Внутривидовой полиморфизм и особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы (Apis mellifera L. ) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Львов, Алексей Валерьевич

• Львов, Алексей Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Львов, Алексей Валерьевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Роль антибактериальных пептидов в иммунитете насекомых.

1.1. Представление об иммунитете насекомых.

1.2. Антибактериальные пептиды насекомых.

1.2.1. Многообразие антибактериальных пептидов насекомых.

1.2.2. Особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов.

1.2.3. Механизм действия антибактериальных пептидов.

1.3. Иммунитет и система антибактериальных пептидов медоносной пчелы.

1.3.1. Иммунитет медоносной пчелы.

1.3.2. Антибактериальные пептиды медоносной пчелы.

Глава 2. Материалы и методы исследований'.;.-.

2.1. Характеристика объектов исследования.

2.2. Описание исследованных регионов.

2.3. Методы исследования антибактериальных пептидов медоносной пчелы.

2.3.1. Консервация пчел для перевозки и хранения.

2.3.2. Выделение ДНК и РЖ.

2.3.3. Амплификация тотальной ДНК.

2.3.4. Электрофоретическое фракционирование ДНК.

2.3.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2.3.6. Перенос РНК на мембранные фильтры.

2.3.7. Радиоактивное мечение препаратов ДНК.

2.3.8. Молекулярная гибридизация.

2.3.9. Элюция ДНК из агарозных гелей.

2.3.10. Клонирование фрагментов генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы.

2.3.11. Подготовка компетентных клеток Е. coli.

2.3.12. Трансформация компетентных клетоксо// гаюзмидной ДНК.

2.3.13. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК.

2.3.14. Секвенирование ДНК ферментативным методом.

2.3.15. Элекгрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-элекгрофорез).

2.3.16. Составы использованных стандартных растворов.

2.4. .Методы идентификации расового происхождения.

2.4.1. Морфометрический анализ.

2.4.2. Анализ полиморфизма мтДНК (локус COI-COII).

2.5. Компьютерный анализ и статистическая обработка результатов.

Глава 3. Амплификация и поиск полиморфизма участков генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина и дефензина медоносной пчелы Apis mellifera L.

3.1. Анализ известных нуклеотидных последовательностей и подбор праймеров.

3.2 Определение нуклеотидной последовательности и идентификация полученных ПЦР-амплифицированных фрагментов.

3.3 Полиморфизм генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы.

Глава 4. Экспрессия генов антибактериальных пептидов (абецина, гименоптецина, дефензина) у медоносной пчелы Apis mellifera L.

4.1 Экспрессия генов антибактериальных пептидов Apis mellifera (абецина, гименоптецина, дефензина) в ходе инфекционного процесса и при действии адаптогена (эксперимент I).

4.2. Межрасовые различия характера экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica (эксперимент II).

Глава 5. Полиморфизм гена дефензина в башкирской популяции медоносной пчелы Apis mellifera.

5.1. Гетерогенность субпопуляций медоносной пчелы по полиморфному локусу гена дефензина.

5.2. Интегральная гетерогенность субпопуляций РБ.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Внутривидовой полиморфизм и особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы (Apis mellifera L. )»

В последние годы проявляется значительный интерес к изучению антибактериальных пептидов (АБП) насекомых и беспозвоночных в целом. К настоящему времени из насекомых выделено более ста веществ пептидной природы, обладающих бактериостатическими, бактерицидными и фунгицидными свойствами. Повышенный интерес к ним, прежде всего, обусловлен их большим прикладным значением. По мнению многих специалистов, АБП являются перспективным источником нового класса антибиотиков, потенциальный спектр применения которых не ограничивается только рамками медицины (Hancock, Lehrer, 1998). Использование АБП в области сельского хозяйства привело к созданию новых трансгенных сортов растений, устойчивых к различного рода заболеваниям.

Следует отметить, что многие исследования в данной области пока носят поисковый характер. Они направлены на расширение списка изучаемых видов и выявление новых пептидных антибиотиков. Вместе с тем, АБП являются наиболее древними и биологически значимыми компонентами иммунной системы насекомых (Черныш и др., 1999). Создание ясного представления о системе антибактериальных пептидов и механизмах её функционирования у медоносной пчелы является важным этапом решения проблемы эволюции иммунитета у насекомых.

В настоящее время у медоносной пчелы обнаружены следующие антибактериальные пептиды: апидацины (несколько изоформ), абецин, дефензин и гименоптецин (Casteels-Josson et al. 1993; Casteels-Josson et al., 1994). Наличие этих пептидов в организме на всех стадиях развития, в мёде, маточном молочке и 7 прополисе является необходимой составляющей групповой и индивидуальной системы иммунитета (Зюман, 1992). Вместе с тем генетические аспекты иммунитета данного вида изучены крайне слабо. Поэтому исследование структурной организации и экспрессии генов АБП медоносной пчелы заслуживают особого внимания.

Кроме перспективности исследований АБП медоносной пчелы для медицины, изучение цитотоксических пептидов является отправной точкой при создании нового поколения иммуномодуляторов для пчеловодства, повышающих уровень естественного гуморального иммунитета отдельной особи и пчелосемьи в целом.

Одновременно молекулярно-генетический анализ комплекса антибактериальных пептидов является перспективным подходом к изучению структуры популяций и адаптивных возможностей медоносной пчелы. Исследование полиморфизма генов АБП может стать основой для создания ДНК-маркёров, непосредственно связанных с иммунитетом данного вида, открыть новые возможности для решения проблем сохранения внутривидового биоразнообразия медоносной пчелы.

Цели и задачи исследований. Цель работы заключалась в выявлении особенностей экспрессии и внутривидового полиморфизма генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы (Apis mellifera L.J. Были поставлены следующие задачи:

1. Амплификация и исследование полиморфизма генов АБП;

2. Изучение экспрессии генов АБП;

3. Популяционно-генетический анализ полиморфизма генов АБП. 8

Научная новизна. Впервые изучена экспрессия генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина и дефензина медоносной пчелы в ходе инфекционного процесса при заражении битоксибациллином (БТБ), а также при действии адаптогена - хитоолигосахаридов (ХОС). Обнаружены нуклеотидные замены в кодирующей области гена дефензина., которые ведут к замене аминокислот в соответствующем пептиде. Выявлена новая, ранее не известная у медоносной пчелы, форма диаллельного полиморфизма гена дефензина. Впервые проведено популяционно-генетическое исследование медоносной пчелы с использованием обнаруженного полиморфного сайта в качестве объекта ДНК-типирования. Показана генетическая неоднородность зоны гибридизации пчёл тёмной лесной (Apis mellifera mellifera) и южных рас. Найденные различия позволяют использовать полиморфный сайт гена дефензина в качестве удобного популяционно-генетического маркёра.

Практическая ценность работы. Полученные результаты могут быть использованы при осуществлении программ разведения пчёл среднерусской расы. Оценка иммунной устойчивости делает возможным целенаправленный отбор при выведении устойчивых к заболеваниям линий и пород пчёл. Применение обнаруженного нами полиморфизма гена дефензина в качестве маркёра в комплексе с результатами анализа митохондриального генома и морфометрии, позволяет дифференцировать субпопуляции, находящиеся на разных стадиях гибридизации. На основе полученных в результате анализа данных возможно выделение субпопуляций перспективных с точки зрения сохранения генофонда среднерусской расы медоносной пчелы. 9

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии»

Челябинск, 1999); «Актуальные проблемы биологии» (Сыктывкар, 1999, 2000);

Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2000).

Работа выполнялась в 1997-2001 гг. в Институте биохимии и генетики (до

1999 г. Отдел биохимии и цитохимии) Уфимского научного центра РАН в рамках следующих тем:

• "Генетико-биохимические особенности башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы" (РАН, № госрегистрации 01.9.60001037, 1996-1998);

• "Молекулярные механизмы адаптивности южно-уральской популяции Apis mellifera mellifera к современным условиям обитания" (РАН, № госрегистрации 01.99.0008299, 1999-2001);

• "Физиолого-биохимические особенности холодоустойчивости башкирской популяции среднерусской породы медоносной пчелы" (АН РБ, договор №1, 1996-1998);

• "Молекулярно-генетическая паспортизация генофонда башкирской популяции медоносной пчелы" (АН РБ, договор №15, 1999-2001);

• "Разработка комплекса молекулярно-генетических методов для контроля состояния генофонда башкирской пчелы" (АН РБ, договор №17, 1999-2001);

• "Изучение экспрессии биохимических механизмов защитных реакций как основа оценки адаптивных возможностей организма насекомых" (АН РБ, 19992001).

10

Автор выражает свою признательность руководителю и научному консультанту диссертационной работы - к.б.н., с.н.с. А.Г. Николенко и д.б.н. проф. A.B. Чемерису за организационную работу, поддержку и общую редакцию рукописи. Хотелось бы также поблагодарить проф. Э.К. Хуснутдинову за советы и консультации, значительно облегчившие работу над диссертацией. Искренне благодарю сотрудников лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИБГ УНЦ РАН О. Филатову, Ю.М. Никонорова, Б.Е. Сабиржанова, Ал.Х. Баймиева и Ан.Х. Баймиева за методическую поддержку при выполнении экспериментальной части работы. Сердечно благодарю за оказанную помощь в сборе материала и критические замечания всех сотрудников лаборатории биохимии адаптивности насекомых ИБГ УНЦ РАН.

11

Заключение диссертации по теме «Генетика», Львов, Алексей Валерьевич

134 Выводы

1. Методом ПЦР амплифицированы фрагменты генов АБП медоносной пчелы абецина, гименоптецина и дефензина. Показаны различия между длинами амплифицированных фрагментов генов абецина и дефензина медоносной пчелы и аналогичными участками, ограниченными праймерами, подобранными к последовательностям кДНК, что, по-видимому, можно объяснить присутствием интронов в генных вариантах амплификатов. Выявлено 5 нуклеотидных замен в кодирующей области гена дефензина, приводящих к 3 аминокислотным заменам в соответствующих аминокислотных последовательностях.

2. Методом дот-блот-гибридизации показана экспрессия генов всех трёх антибактериальных пептидов у Apis mellifera в контрольных вариантах. Это может свидетельствовать об экспрессии данных генов в нормальном неинфицированном состоянии, что изменяет сложившееся представление об исключительно индукционном характере экспрессии генов АБП насекомых.

3. Установлено увеличение уровня экспрессии генов антибактериальных пептидов Apis mellifera в первые 15 минут после введения битоксибациллина per os. Показано, что динамика уровня экспрессии антибактериальных пептидов определяется типом пептида, но соответствует временным периодам развития инфекционного процесса.

4. Показано, что введение per os хитоолигосахаридов в качестве адаптогенов индуцирует ответ антибактериальных пептидов, по характеру аналогичный экспрессии генов при инфицировании. Одновременное введение хитоолигосахаридов и битоксибациллина вызывает резкое снижение уровня

135 экспрессии, что, вероятно, связано аддитивным эффектом действия этих двух факторов.

5. Обнаружен ранее неизвестный диаллельный полиморфизм гена дефензина Apis mellifera, регистрируемый методом ПЦР по различиям длин амплификатов. Показана гетерогенность южно-уральских субпопуляций медоносной пчелы по частотам аллелей данного полиморфного локуса. Выявлены субпопуляции как достоверно отклоняющиеся, так и не отклоняющиеся от равновесного распределения Харди-Вайнберга. Найденные различия позволяют использовать данный. полиморфизм гена дефензина в качестве удобного популяционно-генетического маркёра.

6. Показана генетическая неоднородность представлявшейся ранее однородной зоны гибридизации расы Apis mellifera mellifera и пчел южных рас, охватывающей большую часть естественного ареала башкирской популяции пчелы. Анализ субпопуляций гибридной зоны по двум критериям (частота аллелей гена дефензина и отклонение частот генотипов от распределения по Харди-Вайнбергу) позволил дифференцировать субпопуляции гибридной зоны на три группы, возможно, находящиеся на разных стадиях гибридизации, что хорошо согласуется с данными морфометрических исследований и результатами анализа полиморфного локуса COI-COII мтДНК.

136

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Львов, Алексей Валерьевич, 2002 год

1. Акъюлова 3. Медоносные ресурсы Башкирии // Пчеловодство. 1983. №10. С. 17.

2. Алпатов В.В. Породы медоносной пчелы. М.: Изд. мое. общ. испыт. природы. 1948. С.183.

3. Андреевский А.М., Ногасин К. Протеазно-ингибиторная активность тканей дрозофилы при тепловом шоке на разных фазах индивидуального развития // 6 Всес. совещание по пробл. биологии и генетики дрозофилы (тез. докл.). Одесса. 1989. С.5-6.

4. Артеменко Р.П., Скрипник Е.И Иммунитет у пчёл // Пчеловодство. 1984. №11. С.18-19.

5. Ахметова И.Э., Муллагалиев И.Р., Ахметов P.P., Хайруллин P.M. Получение биологически активных олигомеров хитина // Достижения биологического факультета БГУ. Уфа. 1998. С. 17-21.

6. Байтеряков Р.Г. Бортевое пчеловодство в Южно-Уральском заповеднике // Леса Башкортостана: современное состояние и перспективы. Материалы научно-практической конференции. Уфа. 1997. С.237-238.

7. Бартникайте И.О., Кршцунене P.A. Цитопатологические и количественные изменения гемоцитов у личинок колорадского жука после обработки битоксибациллином // Тр. АН Лит. ССР. Серия В. 1988. Т.4(104). С.54-58.

8. Бондарчук Л.И., Нагорная И.М., Левченко И.А. Новое об антибактериальных свойствах мёда//Пчеловодство. 1995. №4. С.48-43.

9. Бургасов П.Н., Румянцев С.Н. Антимикробный конституциональный иммунитет. М.: Медицина, 1985, 256с.137

10. Глински 3., Ярош Я. Свидетельства о неклеточном иммунитете у медоносной пчелы // AmiaKTa=Apiacta. 1993. Т.28. №3-4. С.69-77.

11. Глупов В.В. Некоторые аспекты иммунитета насекомых // Успехи современной биологии. 1992. Т. 112. вып.1. С.62-73.

12. Глупов В.В., Хвощевская М.Ф., Щепеткин И.А., Крюкова H.A. Морфофункциональная структура популяции гемоцитов Gallería mellonella L. (Lepidoptera: Piralidae) при инфекционном процессе // Изв. РАН. Серия биологическая. 1997. №6. С.645-653.

13. Горбунов П.С. Гемолимфа пчёл на ноземотозе // Автореф. дис. к.б.н.:Л., Ленингр. гос. пед. ин-т. 1987. 20с.

14. Гранкин H.H. Селекция и воспроизводство среднерусских пчел для центральных и северных областей России // Автореферат дисс. д.с-х.н. М. 1997. С.З.

15. Гробов О.Ф., Лихотин А.К. Болезни и вредители пчел. М.: Агропромиздат. 1989. 239с.

16. Еськов Е.Е. Экология медоносной пчелы. Рязань: Русское слово. 1995. 390с.

17. Еськов Е.К. Экология медоносной пчелы. М.: Росагропромиздат. 1990. 221с.

18. ЖеребкинМ.В. Зимовка пчёл. Россельхозиздат. 1979. С.3-149.

19. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука. 1991. 272с.

20. Запольских О.В. Клетки гемолимфы трутневого расплода при варроатозе // Пчеловодство. 1983. №9. С.34-36.

21. Запольских О.В. Морфологический и цитохимический анализ клеток гемолимфы рабочей пчелы // Цитология. 1976. T.XVIII. № 8. С.956-962.138

22. Запольских O.B. Сравнительно-морфологическое и цитохимическое исследование клеток гемолимфы некоторых перепончатокрылых // Автореф. к.б.н. Л., Институт цитологии АН СССР, 1978. 19 с.

23. Зюман Б.В. Факторы и механизмы неспецифической резистентности медоносной пчелы (Apis mellifera L.) // Автореф. дисс. д.в.н. М., ВИЭВ, 1991. 30с.

24. Зюман Б.В. Лизоцим в жизнедеятельности семьи пчёл // Научно-технический бюл. / Дальневосточный зональный н.-и. вет. институт. 1991. №2. С.28-31.

25. Зюман Б.В. О бактерицидности мёда // Пчеловодство. 1991(a). №12. С.32-33.

26. Зюман Б.В. Роль мёда и маточного молочка в естественной резистентности семьи медоносных пчёл//Вест. Рос. акад. с.-х. наук. 1992. №6. С.56-58.

27. Зюман Б.В. Антибактериальные пептиды в неспецифической резистентности медоносной пчелы // Докл. РАСХН. 1993(a). №4. С.70-76.

28. Зюман Б.В. Почему болеют пчёлы // Пчеловодство. 1993. №4. С.24-25.

29. Зюман Б.В., Гордиенко Л.Н Выявление комплемента в гемолимфе пчёл // Ветеринария. 1986. №11. С.29-31.

30. Зюман Б.В., Гордиенко Л.Н Комплемент в системе иммунитета у пчёл // Инфекц. патол. с.-х. животных и пчёл на Дал. Вост. Новосибирск. 1988. С.61-67.

31. Зюман Б.В., Шариков А.П., Лобаченко Н.И. Устойчивость пчёл к заболеваниям // Пчеловодство. 1987. №5. С. 12-13.

32. Картель H.A., Макеева E.H., Мезенко А.М. Генетика. Энциклопедический словарь. Минск.: Технология. 1999. 437с.

33. Колокова Г.П., Потапов М. И. Протектины моллюсков и группы крови. // Проблемы гематологии и переливания крови. 1976. №9. С.40-43.139

34. Коппел X., Мертинс Дж. Биологическое подавление вредных насекомых М.: Мир. 1980. 416с.

35. Королёв Н.П. Функции лектинов в клетках. // Итоги науки и техники, серия Общие проблемы физико-химической биологии, Т.1 / Под ред. акад. A.JI. Курсанова. М. 1984. 380с. Кривцов Н.И. Пчеловодство. М.: Мир, 1999, С.24-27.

36. Кузнецов Н.Я. Основы физиологии насекомых. Т.1. JL: Изд-во Академии наук СССР. 1948. 380с.

37. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Соросовский образовательный журнал. 1997. №3. С.23-31.

38. Купер Э. JI. Сравнительная иммунология: Пер. с англ. М.: Мир. 1980. 422с. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.

39. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир. 1984. 480с. Мечников И.И. Невосприимчивость в инфекционных болезнях. М.: Медгиз. 1947. 698с.

40. Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Вахитов В.А. Использование метода ПЦР для контроля чистопородности пчелосемей Apis mellifera mellifera L. в условиях Южного Урала // Генетика. 1998. Т.34. №11. С. 1574-1577.

41. Орехов Д.А., Моисеенко Ю.Е Исследование клеток гемолимфы насекомых методом витальной окраски // Зоологический журнал. 1978. T.LVII. вып.5. С.777-782.140

42. Петров Пл. Распространение и история формирования пчёл рода Apis (Hymenoptera, Apidae) // Успехи современной биологии. 1992. Т. 112. С.359-371.

43. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина. 1982. 386с.

44. Поздняков В.Н., Абрамова А.В., Чудинов О.С. и др. Молекулярно-генетические подходы в изучении генетического полиморфизма различных пород пчёл // С-х. биология. 2000. №4. С.56-59.

45. Полевщиков А.В. Лектины в защитных реакциях беспозвоночных // Ж. общ. биол. 1996. Т.57. № 6. С.718-739.

46. Полтев В.И., Нешатаева Е.В. Болезни и вредители пчел. М.: Колос. 1977. 160с.

47. Раушенбах И.Ю. Стресс-реакция насекомых: механизм, генетический контроль, роль в адаптации // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №8. С. 1110-1118.

48. Рождественский А.П. Хистамов М.Ф., Арсламов Р.М. и др. Атлас Республики Башкортостан. М.: Комитет по геодезии и картографии Мин. экологии и природных ресурсов РФ. 1992. С. 18-20.

49. Руттнер Ф. Породы пчёл Африки // XXV международный конгресс по пчеловодству. Бухарест. 1978. С.330-349.

50. Салтыкова Е.С. Адаптивное действие хитоолигосахаридов на Apis mellifera L.: Дис. к.б.н. Санкт-Петербург-Пушкин. 2000. 153с.

51. Саттаров В.Н. Популяционно-генетический полиморфизм башкирской популяции медоносной пчелы Apis mellifera L.: Дис. к.б.н. Санкт-Петербург-Пушкин. 2000. 136с.141

52. Саттаров В.Н., Николенко А.Г., Поскряков А.В., Имангулов И.В. Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан. Уфа. 1998. С.66-67.

53. Симоненкова Г. Антибиотики в мёде // Пчеловодство. 1990. №5. С.44-45.

54. Смирнов В.В., Резник СР., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. Киев.: Наукова думка. 1982. 280с.

55. Солбриг О., Солбриг Д. Популяционная биология и эволюция. М.: Мир. 1982. 488с.

56. Тьпценко В.П. Физиология насекомых. М.:Высш. шк. 1986. 303с.

57. Урбах В.Ю. Биометрические методы (статистическая обработка опытных данных в биологии, сельском хозяйстве и медицине). М.: Изд. Наука. 1964. 415с.

58. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. 1999. 558с.

59. Цитлидзе Б.С. Активность каталазы и зимостойкость грузинских пчёл // Пчеловодство. 1979. №3. С. 13.

60. Черныш С.И. Антимикробные факторы насекомых: эволюционное разнообразие структуры и функций // Проблемы энтомологии в России. 1998. Т.2. С. 197198.

61. Черныш С.И. Нейроиммунология насекомых: опосредуемая мозгом индукция синтеза пептидных антибиотиков у двукрылого Calliphora vi ciña R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Проблемы энтомологии в России. 1998. Т.2. С. 198199.142

62. Черныш С.И., Гордя Н.А., Филатова Н.А. Протекторные механизмы насекомых: темпы молекулярной и фенотипической эволюции // Исследования по генетике. 1999. Вып. 12. С.52-59.

63. Яблоков А.В. Популяционная биология. М.:Высшая школа. 1987. 326с.

64. Abu-Hakima R., Faue I. An ultrastructural and autoradiographic study of the immune response in Hyalophora cecropia pupae // Cell Tissue Res. 1981. V.217. P.311-320.

65. Miyanoshita A., Hara S., Sugiyama M. et al. Isolation and characterization of a new member of the insect defensin family from a beetle, Allomyrina dichotoma // Biochem. Bioph. Res. Comm. 1996. V.220. No.3. P.526-531.

66. Allen K.L., Molan P.C., Reid G.M. A survey of the antibacterial activity of some New Zeland honeys // J. Pharm. Pharmacol. 1991. V.43. No.12. P.817-822.

67. Ashida M. The prophenoloxidase cascade in insect immunity // Res. Immunol. 1990. V.141. No.9. P.908-910.

68. Ashida M., Koizunu Y. Demonstration of the presence of profenoloxidase cascade in larval cuticle of the silkworm, Bombyx mori // Zool. Sci. 1993. V. 10. No.6. P. 12.

69. Ashida M., Yamazaki H.I. Biochemistry of the phenoloxidase system in insects: with special reference to its activation // Molting and Metamorphosis (Eds. Ohnishi E., Ishizali H.) / Japan Sci. Soc. Press, Tokyo; Springer Verland, Berlin. 1990. P.239.

70. Asling В., Dushay Mitchell S., Hultmark D. Mechanisms of immune responses in insects: Abstr. Keystone Symp. "Toward Genet. Manipul. Insects", Tamarron, Colo, March 17-23, 1995 //J. Cell Biochem. 1995. Suppl.21a. P. 188.143

71. Blanchetot A. DNA fingerprinting analysis in the solitary bee Megachile rotundata: variability and nest mate genetic relationships // Genome. 1992. V.35. P.681-688

72. Bohn H., Barwig B. Haemolymph cloning in the cockroach Leucophaea maderae (Blattaria). Influence of ions and inhibitors: isolation of the plasma coagulogen // J. Comp. Physiol. 1984. V.154. No.5. P.457-467.

73. Boman H.G., Hultmark D. Cell-free immunity in insects. // Annual Review of Microbiology: ed. L. N. Ornston, A. Balows, P. Baumann. 1987. V.41. P. 103-126

74. Brechelin M. Immunity in invertebrates. Celes, Molecules and Defense Reactions. Heidelberg: Springer-Verlag. 1986. 233p.

75. Brehelin M., Hofman J.A. Phagocytosis of inert particles in Locusta migratoria and Galleria mellonella: study of ultrastructure and clearence // J. Insect Physiol. 1980 V.26. P. 103.

76. Brown R., Almodovar L., Bhatia H. e.a. Blood group specific agglutinins in invertebrates //J. Immunol. 1968. V. 100. No. 1. P.214-216.

77. Bucher G.E. Potential bacterial pathogens of insects and their characteristics // J. Insect Pathol. 1960. V2. P. 172-195.

78. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Tempst P. Functional and chemical characterization of hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera) // J. Biol. Chem. 1993. V.268. No. 10. P.7044-7054.

79. Casteels P., Ampe C., Jacobs F.,Vaeck M., Temst P. Apidacins: antibacterial peptides from honeybees // The EMBO J. 1989. V.8. P.2387-2391.

80. Casteels P., Ampe C., Riviere L. et al. Isolation and characterization of abaecin, a major antibacterial response peptide in the honeybee (Apis mellifera) // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P.381-386.144

81. Casteels P., Romagnolo J. Castle M. et al. Biodiversity of apidaecin-type peptide antibiotics // J. Biol. Chem. 1994. V.269. No.42. P.26107-26115.

82. Casteels-Josson K., Capaci T., Casteels P., Tempst P. Apidaecin multipeptide precursor structure a putative mechanism for amplification of the insect antibacterial response // EMBO J. 1993. V.12: (4). P. 1569-1578.

83. Chadwik J.M., Aston W.P. An overview of insect immunity // Animal Models of Comparative and Developmental Aspects of Immunity and Disease: ed. M. E. Gershwin, E. L. Cooper. N.Y.: Pergamon. 1979. P. 1-14.

84. Chomezynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thio-cyanate-phenol-chloroform extraction// Anal. Biochem. 1987. V.162. P. 156159.

85. Cociancich Stephane, Ghazi Alexandre, Hetru Charles et al. Insect defensin, an inducible antibacterial peptide, forms voltage-dependent channels in Micrococcus luteus // J. Biol. Chem. 1993. V.268. No.26. P. 19239-19245.

86. Cornuet J.-M., Garnery L. Mitochondrial DNA variability in honeybees and its pylogeographic imlications // Apidologie. 1991. V.22. P.627-642.145

87. Crozier H.R., Crozier Y.C. The mitochondrial genome of Honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization // Genetics. 1993. V.133. P.97-117.

88. Dimarcq J.-L., Zachary D., Hoffman J.A. et al. Expression of the two major inducible antibacterial peptides, defensin and diptericin, in Phormia terranovae // EMBO J. 1990. V.9. No.8. P.2507-2515.

89. Dulmage H.T., Rhodes R.A. Production of pathogens in artificial media // In: Microbial Control of Insect and Mites, Burges H.D., Hussey N.W. London-New York.: Academic Press. 1971. P.507-540.

90. Dunn Peter E. Humoral immunity in insects. Immune strategy appeart to correspond to life-history characteristics// Bioscience. 1990. V.40. No. 10. P.738-744.

91. Eguchi M., Matsui Y., Matsumoto T. Developmental change and normal control of chymotrypsin inhibitors in the haemolymph of the silkworm, Bombyx mori // Comp. Biochem. and Physiol. 1986. V.84. No.3. P.327-332.

92. Elvin C., Vuocolo T., Pearson R. et al. Characterization of a major peritrophic membrane protein, peritrophin-44, from the larvae Lucilia cuprina: cDNA and deduced amino acid sequences // J. Biol. Chem. 1996. V.271. No.15. P.8925-8935.146

93. Engstrom A., Xanthopoulos K.G., Boman H.G., Bennich H. Amino acid and cDNA sequences of lysozyme from Hyalophora cecropia // EMBO J. 1985. V.4. No.8. P.2119-2122.

94. Estoup A., Garneiy L., Solignac M., Cornuet J.-M. Microsatellite variation in honey bee (Apis mellifera L.) populations: hierarchical genetic structure and test of the infinite allele and stepwise mutation models // Genetics. 1995. Y. 140. P.679-695.

95. Farnandez-Sousa J.M., Gavilanes J.G., Municio A.M. et al. Lysozyme from the insect Ceratitis capitata egges // Eur. J. Biochem. 1977. V.72. P.25-33.

96. Faue I. Insect immunity: Early fate of bacteria injected in saturniid pupae. // J. Invertebr. Pathol. 1978. V.31. P. 19-26.

97. Faust R.M. Bacterial diseases // In: Insect Diseases: ed Cantwell G.E. New York: Marcel Dekker. 1974. V.l. P.87-183.

98. Fehlbaum P., Bulet P., Chernysh S.I. et al. Structure-activity analysis of thanatin, a 21-residue inducible insect defense peptide with sequence homology to frog skin antimicrobial peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P. 1221-1225.

99. Flyg C., Dalhammar G., Rasmuson B., Boman H.G. Insect immunity. Inducible antibacterial activity in Drosophila // Insect Biochem. 1987. V. 17. P. 153-160.

100. Franc N., Dimarco J.L., Lagueux M. et al. // Immunity. 1996. V.4. P.431-443.

101. Fukumitsu T., Fujimoto K., Masuda K. Activation of profenoloxidase in Drosophila // Zool. Sci. 1992. V.9. No.6. P. 1133.

102. Furukawa S., Taniai K., Yang J. et al. Induction of gene expression of antibacterial proteins by chitin oligomers in the silkworm, Bombyx mori // Insect Mol. Biol. 1999. V.8: (1). P. 145-148.147

103. Gilliam M., Jeter W.S. Synthesis of agglutinating substances in adult honeybees against Bacillus larvae // J. Invert. Pathol. 1970. V. 16. P.69-70.

104. Glinski Z., Grzegorczyk K. Apidaecins and lysozyme in the honeybee (Apis mellifera L.) from environment nonheavily contaminated with heavy metals // Ann. UMCS. DD. 1995. V.50. P. 139-146.

105. Gupta A.P. Hemocyte type: their structure, synonymies, interrelationships and taxonomie significance // Insect hemocytes: development, form, functions and techniques / Ed. Gupta A.P., Cambridge, London: Cambridge University Press. 1979. P.85.

106. Hall G.H. PCR amplification of a locus with RFLP alleles specific to African honey bees //Biochem. Genet. 1998. V.36. No.9/10. P.351-361.

107. Hancock Robert E.W., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics // Trends Biotechnol. 1998. V.16. P.82-88.

108. Heimpel A.M., Angus T.A. Diseases caused by certain spore-forming bacteria // In: Insect Pathology: An Advanced Treatise, New York: Academic Press. 1963. V.2. P.21-73.

109. Hoffman J.A., Richhart J.-M. Drosophila immunity // Trends Cell Biol. 1997. V.7. P.309-316.

110. Hung S.C., Wang W., Chan S.I., Chen H.M. Membrane lysis by the antibacterial peptides cecropins B1 and B3: A spin-label electron spin resonance study on phospholipid bilayers // Biophys. J. 1999. V.77. No.6. P.3120-3133.

111. Hunt G., Page R. Linkage map of the honey bee Apis mellifera, based on RAPD markers // Genetics. 1995. V.139, P. 1371-1382.

112. Hurlbert R.E., Karlinsey J.E., Spence K.D. Differential synthesis of bacteria-induced proteins of Manduca sexta larvae and pupae // J. Insect Physiol. 1985. V.31. P.205-215.

113. Jarosz J. Alterations in cathodal protein fractions in immune wax moth pupal blood // Cytobios. 1983. V.38. No. 150. P.71-81.

114. Jarosz J. Haemolymph immune proteins protect the insect body cavity from invading bacteria// Compar. Biochem. Physiol. 1995. V.lll. No.2. P.213-220.

115. Kaaya G.P., Flyg C., Bovan H.G. Insect immunity. Induction of cecropin and attacin-like antibacterial factors in the haemolymph of Glossina morsitans morsitans // Insect Biochem. 1987. V. 17. P.309-315.

116. Kanost M.R., Dai W., Dunn P.E. Peptidoglycan fragments elicit antibacterial protein synthesis in larvae of Manduca sexta // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1988. V.8. No.3. P. 147-164.

117. Kato Y., Nakamura T., Takeuchi T. Haemagglutination activity of haemolymph of Bombyx mori treated with a juvenile hormone analogue // Nihon sansgihaku zasshi = J. Sericult. Sci. Jap. 1994. V.63. No.3. P.221-228.

118. Keppi E., Zachary D., Robertson M. et al. Induced antibacterial proteins in the haemolymph of Phormia terranovae (Diptera) // Insect Biochem. 1986. V.16. P.395-402.

119. Marchini D., Bernini L.F., Marri L. et al. The female reproductive accessory glands of the medfly Ceratitis capitata: Antibacterial activity of the secretion fluid // Insect Biochem. 1991. V.21. No.6. P.597-605.150

120. Minnick M.F., Rupp R., Spence K.D. A bacterial-induced lectin which triggers gemocyte coagulation in Manduca sexta // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V.137. No.2. P.729-735.

121. Monro R.E. Protein turnover and the formation of protein inclusions during sporulation of Bacillus thurengiensis // Biochem. J. 1961. V.2. P.225-359.

122. Natori S. Dual functions of insect immunity proteins in defence and development // Res. Immunol. 1990. V.141. No.9. P.938-939.

123. Okada M., Natori S. Purification and characterzation of an antibacterial protein from haemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh-fly) larvae // Biochem. J. 1983. V.211. P.727-734.

124. Olucola A.A., Jing-Qiu C. Distribution, stability and binding specificity of a hemagglutinin in the corn earworm, Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) // Eur. J. Entomol. 1997. V.94. No.2. P. 167-176.

125. Papadopoulou-Karabela K, Iliadis N., Liakos V. Haemocyte changes in honeybee (Apis mellifera L.) artifically infected by Pseudomonas aeruginosa // Apidologie. 1993. V.24. P.81-86.

126. Powning R., Davidson W, Studies on insect bacteriolytic enzymes-II. Some physical and enzymatic properties of lysozyme from haemolymph of Galleria mellonella // Comp. Biochem. Physiol. 1976. V.55(B). P.221-228.

127. Powning R.F., Davidson W.J. Studies on insect bacteriolytic enzymes-II. Some physical and enzymatic properties of lysozyme from haemolymph of Galleria mellonella // Comp. Biochem. Physiol. 1976. V.55(B). P.221-228.151

128. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5467. Saul S., Sugumaran M. Protease inhibitor controls prophenoloxidase activation in

129. Smith D.R., Broun W.M. Restriction endonuclease cleavage site and length polymorphism in mitochondrial DNA of Apis mellifera mellifera and A.m. carnica (Hymenoptera: Apidae) // Annals of the entomological society of America. 1990. Y.83. No.l. P.81-88.

130. Smith D.R., Brown W.M. Polymorphisms in mitochondrial DNA of European and Africanized honeybees (Apis mellifera) // Experientia. 1988. V.44. P.257-260.

131. Spencer E.Y. Comparative amino acid composition of the parasporal inclusions of five entomogenous bacteria // J. Invert. Pathol. 1968. V.10. P.444-445.

132. Spies A.G., Karlinsey J.E., Spence K.D. The immune proteins of the darkling beetle, Eleodes (Coleoptera: Tenebrionidae) // J. Invertebr. Pathol. 1986. V.47. P.234-235.

133. Stinen D., Peferoen M., DeLoof A. Proteins with haemagglutinin activity in larvae of the Colorado beetle Leptinotarsa decemlineata // J. Insect Physiol. 1982. V.25. No.5. P.465-470.

134. Terra W.R. Evolution and function of insect peritrophic membrane // Cienc. e cult. 1996. V.48. No.5-6. P.317-324.

135. Wang X., Jin Q. Inducible antibacterial and lectin activity in hemolymph of Chiysomyia megacephala larvae and pupae // 19 Int. congr. entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Proc.: Abstr. Beijing. 1992. P.334.

136. Xu Jh., Nishijima M., Kono Y. et al. Identification of a hemocyte membrane-protein of the silkworm, Bombyx mon, which specifically binds to bacterial lipopolysaccharide // Insect Biochem. Mol. Biol. 1995. V.25. No.8. P.921-928.

137. Yu X.Q., Kanost M.R. Developmental expression of Manduca sexta hemolin // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1999. V.42. No.3. P. 198-212.

138. Zachary D, Hoffmann D. Lysozyme is stored in the granules of certain haemocyte types in Locusta // J. Insect Physiol. 1984. V.30. P.405-411.

139. Zhu P., Lu Z. Studies on the antibacterial substances of Pieris rapae induced by delfamethrin and trichlorfon //19 Int. Congr. Entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Proc. Abstr. 1992. P.594.