭ обнаружено повышение экспрессии мРНК т-, но не [д.-кальпаина, по-видимому, наблюдаемое увеличение протеолитической активности кальпаинов в этих клетках в большей степени опосредовано гиперактивацией именно т-кальпаина.

Известно, что кальпастатин является единственным известным на сегодняшний день эндогенным ингибитором кальпаинов, повышение экспрессии которого, как правило, приводит к подавлению протеолитической активности кальпаинов (для обзора Göll et al., 2003). Действительно, анализ уровня экспрессии мРНК кальпастатина и активности кальпаинов в одних и тех же образцах выявил подавление активности кальпаинов при сверхэкспрессии кальпастатина. В этом отношении особый интерес представляет обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ. Вероятно, способность клеток ЦНС некоторых крыс породы Вистар сверхэкспрессировать кальпастатин является одним из факторов, способствующих легкому течению ЭАЭ у этих животных. Таким образом, мы полагаем, что одним из факторов, определяющих тяжесть течения ЭАЭ у крыс породы Вистар, является степень и распространенность сверхэкспрессии, а также гиперактивации кальпаинов клеток ЦНС; способность клеток ЦНС сверхэкспрессировать кальпастатин, напротив, обеспечивает развитие легких форм ЭАЭ.

Выявленное нами распространение гиперактивации и сверхэкспрессии т-кальпаина по различным отделам спинного мозга крыс в зависимости от тяжести течения болезни согласуется с данными о протяженности нейродеструктивных изменений в ЦНС (см п. 3.3.), что позволяет предположить вовлеченность m-кальпаина в процессы инициации гибели нейронов и клеток глии в условиях развития патологии данного типа. Развитие воспалительной реакции сопровождается высвобождением в межклеточную среду провоспалительных цитокинов, лейкотриенов, активных форм кислорода и азота, эйкозаноидов (глутамата, аспартата) и других токсических молекул. Повышение во внеклеточном пространстве концентрации этих веществ вызывает нарушение регуляции гомеостаза различных ионов, в том числе, ионов кальция и приводит к гиперактивации кальпаинов в клетках ЦНС. Активированный кальпаин, в свою очередь, расщепляет кальпаинчувствительные белки (белки клеточной адгезии, белки миелина, некоторые белки клеточного цитоскелета и транскрипционные факторы), вызывая тем самым необратимые повреждения в клетке и в итоге - ее гибель (Göll et al., 2003). Помимо вышеперечисленного, гиперактивация кальпаинов в клетках ЦНС может препятствовать регенерации нервной клетки после ее повреждения, вследствие развития ЭАЭ. Действительно, недавно было показано, что белок GAP-43, сверхэкспрессия которого необходима для успешной регенерации нейронов, является субстратом кальпаина (Захаров и др., 2005). Расщепление белка GAP-43 кальпаином происходит внутри важного функционального домена и, следовательно, нарушает его физиологические функции, что, вероятно, негативно сказывается на регенераторной способности нервных клеток. Полученные нами данные показывают, что гиперактивация кальпаина, наблюдаемая в клетках различных отделов спинного мозга животных с индуцированным ЭАЭ приводит к протеолитическому расщеплению белка GAP-43, причем степень протеолиза GAP-43 кальпаином связана с тяжестью течения ЭАЭ.

Ввиду генетической разнородности крыс породы Вистар, по-видимому, не все животные обладают способностью сверхэкспрессировать белок GAP-43 в ответ на повреждение клеток нервной системы. Мы полагаем, что это является одной из причин развития у крыс породы Вистар ЭАЭ различной тяжести. Так, при бессимптомной и легкой форме заболевания необходимый для успешной регенерации уровень белка GAP-43 в клетках ЦНС поддерживается за счет выявленного нами усиления экспрессии мРНК GAP-43, при этом доля GAP-43-3 сохраняется на уровне контрольного значения. Следовательно, в клетках спинного мозга таких животных возрастает содержание целой молекулы GAP-43, и клетки, вероятно, приобретают способность к регенерации. У животных с тяжелым течением заболевания в клетках всех отделов спинного мозга содержание GAP-43 уменьшается, причем как за счет снижения уровня экспрессии мРНК GAP-43, так и за счет повышения степени протеолитического расщепления ОАР-43 кальпаином с образованием фрагмента ОАР-43-3.

На наш взгляд, экспериментальное подавление активности кальпаиновой системы клеток ЦНС с помощью интраназального введения ингибитора кальпаина I, терапевтическое действие которого было показано в данном исследовании, преимущественно снижало именно степень нейродеструктивных изменений в ЦНС, а также, препятствуя протеолитическому расщеплению белка ОАР-43 кальпаином, способствовало регенерации уже поврежденных клеток. Следует отметить, что выбранный нами интраназальный способ введения препарата позволил использовать низкую концентрацию действующего вещества (1 мкг/животное/день) и тем самым минимизировать нежелательные системные реакции.

Эффективность применения ингибитора кальпаина I, показанная нами на модели ЭАЭ, является дополнительным подтверждением вовлеченности кальпаиновой системы в патогенез нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза и указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаинов для клинического применения.

Выявленное в данном исследовании увеличение общего содержания белка ОАР-43 и его молекулярных форм в ликворе крыс с выраженными симптомами ЭАЭ на пике заболевания позволяет рассматривать этот показатель в качестве возможного биомаркера развития патологии данного типа. Однако количество ОАР-43 (и/или его молекулярных форм) в ликворе животных с ЭАЭ продолжает возрастать и в период выздоровления, достигая наибольшего значения при исчезновении видимых клинических проявлений, что осложняет трактовку полученных результатов. По-видимому, наличие высокого уровня белка ОАР-43 и/или его протеолитического фрагмента ОАР-43-3 в СМЖ крыс с ЭАЭ отражает течение двух противоположно направленных процессов: на пике заболевания - дегенерации и в период выздоровления - регенерации нейронов (см. п. З.6.). Мы полагаем, что в результате гибели нейронов путем апоптоза или некроза в СМЖ попадает не только целая молекула белка ОАР-43, но и ОАР-43-3. Регенерация нейронов сопровождается регулируемым процессом секреции белка ОАР-43 или ОАР-43-3. Таким образом, общее содержание белка ОАР-43 и его молекулярных форм в СМЖ крыс с ЭАЭ, вероятно, отражает не только тяжесть, но и фазу течения болезни.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Карпенко, Марина Николаевна, 2009 год

1. Ford M.L., Evavold B.D. (2005) Specificity, magnitude, and kinetics of MOG-specific CD8+ T cell responses during experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol. 35(1), 76-85

2. Franco S.J., Iluttenlocher A. (2005) Regulating cell migration: calpains make the cut. J Cell Sci. 118(Pt 17), 3829-38

3. Frey D., Laux T., Xu L., Schneider C., Caroni P. (2000) Shared and unique roles of CAP23 and GAP43 in actin regulation, neurite outgrowth, and anatomical plasticity. J Cell Biol. 149(7), 1443-54

4. Neumar R.W., Xu Y.A., Gada H., Guttmann R.P., Siman R. (2003) Cross-talk between calpain and caspase proteolytic systems during neuronal apoptosis. J Biol Chem. 278(16), 14162-7

5. Biochem Biophys. 130(1), 337-46 Papadopoulos D., Pham-Dinh D., Reynolds R. (2006) Axon loss is responsible for chronic neurological deficit following inflammatory demyelination in the rat. Exp Neurol. 197(2), 373-85

6. Pardridge W.M. (2005) The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2(1),3-14

7. Soc Lond B Biol Sci. 354(1390), 1641-7 Peterson C., Vanderklish P., Seubcrt P., Cotman C., Lynch G. (1991) Increased spectrin proteolysis in fibroblasts from aged and Alzheimer donors. Neurosci Lett. 121(1-2), 239-43

8. Shields D.C., Banik N.L. (1998) Upregulation of calpain activity and expression in experimental allergic encephalomyelitis: a putative role for calpain in demyelination. Brain Res. 794(1), 68-74

9. Smith T., Groom A., Zhu B., Turski L. (2000) Autoimmune encephalomyelitis ameliorated by

10. Tompa P., Emori Y., Sorimachi II., Suzuki K., Fricdrich P. (2001) Domain III of calpain is a ca2+-regulated phospholipid-binding domain. Biochem Biophys Res Commun. 280(5),1333-9

11. Wang K.K., Yuen P.W. (1997) Development and therapeutic potential of calpain inhibitors. Adv Pharmacol. 37, 117-52