Влияние высокоселективного ингибитора комплексов mTORС1/2 Торина-2 на транскриптомный профиль мозга D. melanogaster и N. guentheri тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Вершинина Юлия Сергеевна

• Вершинина Юлия Сергеевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Вершинина Юлия Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Патогенез стареющего организма

1.1.2. Основные причины возраст-ассоциированных заболеваний нервной системы

1.2. Комплексы mTORC1 и mTORC2

1.2.1. История открытия комплексов. Рапамицин

1.1.2. Основные отличия комплексов

Функциональные отличия

1.2.3. Ингибиторы обоих комплексов mTOR. Торин-2

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Лабораторные животные

2.2. Дизайн эксперимента по определению полулетальных концентраций Торина-2

2.2.1. Эмбриотоксичность, определение LC50 на эмбрионах D. ^гю

2.2.2. Определение LD50 на двухнедельных D. ^гю

2.3. Дизайн эксперимента по оценке генотоксического эффекта Торина-2

2.3.1. Оценка генотоксического эффекта Торина-2 методом комет

2.3.2. Оценка генотоксичности микроядерным тестом

2.4. Дизайн эксперимента по оценке влияния Торина-2 продолжительность жизни D. melanogaster

2.5. Дизайн эксперимента по оценке влияния Торина-2 на транскриптомный профиль мозга D. melanogaster

2.6. Дизайн эксперимента по оценке влияния Торина-2 на транскриптомный профиль мозга N. guentheri

2.7. Выделение РНК и подготовка транскриптомных библиотек

2.7.1. Выделение РНК из голов D. melanogaster

2.7.2. Выделение РНК из голов N. guentheri

2.7.4. Подготовка библиотек из образцов мозга N. guentheri и D. melanogaster

2.7.5. Валидирование библиотек и высокопроизводительное секвенирование

2.7.6. Биоинформатический анализ данных

2.8. Обратная транскрипция

2.9. Дизайн и синтез праймеров

2.10. ПЦР в режиме реального времени

2.11. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле

2.12. Вестерн-блот анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Результаты определения полулетальных концентраций Торина-2

3.1.1. LC50 Торина-2 на эмбрионах D. ^гю

3.1.2. LD50 на двухнедельных D. ^гю

3.2. Результаты оценки генотоксического эффекта Торина-2

3.2.1. Результаты оценки методом комет

3.2.2. Результаты оценки микроядерным тестом

3.3. Влияние Торина-2 на продолжительность жизни D. melanogaster

3.4. Оценка профилей дифференциальной экспрессии в мозге D. melanogaster

3.5. Оценка профилей дифференциальной экспрессии в мозге N. guentheri

3.6. Валидация экспрессии генов методом кПЦР

3.7. Вестерн-блот анализ

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Список литературы:

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние высокоселективного ингибитора комплексов mTORС1/2 Торина-2 на транскриптомный профиль мозга D. melanogaster и N. guentheri»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Несмотря на то, что старение является неотъемлемым и обязательным этапом любой жизни, человечество всегда стремилось преодолеть возрастные ограничения, увеличивая среднюю продолжительность жизни. В странах с высоким уровнем развития здравоохранения этого удаётся достигать наиболее успешно (максимальная ожидаемая продолжительности жизни была зафиксирована ОЭСР (Организация экономического сотрудничества и развития) в 2020 в Японии - 81,6/87,7; Южной Корее - 80,3/86,3; Норвегии - 81,6/84,9 у мужчин/женщин соответственно), в России при этом ожидаемая продолжительность жизни при рождении 68,2/78,2 (https://www.oecd.org/).

Нет никакого сомнения в том, что поиск основных геропротекторных механизмов по-прежнему актуален, и, соответственно, актуален поиск таргетных к этим механизмам препаратов [1].

Однако, при значительном увеличении ожидаемой продолжительности жизни также возрастает риск развития возраст-ассоциированных заболеваний, таких как онкология, нейродегенеративные патологии, сердечно-сосудистые заболевания [2]. Эти заболевания ложатся тяжким бременем на систему здравоохранения, отнимая значительную часть бюджета, а также причиняя значительные страдания людям.

Так называемый сигнальный путь mTOR, включающий в себя два комплекса (mTORC1 и mTORC2) и множество нисходящих путей, действует как интегратор молекулярных систем для поддержки организменных и клеточных взаимодействий с окружающей средой. Путь mTOR регулирует гомеостаз, напрямую влияя на синтез белка, транскрипцию, аутофагию, метаболизм, биогенез и поддержание органелл. Активность комплексов mTORС1/2 либо стимулирует рост, когда окружающая среда благоприятна, либо запускает катаболические процессы, такие

как аутофагия, которые разрушают клеточные компоненты для получения энергии и строительных блоков при неблагоприятных условиях либо во время сна [3].

Нарушение регуляции активации комплексов, включающих mTOR-мишень, тесно связано с широким спектром возраст-ассоциированных патологических состояний, зависящих от метаболизма, включая диабет, онкологию, нейродегенеративные заболевания, миопатии, воспалительные, инфекционные и аутоиммунные состояния [4].

В настоящее время существуют доказательства того, что снижение активности mTORC1, например, за счет ограничения калорийности [5] или приёма рапамицина и его аналогов (называемых рапалогами) с пищей, увеличивает продолжительность жизни большинства модельных организмов, включая S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster, M. musculus, а также нечеловеческих приматов [6, 7]. При этом геропротекторный эффект проявляется вне зависимости от возраста начала приёма вещества [8]. Кроме того, эффект этих вмешательств включает в себя сохранение объёма серого вещества головного мозга [5], усиление индукции формирования длительной памяти (LTP) в дендритных шипиках [3, 9, 10], снижение отложений A0 и тау в гиппокампе и общее улучшение способности к обучению и формированию памяти [10]. mTOR также участвует в синтезе синаптических белков de novo [11].

В последние годы также широко обсуждается влияние нарушений сигнализации пути mTOR в центральной нервной системе на возбудимость нейронов и эпилептогенез [12].

Однако рапамицин имеет метаболические и иммунологические побочные эффекты, такие как пневмонит, стоматит, плохое заживление ран, нефротоксичность и иммуносупрессия [13].

Аналоги рапамицина (называемые рапалогами), такие как темсиролимус и эверолимус, а также ингибиторы mTOR второго поколения, такие как Торин-1 и Торин-2, предположительно, обладают лучшей переносимостью за счёт значительно более низких эффективных доз (приблизительно в 400 раз), воздействуют на оба комплекса mTORC и перспективны в качестве препаратов для

лечения нейродегенеративных заболеваний, а также онкологии и других сопутствующих пожилому возрасту патологий.

Таким образом, изучение профиля экспрессии мозга под воздействием Торина-2 представляет значительный интерес.

Цели и задачи исследования

Цель работы - выявление основных изменений профилей экспрессии генов в мозге D. melanogaster и N. guentheri под воздействием высокоселективного ингибитора двух комплексов мишени рапамицина mTORC1/2 Торина-2 и оценка токсикологического потенциала Торина-2.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить эмбриотоксическое и тератогенное действие Торина-2 на рыб D. гепо, а также диапазон безопасных концентраций: определить наличие летальных и сублетальных признаков с указанием сроков их проявления;

2. Оценить генотоксичность Торина-2 на модели N. guentheri и D. гепо, исследуя его ДНК-повреждающую активность методом ДНК-комет и при помощи альтернативных стратегий: найти диапазон безопасных концентраций;

3. Определить влияние Торина-2 на продолжительность жизни D. melanogaster: провести пилотный эксперимент для выбора оптимальных параметров и затем полномасштабный опыт, сопровождающийся сбором биоматериала для молекулярно-биологических исследований;

4. Исследовать влияние Торина-2 (пожизненный приём в составе пищи) на экспрессию генов в тканях мозга D. melanogaster в трёх возрастных точках;

5. Идентифицировать изменения экспрессии генов в тканях мозга N. guentheri под воздействием двухнедельной диеты с Торином-2;

6. Выявить общие паттерны экспрессии генов под воздействием Торина-2 на моделях N. guentheri и D. melanogaster независимо от различий в условиях эксперимента.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В результате работы получены интересные, ранее не обсуждавшиеся результаты. Так, в большинстве предыдущих исследований ингибиторы mTOR рассматривались с двух точек зрения: в многочисленных доклинических и немногочисленных клинических исследованиях изучалось влияние ингибиторов mTOR на организм в целом, в том числе на продолжительность жизни, на иммунную функцию, влияние на протекание тех или иных болезней (в частности, особенно широко - на различные виды онкологии). С другой стороны, нижестоящие субстраты mTORC1/2 изучались фосфопротеомным методом, в подавляющем большинстве случаев на клеточных линиях млекопитающих. Этот метод имеет ограничения, обусловленные тем, что в организме множество популяций клеток взаимно влияют друг на друга, системы иммунитета организма оказывают значительный эффект на метаболизм привнесённых веществ. Кроме того, при изучении результатов воздействия вещества на нервную систему необходимо учитывать наличие ГЭБ, что невозможно сделать при исследовании изолированной и иммортализированной клеточной линии.

В настоящем исследовании проведён широкий анализ действия высокоселективного АТФ-конкурентного ингибитора mTORС1/2 Торина-2 на профиль экспрессии генов методом высокопроизводительного секвенирования, тем самым получено представление о влиянии Торина-2 на головной мозг живого модельного объекта в трёх возрастных категориях, сделано предположение о нижестоящих субстратах mTOR, выявление которых было невозможно в клеточных линиях, а также оценена возможность влияния Торина-2 на нейродегенеративные заболевания, что особенно важно в свете прогрессирующего

увеличения продолжительности жизни населения и сопутствующих этому нейрональных дисфункциях.

В рамках данной работы также проводились токсикологические исследования с целью выбора оптимальных нетоксичных доз Торина-2. Полученные данные об эффективности препарата, в сочетании с оценкой его безопасности (эксперименты по исследованию острой токсичности, эмбрио- и генотоксичности), позволяют сделать предположение о потенциале применимости, а также о целесообразности продолжения исследований в этом направлении. Помимо этого, такие данные могут быть использованы в дальнейшем при планировании других токсикологических исследований Торина-2 (например, при использовании моделей in vivo и in vitro) или молекул, близких по структуре и свойствам. В рамках этих задач были определены концентрации эмбриотоксического и тератогенного эффекта на эмбрионах D. rerio, LC50 на двухнедельных D. rerio, подтверждено отсутствие генотоксического эффекта в тканях печени и мозга взрослых N. guentheri.

В данной работе впервые проведён сравнительный анализ профилей экспрессии в мозге двух модельных объектов под воздействием ингибитора высококонсервативных протеинкиназ mTORCl и mTORC2 Торина-2.

Впервые проведена оценка геропротекторного эффекта Торина-2 на модельном объекте D. melanogaster.

Таким образом, наши результаты представляют собой значительный интерес в свете изучения связи процессов, происходящих в головном мозге.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показано, что Торин-2 относится к классу высокотоксичных веществ в экспериментах на острую токсичность на эмбрионах D. rerio и двухнедельных D. rerio;

2. Показано, что Торин-2 не является генотоксичным веществом;

3. Установлено, что Торин-2 на модели D. melanogaster оказывает незначительный геропротекторный эффект на самцов и не оказывает геропротекторного эффекта на самок;

4. Обнаружено, что приём Торина-2 оказывает значительное влияние на поло-специфичные аспекты активации иммунной системы и организации хроматина на уровне транскрипционной активности;

5. Показано, что приём Торина-2 снижает в головном мозге количество мРНК, принимающих участие в активности NMDA-рецептора;

6. Показано, Торин-2 индуцирует активность фосфорилирования компонентов МАРК-пути в старшем и молодом возрасте.

Личный вклад соискателя

Основные результаты работы получены автором лично или при его непосредственном участии.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Научные положения, выводы и практические рекомендации, приведённые в работе, основаны на фактических результатах, которые отражены в публикациях в рецензируемых научных изданиях. Достоверность полученных результатов подтверждена комплексным использованием различных современных методов исследований и анализа, а также многократными независимо поставленными экспериментами и биологическими повторами, статистической обработкой экспериментальных данных и их сопоставлением с литературными источниками.

Работа выполнена в соответствии с общепринятыми этическими и научными принципами. Выводы и положения, выносимые на защиту, обоснованы

фактическим материалом, полученным в результате проведения экспериментов, анализа и интерпретации данных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных журналах, индексируемых Web of Science

Статьи в рецензируемых научных журналах:

1) Vershinina YS, Krasnov GS, Garbuz DG, Shaposhnikov MV, Fedorova MS, Pudova EA, Katunina IV, Kornev AB, Zemskaya NV, Kudryavtsev AA, Bulavkina EV, Matveeva AA, Ulyasheva NS, Guvatova ZG, Anurov AA, Moskalev AA, Kudryavtseva AV. Transcriptomic Analysis of the Effect of Torin-2 on the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. Int J Mol Sci. 2023 May 22;24(10):9095. doi: 10.3390/ijms24109095. PMID: 37240439.

2) Guvatova ZG, Fedorova MS, Vershinina YS, Pudova EA, Lipatova AV, Volodin VV, Gladysh NS, Tokarev AT, Kornev AB, Pavlov VS, Bakhtogarimov IR, Krysanov EY, Moskalev AA, Krasnov GS, Kudryavtseva AV. De Novo Transcriptome Profiling of Brain Tissue from the Annual Killifish Nothobranchius guentheri. Life (Basel). 2021 Feb 11;11(2):137. doi: 10.3390/life11020137

Работа представлена на международной конференции:

Vershinina YS; Krasnov GS, Guvatova ZG, Kudryavtseva AV. (2022). Change specifically responses to mTORC1/2 inhibition based on brain of N.guentheri. EpLS -European Proceedings of Life Sciences DOI: 10.15405/epls.22011.1

Объём и структура диссертации.

Работа изложена на 119 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов, содержит 31 рисунок и 10 таблиц. Библиографический указатель включает 206 источников отечественной и зарубежной литературы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Патогенез стареющего организма

Старение - естественный этап жизни, характеризующийся прогрессирующим ухудшением различных физиологических функций. В значительной степени это обусловлено нарушениями на уровне клеток, в том числе - изменениями профилей экспрессии генов. При этом у человека может не быть явных заболеваний [14]. Эти прогрессирующие ухудшения также влияют на ЦНС [15, 16], в которой оказывают влияние на поведение, вызывают нарушения когнитивных способностей, обучения и памяти [17]. Старение также связано с изменениями в иммунной системе [18]. С одной стороны, это явление сопровождается иммунным дефицитом, изменениями в составе популяций Т-клеток (у млекопитающих) и снижением способности элиминировать патогены, а с другой стороны - индукцией хронического воспаления различных тканях, в т. ч. нервной. Природа последнего явления может быть связана с накоплением мутантных форм белков в самих клетках ткани, общими изменениями экспрессии генов, связанных с иммунным ответом и воспалением [19, 20]. В свою очередь, это может способствовать возникновению и прогрессированию нейродегенеративных заболеваний [21, 22].

Показатели продолжительности жизни, хотя и являются ценным критерием в исследованиях на различных модельных объектах, не полностью отражают влияние тех или иных вмешательств на процессы старения. Старение - сложный процесс, затрагивающий многие физиологические системы, не все одновременно и с разной скоростью [23].

При этом больше всего жизней с увеличением возраста уносят сердечнососудистые заболевания, за ними следуют онкология, хронические респираторные заболевания, заболевания органов пищеварения, деменции (включая болезнь Альцгеймера), сахарный диабет, хронические заболевания печени, хронические заболевания почек и, наконец, болезнь Паркинсона [24].

За долгие годы исследований накопилось большое количество данных о способах продления жизни у различных модельных организмов, от бактерий до приматов, выявлено несколько тысяч генов, ассоциированных со старением, а также охарактеризованы и всесторонне проверены основные способы увеличения продолжительности жизни. Это генетические манипуляции [25, 26], режимы освещения [27], снижение температуры тела [28], диетические модуляции [29, 30] и фармакологические средства, направленные на возрастные молекулярные и клеточные процессы (антивозрастные препараты или геропротекторы) [24].

Почти все эти вмешательства напрямую связаны с путями, проходящими через комплексы шТОЯСШ [31].

Стоит особо отметить, что средняя ожидаемая продолжительность жизни имеет чёткую гендерную зависимость. Если у большинства видов в естественных условиях самки имеют более высокую продолжительность жизни, то иная ситуация обстоит с влиянием терапевтических препаратов [32].

Так, международная Программа тестирования вмешательств (1ТР)), проводящая перекрёстное контролируемое исследование всех существующих геропротекторов, выявила по состоянию на 2023 год всего восемь фармакологических препаратов, влияние которых на продолжительность жизни мышей было подтверждено (https://www.nia.nih.gov/research/dab/interventions-testing-program-itp/about-itp). При этом в большинстве случаев этот эффект проявлялся у самцов, и только два из восьми препаратов оказали влияние на продолжительность жизни самок, это рапамицин и каптоприл (рис. 1). Многократно подтверждено при этом, что рапамицин оказывает геропротекторный эффект вне зависимости от возраста, когда был начат его приём [6].

Таблица 1 - Основные геропротекторы, проверенные Программой тестирования вмешательств на мышах (https://www.nia.nih.gov/research/dab/interventions-testing-program-itp/compounds-testing).

Вещество год концентрация в пище Возраст на момент начала лечения пол

aspirin (Asp) 2004 20 ppm 4 mo Male

nordihydroguaiaretic acid (NDGA) 2004 2500 ppm 9 mo Male

rapamycin (Rapa) 2005 14 ppm 20 mo Male & Female

rapamycin (Rapa) 2006 14 ppm 9 mo Male & Female

17-a-estradiol (17aE2) 2009 4.8 ppm 10 mo Male

acarbose (ACA) 2009 1000 ppm 4 mo Male

rapamycin (Rapa) -Stage II 2009 4.7 ppm 9 mo Male & Female

rapamycin (Rapa) -Stage II 2009 14 ppm 9 mo Male & Female

rapamycin (Rapa) -Stage II 2009 42 ppm 9 mo Male & Female

nordihydroguaiaretic acid (NDGA) - Male only, Stage II 2010 800 ppm 6 mo Male

nordihydroguaiaretic acid (NDGA) - Male only, Stage II 2010 2500 ppm 6 mo Male

nordihydroguaiaretic acid (NDGA) -Stage II 2010 5000 ppm 6 mo Male

17-a-estradiol (17aE2) 2011 14 ppm 10 mo Male

metformin and rapamycin (MetRapa) 2011 Met:1000 ppm and Rapa:14 ppm 9 mo Male & Female

Protandim (Prot) 2011 600 ppm then 1200 ppm 10 mo then 17 mo Male

acarbose (ACA) 2012 1000 ppm 16 mo Male

nordihydroguaiaretic acid (NDGA) - Male only, Cross-Section 2012 2500 ppm 13 mo Male

acarbose (ACA) -Stage II 2013 400 ppm 8 mo Male

acarbose (ACA) -Stage II 2013 1000 ppm 8 mo Male

acarbose (ACA) -Stage II 2013 2500 ppm 8 mo Male

rapamycin (Rapa) -Stage II 2015 42 ppm 20 mo (stop at 23) Male

rapamycin (Rapa) -Stage II 2015 42 ppm 20 mo Male & Female

canagliflozin (Cana) 2016 180 ppm 7 mo Male

Captopril (Capt) 2017 180 ppm 5 mo Female

Rapamycin + Acarbose (RaAc) -Stage II 2017 Ra: 14.7 ppm and Ac: 1000 ppm 9 mo or 16 mo Male & Female

Таким образом, рапамицин в настоящий момент является первым и наиболее хорошо изученным веществом, продлевающим жизнь у самцов и самок различных модельных организмов.

1.1.2. Основные причины возраст-ассоциированных заболеваний нервной

системы

Нейродегенеративные заболевания — большая группа неврологических расстройств (в основном болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, лобно-височная деменция и боковой амиотрофический склероз и др. ), связанных в том числе с постепенным уменьшением количества нервных клеток из-за специфических изменений их метаболизма. Основными метаболическими патологиями, вовлечёнными в хронические болезненные состояния центральной нервной системы (ЦНС), являются окислительный стресс, воспаление, митохондриальная / энергетическая недостаточность и резистентность к инсулину [33-35].

Изменения метаболической функции в головном мозге приводят к нарушениям в трансмембранном транспорте ионов, синаптической и глутаматергической передачи [36-38], нормального функционирования астроцитов и олигодендроцитов [38-42], формирования долговременной памяти (LTR), а также к нарушениям аутофагии, важного процесса в функционировании клетки [38].

Для большинства нейродегенеративных расстройств также характерен общий патогенетический механизм, заключающийся в накоплении неправильно свёрнутых белков, которые откладываются в виде внутриклеточных или внеклеточных агрегатов и вызывают гибель клеток [39].

Ранее было показано, что энергетический метаболизм в мозге происходит посредством взаимосвязи двух типов клеток - глиальных и нейрональных [40]. Наиболее высокие показатели потребления глюкозы были зафиксированы у глиальных клеток, в то время как в нейрональных клетках у большинства живых организмов зафиксирован один из наиболее высоких уровней потребления энергии. Таким образом, глиальные клетки являются поставщиками энергии для нейрональных клеток [41]. Помимо глюкозы, мозг может получать энергию от лактата и кетоновых тел [42].

Основными регуляторными звеньями метаболизма как в глиальных, так и в нейрональных клетках при этом являются комплексы mTORC1/2 и PI3K/AKT, тесно связанные между собой. Как датчик питательных веществ, mTORC1/2 выполняет важные гомеостатические функции в регулировании энергетического обмена и поддержке роста и пластичности нейронов [43]. Например, при болезни Альцгеймера передача сигналов через mTORC1/2 играет важную роль в патогенезе, ингибируя как передачу сигналов инсулина, так и стимулируя аутофагическое удаление агрегатов в-амилоида (Ав) [44]. Ингибирование Р13К и mTORC1/2, как было показано, также влияет на формирование долговременной памяти [36].

Иммунитет и воспаление

Большое значение в развитии патогенеза нейродегенеративных заболеваний имеет воспаление.

В целом, хроническое воспаление является общей чертой всех возрастных патологий. Источником такого воспаления может быть секреторный фенотип (SASP) стареющих клеток, посредством которого высвобождаются провоспалительные медиаторы. SASP частично регулируется mTORC1/2, возможно, через петли обратной связи трансляции IL1A или передачи сигналов MAPK [45]. В некоторых предыдущих исследованиях было показано, что ингибирование mTORC1/2 и MAP-киназы может способствовать подавлению этого воспаления [46].

В свою очередь, митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK) p38 реагируют на несколько стрессовых стимулов, таких как ультрафиолетовое облучение, тепловой шок и воздействие цитокинов. Они участвуют в процессах клеточной дифференцировки, аутофагии и апоптоза [47].

Также ранее было показано, что mTORC2 имеет обратную корреляцию с уровнем фосфорилирования p38 MAPK [48].

Состарившаяся или "стареющая" микроглия проявляет обострённую реакцию на незначительные повреждения или слабые раздражители с потенциально повреждающим ответом [49]. В отличие от «молодой», у «старой» микроглии наблюдается повышенная продукция активных форм кислорода (АФК) и воспалительных цитокинов со снижением продукции оксида азота (NO) [50].

Возможно, эта двойная роль некоторых цитокинов также способствует, по крайней мере частично, балансу метаболизма и иммунной активности [51].

Циркадныеритмы и влияние их нарушений на организм

Широко известно, что гены, ответственные за циркадные ритмы, играют значительную роль в развитии нейродегенеративных расстройств и деменции. Кроме того, они влияют на метаболические заболевания и повреждение клеток,

регуляцию клеточного цикла, развитие онкологических заболеваний, энергетический метаболизм, вирусные заболевания и др. [52].

Ранее в исследовании Чжан с коллегами полногеномный RNAi-скрининг выявил сотни генов, которые регулируют циркадные ритмы [51]. Было показано, что наиболее сильно обогащённым путём был путь передачи сигналов инсулина (IIS). Также было показано, что ингибирование многочисленных субстратов IIS, таких как PI3K и mTORC1/2, значительно меняет циркадные ритмы [53].

При этом несколько регуляторов транскрипции образуют отрицательные и положительные петли обратной связи, взаимодействуют с клеточным механизмом транскрипции / трансляции, регулируя ритмичную экспрессию генов [54].

Ввиду того, что mTORC1/2 является основным интегратором внутриклеточных сигналов, который связывает энергетический статус (например, уровни кислорода и АТФ) и питательные вещества (например, уровни лейцина и аргинина) для регулирования роста и метаболизма клеток, он служит связующим звеном между метаболическими состояниями клеток и циркадной синхронизацией [55].

Дисфункция циркадных ритмов во время повреждения нейронов и когнитивной потери также тесно связана с путями индукции аутофагии.

Аутофагия

Аутофагия — это эволюционно сохраняемый, зависящий от лизосом катаболический процесс, при котором цитоплазматические компоненты, включая повреждённые органеллы, белковые агрегаты и липидные капли, разлагаются, а их компоненты перерабатываются, что имеет большое значение при когнитивных нарушениях и болезни Альцгеймера, боковом амиотрофическом склерозе, болезни Хантингтона (HD), черепно-мозговых травмах и болезни Паркинсона [56].

Регуляция аутофагии опосредуется сигналами окружающей среды, такими как уровни питательных веществ и внешние стрессоры, гипоксия или высокая температура, через сложную сеть белков и сигнальных путей (обзор в

[57]). Условия, в которых недостаточно питательных веществ, приводят к высокому соотношению АМФ / АТФ, индуцируют аутофагию путем активации АМРК [63, 64]. И, наоборот, обнаружение повышенного содержания аминокислот с помощью шТОЯС1 [48, 65], чувствительного к питательным веществам комплекса, содержащего шТОЯ на лизосомальной мембране, активно способствует пролиферации клеток, производству биомассы и подавляет аутофагию. Эти результаты предполагают более систематическую интеграцию метаболизма с помощью шТОЯ, которая уравновешивается определением энергетического состояния клетки с помощью АМРК, чтобы должным образом управлять процессом аутофагии и удовлетворять гомеостатические потребности.

Таким образом, аутофагия играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза в ответ на внутриклеточный стресс, однако эффективность аутофагии снижается с возрастом, а избыточное питание может нарушать аутофагический процесс [61].

Ранее было показано, что ингибиторы шТОЯС1/2 вызывают потерю глюкозы с мочой, но при этом активируют гликогенолиз и глюконеогенез и, таким образом, увеличивают выработку эндогенной глюкозы во время голода, чаще всего это происходит ночью. Этот эффект также способствует переключению метаболизма с анаболического на катаболический, зависящий не от глюкозы и инсулина, а от окисления жирных кислот, и приводит к уменьшению топлива шТОЯС1: содержащегося в крови инсулина и аминокислот. Ночное подавление шТОЯС1/2 сопровождается ежедневной активацией, и это состояние позволяет поддерживать митохондриальный и лизосомальный гомеостаз [62].

Таким образом, шТОЯ - одна из наиболее перспективных мишеней в клетке для различных манипуляций, однако для преодоления недостатков воздействия на неё рапамицина существует необходимость в тщательном изучении субстратов комплексов шТОЯ (шТОЯС1 и шТОЯС2).

1.2. Комплексы mTORC1 и mTORC2 1.2.1. История открытия комплексов. Рапамицин

В 1964 году командой исследовательской лаборатории Ayerst [63] был идентифицирован макролид (макроциклический лактон) рапамицин - токсин, выделяемый почвенной бактерией Streptomyces hygroscopicus.

В самом начале исследований рапамицин привлёк внимание научного сообщества своими фунгицидными свойствами, но вскоре было обнаружено, что, кроме противогрибкового эффекта, рапамицин способен подавлять рост клеток эукариот. Изучение этого механизма заняло несколько лет, и, наконец, в 1994 году, препарат был одобрен FDA в качестве агента, способствующего улучшению приживаемости при трансплантации и стентировании.

В 1991 году в журнале Science вышла статья Хейтмана и др. об обнаружении у дрожжей в качестве мишени рапамицина комплекса, в котором субъединица FKBP связывается с рапамицином [64]. Эта мишень была названа соответственно TOR (мишень рапамицина - target of rapamycin). Также в этой статье впервые было высказано предположение и подтверждено, что комплекс, в который входит эта мишень, может опосредовать поступление в ядро сигналов, необходимых для прохождения через клеточный цикл. В 1994 году три независимые группы исследователей подтвердили наличие данной мишени у млекопитающих [70, 71]. Таким образом, мишень mTOR привлекла к себе ещё более пристальное внимание.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Вершинина Юлия Сергеевна, 2023 год

Список литературы:

1. Moskalev A. et al. Targeting aging mechanisms: pharmacological perspectives. // Trends Endocrinol. Metab. TEM. 2022. Vol. 33, № 4. P. 266-280.

2. Abdelkader H. et al. Glycation-induced age-related illnesses, antiglycation and drug delivery strategies. // J. Pharm. Pharmacol. 2022. Vol. 74, № 11. P. 1546-1567.

3. Szwed A., Kim E., Jacinto E. Regulation and metabolic functions of mTORCl and mTORC2. // Physiol. Rev. 2021. Vol. 101, № 3. P. 1371-1426.

4. Betancur C., Sakurai T., Buxbaum J.D. The emerging role of synaptic cell-adhesion pathways in the pathogenesis of autism spectrum disorders // Trends Neurosci. 2009. Vol. 32, № 7. P. 402-412.

5. Blagosklonny M.V. Calorie restriction: Decelerating mTOR-driven aging from cells to organisms (including humans) // Cell Cycle. 2010. Vol. 9, № 4. P. 683-688.

6. Harrison D.E. et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. // Nature. 2009. Vol. 460, № 7253. P. 392-395.

7. Lamming D.W. et al. Rapalogs and mTOR inhibitors as anti-aging therapeutics // J. Clin. Invest. 2013. Vol. 123, № 3. P. 980-989.

8. Zhang Y. et al. Rapamycin Extends Life and Health in C57BL/6 Mice // J. Gerontol. Ser. A. 2014. Vol. 69A, № 2. P. 119-130.

9. Crino P.B. Mechanistic target of rapamycin (mTOR) signaling in status epilepticus. // Epilepsy Behav. EB. 2019. Vol. 101, № Pt B. P. 106550.

10. Sun Q. et al. Rapamycin inhibits activation of AMPK-mTOR signaling pathway-induced Alzheimer's disease lesion in hippocampus of rats with type 2 diabetes mellitus // Int. J. Neurosci. 2019. Vol. 129, № 2. P. 184-193.

11. Sutton M.A., Schuman E.M. Dendritic Protein Synthesis, Synaptic Plasticity, and Memory // Cell. 2006. Vol. 127, № 1. P. 49-58.

12. Nakamura K., Toshima T., Takemura I. The comparative and developmental study of auditory information processing in autistic adults. // J. Autism Dev. Disord. 1986. Vol. 16, № 2. P. 105-118.

13. Li J., Kim S.G., Blenis J. Rapamycin: One Drug, Many Effects // Cell Metab. 2014. Vol. 19, № 3. P. 373-379.

14. Young A. Ageing and physiological functions // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1997. Vol. 352, № 1363. P. 1837-1843.

15. Smith R.G., Betancourt L., Sun Y. Molecular Endocrinology and Physiology of the Aging Central Nervous System // Endocr. Rev. 2005. Vol. 26, № 2. P. 203-250.

16. Yung R.L., Julius A. Epigenetics, aging, and autoimmunity // Autoimmunity. 2008. Vol. 41, № 4. P. 329-335.

17. Lipsitz L.A. Loss of "Complexity" and Aging: Potential Applications of Fractals and Chaos Theory to Senescence // JAMA. 1992. Vol. 267, № 13. P. 1806.

18. Larbi A. et al. Aging of the Immune System as a Prognostic Factor for Human Longevity // Physiology. 2008. Vol. 23, № 2. P. 64-74.

19. Lee C.-K., Weindruch R., Prolla T.A. Gene-expression profile of the ageing brain in mice // Nat. Genet. 2000. Vol. 25, № 3. P. 294-297.

20. de Magalhaes J.P., Curado J., Church G.M. Meta-analysis of age-related gene expression profiles identifies common signatures of aging // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, № 7. P. 875-881.

21. Block M.L., Zecca L., Hong J.-S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms // Nat. Rev. Neurosci. 2007. Vol. 8, № 1. P. 57-69.

22. Gao H.-M., Hong J.-S. Why neurodegenerative diseases are progressive: uncontrolled inflammation drives disease progression // Trends Immunol. 2008. Vol. 29, № 8. P. 357-365.

23. Schaum N. et al. Ageing hallmarks exhibit organ-specific temporal signatures. // Nature. 2020. Vol. 583, № 7817. P. 596-602.

24. Li Z. et al. Aging and age-related diseases: from mechanisms to therapeutic strategies. // Biogerontology. 2021. Vol. 22, № 2. P. 165-187.

25. Piper M.D.W. et al. Separating cause from effect: how does insulin/IGF signalling control lifespan in worms, flies and mice? // J. Intern. Med. 2008. Vol. 263, № 2. P. 179-191.

26. Ladiges W. et al. Lifespan extension in genetically modified mice. // Aging Cell. 2009. Vol. 8, № 4. P. 346-352.

27. Nash T.R. et al. Daily blue-light exposure shortens lifespan and causes brain neurodegeneration in Drosophila. // NPJ Aging Mech. Dis. 2019. Vol. 5. P. 8.

28. Conti B. Considerations on temperature, longevity and aging. // Cell. Mol. Life Sci. CMLS. 2008. Vol. 65, № 11. P. 1626-1630.

29. Hwangbo D.-S. et al. Mechanisms of Lifespan Regulation by Calorie Restriction and Intermittent Fasting in Model Organisms. // Nutrients. 2020. Vol. 12, № 4.

30. Bishop N.A., Guarente L. Genetic links between diet and lifespan: shared mechanisms from yeast to humans. // Nat. Rev. Genet. 2007. Vol. 8, № 11. P. 835-844.

31. Liu G.Y., Sabatini D.M. mTOR at the nexus of nutrition, growth, ageing and disease // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2020. Vol. 21, № 4. P. 183-203.

32. Putin E. et al. Deep biomarkers of human aging: Application of deep neural networks to biomarker development. // Aging. 2016. Vol. 8, № 5. P. 1021-1033.

33. De Felice F.G., Ferreira S.T. Inflammation, Defective Insulin Signaling, and Mitochondrial Dysfunction as Common Molecular Denominators Connecting Type 2 Diabetes to Alzheimer Disease // Diabetes. 2014. Vol. 63, № 7. P. 2262-2272.

34. Butterfield D.A., Di Domenico F., Barone E. Elevated risk of type 2 diabetes for development of Alzheimer disease: A key role for oxidative stress in brain // Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Basis Dis. 2014. Vol. 1842, № 9. P. 1693-1706.

35. Ashrafi G. et al. GLUT4 Mobilization Supports Energetic Demands of Active Synapses. // Neuron. 2017. Vol. 93, № 3. P. 606-615.e3.

36. Kann O. The interneuron energy hypothesis: Implications for brain disease. // Neurobiol. Dis. 2016. Vol. 90. P. 75-85.

37. Yu L. et al. Efficient Coding and Energy Efficiency Are Promoted by Balanced Excitatory and Inhibitory Synaptic Currents in Neuronal Network. // Front. Cell. Neurosci. 2018. Vol. 12. P. 123.

38. Boland B. et al. Promoting the clearance of neurotoxic proteins in neurodegenerative disorders of ageing. // Nat. Rev. Drug Discov. 2018. Vol. 17, № 9. P. 660-688.

39. Oliveira L.T. et al. Exogenous ß-amyloid peptide interferes with GLUT4 localization in neurons. // Brain Res. 2015. Vol. 1615. P. 42-50.

40. Mayorga-Weber G., Rivera F.J., Castro M.A. Neuron-glia (mis)interactions in brain energy metabolism during aging. // J. Neurosci. Res. 2022. Vol. 100, № 3. P. 835-854.

41. Aldana B.I. Microglia-Specific Metabolic Changes in Neurodegeneration. // J. Mol. Biol. 2019. Vol. 431, № 9. P. 1830-1842.

42. Cunnane S.C. et al. Can Ketones Help Rescue Brain Fuel Supply in Later Life? Implications for Cognitive Health during Aging and the Treatment of Alzheimer's Disease. // Front. Mol. Neurosci. 2016. Vol. 9. P. 53.

43. Saxton R.A., Sabatini D.M. mTOR Signaling in Growth, Metabolism, and Disease // Cell. Cell Press, 2017. Vol. 168, № 6. P. 960-976.

44. Vingtdeux V. et al. Novel synthetic small-molecule activators of AMPK as enhancers of autophagy and amyloid-ß peptide degradation // FASEB J. 2011. Vol. 25, № 1. P. 219-231.

45. Laberge R.-M. et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. // Nat. Cell Biol. 2015. Vol. 17, № 8. P. 1049-1061.

46. Alimbetov D. et al. Suppression of the senescence-associated secretory phenotype (SASP) in human fibroblasts using small molecule inhibitors of p38 MAP kinase and MK2 // Biogerontology. 2016. Vol. 17, № 2. P. 305-315.

47. Benavides-Serrato A. et al. mTORC2 modulates feedback regulation of p38 MAPK activity via DUSP10/MKP5 to confer differential responses to PP242 in glioblastoma. // Genes Cancer. 2014. Vol. 5, № 11-12. P. 393-406.

48. Marchetti S. et al. Extracellular signal-regulated kinases phosphorylate mitogen-activated protein kinase phosphatase 3/DUSP6 at serines 159 and 197, two sites critical for its proteasomal degradation. // Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25, № 2. P. 854-864.

49. Tang Y., Le W. Differential Roles of M1 and M2 Microglia in Neurodegenerative Diseases // Mol. Neurobiol. 2016. Vol. 53, № 2. P. 1181-1194.

50. Gomes-Leal W. Microglial physiopathology: how to explain the dual role of microglia after acute neural disorders? // Brain Behav. 2012. Vol. 2, № 3. P. 345-356.

51. Feder D. et al. Immune responses in Rhodnius prolixus: influence of nutrition and ecdysone // J. Insect Physiol. 1997. Vol. 43, № 6. P. 513-519.

52. Kim B.H. et al. Effects of Intermittent Fasting on the Circulating Levels and Circadian Rhythms of Hormones. // Endocrinol. Metab. Seoul Korea. 2021. Vol. 36, № 4. P. 745756.

53. Ramanathan C. et al. mTOR signaling regulates central and peripheral circadian clock function // PLOS Genet. 2018. Vol. 14, № 5. P. e1007369.

54. Aguilar-Arnal L., Sassone-Corsi P. Chromatin landscape and circadian dynamics: Spatial and temporal organization of clock transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. 2015. Vol. 112, № 22. P. 6863-6870.

55. Dadon-Freiberg M., Chapnik N., Froy O. REV-ERBa alters circadian rhythms by modulating mTOR signaling. // Mol. Cell. Endocrinol. 2021. Vol. 521. P. 111108.

56. Wong S.Q. et al. Autophagy in aging and longevity. // Hum. Genet. 2020. Vol. 139, № 3. P. 277-290.

57. Lahiri V., Hawkins W.D., Klionsky D.J. Watch What You (Self-) Eat: Autophagic Mechanisms that Modulate Metabolism. // Cell Metab. 2019. Vol. 29, № 4. P. 803826.

58. Bujak A.L. et al. AMPK activation of muscle autophagy prevents fasting-induced hypoglycemia and myopathy during aging. // Cell Metab. 2015. Vol. 21, № 6. P. 883890.

59. Wang F., Jia J., Rodrigues B. Autophagy, Metabolic Disease, and Pathogenesis of Heart Dysfunction. // Can. J. Cardiol. 2017. Vol. 33, № 7. P. 850-859.

60. Perera R.M., Zoncu R. The Lysosome as a Regulatory Hub. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2016. Vol. 32. P. 223-253.

61. Kitada M., Koya D. Autophagy in metabolic disease and ageing. // Nat. Rev. Endocrinol. 2021. Vol. 17, № 11. P. 647-661.

62. Guerrero-Morín J.G., Santillán M. Crosstalk dynamics between the circadian clock and the mTORC1 pathway. // J. Theor. Biol. 2020. Vol. 501. P. 110360.

63. Vézina C., Kudelski A., Sehgal S.N. Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle. // J. Antibiot. (Tokyo). 1975. Vol. 28, № 10. P. 721-726.

64. Heitman J., Movva N.R., Hall M.N. Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast. // Science. 1991. Vol. 253, № 5022. P. 905909.

65. Brown E.J. et al. A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex // Nature. 1994. Vol. 369, № 6483. P. 756-758.

66. Chiu M.I., Katz H., Berlin V. RAPT1, a mammalian homolog of yeast Tor, interacts with the FKBP12/rapamycin complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91, № 26. P.12574-12578.

67. Abraham R.T., Wiederrecht G.J. Immunopharmacology of rapamycin. // Annu. Rev. Immunol. 1996. Vol. 14. P. 483-510.

68. Kunz J. et al. Target of rapamycin in yeast, TOR2, is an essential phosphatidylinositol kinase homolog required for G1 progression. // Cell. 1993. Vol. 73, № 3. P. 585-596.

69. Mather M.L., Jeffries M.A., Wood T.L. The mechanistic target of rapamycin as a regulator of metabolic function in oligodendroglia during remyelination. // Curr. Opin. Pharmacol. 2022. Vol. 63. P. 102193.

70. Chia L.Y. et al. Adrenoceptor regulation of the mechanistic target of rapamycin in muscle and adipose tissue. // Br. J. Pharmacol. 2019. Vol. 176, № 14. P. 2433-2448.

71. Magnuson B., Ekim B., Fingar D.C. Regulation and function of ribosomal protein S6 kinase (S6K) within mTOR signalling networks. // Biochem. J. 2012. Vol. 441, № 1. P. 1-21.

72. Dominguez J. et al. CONVERSION TO RAPAMYCIN IMMUNOSUPPRESSION IN RENAL TRANSPLANT RECIPIENTS: REPORT OF AN INITIAL EXPERIENCE1 // Transplantation. 2000. Vol. 70, № 8. P. 1244-1247.

73. Yousefzadeh M.J. et al. An aged immune system drives senescence and ageing of solid organs. // Nature. 2021. Vol. 594, № 7861. P. 100-105.

74. Yu Y. et al. Phosphoproteomic analysis identifies Grb10 as an mTORC1 substrate that negatively regulates insulin signaling. // Science. 2011. Vol. 332, № 6035. P. 1322-1326.

75. Jacinto E. et al. Mammalian TOR complex 2 controls the actin cytoskeleton and is rapamycin insensitive. // Nat. Cell Biol. 2004. Vol. 6, № 11. P. 1122-1128.

76. Loewith R. et al. Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control. // Mol. Cell. 2002. Vol. 10, № 3. P. 457-468.

77. Sarbassov D.D. et al. Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB. // Mol. Cell. 2006. Vol. 22, № 2. P. 159-168.

78. Yang H. et al. mTOR kinase structure, mechanism and regulation. // Nature. 2013. Vol. 497, № 7448. P. 217-223.

79. Hay N., Sonenberg N. Upstream and downstream of mTOR. // Genes Dev. 2004. Vol. 18, № 16. P. 1926-1945.

80. Chen J., Long F. mTOR signaling in skeletal development and disease // Bone Res. 2018. Vol. 6, № 1. P. 1.

81. Battaglioni S. et al. mTOR substrate phosphorylation in growth control. // Cell. 2022. Vol. 185, № 11. P. 1814-1836.

82. Jhanwar-Uniyal M. et al. Discrete signaling mechanisms of mTORC1 and mTORC2: Connected yet apart in cellular and molecular aspects. // Adv. Biol. Regul. 2017. Vol. 64. P. 39-48.

83. Bjedov I., Rallis C. The Target of Rapamycin Signalling Pathway in Ageing and Lifespan Regulation. // Genes. 2020. Vol. 11, № 9.

84. Ballesteros-Alvarez J., Andersen J.K. mTORC2: The other mTOR in autophagy regulation // Aging Cell. 2021. Vol. 20, № 8.

85. Chen J. et al. Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. Vol. 92, № 11. P. 4947-4951.

86. Lipton J.O., Sahin M. The neurology of mTOR. // Neuron. 2014. Vol. 84, № 2. P. 275-291.

87. Chatterjee A. et al. Rapamycin-induced G1 cell cycle arrest employs both TGF-ß and Rb pathways. // Cancer Lett. 2015. Vol. 360, № 2. P. 134-140.

88. Wang Y. et al. Metformin induces autophagy and G0/G1 phase cell cycle arrest in myeloma by targeting the AMPK/mTORC1 and mTORC2 pathways. // J. Exp. Clin. Cancer Res. CR. 2018. Vol. 37, № 1. P. 63.

89. Jewell J.L. et al. Differential regulation of mTORC1 by leucine and glutamine // Science. 2015. Vol. 347, № 6218. P. 194-198.

90. Meng D. et al. Glutamine and asparagine activate mTORC1 independently of Rag GTPases // J. Biol. Chem. 2020. Vol. 295, № 10. P. 2890-2899.

91. Stracka D. et al. Nitrogen Source Activates TOR (Target of Rapamycin) Complex 1 via Glutamine and Independently of Gtr/Rag Proteins // J. Biol. Chem. 2014. Vol. 289, № 36. P. 25010-25020.

92. Dibble C.C. et al. TBC1D7 is a third subunit of the TSC1-TSC2 complex upstream of mTORC1. // Mol. Cell. 2012. Vol. 47, № 4. P. 535-546.

93. Cunningham J.T. et al. mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1 -PGC- lalpha transcriptional complex. // Nature. 2007. Vol. 450, № 7170. P. 736740.

94. Lamming D.W. et al. Rapamycin-induced insulin resistance is mediated by mTORC2 loss and uncoupled from longevity. // Science. 2012. Vol. 335, № 6076. P. 1638-1643.

95. Hagiwara A. et al. Hepatic mTORC2 activates glycolysis and lipogenesis through Akt, glucokinase, and SREBPlc. // Cell Metab. 2012. Vol. 15, № 5. P. 725-738.

96. Yuan M. et al. Identification of Akt-independent regulation of hepatic lipogenesis by mammalian target of rapamycin (mTOR) complex 2. // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287, № 35. P. 29579-29588.

97. Gkountakos A. et al. Unmasking the impact of Rictor in cancer: novel insights of mTORC2 complex // Carcinogenesis. 2018. Vol. 39, № 8. P. 971-980.

98. Kim L.C., Cook R.S., Chen J. mTORC1 and mTORC2 in cancer and the tumor microenvironment // Oncogene. 2017. Vol. 36, № 16. P. 2191-2201.

99. Maiese K. Targeting the core of neurodegeneration: FoxO, mTOR, and SIRT1 // Neural Regen. Res. 2021. Vol. 16, № 3. P. 448-455.

100.Lenz G., Avruch J. Glutamatergic regulation of the p70S6 kinase in primary mouse neurons. // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, № 46. P. 38121-38124.

101. Quevedo C., Salinas M., Alcázar A. Regulation of cap-dependent translation by insulin-like growth factor-1 in neuronal cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol. 291, № 3. P. 560-566.

102.Feldman M.E. et al. Active-site inhibitors of mTOR target rapamycin-resistant outputs of mTORC1 and mTORC2. // PLoS Biol. 2009. Vol. 7, № 2. P. e38.

103. Chen Y., Zhou X. Research progress of mTOR inhibitors. // Eur. J. Med. Chem. 2020. Vol. 208. P. 112820.

104. Chresta C.M. et al. AZD8055 Is a Potent, Selective, and Orally Bioavailable ATP-Competitive Mammalian Target of Rapamycin Kinase Inhibitor with In vitro and In vivo Antitumor Activity // Cancer Res. 2010. Vol. 70, № 1. P. 288-298.

105.Maira S.-M. et al. Identification and characterization of NVP-BEZ235, a new orally available dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor with potent in vivo antitumor activity // Mol. Cancer Ther. 2008. Vol. 7, № 7. P. 18511863.

106. Toledo L.I. et al. A cell-based screen identifies ATR inhibitors with synthetic lethal properties for cancer-associated mutations // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. Vol. 18, № 6. P. 721-727.

107. Choi S. et al. mTOR signaling intervention by Torin1 and XL388 in the insular cortex alleviates neuropathic pain // Neurosci. Lett. 2020. Vol. 718. P. 134742.

108.Liu Q. et al. Discovery of 9-(6-Aminopyridin-3-yl)-1-(3-(trifluoromethyl)phenyl)benzo[ h ][1,6]naphthyridin-2(1 H )-one (Torin2) as a Potent, Selective, and Orally Available Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Inhibitor for Treatment of Cancer // J. Med. Chem. 2011. Vol. 54, № 5. P. 1473-1480.

109. Ahmed M. et al. High prevalence of mTOR complex activity can be targeted using Torin2 in papillary thyroid carcinoma // Carcinogenesis. 2014. Vol. 35, № 7. P. 15641572.

110. Simioni C. et al. Activity of the novel mTOR inhibitor Torin-2 in B-precursor acute lymphoblastic leukemia and its therapeutic potential to prevent Akt reactivation // Oncotarget. 2014. Vol. 5, № 20. P. 10034-10047.

111.Danzer S.C. Double agent mTOR // Epilepsy Curr. 2019. Vol. 19, № 1. P. 44-46.

112. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD, 2019.

113.Panagiotou E.M., Ojasalo V., Damdimopoulou P. Phthalates, ovarian function and fertility in adulthood. // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2021. Vol. 35, № 5. P. 101552.

114. Ostling O., Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. Vol. 123, № 1. P. 291-298.

115.Haywood A.F.M., Staveley B.E. Mutant alpha-synuclein-induced degeneration is reduced by parkin in a fly model of Parkinson's disease // Genome. 2006. Vol. 49, № 5. P. 505-510.

116.Haddadi M. et al. Brain aging, memory impairment and oxidative stress: a study in Drosophila melanogaster // Behav. Brain Res. 2014. Vol. 259. P. 60-69.

117. Tamura T. et al. Aging specifically impairs amnesiac-dependent memory in Drosophila // Neuron. 2003. Vol. 40, № 5. P. 1003-1011.

118.Fernández J.R. et al. Differences in locomotor activity across the lifespan of Drosophila melanogaster // Exp. Gerontol. 1999. Vol. 34, № 5. P. 621-631.

119. Carey J.R. et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata // Exp. Gerontol. 2006. Vol. 41, № 1. P. 93-97.

120. Gupta V.K. et al. Restoring polyamines protects from age-induced memory impairment in an autophagy-dependent manner // Nat. Neurosci. 2013. Vol. 16, № 10. P. 1453-1460.

121.Proshkina E.N. et al. Basic mechanisms of longevity: A case study of Drosophila pro-longevity genes. // Ageing Res. Rev. 2015. Vol. 24, № Pt B. P. 218-231.

122.Anisimov V.N., Mylnikov S.V., Khavinson V.K. Pineal peptide preparation epithalamin increases the lifespan of fruit flies, mice and rats. // Mech. Ageing Dev. 1998. Vol. 103, № 2. P. 123-132.

123. Valenzano D.R. et al. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri // Aging Cell. 2006. Vol. 5, № 3. P. 275-278.

124.Kalueff A.V., Stewart A.M., Gerlai R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders // Trends Pharmacol. Sci. 2014. Vol. 35, № 2. P. 63-75.

125. Grabherr M.G. et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome // Nat. Biotechnol. Nat Biotechnol, 2011. Vol. 29, № 7. P. 644652.

126.Langmead B., Salzberg S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 4. P. 357-359.

127.Li B., Dewey C.N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome // BMC Bioinformatics. 2011. Vol. 12, № 1. P. 323.

128. Robinson M.D., McCarthy D.J., Smyth G.K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data // Bioinformatics. Oxford University Press, 2009. Vol. 26, № 1. P. 139-140.

129. Sun Y. et al. Fin56-induced ferroptosis is supported by autophagy-mediated GPX4 degradation and functions synergistically with mTOR inhibition to kill bladder cancer cells // Cell Death Dis. 2021. Vol. 12, № 11. P. 1028.

130. Davie K. et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain // Cell. 2018. Vol. 174, № 4. P. 982-998.e20.

131.Mangleburg C.G. et al. Integrated analysis of the aging brain transcriptome and proteome in tauopathy // Mol. Neurodegener. 2020. Vol. 15, № 1. P. 56.

132.Bouska M.J., Bai H. Loxl2 is a mediator of cardiac aging in Drosophila melanogaster, genetically examining the role of aging clock genes // G3 Bethesda Md. 2022. Vol. 12, № 1. P. jkab381.

133. Hall H. et al. Transcriptome profiling of aging Drosophila photoreceptors reveals gene expression trends that correlate with visual senescence // BMC Genomics. 2017. Vol. 18, № 1. P. 894.

134.Hwang W., Lang M.J., Karplus M. Kinesin motility is driven by subdomain dynamics // eLife. eLife Sciences Publications Ltd, 2017. Vol. 6.

135. Cao W. et al. Toll-like receptor-mediated induction of type I interferon in plasmacytoid dendritic cells requires the rapamycin-sensitive PI(3)K-mT0R-p70S6K pathway. // Nat. Immunol. 2008. Vol. 9, № 10. P. 1157-1164.

136. de Boer S.E. et al. Enhanced Humoral Immune Response After COVID-19 Vaccination in Elderly Kidney Transplant Recipients on Everolimus Versus Mycophenolate Mofetil-containing Immunosuppressive Regimens. // Transplantation. 2022. Vol. 106, № 8. P. 1615-1621.

137.Mannick J.B. et al. mTOR inhibition improves immune function in the elderly. // Sci. Transl. Med. 2014. Vol. 6, № 268. P. 268ra179.

138.DiAngelo J.R. et al. The immune response attenuates growth and nutrient storage in Drosophila by reducing insulin signaling // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. Vol. 106, № 49. P. 20853-20858.

139.Becker T. et al. FOXO-dependent regulation of innate immune homeostasis // Nature. 2010. Vol. 463, № 7279. P. 369-373.

140. Varma D. et al. Forkhead, a new cross regulator of metabolism and innate immunity downstream of TOR in Drosophila // J. Insect Physiol. 2014. Vol. 69. P. 80-88.

141.Klein S.L., Flanagan K.L. Sex differences in immune responses. // Nat. Rev. Immunol. 2016. Vol. 16, № 10. P. 626-638.

142. Gal-Oz S.T. et al. ImmGen report: sexual dimorphism in the immune system transcriptome. // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1. P. 4295.

143. So J. et al. Sexual dimorphism of monocyte transcriptome in individuals with chronic low-grade inflammation. // Biol. Sex Differ. 2021. Vol. 12, № 1. P. 43.

144.Kovats S. Estrogen receptors regulate innate immune cells and signaling pathways. // Cell. Immunol. 2015. Vol. 294, № 2. P. 63-69.

145.Kadel S., Kovats S. Sex Hormones Regulate Innate Immune Cells and Promote Sex Differences in Respiratory Virus Infection. // Front. Immunol. 2018. Vol. 9. P. 1653.

146.Keeley R.J. et al. Sex difference in cue strategy in a modified version of the Morris water task: correlations between brain and behaviour. // PloS One. 2013. Vol. 8, № 7. P.e69727.

147. Villa A. et al. Estrogen accelerates the resolution of inflammation in macrophagic cells. // Sci. Rep. 2015. Vol. 5. P. 15224.

148.Routley C.E., Ashcroft G.S. Effect of estrogen and progesterone on macrophage activation during wound healing. // Wound Repair Regen. Off. Publ. Wound Heal. Soc. Eur. Tissue Repair Soc. 2009. Vol. 17, № 1. P. 42-50.

149. Kim S. et al. Gender differences in risk factors for transition from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease: A CREDOS study // Compr. Psychiatry. 2015. Vol. 62. P. 114-122.

150.Neu S.C. et al. Apolipoprotein E Genotype and Sex Risk Factors for Alzheimer Disease: A Meta-analysis // JAMA Neurol. 2017. Vol. 74, № 10. P. 1178-1189.

151.Fombonne E. Epidemiology of pervasive developmental disorders // Pediatr. Res. 2009. Vol. 65, № 6. P. 591-598.

152. Zablotsky B. et al. Estimated Prevalence of Autism and Other Developmental Disabilities Following Questionnaire Changes in the 2014 National Health Interview Survey // Natl. Health Stat. Rep. 2015. № 87. P. 1-20.

153.Mozzetta C. et al. The histone H3 lysine 9 methyltransferases G9a and GLP regulate polycomb repressive complex 2-mediated gene silencing. // Mol. Cell. 2014. Vol. 53, № 2. P. 277-289.

154.Mizuno K. et al. Calcium/calmodulin kinase kinase beta has a male-specific role in memory formation // Neuroscience. 2007. Vol. 145, № 2. P. 393-402.

155. Gresack J.E. et al. Sex differences in contextual fear conditioning are associated with differential ventral hippocampal extracellular signal-regulated kinase activation // Neuroscience. 2009. Vol. 159, № 2. P. 451-467.

156. Sase A.S. et al. Sex-Specific Regulation of Fear Memory by Targeted Epigenetic Editing of Cdk5 // Biol. Psychiatry. 2019. Vol. 85, № 8. P. 623-634.

157.Kudo K. et al. A selective increase in phosphorylation of cyclic AMP response element-binding protein in hippocampal CA1 region of male, but not female, rats following contextual fear and passive avoidance conditioning // Brain Res. 2004. Vol. 1024, № 1-2. P. 233-243.

158. Tsai H.-W., Grant P.A., Rissman E.F. Sex differences in histone modifications in the neonatal mouse brain // Epigenetics. 2009. Vol. 4, № 1. P. 47-53.

159.Benoit J.D., Rakic P., Frick K.M. Prenatal stress induces spatial memory deficits and epigenetic changes in the hippocampus indicative of heterochromatin formation and reduced gene expression // Behav. Brain Res. 2015. Vol. 281. P. 1-8.

160. Tyler C.R. et al. Developmental exposure to 50 parts-per-billion arsenic influences histone modifications and associated epigenetic machinery in a region- and sex-specific manner in the adult mouse brain // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015. Vol. 288, № 1. P. 40-51.

161.Fortress A.M. et al. 17^-Estradiol regulates histone alterations associated with memory consolidation and increases Bdnf promoter acetylation in middle-aged female mice // Learn. Mem. Cold Spring Harb. N. 2014. Vol. 21, № 9. P. 457-467.

162.Frick K.M. et al. Sex steroid hormones matter for learning and memory: estrogenic regulation of hippocampal function in male and female rodents // Learn. Mem. Cold Spring Harb. N. 2015. Vol. 22, № 9. P. 472-493.

163. Shors T.J., Weiss C., Thompson R.F. Stress-induced facilitation of classical conditioning // Science. 1992. Vol. 257, № 5069. P. 537-539.

164.Roozendaal B. et al. Involvement of stress-released corticotropin-releasing hormone in the basolateral amygdala in regulating memory consolidation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 21. P. 13908-13913.

165.Luine V. et al. Sex differences in chronic stress effects on cognition in rodents // Pharmacol. Biochem. Behav. 2017. Vol. 152. P. 13-19.

166. Shors T.J., Falduto J., Leuner B. The opposite effects of stress on dendritic spines in male vs. female rats are NMDA receptor-dependent // Eur. J. Neurosci. 2004. Vol. 19, № 1. P. 145-150.

167.Pawate S. et al. Redox regulation of glial inflammatory response to lipopolysaccharide and interferon? // J. Neurosci. Res. 2004. Vol. 77, № 4. P. 540-551.

168.Ransohoff R.M. How neuroinflammation contributes to neurodegeneration. // Science. 2016. Vol. 353, № 6301. P. 777-783.

169.Perry V.H., Nicoll J.A.R., Holmes C. Microglia in neurodegenerative disease // Nat. Rev. Neurol. 2010. Vol. 6, № 4. P. 193-201.

170.Michell-Robinson M.A. et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair // Brain. 2015. Vol. 138, № 5. P. 1138-1159.

171. Conde J.R., Streit W.J. Microglia in the aging brain // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2006. Vol. 65, № 3. P. 199-203.

172. Verkhratsky A., Ho M.S., Parpura V. Evolution of Neuroglia // Adv. Exp. Med. Biol. 2019. Vol. 1175. P. 15-44.

173. Thomas G.M., Huganir R.L. MAPK cascade signalling and synaptic plasticity. // Nat. Rev. Neurosci. 2004. Vol. 5, № 3. P. 173-183.

174. Zhang X. et al. Active Protection: Learning-Activated Raf/MAPK Activity Protects Labile Memory from Rac1-Independent Forgetting. // Neuron. 2018. Vol. 98, № 1. P. 142-155.e4.

175. Castonguay D. et al. The Tyrosine Phosphatase STEP Is Involved in Age-Related Memory Decline. // Curr. Biol. CB. 2018. Vol. 28, № 7. P. 1079-1089.e4.

176.Nateri A.S. et al. ERK activation causes epilepsy by stimulating NMDA receptor activity // EMBO J. 2007. Vol. 26, № 23. P. 4891-4901.

177. Guven-Ozkan T., Davis R.L. Functional neuroanatomy of Drosophila olfactory memory formation. // Learn. Mem. Cold Spring Harb. N. 2014. Vol. 21, № 10. P. 519526.

178.Hige T. et al. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. // Neuron. 2015. Vol. 88, № 5. P. 985-998.

179. Qin H. et al. Gamma neurons mediate dopaminergic input during aversive olfactory memory formation in Drosophila. // Curr. Biol. CB. 2012. Vol. 22, № 7. P. 608-614.

180. Zhang Y. et al. Biphasic Regulation of p38 MAPK by Serotonin Contributes to the Efficacy of Stimulus Protocols That Induce Long-Term Synaptic Facilitation. // eNeuro. 2017. Vol. 4, № 1.

181. Gao Y. et al. Genetic dissection of active forgetting in labile and consolidated memories in Drosophila. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. Vol. 116, № 42. P. 21191-21197.

182. Tan B. et al. Low-frequency stimulation induces a durable long-term depression in young adult hyperthyroid rats // NeuroReport. 2016. Vol. 27, № 9. P. 640-646.

183. Osterweil E.K. et al. Hypersensitivity to mGluR5 and ERK1/2 leads to excessive protein synthesis in the hippocampus of a mouse model of fragile X syndrome. // J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 2010. Vol. 30, № 46. P. 15616-15627.

184. Curia G. et al. Resilience to audiogenic seizures is associated with p-ERK1/2 dephosphorylation in the subiculum of Fmr1 knockout mice. // Front. Cell. Neurosci. 2013. Vol. 7. P. 46.

185. Gangarossa G. et al. Mouse hippocampal phosphorylation footprint induced by generalized seizures: Focus on ERK, mTORC1 and Akt/GSK-3 pathways // Neuroscience. 2015. Vol. 311. P. 474-483.

186. Ben J. et al. Effects of Pentylenetetrazole Kindling on Mitogen-Activated Protein Kinases Levels in Neocortex and Hippocampus of Mice // Neurochem. Res. 2014. Vol. 39, № 12. P. 2492-2500.

187. Gangarossa G. et al. Convulsant Doses of a Dopamine D1 Receptor Agonist Result in Erk-Dependent Increases in Zif268 and Arc/Arg3.1 Expression in Mouse Dentate Gyrus // PLoS ONE / ed. Manzoni O.J. 2011. Vol. 6, № 5. P. e19415.

188.Billard J.-M. D-serine signalling as a prominent determinant of neuronal-glial dialogue in the healthy and diseased brain // J. Cell. Mol. Med. 2008. Vol. 12, № 5B. P. 1872-1884.

189. Williams S.M. et al. Immunocytochemical analysis ofD-serine distribution in the mammalian brain reveals novel anatomical compartmentalizations in glia and neurons // Glia. 2006. Vol. 53, № 4. P. 401-411.

190.Katsuki H. et al. Contribution of endogenous glycine and d-serine to excitotoxic and ischemic cell death in rat cerebrocortical slice cultures // Life Sci. 2007. Vol. 81, № 9. P. 740-749.

191.Billard J.-M. d-Serine in the aging hippocampus // J. Pharm. Biomed. Anal. 2015. Vol. 116. P. 18-24.

192. Sarbassov D.D. et al. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton // Curr. Biol. CB. 2004. Vol. 14, № 14. P. 1296-1302.

193. Li X., Gao T. mTORC2 phosphorylates protein kinase CZ to regulate its stability and activity // EMBO Rep. 2014. Vol. 15, № 2. P. 191-198.

194. Thomanetz V. et al. Ablation of the mTORC2 component rictor in brain or Purkinje cells affects size and neuron morphology // J. Cell Biol. 2013. Vol. 201, № 2. P. 293308.

195.Lamprecht R. The actin cytoskeleton in memory formation // Prog. Neurobiol. 2014. Vol. 117. P. 1-19.

196.Bellot A. et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines // Brain Res. 2014. Vol. 1573. P. 1-16.

197.Maiese K. Moving to the Rhythm with Clock (Circadian) Genes, Autophagy, mTOR, and SIRT1 in Degenerative Disease and Cancer // Curr. Neurovasc. Res. 2017. Vol. 14, № 3.

198. Corti O. et al. Autophagy in neurodegeneration: New insights underpinning therapy for neurological diseases // J. Neurochem. 2020. Vol. 154, № 4. P. 354-371.

199.Maiese K. Cognitive Impairment and Dementia: Gaining Insight through Circadian Clock Gene Pathways // Biomolecules. 2021. Vol. 11, № 7. P. 1002.

200.Poillet-Perez L. et al. Autophagy maintains tumour growth through circulating arginine // Nature. 2018. Vol. 563, № 7732. P. 569-573.

201. Zhang J. et al. A tuberous sclerosis complex signalling node at the peroxisome regulates mTORC1 and autophagy in response to ROS // Nat. Cell Biol. 2013. Vol. 15, № 10. P. 1186-1196.

202.Huang C.C.-Y., Ko M.L., Ko G.Y.-P. A new functional role for mechanistic/mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) in the circadian regulation of L-type voltage-gated calcium channels in avian cone photoreceptors // PloS One. 2013. Vol. 8, № 8. P. e73315.

203.Kim J.-O. et al. Potentiation of the anticancer effects of everolimus using a dual mTORC1/2 inhibitor in hepatocellular carcinoma cells // Oncotarget. 2017. Vol. 8, № 2. P. 2936-2948.

204.Burger J.M.S. et al. The functional costs and benefits of dietary restriction in Drosophila // Aging Cell. 2007. Vol. 6, № 1. P. 63-71.

205. Harrington L.S. et al. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins // J. Cell Biol. 2004. Vol. 166, № 2. P. 213-223.

206. Shah O.J., Wang Z., Hunter T. Inappropriate activation of the TSC/Rheb/mTOR/S6K cassette induces IRS1/2 depletion, insulin resistance, and cell survival deficiencies // Curr. Biol. CB. 2004. Vol. 14, № 18. P. 1650-1656.