Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Глинщикова, Ольга Анатольевна

• Глинщикова, Ольга Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Глинщикова, Ольга Анатольевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Внутренние стандарты.

1.1.1 Амплификационные методы определения вирусных нуклеиновых кислот.

1.1.2 Количественное определение нуклеиновых кислот.

1.1.3 Метод лимитирующих разведений.

1.1.4 Конкурентная ПЦР.

1.1.5 Real-time ПЦР.

1.1.6 Внутренние стандарты.

1.1.7 Свободные РНК и ДНК-стандарты.

1.1.8 Биологические стандарты.

1.1.9 Генноинженерные стандарты.

1.1.10 Армированные РНК-стандарты.

1.1.11 Стандарты для мутационного анализа.

1.1.12 Скрининг продуктов крови.

1.1.13 Стандарты для множественных методов.

1.2 Ретровирусы.

1.2.1 Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы MuLV.

1.2.2 Принципы конструирования ретровирусных векторов.

1.2.3 Упаковывающие клетки.

1.3 Природа вируса гепатита С.

1.3.1 Организация генома HCV.

1.3.2 Вариабельность генома HCV и его генотипы.

1.3.3 Клиническое значение генотипов HCV.

1.3.4 Вакцина против НСV.

1.3.5 Вирусная репликация.

1.3.6 Репликационный цикл.

1.3.7 Динамика репликации.

1.3.8 Определение РНК НС V при остром и хроническом гепатите С.

1.3.9 Мониторинг уровня РНК HCV в течение терапии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Образцы сывороток.

2.2 Определение РНК HCV в сыворотке крови.

2.3 Выделение РНК HCV из сыворотки крови.

2.4 Обратная транскрипция и «nestecb-ПЦР.

2.5 Детекция продуктов амплификации.

2.6 Праймеры.

2.7 Конструирование внутреннего стандарта.

2.8 Получение пакующей клеточной линии.

2.9 Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК HCV.

2.10 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV.

2.11 Использование внутреннего стандарта в экспериментах с разведенными сыворотками.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Конструирование внутреннего стандарта.

3.2 Получение пакующей линии клеток.

3.3 Определение титра ретровирусных частиц.

3.4 Чувствительность метода.

3.5 Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV.

3.6 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV.

3.7 Статистическая обработка количественных измерений.

3.8 Анализ динамики вирусной концентрации на примере разведенных сывороток.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора.

4.2 Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера.

4.3 Полуколичественное определение.

4.4 Использование внутреннего стандарта для сывороток разных генотипов.

4.5 Использование внутреннего стандарта при качественном и количественном определении РНК HCV.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора»

В последние годы одним из основных методов молекулярной диагностики вирусных инфекций стала полимеразная цепная реакция. Это высокочувствительный и высокоспецифичный метод. Введение внутреннего стандарта, который амплифицируется с теми же праймерами, что и исследуемая мишень, делает реакцию амплификации конкурентной, позволяя проводить количественные оценки концентрации исследуемой мишени по известной концентрации внутреннего стандарта. Кроме того, внутренний стандарт играет роль контроля прохождения реакции в отдельной пробирке.

Широкое распространение конкурентная ОТ-ПЦР с использованием внутреннего стандарта получила при анализе экспрессии генов и при диагностике вирусных инфекций.

Особые проблемы возникают при разработке РНК-внутренних стандартов. Во-первых, в отличие от ДНК молекулы РНК нестабильны, легко подвергаются рибонуклеазному расщеплению. Упаковка РНК в белковую оболочку позволяет решить эту проблему. Кроме того, упакованная РНК, в отличие от свободной, имитирует по строению исследуемый вирус, что позволяет контролировать все стадии процесса выделения РНК и ОТ-ПЦР. Во-вторых, существует проблема подсчета концентрации внутреннего стандарта. Еще не предложено внутреннего РНК- стандарта, для которого эти проблемы были бы решены в полной мере, и который удовлетворял бы всем теоретическим требованиям. В связи с этим, предлагаемый в работе новый тип внутреннего РНК-стандарта - на основе ретровирусного вектора - является весьма актуальным.

Нами разработан внутренний РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С. Это рекомбинантный ретровирус, содержащий модифицированную последовательность РНК HCV, используемую для амплификации в ПЦР, и селективный маркер - ген устойчивости к пуромицину. Наличие последнего позволяет определять титр ретровирусных частиц стандарта в экспериментах по инфицированию клеточных культур. Предлагаемый ретровирусный стандарт получают из культуры пакующих клеток, просто собирая среду культивирования, в которой росли клетки.

Особое значение ПЦР-диагностика HCV имеет для скрининга донорской крови и ее компонентов, которые являются основными источниками вируса для лиц, получающих множественные трансфузии. Введение в диагностические тест-системы внутреннего стандарта позволяет выявлять ложноотрицательные результаты и становится, следовательно, острой необходимостью. Кроме того, введение внутреннего стандарта дает возможность проводить количественные оценки изменения концентрации HCV, что представляет несомненный клинический интерес, так как основными прогностическими факторами интерфероновой терапии являются генотип вируса и динамика изменения концентрации вируса в течение первых недель лечения.

В работе продемонстрировано применение внутреннего стандарта для качественных и количественных определений РНК HCV.

Использование рекомбинантного ретровирусного вектора - это новый подход в получении внутренних стандартов для конкурентной ОТ-ПЦР, а также для нового количественного метода определения нуклеиновых кислот - real-time ПЦР.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Разработка РНК-внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора для конкурентной ОТ-ПЦР, который позволяет оценивать количественные изменения концентрации РНК HCV в сыворотке крови больных в ходе терапии и контролировать прохождение реакции в каждой пробирке при качественном определении и генотипировании РНК вируса гепатита С.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Создание генно-инженерной конструкции, представляющей собой ретровирусный вектор с клонированной в него модифицированной вирусной последовательностью, используемой для амплификации в полимеразной цепной реакции;

2. получение пакующей линии клеток, культуральный супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом вирусного генома;

3. использование полученного внутреннего стандарта в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК HCV;

4. применение полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК HCV.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Предложен новый тип внутреннего стандарта для конкурентной ОТ-ПЦР - это РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора. Внутренний стандарт разработан для качественного и количественного определения РНК HCV в сыворотке крови больных. Предлагаемый внутренний стандарт представляет собой рекомбинантные ретровирусные частицы в культуральной среде пакующих клеток. Концентрация внутреннего стандарта измеряется в экспериментах по инфицированию клеток-мишеней.

ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ.

Предложенный в работе подход может быть использован при получении внутренних РНК- стандартов для конкурентной ОТ-ПЦР и real-time ПЦР. В ходе исследования получен внутренний РНК- стандарт для конкурентной ПЦР для определения и генотипирования РНК HCV.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликованы 6 работ. Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (2000г.Москва), на I Всероссийском съезде гематологов (2002г. Москва), и на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении (2002г. Москва).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 96 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 26 рисунков и 4 таблицы. Список цитированной литературы включает 108 наименований.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Глинщикова, Ольга Анатольевна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый принцип получения внутреннего РНК-стандарта для конкурентной ПЦР на основе ретровирусного вектора. (Патент РФ №2186388. Способ количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке крови).

2. Получена пакующая линия клеток мышиных фибробластов, культуральный супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом генома HCV.

3. Внутренний стандарт введен в тест-систему, используемую в лаборатории молекулярной гематологии, в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК HCV.

4. Показана возможность применения полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК HCV.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Глинщикова О.А., Макарик Т.В., Романова Е.А., Судариков А.Б.

Определение генотипов вируса гепатита С у гематологических больных. Тез.докл. 3 Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика в современной медицине". 2000г. Москва. Электронная версия http://www.hepatitinfo.ru/confgen<l/indexl.htm

2. Глинщикова О.А., Романова Е.А., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Количественное определение РНК вируса гепатита С в сыворотке крови больных. Тез.докл. Научно-практический симпозикм «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении».М.: НПО «Литех», 2002г. -с.34-36.

3. Глинщикова О.А., Куликов С.М., Судариков А.Б. Внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С в конкурентной полимеразной цепной реакции. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004. - №6 - с.84-88.

4. Glinschikova О.A., Sudarikov А.В./ complete cds./GenBank AY 171560.

5. Судариков А.Б., Глинщикова О.А. Способ количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке крови. Патент на изобретение №2186388. М.: Государственный реестр изобретений РФ, 2002.

6. Макарик Т.В., Романова Е.А., Глинщикова О.А.,Судариков А.Б. Вирусный гепатит С: новое в эпидемиологии, методах диагностики и терапии. // Гематология и трансфузиология. - 2001. - №3 — с. 86-91.

7. Ядрихинская В.Н, Михайлова ЕА., Судариков А.Б., Глинщикова OA., Булекова Ю.А., Куликов С.М., Савченко В.Г. /Мониторинг инфицирования вирусами гепатитов В, С, G у больных апластической анемией и острыми лейкозами. // Проблемы гематологии и переливания крови. -2002. - № 1. - с. 89.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Получен оригинальный внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора, который позволяет в конкурентной полимеразной цепной реакции количественно определять изменение концентрации вируса гепатита С.

Данный стандарт обладает следующими свойствами:

1) имеет ту же химическую структуру, что и вирус гепатита С;

2) его легко культивировать в пакующей клеточной линии и получать в необходимых количествах;

3) наличие селективного маркера (гена устойчивости к пуромицину) дает возможность вычислять титр внутреннего стандарта в независимых экспериментах по инфицированию клеточных культур;

Полученный внутренний стандарт может быть использован для контроля прохождения реакции в отдельной пробирке, что позволяет избежать появления ложноотрицательных результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Глинщикова, Ольга Анатольевна, 2004 год

1. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. - М.: Амипресс, 1999.

2. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. 2002. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). www.PCR.ru/bibliogr/articles.

3. Кузин С.Н., Лисицина Е.В., Самохвалов Е.И и др. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. // Вопросы вирусологии, 1999, N2, с.79-82.

4. Львов Д.К., Миширо С., Селиванов Н.А. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях СевероЗападной и Центральной частей России. // Вопросы вирусологии, 1995, N6, с.251-253.

5. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С. (Серологические маркеры и методы их выявления). // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы Информационный бюллетень 2002, №2(15).

6. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. // Клиническая лабораторнаядиагностика. 2000, N 5.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. (Т. Maniatis, E.Fritsch, J.Sambrook. Molecular cloning: a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982)

8. Новое в клонировании ДНК. Методы. Пер.с англ./под ред. Д. Гловера.

9. М.: Мир, 1989. Стр.295-296.

10. Ю.Прасолов B.C., Иванов Д.С. Ретровирусные векторы в генной терапии. //Вопросы медицинской химии. 2000, №3.

11. Судариков А.Б., Огрель О.Д. Способ выявления вируса гепатита С в сыворотке крови человека. 2000. Патент РФ № 2150505.

12. Alter H.J., Seeff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis С virus infection: a perspective on long-term outcome. Semin. Liver Dis. 2000; 20: 17-35.

13. Alter H.J., Sanchez-Pescador R., Urdea M.S., et al. Evaluation of branched DNA signal amplification for the detection of hepatitis С virus RNA. J. Viral. Hepat. 1995; 2(3): 121-32.

14. Amoroso P., Rapicetta M., Tosti ME, Mele A., Spada E., Buonocore S., Lettieri G., Pierri P., Chionne P., Ciccaglione A.R, Sagliocca L. Correlation between virus genotype and chronicity rate in acute hepatitis C. J. Hepatol. 1998 Jun; 28(6): 939-44.

15. Argetsinger J.E., Gussin G. Intact ribonucleic acid from defective particles of bacteriophage R17. J.Mol.Biol. 1966; 21: 421-434.

16. Aust G. Competitive rt-PCR to quantify small amounts of mRNA. Methods Mol. Biol. 2003; 249: 31-40.

17. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of hepatitis С virus. J.Gen. Virol. 2000; 81: 1631-1648.

18. Baum C., Ostertag W., Stocking C., Laer D. in: Gene Therapy of Cancer, Academic Press. 1999; 51-76.

19. Bekkering F.C., Brouwer J.T., Schalm S.W., Elewaut A. Hepatitis С viral kinetics. Hepatology 1997; 26: 1691-1693.

20. Blight K.J., Kolykhalov A.A., Rice C.M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science 2000; 290: 1972-1974.

21. Boisvert J., He X.S., Cheung R. et al. Quantitative analysis of hepatitis С virus in peripheral blood and liver: replication detected only in liver. J.Infect.Dis. 2001 Oct 1; 184(7): 827-35.

22. Bonkovsky H.L., Woolley M., and the Consensus Interferon Study Group.Reduction of health-related quality of life in chronic hepatitis С and improvement with interferon therapy. Hepatology 1999; 29: 264-270.

23. Bouvier-Alias M., Patel K., Dahari H. et al. Clinical utility of total HCV Core antigen quantification: a new inderect marker of HCV replication. Hepatology 2002; 36; 1.

24. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis С virus:quasispecies and genotypes. Semin. Liver Dis. 1995; 15: 41-63.

25. Busch M.P., Rawal B.D., Nowicki M. et al. HCV RNA and ALT patterns in seroconverting transfusion recipients, and correlation with donor ALT and RNA (abstract). Transfusion 1997; 37(Suppl):l 1 IS.

26. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 1989 Apr 21; 244(4902): 359-62.

27. CofFm J.M., Hughes S.H., Varmus H.E. (eds.) (1997), Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

28. Cosset F.L., Takeuchi Y., Battini J.L., Weiss R.A., Collins M.K. J.Virol. 1995; 69: 7430-7436.

29. Davis G.L. Monitoring of viral levels during therapy of hepatitis C. Hepatology 2002; 36; 5; suppl.l.

30. Davis G.L., Lau J.Y. Factors predictive of a beneficial response to therapy of hepatitis C. Hepatology 1997 Sep; 26(3 Suppl 1): 122S-127S

31. DuBios D.B., WalkerPeach C.R., Pasloske B.L., Winkler M. Universal ribonuclease resistant RNA standards (Armored RNA) for RT-PCR and bDNA-base hepatitis С virus RNA assays. Clin.Chem. 1997; 43(11): 2218 (Abstract).

32. DuBios D.B., WalkerPeach C.R., Pasloske B.L. Ribonuclease resistant viral RNA standards. 1997. USA Patent No.5,677,124.

33. Farci P., Alter H.J., Wong D., Miller R.H., Shih J.W. et al. A long-term studyof hepatitis С virus replication in non-A, non-B hepatitis. N. Engl. J. Med. 1991;325:98-104.

34. Farci P., Govindarajan S., Wong D.C., Engle R. et.al. Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis С virus. Science 1992; 258: 135140.

35. Fields B.N., Knipe D.M. 1989. Fundamental virology.

36. Fried M.W., Shiffinan M.L., Reddy K„ Smith C., Marions G. et.al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis С virus infection. N. Engl. J. Med. 2002; 347: 975-982.

37. Fukutomi Т., Nakamuta M., Fukutomi M. et al. Decline of hepatitis С virus in serum during the first 24 h after administration of interferon -beta as a predictor of the efficacy of therapy. J. Hepatol. 2001; 34: 100-107.

38. Gerlach J.T., Zachoval R., Gruener N.H., Jung M-C., Ulsenheimer A., Schraut W., Waechtler M. et al. Acute hepatitis C: natural course and response to antiviral treatment Abstract. Hepatology 2001; 34: 341 A.

39. Germi R., Crance J.M., Garin D., Zarski J.P., Drouet E. Hepatitis С virus culture systems. Pathol. Biol. (Paris) 2001 Apr; 49(3): 255-61

40. Germi R., Crance J.M., Garin D. et.al. Mosquito cells bind and replicate hepatitis С virus. J.Med.Virol. 2001 May; 64(1): 6-12.

41. Gilliland G., Perrin S., Blanchard К., Вшт H.F. Analysis of cytokine mRNA and Dna: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc. Natl. Acad .Sci. USA. 1990; 87(7): 2725-2729.

42. Gowans E.J. Distribution of markers of hepatitis С virus infection throughout the body. Semin. Liver Dis. 2000; 20(1): 85-102.

43. Grovatto M., Pozzato S., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis С virus infected patients are replication sites of the virus. Haemotologica. 2000; 85(4): 356-361.

44. Haberhausen G., Pinsl J., Kuhn C.-Ch., Markert-Hahn Ch. Comparative study of different standardization concepts in quantitative competitive reverse transcription- PCR assay. J.Clin.Microbiol. Mar. 1998; 628-633.

45. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology 2002; 36; 5; suppl.l.

46. Kwok S., Sninsky JJ. PCR detection of human immunodeficiency virus type 1 proviral sequence. In Diagnostic Molecular Biology Principles and Applications. Persing D.H., Smith T. F., Tenover T.J., White T.J. Eds. ASM Press. 1993; Washington, DC.

47. Lai M.E., Mazzoleni A.P., Argiolu F., DeVergilis S., Balistrieri A. et.al. Hepatitis С virus in multiple episodes of acute hepatitis in polytransfused thalassaemic children. Lancet 1994; 343: 388-390.

48. Lam N.P., Neumann A.U., Gretch D.R. et al. Dose-dependent acute clearance of hepatitis С genotype 1 virus with interferon alfa. Hepatology 1997; 26: 226-231.

49. Lau D.T.-Y., Kleiner D.E., Ghany M.G., Park Y., Schmid P., Hoofiiagle J.H.I 0-year follow-up after interferon- therapy for chronic hepatitis C. Hepatology 1998; 28: 1121-1127.

50. Layden J.E., Layden T.J., Levi-Drammer R. et al. Early viral kinetics of

51. HCV predicting treatment response after only 24 hours (abstract). Gastroenterology 2001; 120: A30.

52. Layden J.E., Layden T.J. How can mathematics helps us understand HCV. Gastroenterology 2001; 120: 1546-1549.

53. Lerat H., Berby F., Trabaud M.A. et al. Specific detection of hepatitis С minus strand RNA in hematopoetic cells. // J. Clin. Invest. -1996. V.97. -N3. - P.845-851.

54. Liang T.J., Rehermann В., Seeff L.B., Hoofiiagle J.H. Pathogenesis, natural history, treatment and prevention of hepatitis C. Ann. Intern. Med. 2000; 132; 296-305.

55. Lim F., Peabody D.S. Mutations that increase the affinity of a translational repressor for RNA. Nucleic. Acids. Res. 1994; 22: 3747-3752.

56. Lindsay K.L. Introduction to Therapy of Hepatitis С Hepatology 2002; 36(5); Suppl. 1.

57. Lohmann V., Koch J., Herian U., Theilmann L., Bartenschlager R. Replication of subgenomic hepatitis С virus RNA in a hepatoma cell line. Science 1999; 285: 110-113.

58. Major M.E., Mihalik K., Fernandez J., Seidman J. et.al. Long-term follow-up of chimpanzees inoculated with the first infectious clone for hepatitis С virus. J. Virol. 1999; 73: 3317-3325.

59. Manns M.P., McHutchison J.G., Gordon S.C., Rustgi V.K.et.al. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment for chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet 2001; 358: 958-965.

60. Martell M., Gomez J., Esteban J.I., Sauleda S., Quer J., Cabot В., Esteban R., Guardia J. High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis С virus RNA. J.Clin.Microbiol. 1999 Feb.; 327-332.

61. Martell M., Esteban J.I., Quer J., Genesca J.etal. Hepatitis С virus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution. J. Virol. 1992; 66: 32253229.

62. McHutchison J.G., Gordon S.C., Schiff E.R., Shiftman M.L. et.al. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. N. Engl. J. Med. 1998; 339: 1485-1492.

63. Mehta S.H., Cox A., Hoover D.R., Wang X-H., Mao Q. et.al. Protection against persistence of hepatitis C. Lancet 2002; 359: 1478-1483.

64. Mercer D.F., Schiller D.E., Elliot J.F., Douglas D.N. et.al. Hepatitis С virus replication in mice with chimeric human livers. Nat. Med. 2001; 7: 927-933.

65. Mihm S., Fayyazi A., Hartmann H., Ramadori G. Analysis of histopathological manifestations of chronic hepatitis С virus infection with respect to virus genotype. Hepatology 1997 Mar; 25(3): 735-9

66. Miller A.D., Garcia J.V., von Suhr N., Lynch C.M., Wilson C., Eiden M.V. Construction and properties of retrovirus packaging cells based on gibbon ape leukemia virus. J.Virol. 1991 May; 65(5): 2220-4.

67. Mita E., Hayashi N., Kanazawa Y., Hagiwara H., Ueda K., Kasahara A., Fusamoto H., Kamada T. Hepatitis С virus genotype and RNA titer in the progression of type С chronic liver disease. J.Hepatol. 1994 Sep; 21(3):468-73.

68. Morgenstem J.P., Land H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res. 1990 Jun 25; 18(12): 3587-96.

69. Nagayama K., Kurosaki M., Enomoto N., Miyasaka Y., Marumo F., Sato C. Characteristics of hepatitis С viral genome associated with disease progression. Hepatology 2000 Mar; 31(3): 745-50.

70. Natarajan; Venkatachala, Germantown, Salzman M.D.; Norman P., Potomas M.D. 2000. US 1997000949333.

71. Nicoletti A., Sassy-Prigent C. An alternative quantitative polymerase chain reaction method. Anal.Biochem. 1996; 236(2): 229-241.

72. NIH Consensus Statement. Hepatology 2002; 36; 5; suppl.l.

73. Nubling C.M., Unger G., Chudy M., Raia S., Lower J. Sensitivity of core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion 2002; 42: 1037-1045.89.0kumura A., Yoshioka K., AiyamaT. et al. Different constitution of hepatitis

74. С virus population in peripheral blood mononuclear cells and plasma in patients with type С chronic liverdisease. Dig. Dis. Sci. 1998; 43(2): 377383.

75. Pasloske B.L., WalkerPeach C.R., Obermoeller R.D., Winkler M.W., DuBios D.B. Armored RNA technology for the production of ribonuclease resistant viral RNA controls and standards. J.Clin.Microbiol. 1998; 36(12): 35903594.

76. Pawlotsky J.M. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology 2002; 36(5; Suppl.l.

77. Pawlotsky J.-M., Bouvier-Alias M., Hezode C., Darthuy F., Remire J., Dhumeaux D. Standardization of hepatitis С virus RNA quantification. Hepatology 2000; 32: 654-659.

78. Piatak M.J., Saag M.S., Yang L.C., Clark S.J., Kappes J.C., Luk K.-C., Hahn B.H., Shaw G.M., and Lifson J.D. High levels of HIV-1 in plasma during all stages of infection determined by competitive PCR. Science 1993; 259: 1749-1754.

79. Prince A.M., Huima-Byron Т., Parker T.S., Levine D.M. Visualization ofhepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins. J.Viral.Hepat. 1996 Jan; 3(1): 11-7.

80. Radkowski M., Kubicka J., Kisiel E. et al. Detection of active hepatitis С vims and hepatitis G virus/GB virus С replication in bone marrow in human subjects. Blood 2000; 95(12): 3986-3989.

81. Sabin C.A., Telfer P., Phillips A.N., Bhagani S., Lee C.A. The association between hepatitis С virus genotype and human immunodeficiency virus disease progression in a cohort of hemophilic men. J.Infect.Dis. 1997 Jan; 175(1): 164-8.

82. Saldanha J., Lelie N., Heath A. Establishment of the first international standard for nucleic acid amplificationtechnology (NAT) assay for HCV RNA. WHO Collaborative Study Group. Vox Sang 1999; 76:149-58.

83. Shimizu Y.K., Weiner A.J., Rosenblatt J., Wong D.C., Shapiro M. et.al. Early events in hepatitis С virus infection of chimpanzees. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1990; 87: 6441-6444.

84. Shiratori Y., Imazeki F., Moriyama M., Yano M., Arakawa Y., Yokosuka O., Kuroki T. et al. Histologic improvement of fibrosis in patients with hepatitisC who have sustained response to interferon therapy. Ann.Intern.Med. 2000; 132: 517-524.

85. Takaki A., Wiese M., Maertens G., Depla E., Seifert U. et.al. Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades afterrecovery from a single-source outbreak of hepatitis C. Nat.Med. 2000; 6: 578-582.

86. Thimme R., Oldach D., Chang K.-M., Steiger C., Ray S.C., Chisari F.V. Determination of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection. J.Exp.Med. 2001; 194: 1395-1406.

87. Yuasa Т., Ishikawa G., Manabe S. et al. The particle size of hepatitis С virus estimated by fil-tration through microporous regenerated cellulose fibre. J.Gen.Virol. 1991 Aug; 72 ( Pt 8):2021-4.

88. Zeuzem S., Herrmann E., Lee J.H., Fricke J. et.al. Viral kinetics in patients with chronic hepatitis treated with standard and peginterferon alfa-2a. Hepatology 2001; 120: 1438-1447.

89. Zeuzem S., Lee J.H., Franke A. et.al. Quantification of the initial decline of serum hepatitis С virus RNA and response to interferon alfa. Hepatology 1998; 27: 1149-1156.

90. Zimmermann K., Mannhalter J.W. Technical aspects of quantitative competitive PCR. Bio.Tech. 1996; 21: 268-279.