Влияние возраста и пониженного содержания кислорода на функциональные свойства культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат биологических наук Валюшкина, Мария Петровна

• Валюшкина, Мария Петровна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Валюшкина, Мария Петровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Характеристика старения.

1.1.1 .Некоторые теории старения.

1.1.2. Некоторые физиологические аспекты старения.

1.1.3. Клеточное старение.

1.1.4. Возрастные изменения ММСК.

1.2. Характеристика ММСК.

1.2.1. Пролиферативная активность ММСК в культуре.

1.2.2. Иммуннофенотип культивируемых ММСК.

1.2.3. Дифференцировочный потенциал ММСК in vitro.

1.3. Эффекты снижения концентрации кислорода в культуре.

1.3.1. Влияние пониженной концентрации кислорода на клеточную пролиферацию.

1.3.2. Влияние гипоксии на иммуннофенотип клеток.

1.3.3. Влияние гипоксии на дифференцировку клеток.

1.4. Репарация кости.

1.4.1. Физиологическая и регенеративная репарация костной ткани.

1.4.2. Применение клеточных препаратов при повреждении костной ткани.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Реактивы и оборудование.

2.2. Получение и культивирование кмММСК крыс разного возраста.

2.3. Исследование морфофункционалных свойств культивируемых ММСК.

2.3.1. Морфология, пролиферативная активность, колониеобразование и содержание бета-галактозидазы.

2.3.2. Иммунофенотип культивируемых ММСК костного мозга разновозрастных крыс.

2.3.3. Потенциал дифференцировки.

2.4. Репаративный потенциал ММСК разновозрастных крыс.

2.4.1. Подготовка клеточных препаратов.

2.4.2. Подготовка помещения и животных к операции.

2.4.3. Экспериментальная модель перелома малой берцовой кости.

2.4.5. Подготовка срезов костной ткани и гистологический анализ.

2.5. Статистическая оценка.

Глава 3. Результаты.

3.1. Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга крыс разного возраста, культивируемых в стандартных условиях.

3.1.1. ММСК в первичной культуре.

3.1.2. Пролиферативная активность ММСК.

3.1.3 Особенности образования колоний.

3.1.4. Выделение «стареющих» клеток.

3.1.3. Иммунофенотип ММСК.

3.1.4.Дифференцировочный потенциал.

3.1.5. Репаративный потенциал кмММСК.

3.2. Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга крыс разного возраста, культивируемых при пониженном 5% содержании кислорода.

3.2.1. ММСК в первичной культуре.

3.2.2. Пролиферативная активности ММСК.

3.2.3. Особенности образования колоний.

3.2.4. Выделение «стареющих» клеток.

3.2.3. Иммунофенотип ММСК.

3.2.4.Дифференцировочный потенциал клеток.

3.2.5.Репаративный потенциал клеток.

Обсуждение.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние возраста и пониженного содержания кислорода на функциональные свойства культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс»

Одной из самых главных современных демографических проблем является резкое изменение возрастной структуры населения, которое выражается в значительном увеличение доли лиц пожилого и старческого возраста (Вишневский А. Г. и др., 2003). В связи с этим возникает необходимость совершенствования методов лечения и профилактики заболеваний у пожилых людей для продления их трудоспособности и улучшения качества жизни. Обширные и многолетние исследования процессов старения привели к тому, что к настоящему времени сформулировано большое число теорий старения. Так В.Н.Анисимов в своей монографии «Молекулярные и физиологические механизмы старения», говорит о существовании более 300 теорий (Анисимов В.Н. 2008). Однако среди наиболее перспективных можно отметить разрабатываемую в настоящее время Благосклонным М.В. теорию TOR-центрического старения (Blagosklonny M.V., 2012) и свободнорадикальную теорию (Harman D., 1994).

Особое место среди исследований последних лет занимают работы по выявлению возрастных изменений у клеток-предшественников, полученных из взрослого организма. В настоящее время в литературе представлено две противоположные точки зрения о влиянии возраста донора на характеристики клеток-предшественников. Согласно одной, существует обратная зависимость между возрастом донора и репликативной активностью прогениторных клеток (Паюшина О.В. и др., 2006; Caplan A.I., 2009). Другие авторы представляют экспериментальные данные, согласно которым возрастные изменения в популяции клеток-предшественников отсутствуют (Григорян A.C. и др., 2009). Таким образом, до сих пор не существует общепринятого мнения о наличии возрастных изменений в пуле клеток-предшественников.

Одной из главных проблем в исследованиях клеток-предшественников, полученных из взрослого организма и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), в частности, является их высокая гетерогенность (Анохина Е.Б.и др. 2007), из-за чего возникают сложности их идентификации и применения в медицине. Причиной этого могут быть индивидуальные особенности донора, среди которых отдельно отмечают состояние его здоровья и возраст (Анисимов В.Н., 2008; Sharpless N.E. et al., 2007). В настоящее время существует значительное количество исследований, в которых проводится оценка влияния возраста донора на характеристики культивируемых ММСК, такие как потенциал остеогенной дифференцировки и адипогенез (Zhou S. et al., 2008; Шахпазян Н.К. и др., 2012).

Кислород является важным фактором микроокружения ММСК in vivo и in vitro, который может оказывать влияние, как на пролиферативную активность, так и на потенциал дифференцировки. Показано, что при пониженном относительно атмосферного содержании кислорода стимулируются ранние этапы остеогенеза и подавляется адипогенез (Шахпазян Н.К.и др., 2012; Zhou S., et al., 2005). Кроме этого было показано увеличение пролиферативной активности, числа КОЕ-Ф и снижение доли стареющих клеток (Nekanti U. et al., 2010).

Остается неясным влияние пониженного содержания кислорода на кмММСК разновозрастных животных. Вместе с тем характеристика влияния пониженного содержания кислорода на клетки старых животных может быть востребована для решения ряда задач регенеративной медицины, в частности, вопрос о возможности быстрого наращивания клеточной массы при использовании аутологичных клеток.

Получаемые данные о биологии ММСК уже сейчас находят свое применение в медицине, а анализ возможности использования клеток-предшественников, полученных из взрослого организма, в медицине является перспективным направлением исследования. В настоящее время существуют данные об успешном их применении для лечения ряда тяжелых заболеваний (Пальцев М.А., и др. 2006). Была показана эффективность использования ММСК, предкультиврование которых осуществлялось при 5% кислорода, что объяснялось, в первую очередь, паракринными эффектами на такие параметры как пролиферативная активность (Lennon D.P. et al., 2001). Не исследованными остаются эффекты введения разновозрастных кмММСК, культивируемых при различной содержании кислорода на репарацию трубчатых костей.

Исходя из выше изложенного, была поставлена цель: исследовать влияние возраста крыс на морфофункциональные характеристики их ММСК из костного мозга, культивируемых при различном содержании кислорода (5 и 20%), а также влияние введения этих клеток в зону экспериментального перелома трубчатой кости на процесс репарации.

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести анализ репликативных особенностей культивируемых ММСК из костного мозга крыс разного возраста при 5% и 20% 02.

2. Изучить изменения доли «стареющих» клеток в популяции ММСК костного мозга крыс в зависимости от возраста животного и концентрации кислорода.

3. Проанализировать иммунофенотип культивируемых ММСК костного мозга (кмММСК) разновозрастных крыс при 20% и при 5% кислорода в газовой среде.

4. Оценить изменения остео- и адипогенного потенциала при культивировании кмММСК разновозрастных крыс в стандартных условиях и при 5% кислорода в среде.

5. Исследовать влияние введения аллогенных кмММСК молодых и старых животных на репарацию трубчатой кости после предварительной экспансии клеток в газовой среде, содержащей 20% или 5% кислорода.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Валюшкина, Мария Петровна

Выводы

1. Установлены различия в морфофункциональных характеристиках культивируемых ММСК костного мозга крыс: снижение репликативной активности, количества КОЕ-Ф и остеогенного потенциала, при увеличении индуцированной адипогенной дифференцировки и доли «стареющих» клеток в популяции с увеличением возраста животного (1-19 мес.)

2. В первичных культурах в условиях пониженного содержания кислорода (5%) выявлено снижение пролиферативной активности кмММСК во всех возрастных группах. Субкультивирование при 5% кислорода приводило к усилению пролиферативной активности кмММСК всех возрастных групп и сглаживанию возрастных различий к третьему пассажу.

3. Постоянное культивирование кмММСК при 5% кислорода стимулировало образование КОЕ-Ф во всех возрастных группах, особенно выраженное у молодых животных. При этом доля клеток, содержащих бета-галактозидазу (маркер « старения»), снижалась более существенно в возрастной группе 6-8 месяцев.

4. Не выявлено зависимости экспрессии СБ90, СБ73, СБ54, СВ44, СЭ45 и СБ11Ъ от возраста животных и содержания кислорода в среде культивирования.

5. При пониженном содержании кислорода (5%) показано достоверное увеличение индуцированного адипогенеза кмММСК одномесячных животных и незначительное снижение у взрослых (6-8 мес.) крыс, а также усиление начальной стадии индуцированной остеогенной дифференцировки в возрастных группах.

6. Продемонстрировано увеличение коэффициента утолщения костной мозоли через 14 дней после экспериментального перелома малоберцовой кости и введения суспензии аллогенных кмММСК, которое было более выраженным при введении клеток молодых животных.

7. После введения кмММСК молодых крыс увеличивалась доля хрящевой ткани по сравнению с клетками старого животного. После предкультивирования клеток в среде, содержащей 5% кислорода, доля новообразованной костной ткани была больше по сравнению с контрольными группами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Валюшкина, Мария Петровна, 2013 год

1. Анисимов В.Н. Эпифиз, биоритмы и старение организма. // Успехи физиологических наук. 2008. - Т. 39. - №4. - С.40 - 65.

2. Анисимов В.Н. Приоритетные направления фундаментальных исследований в геронтологии: вклад России.// Успехи геронтологии. 2003. - Вып. 12. - С. 9 - 27.

3. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения». СПб.: Наука.-2008.-481 с.

4. Анохина Е.Б. Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс. // Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 2007. - 25 с.

5. Анохина Е.Б. Механизмы регуляции транскрипционного фактора HIF при гипоксии: обзор. /Биохимия. 2010. - Т. 75. - № 2. - с. 185-195.

6. Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс. // Цитология. 2007. Т. 49. - №1. - С. 40-47.

7. Балан О.В., Воротеляк Е.А., Смирнова Т.Д., Озернюк Н.Д. Особенности сателитных клеток миобластов на разных стадиях онтогенеза крыс. //Известия РАН. Серия биологическая. 2008. - № 2. - С. 151 - 155.

8. Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга на ранних этапах культивирования. //Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2007. - Т. 143. - № 4. - С. 386 - 389.

9. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. Жамбалова А.П., Козионова М.П. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода. //Цитология. -2009.-Т.51.-№1.-С. 5-11.

10. Буравкова Л.Б., Андреева Е.Р., Григорьев А.И. Роль кислорода как биологического факторамикроокружения в проявлениифункциональных свойств мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека./Физиология человека. 2012. -Т.38. - №4. - с. 1 -10.

11. Вишневский А. Г, Андреев Е. М., Трейвиш А. И. Перспективы развития России: роль демографического фактора. -М.: Научные труды ИЭ1111, научные труды № 53Р, 2003. 90 с.

12. Горидова Л.Д., Дедух Н.В. Репаративная регенерация кости в различных условиях. //Травма. 2009. -Т. 10. - № 1. - С. 88 - 91.

13. Горская Ю.Ф., Куралесова А.И. Шуклина Е.Ю., Нестеренко В.Г. Численность стромальных клеток-предшественников в гетерогенных трансплантантах костного мозга мышей СВА разного возраста. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2002. - Т. 133.-№2.-С. 176- 179.

14. Григорян A.C., Кругляков П.В., Таминкина Ю.А. Полынцева Д.Г. Зависимость пролиферациии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток от характеристики донора.// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2009. Т. 4. - № 2. - С. 70 - 75 .

15. Донцов В.И., Крутько В.Н. Моделирование процессов старения: новая иммуно-регуляторная теория старения. //Успехи современной биологии. 2010. - Т. 130. -№ 1.-С.З -19.

16. Дурнова Г.И., Логинов В.И., Капланский A.C. Заживление перелома малоберцовой кости у крыс при длительном вывешивании. //Авиакосм и экологич мед. 2002. -Т. 36. - № 3. - С. 52 -55.

17. Ершов Ю.А. Кинетические модели роста стволовых клеток. //Журн. Физической химии. 2009. - Т. 83. - № 8. - С. 1564 - 1569.

18. Зенков Н.К., Меньшиков Е.Б., Шкурупий В.А. Старение и воспаление.// Успехи современной биологии. 2010. - Т. 130. - № 1. - С. 20 - 37.

19. Кануго М. Биохимиия старения: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - 296 с.

20. Козлов В.А., Труфакин В.А., Карпов P.C. Стволовые клетки: действительность, проблемы, перспективы.// Вестник РАМН. 2004. - № 9. - С. 32 - 40.

21. Конки Д., Эрба Э, ФрешниР., Грффитс Б., Хэй Р., Ласнитский И., Маурер Г., Мораска Л., Вилсон Э. Культура животных клеток. Методы. /Под ред.Р.Фрешни. -М: Мир. 1989.-332 с.

22. Коркушко О.В., Иванов Л.А., Писарук A.B., Чебаторёв Н.Д. Дыхательная функция крови в пожелом и старческом возрасте и факторы, её определяющие. //Физиология человека. 2009. - Т.35. - № 2. - С.40 - 46.

23. Коркушко О.В., Калиновская Е.Г., Молотков В.И. Преждевременное старение человека. Киев.: «Здоровя».1979. - 192 с.

24. Крутько В.Н., Донцов В.И., Захарьящева О.В. Систамная теория стариения: методолоические основы, главные положения и приложения. //Авиакосм и экологич мед. 2009. - Т. 43. - № 1. - С. 12 -19.

25. Кухарчук А.Л., Радченко В.В,. Сирман В.М. Регенератная медициная:направления, достижения, проблемы и перспективы развития. Часть I: принипы и методы. //Украинский медичний часопис. 2004. - №2 (40). - С. 70 -76.

26. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., Лациник Н.В., Нестеренко В.Г. Возрастные изменения количества стромальных клеток-предшественников в костном мозге животных. //Морфология. 2004. - Т. 126. - № 6. - С.46 - 49.

27. Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной И.М. Соотношение апоптоза и пролиферации клеток тимуса при его инволюции.// Бюлл. эксперим. биол. и мед. -2011.-Т. 151.-№4.-С. 442-444.

28. Лэмб М. Биология старения пер. с англ. Л. К. Обуховой ; под ред. Н. М. Эмануэля. - М.: Мир, 1980. - 206 с.

29. Мазуров В.И. Болезни суставов. СПб. :Изд. СпецЛит. 2008. - 397с.

30. Меньшикова Е.Б., Шабалина И.Г., Зенков Н.К., Колосова Н.Г. Генерация активированных кислородных метаболитов митохондриями преждевременностареющих крыс OXYS // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2002. - № 133 (2). - С. 175-177.

31. Мусина P.A., Бекчанова Е.С., Белявский A.B., Гриненко Т.С., Сухих Г.Т. Мезенхимальные стволовые клетки пуповинной крови.// Клеточные технолгии в биологии и медицине. 2007. - № 1. - С.16 - 20.

32. Мяделец О.Д., Основы цитологии, эмбриологии и общей гистологии.- М.: Медицинская книга, Н.Новгород: Изд-во НГМА. 2002. - 367с.

33. Пальцев М.А., Смирнов В.Н., Романов Ю.А., Иванов A.A. Перспективы использования стволовых клеток в медицине.// Вестник российской академии наук. 2006. Т. 76. - № 2. - С. 99 -111.

34. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. Мезенхимные стволовые клетки: источники, фенотип и потенции к дифференцировке.// Известия РАН. Серия биологическая. 2006. - №1. - С. 6 - 25.

35. Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Стволовые клетки в регенеративной терапии сердечных заболеваний: роль межклеточных взаимодействий. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2009. - Т. 4. - № 1. - С. 43 - 49.

36. Савенко М.А. Детерминанты активного долголетия людей пожилого возраста.// Автореф. д-ра. мед. наук. СПб. - 2009. - 40 с.

37. Селедцова Г.В., Селедцов В.И., Рабинович С.С., парлюк О.В., Кафанова М.Ю. Трансплантация фетальных клетокв лечении неврологических расстройств.//Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2008. - Т. 2. -№ 1. - С. 49-56.

38. Сорокин А.П. Общие закономерности строения опорного аппарата человека. -М.: Медицина, 1973. 263 с.

39. Спесивцев А. Ю.Оптимизация лечения лиц пожилого и старческого возраста с переломами проксимальной трети бедренной кости.//Автореф. канд. мед. наук. -СпБ. 2009.- 25 с.

40. ТкемаладзеДж.В., Чичинадзе К.Н. Центриолярные механизмы дифференцировки и репликативного старения клеток высших животных. // Биохимия. 2005. - Т. 70. -№11.-С. 1566-1584.

41. Трошин, A.C. Биология клетки в культуре. / A.C. Трошин. Л.: - 1984. - С . 3 - 245.

42. Ушаков Б.Н. Биология старения. Серия: Руководство по физиологии. /Ред Ушаков Б.Н. Л.: "Наука" 1982. С.616

43. Фриденштейн А.Я., Горская Ю.Ф., Лациник Н.В., Шуклина Е.Ю., Нестеренко В.Г. Возрастные изменения содержания стромальных клоногенных клеток в кроветвоных и лимфоидных органах. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1999. - Т. 127.-№5.-С. 550-553.

44. Фролышс В.В. Старение и увеличение продолжительности жизни.-Л.: Наука, -1988.-239 с.

45. Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Трофимов A.B., Полякова В.О., Севостьянова H.H., Кветной И.М. Морфофункциональный основы пептидной регуляции старения. //Успехи современной биологии. 2011. - Т. 131. - № 2. - С.115 - 121.

46. Шабалин, В. Н. Основные закономерности старения организма человека / В. Н. Шабалин // Здравоохранение Российской Федерации. 2009. - № 2. - С. 13 -18.

47. Шигаева М.И., Гриценко Е.Н., Мурзаева С.В., Горбачева О.С., Таланов Е.Ю., Миронова Г.Д. Возрастные изменения Функционирования митохондриальной системы транспорта калия.//Биофизика. 2010.-№ 5.- С.1030-1037.

48. Эмануэль Н.М. Некоторые молекулярные механизмы и перспективы профилактики старения. // Известия академии наук СССР. Биологическая серия. - 1975,-№4,-С. 785-794.

49. Afshari С.А., Vojita P.J., Annab L.A., Futreal P.A., Willard T.B., Barrett J.C. Investigation of the role of Gl/S cell cycle mediators in cellular senescence.// Exp. Cell Res. 1993. - V. 209. - P. 231 - 237.

50. Baker D.J., Wijshake Т., Tchkonia Т., LeBrasseur N.K., Childs B.G., van de Sluis B, Kirkland J.L., van Deursen J.M. Clearance of pl6Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. // Nature. 2011. -№ 479. - C. 232 - 236.

51. Blagosklonny M.V. TOR-driven aging and age-related diseases.// Тез. Докл. 2-ой международной конференции «Генетика старения и долголетия». М. - 2012. -112 с.

52. Blagosklonny M.V. Cell senescence and hypermitogenic arrest. //EMBO Rep. 2003. V. - 4. - №4. - P. 358 - 362.

53. Bos R., van Diest P.J., van der Groep P. et al. Expression of hypoxia-inducible factor-la and cell cycle proteins in invasive breast cancer are estrogen receptor related.// Breast Cancer Res 2004. V. 6. - P. R450 - R459.

54. Bosch P., Pratt S.L., Stice S.L. Isolation, characterization, gene modification and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells.// Biology of reproduction. 2006. -V. 74.-P. 46-57.

55. Bruder S.R., Jaiswal N. Ricalton N.S., Mosca J.D., Kraus K.H., Kadiyala S. Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration. //J Am Soc Nephrol. 2004. - №15. - P. 1794 - 1804.

56. Campisi J. Cellular senescence: putting the paradoxes in perspective. //Curr Opin Genet. -2011,- V.21.-№l.-P. 107-112.

57. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M. Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. -№ 7. - P. 3213-3218.

58. Conget P. A., Minguell J.J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells.//J Cell Physiol. 1999. - V. 181. - №1. - P. 67 -73.

59. Dexheimer V, Mueller S, Braatz F, Richter W. Reduced reactivation from dormancy but maintained lineage choice of human mesenchymal stem cells with donor age.// PLoS One. 2011;6(8): Article ID e22980

60. D'Ippolito G., Schiller P.C., Ricordi C., Roos B.A., Howard G.A. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow.// J Bone Miner Res. 1999. - V. 14 - № 7. P. 1115 -1122.

61. Dominici M., Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.// Cytotherapy. 2006. - V. 8. - № 4. - P. 315 - 317.

62. Fehrer C., Lepperdinger G. Mesenchymal stem cell aging.//Exp Gerontol. 2005. -V.40. - № 12. - P. 926-930.

63. Freitas A.A., Vasieva O., de Magalhäes J.P. A data mining approach for classifying DNA repair genes into ageing-related or non-ageing-related.// BMC Genomics. 2011. -V. 12.-P. 12-27.

64. Gang E.J., Jeong J.A., Hong S.H., Hwang S.H., Kim S.W., Yang I.H., Ahn C., Han H., Kim H. Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood.//Stem Cells. 2004. - V. 22. - № 4. - P. 617 - 624.

65. Gardner L.B., Li Q., Park M.S. et al. Hypoxia inhibits Gl/S transition through regulation of p27 expression.// The Journal of Biological Chemistry. 2001. - V. 276. - № 11.-P. 7919-7926.

66. Gardner L.B., Li F., Yang X. et al. Anoxic fibroblasts activate a replication checkpoint that is bypasses by Ela.// Molecular and cellular biology. 2003. - V. 23. - №24. - p. 9032 - 9045

67. Grayson W.L., Zhao F., Izadpanah R., Bunnell B., Ma T. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs.//J Cell Physiol. -2006. -№207.-P. 331 -339.

68. Harman D. Free-radical theory of aging: inversing the functional life span. // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1994. - V. 717. - P. 1 - 15.

69. Hashimoto J., Kariya Y., Miyazaki K. Regulation of proliferation and chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by laminin-5 (laminin-332). //Stem Cells. 2006. V. 24. -№11,- P. 2346 - 2354.

70. Herbertson A., Aubin J.E. Cell sorting enriches osteogenic populations in rat bone marrow stromal cell cultures.// Bone. 1997. - V. 21. - № 6. - P. 491 - 500.

71. ImG.I., Kim D.Y., ShinJ.H., Hyun C.W., ChoW.H. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. //J. Bone Joint Surg. -2001. № 83-B. - P. 289-294.

72. Jackson L., Jones D.R., Scotting P., Sottile V. Adult mesenchymal stem cells: Differentiation potential and therapeutic applications. //J Postgrad Med. 2007. - V. 53. -№2.-P. 121 -127.

73. Johnstone B., Hering T.M., Caplan A.I., Goldberg V.M., Yoo J.U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.//Exp Cell Res. -1998. V. 238. - № 1. - P. 265 - 272.

74. Kanichai M., Ferguson D., Prendergast P.J., Campbell V.A. Hypoxia Promotes Chondrogenesis in Rat Mesenchymal Stem Cells: A Role for AKT and Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-la.// Cell Physiol. 2008. - № 216. - P. 708 - 715.

75. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation.// Arthritis Research & Therapy. 2007. - V. 9. - №1. - P. 204 - 214.

76. Lavrentieva A., Majore I., Kasper C., Hass R. Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells.//Cell Commun Signal. 2010. -V. 8.-P. 18-27.

77. Lee B.Y., Han J.A., Im J.S., Morrone A., Johung K., Goodwin E.C., Kleijer W.J., DiMaio D., Hwang E.S. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.// Aging Cell. 2006. - V. 5. - № 2. - P. 187 - 195.

78. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis.// J Cell Physiol. 2001. - V. 187. - № 3. - P. 345 - 355.

79. Lepperdinger G. Inflammation and mesenchymal stem cell aging.// Curr Opin Immunol. 2011.-V. 23.-№4. - P. 518 -524.

80. Lin Q., Lee Y. J., Yun Z. Differentiation arrest by hypoxia.// J. of Biological Chemistry. 2006. - V. 281. - № 31. - P. 30678 - 30683.

81. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. // J. Cell Physiol. 1998. - № 176. - P. 57 - 66.

82. Miura T., Mattson M.P., Rao M.S. Cellular lifespan and senescence signaling in embryonic stem cells.//Aging Cell. 2004. -V. 3. - № 6. - P. 333-343.

83. Obukhova L.A., Skulachev V.P., Kolosova N.G. Mitochondria-targeted antioxidant SkQl inhibits age-dependent involution of the thymus in normal and senescence-prone rats.//Aging. 2009. - V. 1. - № 4. - P. 389 - 401.

84. Pacary E., Legros H., Valable S. et al. Synergistic effects of CoC12 and ROCK inhibition on mesenchymal stem cell differentiation into neuron-like cells.// Journal of Cell Science. 2006. - V. 119. -№ 3. - P. 2667 - 2678.

85. Park Y.K., Park H. Prevention of CCAAT/enhancer-binding protein beta DNA binding by hypoxia during adipogenesis.//J Biol Chem. 2010. - V. 285. - № 5. - P.3289 - 3299.

86. Pass D., Freeth G. The Rat. //ANZCCART News. 1993. - V. 6. - № 4. - P. 1-4.

87. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells.// Science. 1999. - V. 284. - № 5411. - P. 143 -147.

88. Ponticiello M.S., Schinagl R.M., Kadiyala S., Валу F.P. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. //J Biomed Mater Res. 2000. V. 5. - № 2. P. 246 - 255.

89. Qian S.W., Li X., Zhang Y.Y., Huang H.Y., Liu Y., Sun X., Tang Q.Q. Characterization of adipocyte differentiation from human mesenchymal stem cells in bone marrow.// BMC Dev Biol. 2010. - V. 7. - P. 10 - 47.

90. Ren H., Cao Y., Zhao Q. et al. Proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells under hypoxic conditions.// Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. - V. 347. - № 1. - P. 12 - 21.

91. Rochefort G. Y., Delorme В., Lopez A ., Hérault О., Bonnet P., Charbord P., Eder V., Domenech J. Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxia.// Stem Cells. 2006. - V. 24. - № 10. - P. 2202 - 2208.

92. Roobrouck V.D., Ulloa-Montoya F, Verfaillie C.M. Self-renewal and differentiation capacity of young and aged stem cells.//Exp Cell Res. 2008. - V. 314. - № 9. - P. 1937 - 1944.

93. Salim A., Nacamuli R.P., Morgan E.F., Giaccia A.J., Longaker M.T. Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx2 expression in osteoblasts.// J of Biological Chemistry. 2004. - V. 279. -№ 38. - P. 40007 - 40016.

94. Sethe S., Scutt A., Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells. //Age. Res. Rev. -2006. № 5. - P. 90-116.

95. Sharpless N.E., DePinho R.A. How stem cells age and why this makes us grow old. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2007. - V. 8. - № 9. - P. 703 - 713.

96. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of Stromal Cell Precursors in Human Bone Marrow by a Novel Monoclonal Antibody, STRO-1. // Blood. 1991. - №78. - P. 55-62.

97. Skulachev V.P. New data on biochemical mechanism of programmed senescence of organisms and antioxidant defense of mitochondria.//Biochemistiy (Mosc). 2009. - V. 74.-№12.-P. 1400- 1403.

98. Spivak I.M. Complex study of aging markers in primary fibroblasts by humans. //Тез. Докл. 2-ой международной конференции " Генетика старения и долголетия". М. -2012.-112 с.

99. Stenderup К., Justesen J., Clausen С., Kassem М. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells.//Bone. -2003. V. 33. № 6. - P. 919 - 926.

100. Stolzing A., Jones E., McGonagle D., Scutt A. Age-related changes in human bone marrow-drived mesenchymal stem cells: Conseguences for cell therapies. // Mechanisms of ageing and development. 2008. - № 129. - P. 163 - 173.

101. Takacs-Buia L., Iordachel C., Efimov N., Caloianu M., Montreuil J., Bratosin D. Pathogenesis of osteoarthritis: chondrocyte replicative senescence or apoptosis?// Cytometry В Clin Cytom. 2008. - V. 74. - № 6. - P. 356 - 362.

102. Tang Q.Q., Otto T.C., Lane M.D. Commitment of C3H10T1/2 pluripotent stem cells to the adipocyte lineage.// Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. V. 101. - № 26. - P. 96079611.

103. Tsai C.C., Chen Y.J., Yew T.L., Chen L.L., Wang J.Y., Chiu C.H., Hung S.C.Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST.//Blood. 2011. - V. 117. - № 2. - P. 459 - 469.

104. Utting J.C., Robins S.P., Brandao-Burch A., Orriss I.R., Behar J., Arnett T.R. Hypoxia inhibits the growth, differentiation and bone-forming capacity of rat osteoblasts.//Exp Cell Res. 2006. - V. 312. - № 10. - P. 1693 - 1702.

105. Wagner W., Horn P., Ho A.D. Aging of hematopoietic stem cells is regulated by the stem cell niche. // Experimental Gerontology. 2008. - № 43. - P. 974 - 980.

106. Zhou S., Lechpammer S., Greenberger J.S., Glowacki J. Hypoxia inhibition of adipocytogenesis in human bone marrow stromal cells requires transforming growth factor-ß/Smad3 signaling.// J Biol Chem. 2005. - V. 280. - № 24. - P. 22688 - 22696.

107. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fräser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.// Molecular Biology of the Cell. 2002. - V. 13. - P. 4279 - 4295.

108. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J. A., Maini R.N. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals.//Arthritis Res. 2000. - V. 2. - № 6. - P. 477 - 488.